CN112782289A - 一种鉴别羊肉的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分析羊肉特征挥发性物质的方法及应用。本发明建立气相色谱质谱联用仪分析羊肉特征挥发性物质的方法，构建了羊肉特征挥发性物质谱，可用于鉴别羊肉，有广阔的应用前景。

Description

一种鉴别羊肉的方法
技术领域
本发明涉及一种分析羊肉特征挥发性物质的方法及应用。
背景技术
不同产地、不同品种的羊肉在口感及风味有很大区别，在羊品种繁殖、生产、销售和流通过程中均需要科学的无损检测方法，确保羊肉的质量。建立定性、定量的科学鉴定羊肉产地和品种的方法，不仅为羊繁育过程品种控制提供重要科学依据，而且为优质羊肉的生产及销售起到重要保护作用、为消费者提供选择依据。羊肉的气味是羊肉的风味的最主要组成部分之一，羊肉的特征性气味与其特征性的挥发物质密不可分，特征性挥发物质也是判断羊肉口味的一个重要指标。
本技术分别利用羊肉中的脂肪酸：4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸、正癸酸和挥发性物质：4-甲基苯酚和3-甲基吲哚作为鉴定羊肉的特征挥发性物质，建立气相色谱与质谱联用的方法分析对以上特征挥发性物质进行定性定量分析，建立羊肉的特征挥发性物质谱，用于鉴别不同品种的羊肉。该方法不仅可用于用于鉴别真假羊肉，还可用于多批次羊肉的无损鉴定，具有快速方便的特点，具有广阔应用前景。
发明内容
本发明涉及一种分析羊肉特征挥发性物质的方法及应用。本发明取羊皮下脂肪，以生羊肉中的脂肪酸：4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸、正癸酸和熟羊肉中的挥发性物质：4-甲基苯酚和3-甲基吲哚等作为羊肉的特征挥发性物质，利用气相色谱质谱联用法定量分析以上特征挥发物质，建立不同地区、不同品种的羊肉特征挥发物质谱的标准数据库，以该数据库为基准用于甄别羊肉的品种。该方法不仅可用于用于鉴别真假羊肉，还可用于多批次羊肉的无损鉴定，具有广阔应用前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
取羊皮下脂肪作为分析样品，生羊肉中脂肪酸4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸、正癸酸的分析方法：将生羊肉样品冷冻干燥至恒重，定量称取干燥羊肉样品装入顶空瓶，加入体积是羊肉重量50～100倍的正己烷溶剂，混合均匀后再加入正己烷体积1～3倍的甲酯化溶液，甲酯化溶液的组成为：乙酰氯：甲醇＝1:5～20(mL/mL)；上述样品装入顶空瓶并密封，于70～90℃水浴反应1～5小时。反应结束后冷却，加入反应体积的1～2倍的3～10g/mL的碳酸钠溶液，混合均匀后于离心力为800～5000g离心3～10分钟，移取上层有机相；下层水相再用等体积正己烷萃取，萃取液离心后移取上层有机相；合并两次有机相并定容，用0.22μM滤膜过滤，利用气相色谱-质谱联用仪分析滤液。
气相色谱-质谱联用仪分析条件：色谱柱DB-5ms(30m*0.25mm*0.25μm)，载气为高纯He，流速1.5mL/min，进样量1μL，分流比1:30，FID检测器300℃，Aux heaters 280℃，溶剂延迟9min；升温程序为60℃维持2min后以5℃/min升至260℃，再以20℃/min升至300℃，并维持5min；质谱条件为EI离子源，电离能量70eV，离子源温度230℃；数据采集通过Agilentmasshunter workstation software完成。
将气相色谱质谱分析获得的4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸和正癸酸的峰高与样品质量的比值作为以上四种物质的相对含量。
熟羊肉中挥发性物质4-甲基苯酚和3-甲基吲哚的分析方法：将生羊肉样品剪碎，定量样品装入顶空瓶，密封后插入顶空固相微萃取(SPME)萃取针，60～90℃加热15～50min，利用萃取针直接进样气相色谱-质谱联用仪进行分析。
气相色谱-质谱联用仪分析条件：色谱柱DB-WAX(30m*2.5μm*2.5μm)，载气高纯He，流速1.5mL/min，不分流模式；FID检测器heater 300℃，Aux heaters 280℃，进样口250℃，不设置溶剂延迟；程序升温为50℃保持1min，再以10℃/min升至110℃，再以5℃/min升至230℃并保持5min；质谱条件为EI离子源，电离能量70eV，离子源温度230℃，扫描模式fullscan，扫描范围m/z 30-400；数据采集通过Agilent masshunter workstation software完成。
将气相色谱质谱分析获得的4-甲基苯酚和3-甲基吲哚的峰高与样品质量的比值作为相对含量。
取品种明确的羊肉按照权利要求2的方法进行分析，建立已知品种羊肉的特征挥发性物质的数据库。
将未知样品按照权利要求2的方法进行分析，所获得的数据与数据库中单一品种羊肉的数据进行单因素方差分析，当P≤0.05时为具有显著性差异，P>0.05时为不具有显著性差异。所测样品的6种特征挥发物质与数据库中某一品种羊肉的6种特征挥发物质均满足P>0.05时，可认定样品为该品种的羊肉；否则，则不是该品种羊肉。
本发明具有如下优点：
1.以生羊肉中的脂肪酸：4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸和正癸酸和熟羊肉中的挥发性物质：4-甲基苯酚、3-甲基吲哚联合作为羊肉特征挥发性物质，用于鉴别羊肉具有快速、准确、定量的优点。
2.本发明建立了分析羊肉特征挥发性物质的分析方法，可实现羊肉的无损检测，可用于养繁殖、羊肉流通等环节，具有客观、灵敏、无损的特点。
附图说明
图1为脂肪酸分析GC-MS总离子流图(GC-MS分析生羊肉脂肪酸的总离子流图)；
图2为挥发性物质的GC-MS的总离子流图(GC-MS分析熟羊肉中挥发性物质的总离子流图)。
具体实施方式
实施例1
1，实验方法
1)羊肉脂肪酸的分析
样品前处理及分析：将羊肉样品(羊的皮下脂肪)冷冻干燥至恒重，称取50mg装入顶空瓶，加入3mL正己烷、5mL乙酰氯-甲醇溶液(乙酰氯：甲醇＝1:8，v/v)，密封，80℃水浴1.5h，每20min振摇一次。水浴后放冷，加入5mL 5％(g/mL)碳酸钠溶液，3000g离心5min，移取有机相；水相再用等体积正己烷同法萃取一次。合并两次有机相并定容，用0.22μM滤膜过滤后使用气相色谱-质谱联用仪分析。
GC-MS条件：安捷伦DB-5ms(30m*0.25mm，0.25μm)，载气为高纯He，流速1.5mL/min，进样量1μL，分流比1:30，FID检测器300℃，Aux heaters 280℃，solvent delay 9min；升温程序为60℃维持2min后以5℃/min升至260℃，再以20℃/min升至300℃，并维持5min，总分析时间49min；质谱条件为EI离子源，电离能量70eV，离子源温度230℃；数据采集通过Agilent masshunter workstation software完成。
2)羊肉挥发性物质的分析
样品前处理与制备：将新鲜羊肉(羊的皮下脂肪)剪碎，称取2.5g装入顶空瓶，密封后插入SPME萃取针，90℃加热30min使羊肉熟化释放挥发性物质，立即将萃取针插入气相色谱-质谱联用仪进行分析。
GC-MS分析条件：色谱柱DB-WAX(30m*2.5μm*2.5μm)，载气高纯He，流速1.5mL/min，不分流模式；FID检测器heater 300℃，Aux heaters 280℃，进样口250℃，不设置溶剂延迟；程序升温为50℃保持1min，再以10℃/min升至110℃，再以5℃/min升至230℃并保持5min；质谱条件为EI离子源，电离能量70eV，离子源温度230℃，扫描模式full scan，扫描范围m/z 30-400；数据采集通过Agilent masshunter workstation software完成。
3)数据分析
将每组的每个组分数据与其他组的相应的数据进行单因素方差分析，当P≤0.05时为具有显著性差异，P>0.05时为没有显著性差异。当两组数据中所测六个脂肪酸和挥发性物质中有一个以上成分的含量存在显著性差异，说明所检验两组的羊肉来源于不同品种的羊。当两组样品中的六个组分的含量均没有显著性差异，说明两组羊肉的品种相同。
对于未知样品，对未知样品和数据库中的数据两两进行单因素方差分析，如六种特征挥发物质与数据库中某一品种羊肉的数据有一个满足P≤0.05，认为该羊肉不是数据库中相比对的已知羊肉的品种；否则，则不是该品种羊肉。
2，结果分析
按照上述方法分别对内蒙古XW羊的生羊肉中脂肪酸及熟羊肉的挥发性物质进行提取及分析，脂肪酸分析GC-MS总离子流图见图1、挥发性物质的GC-MS的总离子流图见图2。
利用上述方法对产于内蒙古的呼伦贝尔小尾羊(XW)、呼伦贝尔大尾羊(DW)、湖羊(HC)、内蒙古未知品种(HS)、宁夏的宁夏滩羊(TX)羊肉进行分析，每个品种的羊肉取10个个体的羊肉样品，按照上述方法进行处理和分析，结果见表1。
表1是内蒙古四个品种和宁夏一个品种的羊肉的6种特征挥发性物质的数据，将每两组的6种挥发性物质的数据分别进行单因素方差分析(ANOVA)，当P≤0.05时为具有显著性差异，P>0.05时为没有显著性差异。比较表1的数据，当每两组的六种挥发性物质数据分别进行比较，每两组的数据均存在不同程度的显著性差异，如：
内蒙古的呼伦贝尔小尾羊(XW)、呼伦贝尔大尾羊(DW)两种品种的羊肉的正癸酸和3-甲基吲哚等2个物质的含量均存在显著性差异，表明呼伦贝尔小尾羊(XW)品种羊肉与呼伦贝尔大尾羊(DW)是两种不同的羊肉。
呼伦贝尔大尾羊(DW)、湖羊(HC)两种品种的羊肉的正癸酸和4-甲基苯酚等2个物质的含量均存在显著性差异，表明DW品种羊肉与HC品种是两种不同的羊肉。
内蒙古的HS和宁夏滩羊(TX)两种品种的羊肉的4-甲基辛酸、4-甲基壬酸、正癸酸等3个物质的含量均存在显著性差异，表明HS、TX是两种不同的羊肉。
以上结果说明利用该方法可区分不同品种的羊肉。
实施例2
对于未知样品A可按照前述按照实施例1的实验方法进行样品处理和分析方法(羊肉脂肪酸的分析和羊肉挥发性物质的分析)进行处理并分析，每个样品平行分析三次，将分析所得的6种特征挥发性物质的数据分别与表1的各个单一品种的6种特征挥发性物质数据进行单因素方差分析，未知样品的6种特征挥发物质与数据库中某一品种羊肉的6种特征挥发物质均满足P>0.05时，可认定样品为该品种的羊肉；否则，该样品不是表中所列的羊肉品种。
未知样品按照上述方面进行检测，检测结果及数据库已知品种羊肉的数据均列于表2。将未知样品的每一个成分分别与已知品种羊肉的成分进行两两单因素方差分析，其中标*的数据为未知样品的数据与该品种的数据存在显著性差异。从表2可见，未知样品中至少有一个成分与已知品种的让肉的数据存在显著性差异，说明未知样品并非来源于数据库中已有的品种的羊肉。
实施例3
如上实施例2的过程，不同之处是对未知样品B进行分析，检测结果及数据库已知品种羊肉的数据均列于表3。
表3的未知样品与数据库中羊肉的6种特征挥发物质含量进行单因素方差分析，结果显示未知样品与内蒙古DW的六种成分均没有显著性差异，而与其他品种的成分存在不同程度的显著性差异，表明该未知样品属于内蒙古DW。
表1羊肉的特征挥发性物质谱(Mean±SD，峰高/mg，n＝10)
Figure BDA0002264983410000081
上述数据为10个样品的平均值，其中#所测10个样品的4-甲基辛酸范围为0.2693～0.8121峰高/mg。
表2未知羊肉样品A的特征挥发性物质谱(Mean±SD，峰高/mg，n＝10)
Figure BDA0002264983410000082
*表示P≤0.05，其它不带有*号的表示P>0.05。
#未知样品的数据是测定三次的结果。
表3未知羊肉样品B的特征挥发性物质谱(Mean±SD，峰高/mg，n＝10)
Figure BDA0002264983410000083
*表示P≤0.05，其它不带有*号的表示P>0.05。
#未知样品的数据是测定三次的结果。

Claims (9)

1.一种鉴别羊肉的方法，其特征在于：分别以生羊肉中的脂肪酸：4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸和正癸酸与熟羊肉中的挥发性物质：4-甲基苯酚和3-甲基吲哚作为羊肉的特征物质，利用气相色谱质谱联用法定量分析以上特征物质，建立不同已知品种的羊肉特征挥发物质谱的标准数据库，以该数据库为基准用于甄别羊肉。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准数据库中包括已知地区养殖的已知品种羊中每个品种10个以上单个个体的6种特征物质。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述鉴别羊肉是指鉴别羊肉是否属于已知地区养殖的已知品种羊的羊肉。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：
甄别羊肉品种的过程为，将未知羊肉样品进行气相色谱质谱联用法定量分析，所获得的数据与数据库中单一品种羊肉的数据进行单因素方差分析，当P≤0.05时为具有显著性差异，P>0.05时为没有显著性差异；
所测样品的6种特征挥发物质与数据库中某一品种羊肉的6种特征挥发物质均满足P>0.05时，可认定样品为该品种的羊肉；否则，则不是该品种羊肉。
5.按照权利要求1、2或4所述的方法，其特征在于：气相色谱质谱联用法定量分析过程为，
(1)取样：所用样品均为羊的皮下脂肪；
(2)生羊肉中脂肪酸4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸、正癸酸的分析方法：将生羊肉样品冷冻干燥至恒重，定量称取干燥羊肉样品装入顶空瓶，加入体积是羊肉重量50～100倍的正己烷溶剂，混合均匀后再加入正己烷体积1～3倍的甲酯化溶液，甲酯化溶液的组成为：乙酰氯:甲醇＝1:5～20(mL/mL)；上述样品装入顶空瓶并密封，于70～90℃水浴反应1～5小时；
反应结束后冷却，加入反应体积的0.5～2倍的3～10％(g/mL)的碳酸钠溶液，混合均匀后于离心力为800～5000g离心3～10分钟，移取上层有机相；下层水相再用等体积正己烷萃取，萃取液离心后移取上层有机相；合并两次有机相并定容，用0.22μM滤膜过滤，滤液利用气相色谱-质谱联用仪分析滤液；
将气相色谱质谱分析获得的4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸和正癸酸的峰高与样品质量的比值作为以上四种物质的相对含量；
(3)熟羊肉中挥发性物质4-甲基苯酚和3-甲基吲哚的分析方法：将生羊肉样品剪碎，定量样品装入顶空瓶，密封后插入顶空固相微萃取(SPME)萃取针，60～90℃加热15～50min，利用萃取针直接进样气相色谱-质谱联用仪进行分析；将气相色谱质谱分析获得的4-甲基苯酚和3-甲基吲哚的峰高与样品质量的比值作为相对含量。
6.按照权利要求1或5所述的方法，其特征在于：
生羊肉中脂肪酸4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸、正癸酸的分析方法中：气相色谱-质谱联用仪分析条件：色谱柱DB-5ms(30m*0.25mm*0.25μm)，载气为高纯He，流速1.5mL/min，进样量1μL，分流比1:30，FID检测器300℃，Aux heaters 280℃，溶剂延迟9min；升温程序为60℃维持2min后以5℃/min升至260℃，再以20℃/min升至300℃，并维持5min；质谱条件为EI离子源，电离能量70eV，离子源温度230℃；数据采集通过Agilent masshunterworkstation software完成。
7.按照权利要求1或5所述的方法，其特征在于：
熟羊肉中挥发性物质4-甲基苯酚和3-甲基吲哚的分析方法：气相色谱-质谱联用仪分析条件：色谱柱DB-WAX(30m*2.5μm*2.5μm)，载气高纯He，流速1.5mL/min，不分流模式；FID检测器heater 300℃，Aux heaters 280℃，进样口250℃，不设置溶剂延迟；程序升温为50℃保持1min，再以10℃/min升至110℃，再以5℃/min升至230℃并保持5min；质谱条件为EI离子源，电离能量70eV，离子源温度230℃，扫描模式full scan，扫描范围m/z 30-400；数据采集通过Agilent masshunter workstation software完成。
8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：取品种明确的10个以上单个个体的羊肉按照权利要求4的方法进行分析，建立已知品种羊肉的、每个个体的6种特征物质特征挥发性物质的数据库。
9.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：将未知样品按照权利要求4的方法进行分析，所获得的数据与数据库中单一品种羊肉的数据进行单因素方差分析，当P≤0.05时为具有显著性差异，P>0.05时为没有显著性差异；
所测样品的6种特征挥发物质与数据库中某一品种羊肉的6种特征挥发物质均满足P>0.05时，可认定样品为该品种的羊肉；否则，则不是该品种羊肉。
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