CN108051506A - 一种快速测定鱼肝油中epa和dha含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鱼肝油中ω‑3不饱和脂肪酸EPA、DHA的测定方法，该方法采用柱前衍生对鱼肝油中的EPA、DHA进行衍生化后，用气相色谱法对其进行测定，按加校正因子内标法计算鱼肝油中的EPA、DHA含量。本发明的方法包括下列步骤：1.鱼肝油柱前衍生化反应制备脂肪酸甲酯溶液；2.EPA甲酯、DHA甲酯相对校正因子测定；3.EPA、DHA气相色谱含量测定；4.按加校正因子内标法计算EPA和DHA的含量。

Description

一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种快速测定鱼肝油及其鱼肝油软胶囊中EPA和DHA的方法。
背景技术
鱼肝油是从鱼类肝脏提取出的主要含有维生素A、维生素D及各种脂肪酸等天然化合物的脂肪油，各国药典均有收载。鱼肝油中含有二十多种脂肪酸，其中EPA、DHA为其特有脂肪酸。EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)属ω-3多不饱和脂肪酸，陆地上的动植物体内几乎没有，在鱼类肝脏中含量最高，EPA、DHA是人体不可缺少的重要营养素，其生理活性作用众所周知。目前国内鱼肝油市场鱼龙混杂，尤其是国产药用级鱼肝油产品质量堪忧，基本是人工合成的维生素A、D及植物油勾兑而成，基本不含有EPA和DHA，已经不再是鱼肝油，实际是维生素AD制剂。故有必要建立一种快速、简便、准确、可靠的鱼肝油中EPA、DHA含量测定方法，以规范国内鱼肝油市场。鱼肝油中EPA、DHA含量测定国内外标准均未见收载，文献报道的测定方法大多采用柱前衍生气相色谱外标法，柱前衍生化方法比较复杂，甲酯化反应催化剂也大多使用14％三氟化硼甲醇溶液。三氟化硼为毒性试剂，腐蚀性强，且易燃易爆，遇水产生爆炸性分解，对实验人员带来较大的健康风险，对环境造成较大的危害，且价格昂贵。同时由于EPA、DHA提纯工艺复杂，对照品价格昂贵，外标法测定大大增加了检测成本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有鱼肝油检测技术存在的诸多缺点，设计提出一种快速、简便、环保检测鱼肝油中EPA、DHA的方法，以解决目前的检测方法存在的操作繁琐、对照品昂贵、检测成本高、试剂毒性大以及定量测定结果准确度差等问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法，所述方法包括下列步骤：
(1)鱼肝油柱前衍生化反应制备脂肪酸甲酯溶液，包括皂化反应、甲酯化反应、提取盐析与脱水：
a.皂化反应：精密称取供试品100mg置20mL带螺口反应瓶中，加1.5mL氢氧化钠甲醇溶液，漩涡混合30秒，于90℃中加热20min，取出冷却，得皂化反应溶液；
b.甲酯化反应:于皂化反应溶液中，加入2mL硫酸甲醇溶液，漩涡混合30秒，于100℃中加热10min，取出冷却，得甲酯化反应溶液；
c.提取盐析：于甲酯化反应溶液中精密加入2mL浓度为5mg/mL二十三烷酸甲酯异辛烷溶液，漩涡混合1min，立即加5mL饱和氯化钠溶液，振摇，静置分层；
d.脱水处理：取上清液转移至装有无水硫酸钠的试管中，振摇，使脱水，脱水后溶液即为脂肪酸甲酯溶液；
(2)EPA甲酯、DHA甲酯相对校正因子测定：
a.混合标准溶液制备：称取二十三烷酸甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯各50mg置10mL棕色容量瓶中，加异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合标准溶液，平行制备二份；
b.气相色谱检测；
(3)EPA、DHA含量测定：
a.供试品溶液制备：精密称取样品100mg，置20mL带螺口反应瓶中，加1.5mL氢氧化钠甲醇溶液，旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，于90℃中加热20min，取出冷却；加2mL硫酸甲醇溶液，漩涡混合30秒，于100℃加热10min，取出冷却；加入2mL内标溶液，漩涡混合1min，立即加5mL饱和氯化钠溶液，振摇，静置分层；取上清液转移至装有无水硫酸钠的试管中，振摇，脱水，得供试品溶液；
b.气相色谱检测。
作为优选，步骤(1)皂化反应中所用的氢氧化钠甲醇溶液的质量分数为2％；甲酯化反应中所用的硫酸甲醇溶液的质量分数为5％。
作为优选，步骤(3)供试品溶液制备中，所用的氢氧化钠甲醇溶液的质量分数为2％；所用的硫酸甲醇溶液的质量分数为5％。
作为优选，步骤(2)与步骤(3)中气相色谱检测的条件为
色谱柱为DB-23 30m×0.25mm×0.25μm的毛细管柱；色谱柱升温程序:起始温度为170℃，以1℃/min的速率升温至225℃并保持5min；载气为纯度99.99％氮气；载气流速为1.0mL/min；进样口温度为250℃；检测器温度为280℃；进样量为1μL；进样方式为分流进样，分流比为100:1。
EPA甲酯、DHA甲酯相对校正因子测定的气相色谱图见图1。
测定结果及相对校正因子(FX)计算，结果见表1。
表1相对校正因子测定结果
计算公式:
AX:EPA甲酯或DHA甲酯峰面积
AS：二十三烷酸甲酯峰面积
WS：二十三烷酸甲酯标准品加入量，mg
WX：EPA甲酯或DHA甲酯标准品加入量，mg
供试品测定气相色谱图见图2。
EPA和DHA含量计算
按加校正因子内标法计算EPA和DHA的含量
鱼肝油原料、口服液计算公式:
鱼肝油软胶囊计算公式：
Ax:EPA甲酯或DHA甲酯峰面积
As：二十三烷酸甲酯峰面积
CFX：EPA甲酯或DHA甲酯相对校正因子
Ws：二十三烷酸甲酯加入量，mg
W供试品称样量，g
平均装量，g
1.04：EPA甲酯和DHA甲酯转换成脂肪酸的转换系数
样品衍生化正交试验
a.因素和水平：采用L16(45)正交表，以EPA、DHA的含量为考察指标，以皂化时间、皂化温度、酯化时间、酯化温度为考察因素设计正交试验表，见表2。
表2正交试验设计
b.正交试验结果:
按L16(45)正交试验，每个组合进行两次平行实验，记录EPA、DHA的含量(取平均值)，结果见表3、表4。
由表3、表4中可见,皂化时间(A)和酯化时间(E)的极差值较大，说明这两种因素对实验结果的影响较大，皂化温度(B)和酯化温度(D)对试验结果的影响相对较小。从表3，可以确定优水平为A4B1D3E2；从表4可以确定优水平为A4B1D3E4，E2、E3、E4三水平测定结果很接近，为缩短反应时间，对极差较小的E因素选用表3的结果。
表3正交试验结果(按EPA计)
因素 皂化时间 皂化温度 空列 酯化时间 酯化温度 EPA含量mg/g
实验1 1 1 1 1 1 66.97
实验2 1 2 2 2 2 69.34
实验3 1 3 3 3 3 66.84
实验4 1 4 4 4 4 66.49
实验5 2 1 2 3 4 68.70
实验6 2 2 1 4 3 69.45
实验7 2 3 4 1 2 62.09
实验8 2 4 3 2 1 63.95
实验9 3 1 3 4 2 69.01
实验10 3 2 4 3 1 68.78
实验11 3 3 1 2 4 71.98
实验12 3 4 2 1 3 64.27
实验13 4 1 4 2 3 69.57
实验14 4 2 3 1 4 64.94
实验15 4 3 2 4 1 70.47
实验16 4 4 1 3 2 71.63
k1 67.409 68.563 69.909 64.567 67.543
k2 66.048 68.128 68.194 68.608 68.016
k3 68.409 67.743 66.186 68.988 67.532
k4 69.154 66.587 66.731 68.856 67.928
R 3.106 1.976 3.723 4.421 0.485
表4正交试验结果(按DHA计)
c.验证试验：对比优选的正交试验条件A4B1D3E2(即皂化时间30min、皂化温度70℃、酯化时间15min、酯化温度90℃)和正交试验表中含量最高的实验11A3B3D2E4(即皂化时间20min、皂化温度90℃、酯化时间10min、酯化温度100℃)对EPA、DHA的含量进行测定。各平行测定三次。结果见表5。从表5可见，条件A3B3D2E4测得的EPA、DHA含量明显高于条件A3B3D2E4，即实验11的条件为鱼肝油衍生化最优条件。
表5验证试验结果
方法学验证
(1)专属性试验
a.不加内标溶液的供试品溶液制备：称取样品约100mg，置20ml带螺口反应瓶中，加1.5ml2％氢氧化钠甲醇溶液，旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，置90℃干式恒温器中加热20min，取出冷却。加2ml5％硫酸甲醇溶液，旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，置100℃干式恒温器中加热10min，取出冷却。精密加入2ml异辛烷，漩涡混合1min，立即加5ml饱和氯化钠溶液，轻轻振摇，静置分层。吸取上清液转移至装有少量无水硫酸钠的试管中，振摇，使脱水，得不加内标溶液的供试品溶液。
b.取上述供试品溶液进样测定，色谱图见图3。由图可见，供试品溶液色谱图中在与二十三烷酸甲酯相同的保留时间处(tR：44.9min)未发现色谱峰。由色谱图2显示：EPA甲酯、二十三烷酸甲酯、DHA甲酯峰与左右相邻峰的分离度分别为2.81/6.77；2.91/2.34；2.39/2.96，均大于1.5。实验结果表明本方法专属性良好。
(2)标准曲线制备
a.混合标准储备液制备：精密称取EPA甲酯、DHA甲酯各约200mg置20ml棕色容量瓶中，加异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，制成约10mg/ml的混合标准储备液。
b.标准曲线测定用系列对照品溶液制备：精密吸取上述储备液0.05、0.5、1.0、2.0、5.0ml至10ml容量瓶中，加上储备液原液，共得六个系列浓度，EPA甲酯含量分别为0.0487、0.487、0.974、1.948、4.870、9.740mg/ml；DHA甲酯含量分别为0.0510、0.510、1.021、2.041、5.103、10.206mg/ml。
c.测定法：EPA、DHA甲酯系列浓度按上述色谱条件进样，每个浓度平行进两针，计算平均峰面积，以对照品溶液浓度为横坐标(X)，平均峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表6、图4、图5。
表6回归方程、相关系数及线性范围
(3)定量限、检测限测定
a.基线噪声测定：取异辛烷按上述色谱条件直接进样，测得基线噪声为0.0554pA。结果见图6。
b.定量限测定：精密吸取上述标准曲线测定用最低浓度溶液2ml至4ml容量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，制成含EPA甲酯0.0244mg/ml、DHA甲酯0.0255mg/ml的溶液，进样测定，色谱图见图7。测得EPA、DHA甲酯的峰高分别为0.5718pA、0.5402pA。计算信噪比(S/N)为EPA：10.32；DHA：9.66。该浓度即为最低定量浓度，结合供试品制备方法，计算EPA、DHA的定量限均为0.5mg/g。
c.检测限测定：精密吸取上述标准曲线测定用最低浓度溶液1.5ml至10ml容量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，制成含EPA甲酯0.0073mg/ml、DHA甲酯0.0077mg/ml的溶液，进样测定，色谱图见图8。测得EPA、DHA的峰高分别为0.1801pA、0.1632pA。计算信噪比(S/N)为EPA：3.25；DHA：2.92。该浓度即为最低检测浓度，结合供试品制备方法，计算EPA、DHA的检测限均为0.15mg/g。
(4)精密度试验
取EPA、DHA含量测定项下的供试品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，测得EPA、DHA甲酯峰面积的RSD分别为0.41％、0.55％，表明本方法精密度良好。
(5)重复性试验
精密称取同一批样品6份，每份约100mg，按EPA、DHA含量测定项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，分别测定并计算EPA、DHA含量，结果见表7，表明本方法重复性良好。
表7重复性试验结果
(6)稳定性试验
取同一份供试品溶液，室温下放置，按上述色谱条件分别在0、4、8、12、16、20、24h进样测定，测得EPA、DHA甲酯的峰面积RSD分别为1.83％、1.89％，表明供试品溶液在24h内稳定。
(7)加样回收率试验
a.标液制备：精密称取EPA甲酯约70mg、DHA甲酯约140mg至10ml容量瓶中，制成约含EPA甲酯7mg/ml、DHA甲酯14mg/ml的混合标液。
b.加标回收试验：取重复性试验项已测知含量的样品，共9份，分别精密称取约50mg至20ml带螺口反应瓶中，加上述标液0.48ml、0.6ml、0.72ml各3份，制成加标水平为80％、100％、120％的加标样品，再分别加入1.5ml2％氢氧化钠甲醇溶液，旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，置90℃干式恒温器中加热20min，取出冷却。加2ml5％硫酸甲醇溶液，旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，置100℃干式恒温器中加热10min，取出冷却。分别精密加入内标溶液2ml，漩涡混合1min，立即加5ml饱和氯化钠溶液，轻轻振摇，静置分层。吸取上清液转移至装有少量无水硫酸钠的试管中，振摇，使脱水，取上清液分别进样测定。回收率试验结果见表8。
表8回收率试验结果
本发明的有益效果：本发明将鱼肝油先皂化后甲酯化，甲酯化催化剂以5％硫酸甲醇溶液替代三氟化硼甲醇溶液，经异辛烷提取，提取物采用气相色谱内标法测定，按加校正因子内标法计算EPA和DHA的含量。操作安全、简便，衍生化反应温和、迅速、高效，可避免有毒有害试剂对人员和环境带来的危害，采用加校正因子内标法可以消除仪器和操作误差、提高方法精密度和准确性，还可大大降低检测成本。
附图说明
图1是相对校正因子测定气相色谱图。
图2是供试品测定气相色谱图。
图3是专属性试验气相色谱图。
图4是EPA甲酯标准曲线。
图5是DHA甲酯标准曲线。
图6是空白溶剂气相色谱图。
图7是定量限测定气相色谱图。
图8是检测限测定气相色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步说明。
实施例1:
本实例涉及的鳕鱼肝油中脂肪酸的检测方法包括供试品皂化反应、甲酯化反应、盐析提取、脱水、气相色谱进样五个步骤，其具体检测流程为：
(1)皂化反应:精密称取供试品约100mg置20ml带螺口反应瓶中，加1.5ml2％氢氧化钠甲醇溶液，旋紧瓶盖，(让皂化反应在密闭条件下进行，可克服较高温度下甲醇挥发致反应溶剂减少，反应速率降低，从而导致脂肪酸甘油酯皂化不完全或延长皂化时间。)漩涡混合30秒，(漩涡混合可大大增加样品和皂化试剂的接触面，反应液颜色逐渐变深，显示室温条件下已发生部分皂化反应，可以缩短高温皂化时间。)置90℃干式恒温器中加热20min，取出冷却，得皂化反应溶液。
(2)甲酯化反应：于步骤(1)制得的样液中，加2ml5％硫酸甲醇溶液，(采用5％硫酸甲醇溶液做催化剂，操作安全、环保，甲酯化反应速度快，且大大降低检测成本。)旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，(漩涡作用同上述皂化反应)置100℃干式恒温器中加热10min，取出冷却，得甲酯化反应溶液。
(3)提取盐析：于步骤(2)制得的样液中，精密加入内标溶液2ml，(采用二十三烷酸甲酯作为内标物质，其优点为：①供试品溶液色谱图中在与内标物相同保留时间处无色谱峰；②保留时间介于EPA甲酯和DHA甲酯之间；③二十三烷酸甲酯为饱和脂肪酸，稳定性明显高于EPA、DHA甲酯，可延长标准物质稳定性和使用时间。)漩涡混合1min，(漩涡混合可以使异辛烷和反应液中各脂肪酸甲酯充分混合，达到最大提取效果。)立即加入饱和氯化钠溶液5ml，轻轻振摇，(盐析可提高异辛烷对脂肪酸甲酯的提取效率。)静置分层(用5％硫酸甲醇溶液做催化剂比14％三氟化硼，上层液澄清时间明显缩短，可快速获得上层清液)。
(4)脱水处理：吸取步骤(3)制得的上清液转移至装有少量无水硫酸钠的试管中，振摇，脱水，(脱水可除去提取液中的微量水分，有效保护色谱柱，延长寿命。)得供试品溶液。
(5)气相色谱进样：再将步骤(4)制得的上清液置进样瓶中，按设定的色谱条件进样1μL，得鳕鱼肝油气相色谱图。
a.定性试验：制备适宜浓度的混合二十三烷酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯溶液，进样，供试品色谱中呈现与对照品色谱保留时间相一致的色谱峰，即为二十三烷酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯峰。其中EPA甲酯色谱峰保留时间为37.7min；二十三烷酸甲酯色谱峰保留时间为44.9min；DHA甲酯色谱峰保留时间为50.4min。
b.定量试验：按加校正因子内标法计算EPA和DHA的含量，
计算公式:
Ax:EPA甲酯或DHA甲酯峰面积
As：二十三烷酸甲酯峰面积
CFX：EPA甲酯或DHA甲酯相对校正因子，EPA甲酯为1.022，DHA甲酯为1.034
Ws：二十三烷酸甲酯加入量，g
W供试品称样量，g
1.04：EPA甲酯和DHA甲酯转换成脂肪酸的转换系数
由公式可见，本法只需使用内标对照品，无需使用EPA、DHA甲酯对照品，二十烷酸甲酯对照品的价格明显低于EPA、DHA甲酯，故本方法可大大降低检测成本。
由于异辛烷的易挥发性，在加饱和氯化钠以及上清液转移等步骤中易造成因异辛烷挥发所致的待测物浓度的改变，同时因气相进样体积小，对仪器进样准确度要求很高，上述诸因素的存在对外标法测定结果的准确性有一定影响。但内标法可彻底排除上述因素的影响，对比了外标法和内标法的加样回收率计算结果，外标法EPA含量测定总回收率、总RSD为97.12％、5.33％；DHA为98.07％、5.49％，外标法的回收率低于内标法，RSD明显高于内标法，表明内标法的准确度和回收率精密度均高于外标法。
c.色谱条件
色谱柱为DB-23(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；色谱柱升温程序:起始温度为170℃，以1℃/min的速率升温至225℃并保持5min；载气为氮气(纯度99.99％)；载气流速为1.0mL/min；进样口温度为250℃；检测器温度为280℃；进样量为1μL；进样方式为分流进样，分流比为100:1。
测定出鳕鱼肝油中EPA的含量为65～74mg/g，DHA的含量为130～148mg/g。
实施例2:
本实例涉及的鲨鱼肝油中脂肪酸的检测方法包括供试品皂化反应、甲酯化反应、盐析提取、脱水、气相色谱进样五个步骤，其具体检测流程为：
(1)皂化反应:精密称取供试品约100mg置20ml带螺口反应瓶中，加1.5ml2％氢氧化钠甲醇溶液，旋紧瓶盖，(让皂化反应在密闭条件下进行，可克服较高温度下甲醇挥发致反应溶剂减少，反应速率降低，从而导致脂肪酸甘油酯皂化不完全或延长皂化时间。)漩涡混合30秒，(漩涡混合可大大增加样品和皂化试剂的接触面，反应液颜色逐渐变深，显示室温条件下已发生部分皂化反应，可以缩短高温皂化时间。)置90℃干式恒温器中加热20min，取出冷却，得皂化反应溶液。
(2)甲酯化反应：于步骤(1)制得的样液中，加2ml5％硫酸甲醇溶液，(采用5％硫酸甲醇溶液做催化剂，操作安全、环保，甲酯化反应速度快，且大大降低检测成本。)旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，(漩涡作用同上述皂化反应)置100℃干式恒温器中加热10min，取出冷却，得甲酯化反应溶液。
(3)提取盐析：于步骤(2)制得的样液中，精密加入内标溶液2ml，(采用二十三烷酸甲酯作为内标物质，其优点为：①供试品溶液色谱图中在与内标物相同保留时间处无色谱峰；②保留时间介于EPA甲酯和DHA甲酯之间；③二十三烷酸甲酯为饱和脂肪酸，稳定性明显高于EPA、DHA甲酯，可延长标准物质稳定性和使用时间。)漩涡混合1min，(漩涡混合可以使异辛烷和反应液中各脂肪酸甲酯充分混合，达到最大提取效果。)立即加入饱和氯化钠溶液5ml，轻轻振摇，(盐析可提高异辛烷对脂肪酸甲酯的提取效率。)静置分层(用5％硫酸甲醇溶液做催化剂比14％三氟化硼，上层液澄清时间明显缩短，可快速获得上层清液)。
(4)脱水处理：吸取步骤(3)制得的上清液转移至装有少量无水硫酸钠的试管中，振摇，脱水，(脱水可除去提取液中的微量水分，有效保护色谱柱，延长寿命。)得供试品溶液。
(5)气相色谱进样：再将步骤(4)制得的上清液置进样瓶中，按设定的色谱条件进样1μL，得鲨鱼肝油气相色谱图。
a.定性试验：制备适宜浓度的混合二十三烷酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯溶液，进样，供试品色谱中呈现与对照品色谱保留时间相一致的色谱峰，即为二十三烷酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯峰。其中EPA甲酯色谱峰保留时间为37.7min；二十三烷酸甲酯色谱峰保留时间为44.9min；DHA甲酯色谱峰保留时间为50.4min。
b.定量试验：按加校正因子内标法计算EPA和DHA的含量，
计算公式:
Ax:EPA甲酯或DHA甲酯峰面积
As：二十三烷酸甲酯峰面积
CFX：EPA甲酯或DHA甲酯相对校正因子，EPA甲酯为1.022，DHA甲酯为1.034
Ws：二十三烷酸甲酯加入量，g
W：供试品称样量，g
1.04：EPA甲酯和DHA甲酯转换成脂肪酸的转换系数
由公式可见，本法只需使用内标对照品，无需使用EPA、DHA甲酯对照品，二十烷酸甲酯对照品的价格明显低于EPA、DHA甲酯，故本方法可大大降低检测成本。
由于异辛烷的易挥发性，在加饱和氯化钠以及上清液转移等步骤中易造成因异辛烷挥发所致的待测物浓度的改变，同时因气相进样体积小，对仪器进样准确度要求很高，上述诸因素的存在对外标法测定结果的准确性有一定影响。但内标法可彻底排除上述因素的影响，对比了外标法和内标法的加样回收率计算结果，外标法EPA含量测定总回收率、总RSD为97.12％、5.33％；DHA为98.07％、5.49％，外标法的回收率低于内标法，RSD明显高于内标法，表明内标法的准确度和回收率精密度均高于外标法。
c.色谱条件
色谱柱为DB-23(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；色谱柱升温程序:起始温度为170℃，以1℃/min的速率升温至225℃并保持5min；载气为氮气(纯度99.99％)；载气流速为1.0mL/min；进样口温度为250℃；检测器温度为280℃；进样量为1μL；进样方式为分流进样，分流比为100:1。
测定出鲨鱼肝油中EPA的含量为14～20mg/g，DHA的含量为120～143mg/g。
实施例3:
本实例涉及的鱼肝油软胶囊中脂肪酸的检测方法包括供试品皂化反应、甲酯化反应、盐析提取、脱水、气相色谱进样五个步骤，其具体检测流程为：
(1)皂化反应:取鳕鱼肝油软胶囊20粒，准确测定其平均装量，将20粒内容物混合均匀。精密称取内容物约100mg置20ml带螺口反应瓶中，加1.5ml2％氢氧化钠甲醇溶液，旋紧瓶盖，(让皂化反应在密闭条件下进行，可克服较高温度下甲醇挥发致反应溶剂减少，反应速率降低，从而导致脂肪酸甘油酯皂化不完全或延长皂化时间。)漩涡混合30秒，(漩涡混合可大大增加样品和皂化试剂的接触面，反应液颜色逐渐变深，显示室温条件下已发生部分皂化反应，可以缩短高温皂化时间。)置90℃干式恒温器中加热20min，取出冷却，得皂化反应溶液。
(2)甲酯化反应：于步骤(1)制得的样液中，加2ml5％硫酸甲醇溶液，(采用5％硫酸甲醇溶液做催化剂，操作安全、环保，甲酯化反应速度快，且大大降低检测成本。)旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，(漩涡作用同上述皂化反应)置100℃干式恒温器中加热10min，取出冷却，得甲酯化反应溶液。
(3)提取盐析：于步骤(2)制得的样液中，精密加入内标溶液2ml，(采用二十三烷酸甲酯作为内标物质，其优点为：①供试品溶液色谱图中在与内标物相同保留时间处无色谱峰；②保留时间介于EPA甲酯和DHA甲酯之间；③二十三烷酸甲酯为饱和脂肪酸，稳定性明显高于EPA、DHA甲酯，可延长标准物质稳定性和使用时间。)漩涡混合1min，(漩涡混合可以使异辛烷和反应液中各脂肪酸甲酯充分混合，达到最大提取效果。)立即加入饱和氯化钠溶液5ml，轻轻振摇，(盐析可提高异辛烷对脂肪酸甲酯的提取效率。)静置分层(用5％硫酸甲醇溶液做催化剂比14％三氟化硼，上层液澄清时间明显缩短，可快速获得上层清液)。
(4)脱水处理：吸取步骤(3)制得的上清液转移至装有少量无水硫酸钠的试管中，振摇，脱水，(脱水可除去提取液中的微量水分，有效保护色谱柱，延长寿命。)得供试品溶液。
(5)气相色谱进样：再将步骤(4)制得的上清液置进样瓶中，按设定的色谱条件进样1μL，得鳕鱼肝油软胶囊气相色谱图。
a.定性试验：制备适宜浓度的混合二十三烷酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯溶液，进样，供试品色谱中呈现与对照品色谱保留时间相一致的色谱峰，即为二十三烷酸甲酯、EPA甲酯和DHA甲酯峰。其中EPA甲酯色谱峰保留时间为37.7min；二十三烷酸甲酯色谱峰保留时间为44.9min；DHA甲酯色谱峰保留时间为50.4min。
b.定量试验：按加校正因子内标法计算EPA和DHA的含量，
计算公式:
Ax:EPA甲酯或DHA甲酯峰面积
As：二十三烷酸甲酯峰面积
CFx：EPA甲酯或DHA甲酯相对校正因子，EPA甲酯为1.022，DHA甲酯为1.034
Ws：二十三烷酸甲酯加入量，g
W：供试品称样量，g
：平均装量，g
1.04：EPA甲酯和DHA甲酯转换成脂肪酸的转换系数
由公式可见，本法只需使用内标对照品，无需使用EPA、DHA甲酯对照品，二十烷酸甲酯对照品的价格明显低于EPA、DHA甲酯，故本方法可大大降低检测成本。
由于异辛烷的易挥发性，在加饱和氯化钠以及上清液转移等步骤中易造成因异辛烷挥发所致的待测物浓度的改变，同时因气相进样体积小，对仪器进样准确度要求很高，上述诸因素的存在对外标法测定结果的准确性有一定影响。但内标法可彻底排除上述因素的影响，对比了外标法和内标法的加样回收率计算结果，外标法EPA含量测定总回收率、总RSD为97.12％、5.33％；DHA为98.07％、5.49％，外标法的回收率低于内标法，RSD明显高于内标法，表明内标法的准确度和回收率精密度均高于外标法。
c.色谱条件
色谱柱为DB-23(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；色谱柱升温程序:起始温度为170℃，以1℃/min的速率升温至225℃并保持5min；载气为氮气(纯度99.99％)；载气流速为1.0mL/min；进样口温度为250℃；检测器温度为280℃；进样量为1μL；进样方式为分流进样，分流比为100:1。
测定出鱼肝油软胶囊中EPA的含量为75～141mg/g，30～141mg/粒，DHA的含量为97～110mg/g，40～103mg/粒。

Claims (7)

1.一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
(1)鱼肝油柱前衍生化反应制备脂肪酸甲酯溶液，包括皂化反应、甲酯化反应、提取盐析与脱水：
a.皂化反应：精密称取供试品100mg置20mL带螺口反应瓶中，加1.5mL氢氧化钠甲醇溶液，漩涡混合30秒，于90℃中加热20min，取出冷却，得皂化反应溶液；
b.甲酯化反应:于皂化反应溶液中，加入2mL硫酸甲醇溶液，漩涡混合30秒，于100℃中加热10min，取出冷却，得甲酯化反应溶液；
c.提取盐析：于甲酯化反应溶液中精密加入2mL浓度为5mg/mL二十三烷酸甲酯异辛烷溶液，漩涡混合1min，加5mL饱和氯化钠溶液，振摇，静置分层；
d.脱水处理：取上清液转移至装有无水硫酸钠的试管中，振摇，使脱水，脱水后溶液即为脂肪酸甲酯溶液；
(2)EPA甲酯、DHA甲酯相对校正因子测定：
a.混合标准溶液制备：称取二十三烷酸甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯各50mg置10mL棕色容量瓶中，加异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合标准溶液，平行制备二份；
b.气相色谱检测；
(3)EPA、DHA含量测定：
a.供试品溶液制备：精密称取样品100mg，置20mL带螺口反应瓶中，加1.5mL氢氧化钠甲醇溶液，旋紧瓶盖，漩涡混合30秒，于90℃中加热20min，取出冷却；加2mL硫酸甲醇溶液，漩涡混合30秒，于100℃加热10min，取出冷却；加入2mL内标溶液，漩涡混合1min，立即加5mL饱和氯化钠溶液，振摇，静置分层；取上清液转移至装有无水硫酸钠的试管中，振摇，脱水，得供试品溶液；
b.气相色谱检测。
2.根据权利要求1所述的一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法，其特征在于，步骤(1)皂化反应中所用的氢氧化钠甲醇溶液的质量分数为2％；甲酯化反应中所用的硫酸甲醇溶液的质量分数为5％。
3.根据权利要求1所述的一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法，其特征在于，步骤(3)供试品溶液制备中，所用的氢氧化钠甲醇溶液的质量分数为2％；所用的硫酸甲醇溶液的质量分数为5％。
4.根据权利要求1所述的一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法，其特征在于，相对校正因子其中，AX:EPA甲酯或DHA甲酯峰面积；AS：二十三烷酸甲酯峰面积；WS：二十三烷酸甲酯标准品加入量，mg；WX：EPA甲酯或DHA甲酯标准品加入量，mg。
5.根据权利要求1所述的一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法，其特征在于，鱼肝油原料、口服液的计算公式:
鱼肝油软胶囊的计算公式：
其中，Ax:EPA甲酯或DHA甲酯峰面积；As：二十三烷酸甲酯峰面积；CFX：EPA甲酯或DHA甲酯相对校正因子；Ws：二十三烷酸甲酯加入量，mg；W：供试品称样量，g；平均装量，g；1.04：EPA甲酯和DHA甲酯转换成脂肪酸的转换系数。
6.根据权利要求1所述的一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法，其特征在于，EPA甲酯的回归方程为Y＝266.19X+3.1796，相关系数为1.0000，线性范围为0.05～10mg/mL；DHA甲酯的回归方程为Y＝263.82X+1.6745，相关系数为1.0000，线性范围为0.05～10mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种快速测定鱼肝油中EPA和DHA含量的方法，其特征在于，步骤(2)与步骤(3)中气相色谱检测的条件为
色谱柱为DB-23 30m×0.25mm×0.25μm的毛细管柱；色谱柱升温程序:起始温度为170℃，以1℃/min的速率升温至225℃并保持5min；载气为纯度99.99％氮气；载气流速为1.0mL/min；进样口温度为250℃；检测器温度为280℃；进样量为1μL；进样方式为分流进样，分流比为100:1。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109001330A (zh) * 2018-08-27 2018-12-14 舟山市食品药品检验检测研究院 一种基于指纹图谱的天然鱼肝油掺假鉴定方法
CN110220996A (zh) * 2019-07-05 2019-09-10 浙江艾兰得生物科技有限公司 鱼油中epa和dha含量的gc检测方法
CN110530996A (zh) * 2019-09-06 2019-12-03 深圳市荣格保健品有限公司 鱼油软胶囊中epa、dha的测定方法
CN114137113A (zh) * 2021-11-26 2022-03-04 重庆伊诺生化制品有限公司 一种多糖中脂肪酸含量的检测方法

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