CN108152431A - 一种红景天破壁饮片hplc指纹图谱的构建方法及质量检测方法 - Google Patents
一种红景天破壁饮片hplc指纹图谱的构建方法及质量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种红景天破壁饮片HPLC指纹图谱的构建方法及质量检测方法。所述指纹图谱的构建方法包括如下步骤：S1：以质量分数为50%~70%的甲醇溶液为溶剂，提取红景天破壁饮片，得供试品溶液；S2：运用HPLC技术，并控制流动相组成和梯度洗脱条件，以对照品为对照对所述供试品溶液进行图谱构建即得所述红景天破壁饮片HPLC指纹图谱。本发明提供的红景天破壁饮片HPLC指纹图谱的构建方法通过对提取条件和色谱条件的特定选取，成功构建了出峰数目多、峰分布均匀、基线平稳的红景天破壁饮片HPLC指纹图谱，操作简单；另外，可利用指纹图谱分析软件将指纹图谱生成为标准指纹图谱，应用于评价红景天破壁饮片的质量。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，特别涉及一种红景天破壁饮片HPLC指纹图谱的构建方法及质量检测方法。
背景技术
红景天破壁饮片是以红景天为原料利用中药破壁技术制成的破壁饮片产品。红景天为景天科植物大花红景天Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba的干燥根和根茎。具有益气活血，通脉平喘的功效，用于气虛血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘。主要含有醇及其苷类、黄酮类、酚及其苷类、萜类、香豆素类、挥发油类、多糖类等成分。
中药破壁饮片是将符合法定标准要求并具有细胞结构的植物类中药饮片，经现代粉碎技术加工至D90﹤45μm(300目以上)的粉体，通过诱发自身物质的粘合性，制成30～100目的原饮片全成分的均匀干燥颗粒状饮片。相比传统饮片，中药破壁饮片具有质量均一，药物利用率高、稳定性好及应用方便快捷的优势。破壁后会带来有效成分或指标成分等化学成分的溶出度变化，使传统饮片的鉴别、质量检测方法不能完全适用。因此，必须针对中药破壁饮片建立专属性强，全面反映中药破壁饮片质量状况的检测方法。而建立一项新的质量检测方法并非易事，例如检测条件和供试品的制备方法等均需要研究考量并进行验证。虽然现有技术中涉及有利用红景天指纹图谱对其质量状况进行检测的方法，但这些方法存在分离度差，专属性、稳定性、重现性和精密度差等缺陷，不能全面反应饮片质量的缺陷，同时还无针对形态特殊的红景天破壁饮片的质量检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中红景天破壁饮片质量状况的检测方法的缺陷和不足，提供一种红景天破壁饮片HPLC指纹图谱的构建方法。本发明提供的方法通过对提取条件和色谱条件的特定选取，成功构建了出峰数目多、峰分布均匀、基线平稳的红景天破壁饮片HPLC指纹图谱，操作简单，可广泛应用于评价红景天破壁饮片的质量。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种红景天破壁饮片HPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
S1：以质量分数为50％～70％的甲醇溶液为溶剂，提取红景天破壁饮片，得供试品溶液；
S2：运用HPLC技术，以对照品为对照对所述供试品溶液进行图谱构建即得所述红景天破壁饮片HPLC指纹图谱；
其中，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸水溶液；
梯度洗脱条件为：0→25min→45min→60min：流动相A：5％→18％→23％→28％，
或梯度洗脱条件为：0→25min→45min→70min：流动相A：5％→15％→23％→28％。
其中，最优选地，梯度洗脱条件为：0→25min→45min→70min：流动相A：5％→15％→23％→28％。
本发明提供的方法通过对提取和色谱条件的特定优化，可成功构建出峰数目多、峰分布均匀、基线平稳的红景天破壁饮片HPLC指纹图谱，操作简单，可广泛应用于红景天破壁饮片的质量检测。
方法中，优选地，S1中所述溶剂为70％的甲醇溶液。
优选地，S1中提取的方式为超声或回流提取。更优选地，S1所述提取的方式为超声提取。
优选地，S1中提取的时间45min～60min。
更优选地，S1所述提取的时间为45min。
优选地，S1中红景天破壁饮片与溶剂的料液比为5～20mg:1mL。
更优选地，S1中红景天破壁饮片与溶剂的料液比为10mg:1mL。
本发明所选用的对照品溶液为现有技术中常用的对照品，可直接购买经配置得到。
优选地，S2中对照品为红景天苷、酪醇和没食子酸一种或几种。
优选地，S2中所用色谱柱为资生堂CAP Cell色谱柱；所述色谱柱的注温为25～30℃。
更优选地，所述色谱柱的注温为30℃。
优选地，所述流动相的流速为0.6ml/min～0.8ml/min；S2中进样体积为20μL；S2中检测波长为275nm。
更优选地，所述流动相的流速为0.6ml/min。
另外，一种红景天破壁饮片的质量检测方法，包括如下步骤：
S1：利用上述指纹图谱的构建方法对不少于10批次的红景天破壁饮片进行测定，得指纹图谱；
S2：将S1所得指纹图谱导入指纹图谱分析软件，生成指纹图谱共有模式即得红景天破壁饮片的标准指纹图谱；
S3：利用标准指纹图谱对红景天破壁饮片的质量进行检测。
优选地，S3是将待测红景天破壁饮片利用S1的方法构建指纹图谱，然后与S2的标准指纹图谱进行对比分析。
对比分析的评判标准为：按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，待检样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不得低于0.85，以没食子酸为参照峰，其余各峰的相对保留时间在±5％的范围内；若不满足此标准，则该破壁饮片为不合格品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的红景天破壁饮片HPLC指纹图谱的构建方法通过对提取条件和色谱条件的特定优化，成功构建了出峰数目多、峰分布均匀、基线平稳的红景天破壁饮片HPLC指纹图谱，操作简单，可广泛应用于红景天破壁饮片的质量检测。
附图说明
图1为不同提取溶剂考察色谱图；
图2为不同甲醇提取浓度考察色谱图；
图3为不同提取方式考察色谱图；
图4为不同提取时间考察色谱图；
图5不同提取料液比考察色谱图；
图6为不同流动相考察色谱图；
图7为不同洗脱梯度条件考察色谱图；
图8为不同流速考察色谱图；
图9为不同柱温条件考察色谱图；
图10为红景天指纹图谱专属性考察色谱图；
图11为红景天指纹图谱仪器精密度考察色谱图；
图12为红景天指纹图谱重复性考察色谱图；
图13为红景天指纹图谱稳定性考察色谱图；
图14为供试品中参照峰(1、2、4号峰)的指认的色谱图；
图15为10批红景天破壁饮片的指纹图谱；
图16为红景天破壁饮片标准指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
1.仪器与材料
1.1仪器
电热恒温水浴锅HWS24(上海一恒科技有限公司、FEJ-200电子称(d＝0.1g)、万分之一电子天平AB204-S(METTLER TOLEOD)、十万分之一电子天平、安捷伦1200RRLC快速液相色谱仪(配有G1315C型号DAD检测器、G4218A的ELSD蒸发光检测器、G1312B二元泵、G1329B自动进样器、G1322A脱气机G1316B柱温箱、Agilent Chemstation色谱工作站)、Waters2695/2988高效液相色谱仪(沃特世科技(上海)有限公司)、Thermo U3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司)、Phenomenex C18(5μm，250mm×4.6mm)、Waters Atltantis C18(5μm，250mm×4.6mm)、Agilent Zorbax SB-Aq C18(5μm，250mm×4.6mm)、Shiseido PAK C18(5μm，250mm×4.6mm)、KQ-400KOE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试剂
乙腈(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、甲醇(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、磷酸(广州化学试剂厂)、甲酸(广州化学试剂厂)、乙酸(广州化学试剂厂)、冰醋酸(广州化学试剂厂)、甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)、重蒸水(自制)。
1.3材料
1.3.1样品：所有红景天破壁饮片均有中山市中智中药饮片有限公司提供。
1.3.2对照品：红景天苷(购自中国食品药品检定研究院，110818-201507)、酪醇(购自中国食品药品检定研究院，111676-200602)、没食子酸(没食子酸，110831-201605)
实施例1 指纹图谱方法构建
(一)对提取条件(提取溶剂、提取浓度、提取时间、提取方式、料液比)进行考察，选用的色谱条件如下：
色谱柱：资生堂CAP Cell色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-35min-55min-80min-85min-95min，乙腈变化8％-20％-27％-27％-8％-8％；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：275nm；
样品进样量20μL；
对照品进样量5μL。
1.提取溶剂的考察
红景天中的主要活性成分为苯乙醇类(红景天、酪醇)、黄酮及黄酮苷类、有机酸(没食子酸、咖啡酸)等较大极性化合物，在甲醇或乙醇中溶解度好，故本项目考察乙醇和甲醇2种溶剂对红景天破壁饮片提取效率的影响。
样品处理：取红景天破壁饮片0.5g，精密称定4份，置具塞锥形瓶中，其中两份加入70％乙醇50mL，另外两份加入70％甲醇50mL，称定重量，浸润30min，超声提取40min，取出后放冷，用提取溶剂补重，粗滤，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品。
采用上述固定的色谱条件，分析上述4份样品，比较不同溶剂提取差异。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且红景天苷、酪醇、没食子酸等含量高为选择标准，筛选出最佳提取溶剂。结果见图1及表1。
表1 红景天供试品制备提取溶剂考察数据(275nm)
由上述结果可见，70％甲醇提取的色谱图与70％乙醇提取的色谱图无异，主峰种类基本一致，相似度达到0.9，但70％甲醇提取的红景天苷的含量显著性高于70％乙醇提取，酪醇、没食子酸含量也高于70％乙醇提取，因此选择提取溶剂为甲醇。
2.甲醇提取浓度的考察
分别考察50％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、甲醇4种不同浓度甲醇溶液对红景天破壁饮片样品化学成分提取的影响。
样品处理：取红景天破壁饮片0.5g，精密称定8份，置具塞锥形瓶中，1和2号加入50mL50％甲醇，3和4号加入50mL75％甲醇，5和6号加入50mL80％甲醇，7和8号加入50mL甲醇，称定重量，浸润30min，超声提取40min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品。
采用上述固定的色谱条件，分析上述8份样品，比较不同溶剂提取差异。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且以红景天苷、酪醇、没食子酸含量高为选择标准，筛选出最佳提取溶剂。结果见图2及表2。
表2 红景天供试品制备甲醇提取浓度考察数据(275nm)
由以上结果可见50％～70％甲醇出峰数目多，提取效率较高，为较佳提取浓度；且70％甲醇更易过滤，操作简便，为最佳条件；而甲醇(即质量分数为100％)作为溶剂，提取效率相对较低，成本较高。
3.提取方式的考察
取红景天破壁饮片0.5g，精密称定4份，分别采用以下2种方法提取样品：①超声提取：其中两份放置于具塞锥形瓶中，加入50mL70％甲醇，称定重量，浸润30min，超声提取60min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤备用。②水浴加热回流提取：另外两份样品放置于圆底烧瓶中，加入70％甲醇50mL，称量重量，浸润30min，80℃水浴加热回流1h，取出，冷却后补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过滤备用。
采用上述固定的色谱条件，分析上述4份样品，比较不同提取方法的提取效果。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且红景天苷、酪醇、没食子酸等含量高为选择标准，筛选提取方式。结果如图3，表3所示：
表3 红景天供试品制备提取方式考察数据(275nm)
由上述结果可见，超声提取及回流提取差异不大，且二者的平均谱图相似度也达到0.9以上，从操作上来讲，超声提取相对简单易行，为最佳条件。
4.提取时间
考察超声提取45min、60min、90min对红景天破壁饮片提取效率的影响。
样品制备：取红景天破壁饮片0.5g，精密称定6份，置具塞锥形瓶中，分别加入50mL70％甲醇，称定重量，浸润30min，1和2号超声提取45min，3和4号超声提取60min，5和6号超声提取90min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤备用。
采用上述固定的色谱条件，分析上述6份样品，比较提取时间对红景天破壁饮片提取效率的差异。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且红景天苷、酪醇、没食子酸含量高为选择标准，筛选出样品提取时间，结果如图4、表4所示：
表4 红景天供试品制备超声提取时间考察数据(275nm)
由上述结果可见，超声时间对于提取的效果影响不明显，以上3组方案的平均谱图的相似度在0.9以上，3种提取时间的红景天苷、酪醇、没食子酸含量无显著性差异，但从节约资源和时间成本的角度出发，超声45min以上(45～60min)为较佳条件，超声45min为供试品制备的提取最佳时间，足以将成分提取完全。
5.提取样品料液比的考察
分别考察0.25g:25mL(破壁饮片质量:提取溶剂的体积)、0.25g:50mL、0.5g:25mL、0.5g:50mL四组不同液料比对提取效果的影响。
样品制备：取红景天破壁饮片0.25g、0.5g，各精密称定4份，置具塞锥形瓶中，1和2号加入70％甲醇25mL，3和4号加入70％甲醇50mL，5和6号加入70％甲醇25mL，7和8号加入70％甲醇50mL称定重量，浸润30min，超声提取45min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤备用。
采用上述固定的色谱条件，分析上述8份样品，比较料液比对红景天破壁饮片提取效率的差异，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且红景天苷、酪醇、没食子酸含量高为选择标准，筛选出供试品制备的料液比，结果如图5、表5所示。
表5 红景天供试品制备超声提取时间考察数据(275nm)
由上述结果可见，四组料液比的平均谱图的相似度在0.8以上，提取效果的差异不明显，从节约物料及提取溶剂的角度出发，最终选择0.25g:25mL(即10mg:1mL)为最佳料液比。
(二)对色谱条件(流动相种类、洗脱梯度、流速及色谱柱柱温)进行考察
供试品溶液的制备：取红景天破壁饮片0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，称定重量，浸润30min，超声提取45min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
1.流动相考察：
流动相条件如下：
(S1)甲醇-0.1％磷酸水溶液；
(S2)甲醇-0.1％的甲酸水溶液；
(S3)甲醇-0.1％醋酸(36％乙酸)水溶液；
(S4)甲醇-0.1％冰醋酸水溶液；
(S5)乙腈-0.1％的磷酸水溶液；
(S6)乙腈-0.1％甲酸水溶液；
(S7)乙腈-0.1％醋酸(36％乙酸)水溶液；
(S8)乙腈-0.1％冰醋酸水溶液。
其它色谱条件如下：资生堂CAP Cell色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；梯度洗脱：梯度洗脱：时间0→30min→55min→70min→95min，乙腈变化5％→12％→18％→21％→28％；柱温25℃；检测波长275nm；样品进样量20μL。按以上色谱条件分析供试品溶液，比较不同洗脱系统对红景天破壁饮片的分离效果，以样品谱图的、峰分布均匀、基线平稳，结果如图6所示。
结果表明，采用流动相(S6)(乙腈-0.1％甲酸水溶液)得到的谱图的峰分布均匀，基线较平稳，故最终确定流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液。
2.洗脱梯度考察
色谱条件：资生堂CAP Cell色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流速1.0mL/min；柱温25℃；检测波长275nm；样品进样量20μL；对照品进样量5μL，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B，按表5所示梯度洗脱，记录色谱图。按以上色谱条件分析供试品溶液，比较不同洗脱梯度(如表6)对红景天破壁饮片分离效果的差异，以样品谱图出峰数目、峰分布均匀，且红景天苷、酪醇、没食子酸能基本分开为选择标准，结果如图7所示。
表6 流动相洗脱梯度表
色谱图如图7所示，结合分离效果及洗脱时间，最终选择梯度13～14，梯度14为最佳条件。
3.流速的考察
考察0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min流速时的样品分析效果，以达到进一步的分离效果，选择最合适的流速。
色谱条件：资生堂CAP Cell色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱条件为：0→25min→45min→70min：流动相A：5％→15％→23％→28％。；流速分别为0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min；柱温25℃；检测波长275nm；样品进样量20μL；对照品进样量5μL。
采用以上色谱条件分析供试品溶液，考察流速对红景天破壁饮片分离效果的影响，结果如图8所示。
结果：分析以上色谱图，当流动相的流速为0.6～0.8mL/min时，没食子酸、红景天苷、酪醇出峰时间适中，能基本分离，0.6mL/min为最佳流速。
4.色谱柱柱温考察
考察25℃、30℃柱温对样品的分离效果，以期通过微调进一步提高峰分离度，选择最合适的柱温。
色谱条件：资生堂CAP Cell色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱条件为：0→25min→45min→70min：流动相A：5％→15％→23％→28％。；流速为0.6mL/min；柱温分别为25℃、30℃；检测波长为275nm；样品进样量20μL；对照品进样量5μL。分析上述样品，考察流速对红景天破壁饮片分离效果的影响，以样品谱图出峰时间适中，峰、分布均匀且红景天苷、酪醇、没食子酸基本分开为选择标准。
从图9的结果可知：25～30℃注温条件下各主要色谱峰的分离度均较好，结合实验条件及实际环境，30℃为最佳的色谱柱温。
实施例2 方法学验证
采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行色谱相似度评价。
供试品溶液制备：
取红景天破壁饮片0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，称定重量，浸润30min，超声提取45min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
色谱条件：
色谱柱：资生堂CAP Cell色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱：0→30min→55min→70min→95min：流动相A：5％→12％→18％→21％→28％；流速：0.6mL/min；柱温25℃；检测波长：275nm；样品进样量：20μL；对照品进样量：5μL。
(1)专属性考察
取批号为20160405的红景天破壁饮片，按上述方法制备供试品溶液及空白供试品溶液，进样，记录色谱图，如图10所示。结果显示溶剂在色谱条件下基本无吸收，对供试品的色谱图影响较小。表明上述方法专属性好。
(2)仪器精密度
取批号为20160405的红景天破壁饮片，按上述提供的方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图(见图11)。采用“中智药业集团中药指纹图谱数据库”软件对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表7，相似度均达0.99以上，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3％，考察结果表明仪器精密度符合要求。
表7 仪器精密度考察色谱图的相似度
| 谱图 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 1 | 0.998 | 0.998 | 0.998 | 0.998 | 0.996 | 0.996 |
| 2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.998 | 0.997 |
| 3 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.998 | 0.998 |
| 4 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.998 | 0.998 |
| 5 | 0.998 | 0.998 | 0.998 | 0.998 | 1.000 | 1.000 |
| 6 | 0.997 | 0.998 | 0.998 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
(3)重复性试验
取批号为20160405的红景天破壁饮片，按实施例1提供的方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图(见图12)。采用“中智药业集团中药指纹图谱数据库”软件对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表8，相似度均达0.99以上，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于5％，考察结果表明方法的重复性符合要求。
表8 重复性考察色谱图的相似度
| 谱图 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 1 | 1.000 | 1.000 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 1.000 |
| 2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 3 | 0.999 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 4 | 0.999 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 5 | 0.999 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 6 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
(4)稳定性试验
测定供试品溶液的稳定性试验。取批号为20160405的红景天破壁饮片，按实施例1提供的方法制备供试品溶液，，在0、2、4、8、12、24h分别进样，记录色谱图(见图13)。采用“中智药业集团中药指纹图谱数据库”软件对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表9，相似度均达0.99以上，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于5％考察结果表明方法的稳定性(耐用性)符合要求。
表9 稳定性考察图谱的相似度
| 谱图 | 0h | 2h | 4h | 8h | 12h | 24h |
| 0h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.999 | 0.998 | 0.997 |
| 2h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.997 | 0.996 | 0.997 |
| 4h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.998 | 0.997 | 0.997 |
| 8h | 0.999 | 0.997 | 0.998 | 1.000 | 0.999 | 0.997 |
| 12h | 0.998 | 0.996 | 0.997 | 0.999 | 1.000 | 0.997 |
| 24h | 0.997 | 0.997 | 0.997 | 0.997 | 0.997 | 1.000 |
实施例3 指纹图谱共有模式的建立
1、首先利用上述实施例1中各最佳条件组合得到的指纹图谱的构建方法对不少于10批次的红景天破壁饮片进行测定，得指纹图谱；然后将所得指纹图谱导入指纹图谱分析软件，生成指纹图谱共有模式，即得红景天破壁饮片的标准指纹图谱；具体方法如下：
(1)参照峰的指认
按上述提供的方法测定对照品溶液，记录色谱图，并将其与红景天破壁饮片指纹图谱进行比较，分析相对应峰的保留时间与紫外吸收情况，指认出：1号参照峰为没食子酸，2号参照峰为红景天苷，4号参照峰为酪醇(见图14)。
(2)标准指纹图谱的建立及共有峰的确认
取10批次的红景天破壁饮片，按上述提供的方法制备供试品溶液，按色谱条件测定10批供试品溶液，记录色谱图。采用“中智药业集团中药指纹图谱数据库”软件对所得10张图谱进行分析，生成对照指纹图谱，确定了18个色谱峰为红景天破壁饮片共有指纹峰，见图15和16，10批样品的相似度均在0.9以上，结果见表10。其中，1号峰高度适中，分离度好，保留时间适中，可作为参照峰。其余17个共有色谱峰与参照峰的平均相对保留时间分别为：1.81、1.86、2.15、2.78、3.01、3.10、3.20、3.64、3.77、3.86、3.98、4.05、4.22、4.28、5.11、5.30、5.58，见表11。
表10 10批红景天破壁饮片指纹图谱的相似度
表11红景天破壁饮片指纹图谱共有峰的相对保留时间
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种红景天破壁饮片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：以质量分数为50%~70%的甲醇溶液为溶剂，提取红景天破壁饮片，得供试品溶液；
S2：运用HPLC技术，以对照品为对照对所述供试品溶液进行图谱构建，即得所述红景天破壁饮片HPLC指纹图谱；
其中，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液；
梯度洗脱条件为：0→25min→45min→60min：流动相A：5%→18%→23%→28%，
或梯度洗脱条件为：0→25min→45min→70min：流动相A：5%→15%→23%→28%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中提取的方式为超声或回流提取。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中提取的时间45min~60min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中红景天破壁饮片与溶剂的料液比：5~20mg:1mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中红景天破壁饮片与溶剂的料液比：10mg:1mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中对照品为红景天苷、酪醇和没食子酸一种或几种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所用色谱柱为资生堂CAP Cell色谱柱；所述色谱柱的注温为25~30℃。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.6 ml/min~0.8 ml/min；S2中进样体积为20 μL；S2中检测波长为275nm。
9.一种红景天破壁饮片的质量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：利用权利要求1~7任一所述指纹图谱的构建方法对不少于10批次的红景天破壁饮片进行测定，得指纹图谱；
S2：将S1所得指纹图谱导入指纹图谱分析软件，生成指纹图谱共有模式即得红景天破壁饮片的标准指纹图谱；
S3：利用标准指纹图谱对待测红景天破壁饮片的质量进行检测。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于， S3是将待测红景天破壁饮片利用S1的方法构建指纹图谱，然后与S2的标准指纹图谱进行对比分析。
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