CN113030360A - 一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法及应用 - Google Patents
一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法及应用，包括以下步骤：S1样品预处理：将样品加入提取液和内标液，涡旋混匀后加入钢珠，研磨、超声后离心，取上清液A，氮气吹干后，进行甲酯化反应，涡旋混匀后静置，氮气吹干，加入复溶液，离心，所得上清液B为待检测样品；S2样品检测：设置气相色谱和质谱的检测条件，进行样品的检测。本发明公开的一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法适合食品中游离脂肪酸的检测，尤其适合肉制品中游离脂肪酸的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学检测分析领域，具体涉及一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法及应用。
背景技术
游离脂肪酸(FFA)是指非酯化的脂肪酸，血中的游离脂肪酸要是脂肪代谢的中间产物，是机体细胞能量代谢的重要代谢底物，过高的游离脂肪酸与代谢综合征、动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、心力衰竭等疾病的发生发展相关。
食品中的游离脂肪酸主要产生于加工或储存的过程中，由磷脂和中性脂肪在中性脂肪酶和酸性脂肪酶的作用下水解形成，对食品的风味的形成有直接的作用。但是食品中的游离脂肪酸时间过长会发生变质，产生对人体有害的物质，因此检测食品中游离脂肪酸的含量既可以检测食品的风味也可以检测食品是否变质。因此建立检测准确度和灵敏度高的检测方法非常必要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法，包括以下步骤：
S1样品预处理：将样品加入提取液和内标液，涡旋混匀后加入钢珠，研磨、超声后离心，取上清液A，氮气吹干后，进行甲酯化反应，涡旋混匀后静置，氮气吹干，加入复溶液，离心，所得上清液B为待检测样品。
S2样品检测：设置气相色谱和质谱的检测条件，进行样品的检测。
进一步地，所述步骤S1的提取液为异丙醇、正己烷、甲醇、三氯甲烷中的一种或多种。
进一步地，所述步骤S1的内标液的浓度为1-10mg/L。
进一步地，所述步骤S1的甲酯化反应的反应温度为15-35℃。
进一步地，所述步骤S1的甲酯化反应的反应时间为10-30min。
进一步地，所述步骤S1的复溶液为异丙醇、正己烷、甲醇、乙醚中的一种或多种。
进一步地，所述步骤S2的气相色谱的进样方式为分流模式。
进一步地，所述步骤S2的质谱的离子检测采用负离子检测。
本发明的第二个方面提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法在食品中的应用。
进一步地，所述游离脂肪酸高通量靶标检测方法在肉制品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明选用甲醇和三甲基硅烷基重氮甲烷作为样品预处理过程中甲酯化反应剂，反应条件温和、反应过程中不对样品中的有机官能团产生影响，副产物生成少，经过预处理后的样品在本发明特殊的气相色谱和质谱的设置条件下，能有明显的、分离度高的特征峰，同时本发明的检测方法稳定度好、准确度高、精确度好，能检测多种游离脂肪酸，适用于肉制品中游离脂肪酸的检测，尤其适用于香肠中游离脂肪酸的检测。
附图说明
1.图1为标准品GC-MS SIM离子流图。
2.图2为样品K1-1按照实施例1检测得到的GC-MS SIM离子流图。
3.图3为样品K1-2按照实施例1检测得到的GC-MS SIM离子流图。
4.图4为样品K1-3按照实施例1检测得到的GC-MS SIM离子流图。
5.图5为样品S2-1按照实施例1检测得到的GC-MS SIM离子流图。
6.图6为样品S2-2按照实施例1检测得到的GC-MS SIM离子流图。
7.图7为样品S2-3按照实施例1检测得到的GC-MS SIM离子流图。
具体实施方式
为了解决上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法，包括以下步骤：
S1样品预处理：将样品加入提取液和内标液，涡旋混匀后加入钢珠，研磨、超声后离心，取上清液A，氮气吹干后，进行甲酯化反应，涡旋混匀后静置，氮气吹干，加入复溶液，离心，所得上清液B为待检测样品。
S2样品检测：设置气相色谱和质谱的检测条件，进行样品的检测。
进一步地，所述步骤S1的具体步骤为：
(1)将样品放置于EP管中，加入800-1000μL提取液和20-60μL内标液，涡旋10-20s后加入钢珠；
(2)研磨仪在35-50Hz下进行3-5min研磨处理，研磨后的样品在冰水浴中超声；
(3)样品在4℃、10000-12000rpm下离心15min，取上清液A于EP管中，氮气吹干；
(4)加入甲酯化反应剂，涡旋10-20s混匀，室温静置15-30min，氮气吹干；
(5)加入复溶液，在4℃、10000-12000rpm下离心15min，所得上清液B为待检测样品。
更进一步地，所述步骤S1的具体步骤为：
(1)将样品放置于EP管中，加入960μL提取液和40μL内标液，涡旋10s后加入钢珠；
(2)研磨仪在40Hz下进行4min研磨处理，研磨后的样品在冰水浴中超声5min；
(3)样品在4℃、12000rpm下离心15min，取400μL上清液A于EP管中，氮气吹干；
(4)加入甲酯化反应剂，涡旋10s混匀，室温静置15min，氮气吹干；
(5)加入160μL复溶液，在4℃、12000rpm下离心15min，所得上清液B为待检测样品。
进一步地，所述提取液为异丙醇、正己烷、甲醇、三氯甲烷中的一种或多种。
进一步地，所述提取液为异丙醇和正己烷的混合液体。
进一步地，所述异丙醇和正己烷的体积比为2：(1-5)。
进一步地，所述异丙醇和正己烷的体积比为2：3。
进一步地，所述内标液的浓度为1-10mg/L。
进一步地，所述内标液的浓度为1mg/L。
进一步地，所述内标液的内标物质为D35-氘代硬脂酸。
进一步地，所述内标液的制备方法如下：用正己烷将D35-氘代硬脂酸配置成浓度为20mg/L的内标中间液；使用时用正己烷稀释内标中间液至浓度为1mg/L。
进一步地，所述甲酯化反应剂为甲醇和三甲基硅烷基重氮甲烷的混合物。
进一步地，所述三甲基硅烷基重氮甲烷为物质的量浓度2moL/L的三甲基硅烷基重氮甲烷-己烷溶液。
进一步地，所述甲酯化反应加入的甲醇200μL，加入的三甲基硅烷基重氮甲烷100μL。
进一步地，所述甲酯化反应的反应温度为15-35℃。
进一步地，所述甲酯化反应的反应时间为10-30min。
进一步地，所述复溶液为异丙醇、正己烷、甲醇、乙醚中的一种或多种。
进一步地，所述复溶液为正己烷。
进一步地，所述步骤S2样品检测的步骤依次为：制备标准溶液、设置气相色谱和质谱的检测条件进行样品检测、分析检测结果。
进一步地，所述标准溶液的标准物质为FFA标准物质混标，购买于上海安谱实验科技股份有限公司，含有49种游离脂肪酸甲酯。
气相色谱的检测条件如下：
进一步地，所述气相色谱仪为Agilent 7890B。
进一步地，所述气相色谱仪选用的色谱柱为Agilent DB-FastFAME(90m×250μm×0.25μm)。
进一步地，所述色谱柱的柱压为46psi。
进一步地，所述的进样体积为1μm。
进一步地，所述的进样方式为分流模式，所述分流模式的分流比为5：1。
进一步地，所述的载气为氮气，流速为3ml/min。
进一步地，所述进样口温度为240℃，传输线温度为240℃。
进一步地，所述柱箱升温过程：初始温度50℃，保持1min，以50℃/min升至200℃，保持15min，以2℃/min升至210℃，保持1min，以10℃/min升至230℃，保温16.5min。
质谱的检测条件：
进一步地，所述的质谱仪型号为Agilent 5977B。
进一步地，所述的质谱仪采用负离子检测，电子能力为-70eV。
进一步地，所述离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃。
进一步地，所述扫描模式为全扫描模式或离子扫描模式。
进一步地，所述扫描范围为33-400。
进一步地，所述溶剂延迟7min。
本发明的第二个方面提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法在食品中的应用。
进一步地，所述游离脂肪酸高通量靶标检测方法在肉制品中的应用。
本申请通过采用特殊的样品预处理过程和特殊的气相色谱和质谱的检测条件，提高了游离脂肪酸检测的灵敏度和准确度，猜测是因为：样品预处理过程中甲酯化反应可以在温和的条件下进行，同时本申请中选取的甲酯化反应试剂对大多数有机官能团不产生影响，不生产影响游离脂肪酸检测的物质，并结合特殊的气相色谱和质谱的检测条件，提高了各种脂肪酸甲酯的分离效果，提高了游离脂肪酸检测的灵敏度和准确度。申请人意外发现，本申请尤其适合检测香肠中的游离脂肪酸含量。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售得到的。
其中：
正己烷选用色谱纯，CAS号：110-54-3。
异丙醇选用色谱纯，CAS号：67-63-0。
甲醇选用色谱纯，CAS号：67-56-1。
三甲基硅烷基重氮甲烷选用色谱纯，CAS号：18107-18-1。
D35-氘代硬脂酸选用色谱纯，纯度为98％，CAS号：17660-51-4。
实施例1
本发明提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法，步骤如下：
S1样品预处理：
(1)将50mg样品放置于EP管中，加入960μL提取液，提取液为异丙醇和正己烷的混合溶液，其中异丙醇和正己烷的体积比为2：3，加入40μL内标液，内标液为D35-氘代硬脂酸浓度为1mg/L的D35-氘代硬脂酸-正己烷溶液，涡旋10s，加入钢珠；
(2)样品在40Hz下进行4min研磨处理，研磨后的样品在冰水浴中超声5min；
(3)超声后的样品在4℃、12000rpm下离心15min，取400μL上清液于EP管中，氮气吹干；
(4)加入甲酯化反应剂，甲酯化反应剂为甲醇200μL和三甲基硅烷基重氮甲烷100μL，其中三甲基硅烷基重氮甲烷为物质的量浓度2moL/L的三甲基硅烷基重氮甲烷-己烷溶液，涡旋10s混匀，室温静置15min，氮气吹干；
(5)加入160μL正己烷，在4℃、12000rpm下离心15min，所得上清液为待检测样品。
S2样品检测：
I、制备标准溶液：
将FFA标准物质混标用正己烷进行梯度稀释，梯度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L，制得的标准溶液4℃冷藏保存。II、设置气相色谱的检测条件：
(1)气相色谱仪为Agilent 7890B；
(2)色谱柱为Agilent DB-FastFAME(90m×250μm×0.25μm)；
(3)色谱柱的柱压为46psi；
(4)进样体积为1μm；
(5)进样方式为分流模式，分流比为5：1；
(6)载气为氮气，流速为3ml/min；
(7)进样口温度为240℃，传输线温度为240℃；
(8)柱箱升温过程：初始温度50℃，保持1min，以50℃/min升至200℃，保持15min，以2℃/min升至210℃，保持1min，以10℃/min升至230℃，保温16.5min。
III、设置质谱的检测条件：
(1)质谱仪型号为Agilent 5977B；
(2)质谱仪采用负离子检测，电子能力为-70eV；
(3)离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃；
(4)扫描模式为全扫描模式或离子扫描模式，扫描范围为33-400；
(5)溶剂延迟7min。
IV、分析检测结果：
(1)吸取一定量的标准溶液，在上述气相色谱和质谱的条件下，进行标准曲线绘制；
(2)吸取一定量的待检测样品，在上述气相色谱和质谱条件下，进行样品检测；
(3)定量结果计算，计算公式：C(con)＝(Cs*V1*V2)/(M*V3)；
式中：C(con)：样本中游离脂肪酸的含量，μg/g；
Cs：复溶液游离脂肪酸酯的浓度，mg/L；
V1：复溶液体积，mL；
V2：加入提取液的体积，mL；
V3：取出提取液的体积比值；
M：称重体积，mg。
本发明还提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法在食品中的应用。
对比例1
本发明提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法，还提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法在食品中的应用，具体实施方式同实施例1，不同之处在于样品预处理中的甲醇和三甲基硅烷基重氮甲烷替换成50％甲醇水溶液和20％三甲基硅烷基重氮甲烷水溶液。
对比例2
本发明提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法，还提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法在食品中的应用，具体实施方式同实施例1，不同之处在于样品预处理中的甲醇和三甲基硅烷基重氮甲烷替换成甲醇-三氟化硼溶液。
对比例3
本发明提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法，还提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法在食品中的应用，具体实施方式同实施例1，不同之处在于柱箱升温过程：初始温度50℃，保持1min，以50℃/min升至200℃，保持15min，以5℃/min升至250℃，保持10min，以10℃/min升至300℃，保温5min。
对比例4
本发明提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法，还提供了一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法在食品中的应用，具体实施方式同实施例1，不同之处在于柱箱升温过程：初始温度80℃，保持1min，以50℃/min升至200℃，保持10min，以10℃/min升至230℃，保持16.5min，以5℃/min升至280℃，保温3min。
性能测试
对实施例和对比例的检测方法，进行游离脂肪酸平均回收率、相对标准偏差(RSD)的测试，表1为实施例1的平均回收率和相对标准偏差。
表1
表1的数据表明，采用实施例1所述的检测方法检测香肠中的游离脂肪酸，准确度和精密度均良好。
对比例1和对比例2由于改变了样品预处理过程中甲酯化反应条件，最终导致游离脂肪酸甲酯化程度较差，与标准品的SIM离子流图比较，游离脂肪酸甲酯的峰型有部分缺失。
对比例3和对比例4由于改变了气相色谱的设置参数，最终导致部分游离脂肪酸甲酯的峰型重合，与标准品的SIM离子流图比较，游离脂肪酸甲酯的峰型有部分缺失。
Claims (10)
1.一种游离脂肪酸高通量靶标检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1样品预处理：将样品加入提取液和内标液，涡旋混匀后加入钢珠，研磨、超声后离心，取上清液A，氮气吹干后，进行甲酯化反应，涡旋混匀后静置，氮气吹干，加入复溶液，离心，所得上清液B为待检测样品；
S2样品检测：设置气相色谱和质谱的检测条件，进行样品的检测。
2.根据权利要求1所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法，其特征在于，所述步骤S1的提取液为异丙醇、正己烷、甲醇、三氯甲烷中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法，其特征在于，所述步骤S1的内标液的浓度为1-10mg/L。
4.根据权利要求1所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法，其特征在于，所述步骤S1的甲酯化反应的反应温度为15-35℃。
5.根据权利要求1所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法，其特征在于，所述步骤S1的甲酯化反应的反应时间为10-30min。
6.根据权利要求1所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法，其特征在于，所述步骤S1的复溶液为异丙醇、正己烷、甲醇、乙醚中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法，其特征在于，所述步骤S2的气相色谱的进样方式为分流模式。
8.根据权利要求1所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法，其特征在于，所述步骤S2的质谱的离子检测采用负离子检测。
9.一种根据权利要求1-8任一项所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法的应用，其特征在于，所述游离脂肪酸高通量靶标检测方法应用于食品中游离脂肪酸的检测。
10.根据权利要求9所述的游离脂肪酸高通量靶标检测方法的应用，其特征在于，所述游离脂肪酸高通量靶标检测方法应用于肉制品中游离脂肪酸的检测。
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