CN101415822A - 来自细菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶 - Google Patents

Abstract

本发明一般地涉及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，其是聚酮化合物合酶复合物的活化所需的，以合成长链多不饱和脂肪酸(LC－PUFA)，例如，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。特别是，本发明涉及细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、用于它们在宿主细胞中的表达的DNA构建体，以及当所述宿主细胞包含于植物中时涉及种子、油和粗粉。还提供的是生产含有二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸的植物油的方法。

Description

来自细菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶

发明背景

本申请要求2006年1月31日提交的美国临时专利申请60/763,644、2007年1月29日提交的美国专利申请NO.11/668,354的优先权，它们的公开内容通过完全引用合并在此。

发明领域

本发明一般地涉及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶涉及聚酮化合物合酶的活化来合成长链多不饱和脂肪酸(例如，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。

相关技术的说明

在大多数有机体中脂肪酸生物合成的主要产物是16-和18-碳化合物。这些脂肪酸的链长度和不饱和度的相对比例在物种之中广泛地变化。例如，哺乳动物主要产生饱和的和单不饱和脂肪酸，而大多数高等植物生产具有一个、两个或三个双键的脂肪酸，后两者包含多不饱和脂肪酸(PUFA)。已经报道了非常长链的PUFA，例如二十二碳六烯酸(DHA，22:6)二十碳五烯酸(EPA，20:5)来自几个物种的海洋细菌，包括Moritella(Vibrio)marina和Shewanella sp.(美国专利6,140,486)，以及来自海藻例如Schizochytrium sp.和Thraustochytrium sp.(美国专利公开20040235127)。

两种主要的PUFA家族是ω-3脂肪酸(也称为“n-3”脂肪酸)，例子是二十二碳六烯酸，以及ω-6脂肪酸(也称为“n-6”脂肪酸)，例子是花生四烯酸(ARA，20:4)。PUFA是细胞的质膜和脂肪组织的主要成分，在其中它们可以分别以磷脂和甘油三酯存在。PUFA是哺乳动物中适当的发育所必需的，特别是在婴儿脑部的发育中，以及对于组织形成和修复是必需的。

几种失调响应于PUFA的治疗。补充PUFA已经显示了降低血管成形术后再狭窄的几率。还已经很好地记载了某些膳食的ω-3脂肪酸对于心血管疾病和类风湿性关节炎的健康效益(Simopoulos，1997；James et al.，2000)。进一步的，PUFA已经被暗示用于治疗哮喘和银屑病。证据表明，PUFA可能涉及钙代谢，表明PUFA可能在骨质疏松症的治疗或预防以及肾脏或泌尿道结石的治疗或预防中是有用的。

对于健康效益的大部分证据适用于长链ω-3脂肪、EPA和DHA，其存在于鱼类和鱼油中。在这种证据的基础上，加拿大(ScientificReview Committee，1990，Nutrition Recommendations，Minister ofNational Health and Welfare，Canada，Ottowa)、欧洲(de Deckerer et al.，1998)、英国(The British Nutrition Foundation，1992，Unsaturatedfatty-acids-nutritional and physiological significance：The report of theBritish Nutrition Foundation′s Task Force，Chapman and Hall，London)和美国(Simopoulos et al.，1999)的健康专家和营养学家建议提高这些PUFA的膳食消耗。

重要的主要的长链PUFA包括DHA和EPA，其主要在不同类型的鱼油中存在，以及ARA，其在丝状真菌例如Mortierella(被孢霉属)中发现。对于DHA，存在着大规模生产的许多来源，包括多种海洋生物、从冷水海洋鱼类获得的油、以及蛋黄级分。然而，存在着与从天然来源大规模生产PUFA相关的几个缺点。PUFA的天然来源，例如动物和真菌，倾向于具有高度异质性的油成分。因而从这些来源获得的油可能需要广泛的纯化来分离出一种或多种期望的PUFA，或来产生富集了一种或多种PUFA的油。

PUFA的天然来源还在可用性方面受到不受控制变动的支配。鱼类资源可能经历天然的变异或可能由于过量捕捞而耗尽。此外，即时有着它们的治疗效益的压倒性证据，关于ω-3脂肪酸的膳食建议没有被注意。鱼油剂具有令人不快的味道和气味，这不可能从期望的产物中经济地分离出来，使得这种产物作为食品添加剂是无法接受的。动物油，特别是鱼油，可能积累环境污染物。食物可以富含鱼油，但是，这种富含由于成本以及在世界范围内鱼类资源的衰减是成问题的。这个问题对于全鱼的消费和摄食也是障碍。尽管如此，如果提高鱼类摄食的健康信息被社会接受，在满足对鱼类的需求方面可能有问题。此外，这种工业的稳定性是成问题的，其严重地依赖水产业饲养的野生鱼类资源(Naylor et al.，2000)。

其他的自然局限性促成了生产ω-3脂肪酸的新方法。天气和疾病可能引起鱼类产量的变动。有机体例如Mortierella的大规模发酵是昂贵的。天然的动物组织含有很低数量的ARA，并且难以被加工。微生物例如Porphyridium(紫球藻属)和Mortierella难以在工业规模上培养。

许多海洋微生物通过聚酮化合物合酶(PKS)机制产生非常长链的PUFA，例如DHA和EPA。PKS是由多功能的多肽组成的酶复合物，所述多肽以反复的方式催化复杂分子从单体底物的合成。PKS是本领域公知的，这种序列的许多实例可以在文献中找到。在Moritella marina中，PKS从丙二酰基-CoA和乙酰-CoA合成DHA。为了活化这种PKS，需要磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Ppt)通过辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺基部分对保守的丝氨酸残基的共价附着来催化载体蛋白的翻译后活化、脂肪酸合成、聚酮化合物合成、以及非核糖体多肽合成，一种包括脂肪酸、聚酮化合物和非核糖体肽的天然产物的生物合成所需的反应。Ppt以及根据它们的载体蛋白特异性被分类。在含有多种需磷酸泛酰巯基乙胺基途径的有机体中，以及表明了每个途径尤其自己的Ppt。虽然已经克隆了M.marina PKS(美国专利NO.6,140,486(Facciottiet al.))，没有发现Ptp。Allen和Bartlett(2002)声称，他们未能从Moritella克隆Ppt基因。

已经尝试了许多方法在植物中生产DHA和EPA(WO05103253A1(Singh et al.)，WO04071467A2(Kinney et al.))。这些方法通常以分步的方式使用脱饱和酶/延伸酶。这种方法具有使用6-8个基因和引起中间体的积累的缺点，中间体的积累是潜在地不希望的结果。使用PKS/Ppt方法，需要的转基因的数量将更少(4-5个)，不预期中间体的积累。

因此，有益的是获得涉及长链PUFA生物合成的遗传物质，以及在植物系统中，特别是地基的陆地作物植物系统中表达所分离的材料，所述植物系统可以被操作来提供商业数量的一种或多种PUFA的生产。还需要的是提高人类和动物中ω-3脂肪酸的摄取。因而，存在着需要来提高大范围的Ω3-强化营养食品和食品添加剂，从而受试者可以选择适合于他们的一般饮食习惯的饲料、饲料成分、食物、食物成分。特别有益的将是具有提高的DNA或EPA的种子油。

当前仅有一种ω-3脂肪酸ALA可以在植物油中获得。然而，存在着摄食的AL向更长链的ω-3脂肪酸例如EPA和DHA的不良转化。这已经在共同待决美国公开NO.20040039058“抑制性失调的治疗和预防”中展现了，通过使用亚麻籽油从社区平均值1g/天提高到14g/天的ALA摄取仅仅少量地提高了血浆磷脂EPA水平。ALA摄取中的14倍增加引起了血浆磷脂EPA中的2倍增加(Manzioris et al.，1994)。因而，为此，需要有效的和商业上可用的利用聚酮化合物合成复合物和活化该复合物的Ppt的PUFA生产、编码Ppt的基因、以及产生它们的重组方法。对于含有更高相对比例的DHA或EPA、含有它们的食物成分和添加剂，也存在着需求。对于生产特定的PUFA的可靠的和经济的方法，也存在着需求。来自表达细菌PKS复合物的、含油种子作物例如油菜、大豆、玉米、葵花或亚麻的油，在长链PUFA、DHA或EPA方面是富集的。可以利用这种油来生产富集ω-3脂肪酸的食物和食品增补剂，这种食物的消费有效地提高EPA和DHA的组织水平。全部用ω-3富集的油生产或制备的食物和食品，例如牛奶、人造黄油和香肠，将产生治疗效益。因而，对于能够活化PKS、用于具有PUFA富集的油的转基因作物植物中的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的新核酸，以及从此产生的改进的油，存在着强烈的需求。

发明概述

在一个方面，本发明提供了编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的分离的核酸。这些可以用于转化细胞或修饰植物的脂肪酸组成或植物产生的油。本发明的一个实施方式是选自以下构成的组的分离的多核苷酸序列：(a)在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的条件下，与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8杂交的多核苷酸；(b)编码SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列的多核苷酸；和(c)编码与SEQID NO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸。在本发明的某些进一步的实施方式中，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列具有至少80％、85％或90％的序列同一性、包括与这些序列的至少约82％、87％、89％、92％、95％、98％和99％的同一性的多肽。技术人员将认识到，由于这些序列是相关的，给定的序列可能同时地与这些多肽序列的超过一种享有90％或更高的同源性。在进一步的实施方式中，所编码的多肽具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性。

在又一个方面，本发明提供了DNA构建体，其包含与编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的DNA分子可操作连接的异源启动子，其中所述DNA分子选自以下构成的组：(a)编码SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列的多核苷酸；(b)在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的条件系，与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8杂交的多核苷酸；以及(c)编码与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸。在其他实施方式中，所述启动子是在原核细胞或真核细胞中有功能的。在某些实施方式中，在其中启动子有功能的真核细胞是植物细胞。在进一步的实施方式中，所述启动子是种子增强的启动子。

在再又一个方面，本发明提供了用本发明提供的DNA构建体转化的宿主细胞，所述DNA构建体包含与编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的DNA分子可操作连接的异源启动子。在另一个实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与DNA分子可操作连接的异源启动子，所述DNA分子编码包含磷酸泛酰巯基乙胺附着位点的聚酮化合物(polyketide)合成酶多肽。在进一步的实施方式中，所述编码包含磷酸泛酰巯基乙胺附着位点的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子来自于Moritella marina。在又一个实施方式中，所述DNA分子编码与SEQ IDNO：19具有至少70％的序列同一性的聚酮化合物合酶多肽，或在此以下描述的任何已知的聚酮化合物合酶。所述宿主细胞可以是植物、真菌或细菌细胞。

在再又一个方面，本发明提供了由用在此提供的DNA构建体转化的宿主细胞组成的植物和它的子代，所述DNA构建体包含与编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的DNA分子可操作连接的异源启动子。这种植物可以被定义为相对于缺乏所述DNA构建体的相同基因型的植物包含改变的脂肪酸新陈代谢。在一个实施方式中，所述植物选择由油菜(canola)、Brassica campestris、含油种子油菜(oilseedrape)、油菜籽(rapeseed)、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、稻米、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿和高粱构成的组。本发明还提供了从所述植物产生的种子、油和粗粉，其被定义为包含可检测的本发明提供的DNA分子或多肽。另外，本发明提供了动物饲料和人类食品成份。

在再又一个方面，本发明提供了制造含有二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸的植物油的方法，包括步骤(a)生长包含本发明的宿主细胞、进一步包含聚酮化合物合酶的植物；(b)产生种子；(c)以及加工所述种子来获得油。

附图的简要说明

以下附图形成了本说明书的部分，被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合在此呈现的特定实施方式的详细说明，可以更好地理解本发明。

附图1显示了载体pMON68081的图。

附图2显示了载体pMON68080的图。

附图3显示了载体pMON94547的图。

附图4显示了载体pMON94544的图。

附图5显示了载体pMON94534的图。

附图6显示了载体pMON68084的图。

附图7显示了载体pMON68085的图。

附图8显示了载体pMON97063的图。

附图9显示了载体pMON94563的图。

附图10显示了载体pMON97066的图。

附图11显示了载体pMON96401的图。

附图12显示了载体pMON78528的图。

发明的详细说明

本发明通过提供用于创建具有改善的DHA和/或EPA含量的植物的方法和组合物克服了先有技术的局限性。有机体例如植物的脂肪酸含量的修饰呈现了许多益处，包括改善的营养和健康效益。脂肪酸含量的修饰可以用于实现在植物、植物部分和植物产物，包括植物种子油，以及细菌和真菌中有益水平的DHA和/或EPA。例如，当在植物的种子组织中产生DHA时，油可以从种子分离，一般地产生含油的DHA，其随后可以用于提供食品和其他产物中有益的特征。

本发明的各个方面包括用于修饰细胞的PUFA含量的方法和组合物，例如，修饰植物细胞的PUFA含量。与本发明相关的组合物包括新的分离的多核苷酸序列、DNA构建体以及由本发明的多核苷酸转化的植物和/或植物部分。宿主细胞可以被操作以表达编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多肽的多核苷酸，所述多肽催化另一个多肽的磷酸泛酰巯基乙胺附着位点的泛酰巯基乙胺化。

提供了以下定义作为对理解本发明的帮助。用语“DNA序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸片段”是指包含核苷酸的有序排列的物理结构。DNA片段、序列或核苷酸序列可以含有在大核苷酸分子、载体等等之内。此外，在这些序列中核酸的有序排列可以以序列表、附图、表格、电子媒体等等的形式描绘。

用语“编码序列”、“编码区”、“结构序列”和“结构核酸序列”是指其中核苷酸以各自形成密码子的一系列三联体排列的DNA序列、核酸序列、核酸分子的全部或片段。每个密码子编码特定的氨基酸。因而，编码序列、编码区、结构序列和结构核酸序列编码形成蛋白、多肽或肽序列的一系列氨基酸。编码序列、编码区、结构序列和结构核酸序列可以含有在大的核酸分子、载体等等之内。此外，在这些序列中核苷酸的有序排列可以以序列表、附图、表格、电子媒体等等的形式描绘。

术语“cDNA”是指互补于并来自mRNA的双链DNA。

“表达”是指一种过程，基因的编码信息通过它被转变为在细胞中存在并运作的结构。表达的基因包括被转录成RNA、然后被翻译成蛋白质的那些，以及被转录成RNA但不翻译成蛋白质的那些(例如，转运RNA和核糖体RNA)。

如在此使用的，“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指在自然中存在具有其自身的调节序列的基因。“嵌合基因”是指任何基因，其不是天然基因，包含在自然中不在一起存在的调节和编码序列。因而，嵌合基因可以包含来自不同来源的调节序列和编码序列，或来自相同来源但以不同于自然中存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在有机体的基因组中在其自然位置的天然基因。“外源基因”或“转基因”是指通过转化过程导入到基因组中的基因。转基因包括通过转化过程导入的基因组DNA(例如，与其活性启动子连接的基因组DNA)。

“异源”是指来自不同来源的两种或多种核酸或蛋白序列之间的关系。例如，如果这样的组合不是自然中通常存在的，启动子对于编码序列是异源的。此外，如果在特定的细胞或有机体中不会天然发生，特定的核酸序列对于它所插入的细胞或有机体可以是“异源的”。

“序列同源性”是指在两个或更多核酸或氨基酸序列之间就位置同一性的百分比而言的相似性水平。术语同源性还用于指出在不同的核酸或蛋白之间的相似功能性质的概念。

“杂交”是指当核酸链具有充分的序列互补性时核酸的第一链与第二链经由氢键碱基配对结合的能力。如在此使用的，如果核酸分子显示出完全的互补性，则称核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如此处使用的，当一个分子的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，称为分子显示出“完全的互补性”。因而，当它们的相互杂交具有足够的稳定性以允许它们在合适的条件下保持相互的退火时，称两条核酸链具有充分的互补性。

如在此使用的，术语“同源性”是指就核苷酸位置同一性百分比，即，序列相似性或同一性方面在多核苷酸序列之间的相似性水平或同一性百分比。如在此使用的，术语同源性还指在不同的多核苷酸分子之间的相似功能性质的概念。当在某些条件下它们特异性地杂交形成双链体分子，多核苷酸分子是同源的。在这些条件下，称为严格条件，一种多核苷酸分子可以用作探针或引物来鉴定享有同源性的其他多核苷酸分子。用语“严格条件”是对于通过特异性杂交操作，例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，3rd edition Volumes 1，2，and 3.J.F.Sambrook，D.W.Russell，and N.Irwin，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2000(Sambrook et al.)中所讨论的，核酸探针与目标核酸(即，与感兴趣的特定核酸序列)的杂交来功能上定义的。因而，本发明提供的核苷酸序列可以利用它们的能力来与多核苷酸分子片段的互补延伸选择性地形成双链分子。取决于预想的应用，人们将希望采用变动的杂交条件来实现探针对目标序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，人们一般希望采用相对高严格条件来形成杂交物，例如，人们将选择相对低的盐度和/或高温度条件，例如在约50℃到约70℃下约0.02M到约0.15M NaCl所提供的。例如，高严格条件是以高严格洗涤缓冲液(0.2×SSC，0.1％ SDS，65℃)洗涤杂交过滤器至少两次。另外，甲酰胺可以用于提高严格度。因而高严格条件还包括5×SSC、50％甲酰胺和42℃。通过杂交的多核苷酸分子检测是本领域技术人员公知的，美国专利NO.4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的范例。

用语“分离的”意指已经从其自然环境移除，不考虑它的最终分布。例如，“分离”自稻米的核酸序列，例如通过从稻米细胞克隆，当被插入到玉米细胞的基因组时保持了“分离的”。

用语“可操作连接”是指两种或多种核酸区域或核酸序列的空间排列，从而它们发挥它们相互的合适效果。例如，启动子区域可以相对于核酸序列放置，从而所述核酸序列的转录被所述启动子区域指导。启动子区域和核酸序列是“可操作连接的”。

术语“磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶或PPT”是指一种通过辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分与保守的丝氨酸残基的共价附着，来催化载体蛋白例如聚酮化合物合酶的多肽的翻译后活化的酶。

术语“聚酮化合物合酶”是指由多功能多肽组成的酶复合物，所述多功能多肽以反复方式催化复杂分子从单体底物的合成。在Moritellamarina中，PKS复合物从丙二酰基-CoA和乙酰-CoA合成DHA。例如，在M.marina中，PKS含有由开放阅读框Orf5、Orf6、Orf7和Orf8编码的4个多肽(Metz et al.，2001)，在美国专利6,140,486中分别被称为Orf6、Orf7、Orf8和Orf9。为了活化这种复合物，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶需要泛酰巯基乙胺基化由Orf5编码的多肽。Shewanella sp.SCRC2738的PKS复合物合成EPA(Metz et al.，2001)。

“上游”和“下游”是对于核苷酸序列的位置以及编码序列的转录或翻译方向所使用的位置术语，其通常在5′到3′方向上进行。

术语“启动子”或“启动子区域”是指核酸序列，通常存在于编码序列的上游(5′)，其能够指导核酸序列成为RNA分子的转录。启动子或启动子区域一般提供了RNA聚合酶的识别位点以及适当的转录起始所必需的其他因素。如在此期待的，启动子或启动子区域包括通过插入或删除调节区、使启动子经历随机或定点诱变等等所衍生的启动子变体。启动子的活性或强度可以通过就它产生的RNA数量、或在细胞或组织中积累的蛋白质数量，相对于类似测量的第二启动子来定量。

用语“3′非编码序列”是指位于编码序列的下游的核苷酸序列，包括多聚腺苷酸识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号其他序列。这些通常被成为3′非翻译区域或3′-UTR。多腺苷酸化信号通常以影响多聚腺苷酸段向mRNA前体的3′末端的添加为特征。不同的3′非编码序列的作用由Ingelbrecht等(1989)例证。

“翻译前导区序列”或“5′非翻译区”或“5′UTR”都是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。5′-UTR存在于完整加工的翻译起始序列的mRNA上游。5′-UTR可以影响向mRNA的主要转录产物的加工、mRNA稳定性或翻译效力。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner and Foster，1995)。

“RNA转录产物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。当RNA转录产物是DNA序列的理想互补拷贝时，它被称为原始转录产物。来自原始转录产物的转录后加工的RNA序列被称为成熟RNA。“信使RNA”(mRNA)是指没有内含子并且可以被细胞翻译成多肽的RNA。

“DNA构建体”是指相互可操作连接来装配成重组DNA分子的异源遗传元件，可以包含提供宿主细胞中DNA多核苷酸分子的表达的元件以及提供所述构建体的维持的元件。植物表达盒包含遗传元件的可操作的连接，当被转移到植物细胞中时提供期望的基因产物的表达。

“重组载体”是指任何试剂，通过它或在它之中，目标核酸被扩增、表达或保存，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体或线性单链的、环形单链的、线性双链的、或环形双链的DNA或RNA核苷酸序列。重组载体可以被合成，或来自于任何来源，并能够基因组整合或自主复制。

“调节序列”是指位于编码序列或内含子的上游(5′)、之中或下游(3′)的核苷酸序列，它的存在或缺乏影响所述编码序列的转录和表达。

“基本上同源的”是指在序列上至少约90％相同的两个序列，如通过例如DNAStar(Madison，WI)中的CLUSTAL W算法所测量的。

“基本上纯的”是指从在其天然状态通常与其相关的基本上所有其他分子在分离的分子。更优选的，基本上纯的分子是在制品中存在的优势种。基本上纯的分子可以是大于约60％地没有、优选的约75％地没有、更优选的约90％地没有、以及最优选的约95％地没有天然混合物中存在的其他分子(不包括溶剂)。用语“基本上纯的”不意图涵盖以它们的天然状态存在的分子。优选的，本发明的核酸分子和多肽是基本上纯的。

术语“转化”是指核酸导入接受者宿主中。术语“宿主”是指细菌细胞、真菌、动物或动物细胞、植物或种子、或任何植物部分或组织，包括植物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚芽和花粉。

如在此使用的，“转基因植物”是具有被稳定导入其基因组，例如核或质体基因组中的外源核酸的植物。

术语“同基因”作为具有或缺乏转基因的植物或植物系之间的比较性术语，是指除了所讨论的转基因之外植物或株系具有相同或相似的遗传背景。例如，代表来自亲本F2群体的表型相似或相同选集的所谓的姐妹系被认为是“同基因的”。当使用未转化的亲本作为回交亲本、使稳定的转化植物的子代与未转化的亲本株系杂交或回交，同时针对型(通过分子标记物分析的基因型，或通过田间观察的表型，或两种)和转基因来选择时，产生的转基因株系被认为是与其未转化的亲本系是高度“同基因的”。

术语“种子”、“籽粒”和“谷粒”被理解为在含义上是等价。术语籽粒通常用于描述玉米或稻米植物的种子。在所有植物中，种子是由种皮、胚芽、糊粉和胚乳组成的成熟的胚珠。

编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的核酸

在一个实施方式中，本发明提供了来自Moritella marina的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的新的核酸。在某些实施方式中，所述核酸包含SEQ ID NO：2、4、6或8。本发明还提供了使用这种核酸，包括SEQ ID NO：2、4、6和8的方法。在一个实施方式中，这些核酸分子在本发明的上下文中被用于改变植物种子中的油的组成。

这些核酸分子可以使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物根据标准PCR^TM扩增技术来扩增。做为选择，它们可以使用标准的合成技术，例如自动化的DNA合成仪来合成。编码期望的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的多核苷酸可以以多种方式来鉴定。举例来说，期望的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的来源，例如来自Moritella的库，用可检测的酶学或化学合成的探针来筛选，所述探针可以从DNA、RNA或非天然发生的核苷酸、或其混合物产生。探针可以从已知的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的多核苷酸酶学地合成，用于正常的或降低严格度的杂交方法。寡核苷酸探针也可以用于筛选来源，并且可以基于已知的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的序列，包括在已知的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶之中保守的序列，或基于从期望的纯化蛋白质获得的肽序列。基于氨基酸序列的寡核苷酸探针可以是简并的，以包括遗传密码的简并性，或者可以偏向于支持来源有机体的偏爱密码子。寡核苷酸也可以被用作引物，用于从已知的或怀疑的来源反转录的mRNA的PCR；PCR产物可以是全长cDNA，或可以用于产生探针来获得期望的全长cDNA。做为选择，期望的蛋白质可以被完全地测序，并进行编码多肽的DNA的完全合成。

一旦分离出期望的基因组或cDNA，它可以通过已知的方法来测序。本领域公认的是，这些方法常遭遇错误，从而同一区域的多次测序是常规的，并仍然预期导致在产生的推断序列中可测量的错误率，特别是在具有重复结构域、广泛的二级结构、或稀有的碱基组成的区域，例如具有高GC碱基含量的区域中。当出现矛盾时，可以进行重新测序，并可以采用特殊的方法。特殊的方法可以包括改变测序条件，通过使用：不同温度；不同的酶；改变寡核苷酸形成高级结构的能力的蛋白质；改变的核苷酸例如ITP或甲基化的dGTP；不同的凝胶组成，例如，添加甲酰胺；不同的引物或远离问题区域的引物；不同的模板例如单链DNA。还可以采用mRNA的测序。

如果希望，编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的核酸的序列可以被修改而不改变表达的蛋白质的最终氨基酸序列，使得所述序列在植物宿主中更易于表达。编码序列可以是人工的DNA。如在此使用的人工DNA是指非天然发生的DNA多核苷酸分子。人工DNA分子可以通过各种方法来设计，例如，基于取代第一多核苷酸的密码子来产生等效物的本领域中已知的方法，乃至改进的、第二代人工多核苷酸，其中这种新的人工多核苷酸对于转基因植物中增强的表达是有用的。设计方面通常采用密码子利用率表，该表格通过编选分离自植物、植物型、科或属的编码序列集合中密码子出现频率来产生。其他设计方案包括降低多腺苷酸化信号、内含子剪接位点、或序列的长的AT或GC延伸的出现(美国专利5,500,365)。全长编码序列或其片段可以使用本领域技术人员已知的方法从人工DNA产生。维持了此处期待的功能、在此公开的核苷酸序列或调节元件的修饰处在本发明的范围之内。这种修饰包括插入、替换和删除，特别是反映了遗传密码的简并性的替换。

本发明从Moritella marina分离了产生具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的分离的DNA序列。编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的序列可以在转基因植物、微生物或动物中表达来有效活化聚酮化合物合酶。也可以使用与在此提供的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多核苷酸基本上相同的、或编码与磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多肽基本上相同的多肽的其他多核苷酸。“基本上相同的”是指氨基酸序列或核酸序列在优选性提高的顺序上展现了与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7中的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多肽序列或编码这些多肽的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、98或99％的同一性。使用序列分析软件进行多肽或多核苷酸比较，例如，GCG Wisconsin程序包的SequenceAnalysis软件包(Accelrys，San Diego，CA)和MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228 S.Park St.，Madison，Wis.53715)。这种软件通过指定相似性或同一性的程度来匹配相似的序列。

DNA构建体

本发明提供了DNA构建体，其包含与在此描述的核酸可操作连接的异源启动子。启动子的选择，例如，可被描述为强表达、弱表达、可诱导表达、组织增强表达(即，在组织中特异地或优先地表达)、器官增强表达(即，在器官中特异地或优先地表达)和发育增强表达(即，在发育的特定阶段特异地或优先地表达)的启动子，在本领域技术人员的能力范围内。类似地，如上所述的核酸分子与启动子的组合也在本领域技术人员能力范围内(参见，例如Sambrook et al.，1989)。

本发明使用的启动子一般包括，但不限于，在细菌、噬菌体、真菌或植物细胞中起作用的启动子。用于细菌表达的有用启动子有lacZ、Sp6、T7、T5或E.coli glgC启动子。用于真菌的有用的启动子包括Saccharomyces cerevisiae Gall(West，et al.(1984))、Saccharomycespombe nmtl(Maundrell，K.(1990))、Neurospora crassa ccg-1(FreitagM and Selker EU(2005))和Pichia methanolica AUG1(Invitrogen)。用于植物细胞的有用的启动子包括γ玉米蛋白Z27启动子(参见，例如Lopes et al.(1995))、L3 oleosin启动子(美国专利No.6,433,252)、大麦PER1启动子(Stacey et al.，1996)、CaMV35S启动子(Odell et al.1985)、CaMV19S(Lawton et al.，1987)、nos(Ebert et al.，1987)、Adh(Walker et al.，1987)、蔗糖合酶(Yang et al.，1990)、肌动蛋白(Wang et al.，1992)、cab(Sullivan et al.，1989)、PEPCase启动子(Hudspeth et al.，1989)，或与R基因复合体相关的那些(Chandler etal.，1989)。玄参花叶病毒(FMV)启动子(Richins et al.，1987)、arcelin、番茄E8、patatin、遍在蛋白、mannopine合成酶(mas)和微管蛋白启动子是有用启动子的其他实例。

存在着各种各样的植物启动子序列，其可以用于驱动转基因植物中编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的多核苷酸的组织特异性表达。实际上，在本发明的特定的实施方式中，使用的启动子是种子特异性启动子。这些启动子的实例包括来自这些基因例如napin(Kridl et al.，1991)、菜豆蛋白(Bustos，et al.，1989)、大豆胰蛋白酶抑制物(Riggs，et al.，1989)、ACP(Baerson et al.，1993)、硬脂酰基-ACP脱饱和酶(Slocombe et al.，1994)、大豆β-伴球蛋白的a′亚单位(P-Gm7S alpha’，参见例如，Chen et al.，1986)、Vicia faba USP(P-Vf.Usp，参见例如，美国专利申请10/429,516，SEQ ID NO：1、2和3)、球蛋白启动子(参见例如Belanger and Kriz，(1991)，大豆β-伴球蛋白的α亚单位(7Sα)(美国专利申请10/235,618，通过引用合并)和Zea mays L3oleosin启动子(P-Zm.L3，参见，例如，Hong et al.，1997)。

在玉米中表达的启动子包括来自编码玉米蛋白(zeins)的基因的启动子，玉米蛋白是在玉米胚乳中发现的一组储存蛋白质。玉米蛋白基因的基因组克隆已经被分离(Pedersen et al.，1982；Russell et al.，1997)，可以使用来自这些克隆包括15kD、16kD、19kD、22kD和27kD基因的启动子。已知在玉米中和在其他植物中起作用的其他种子表达增强启动子包括以下基因的启动子：Waxy(微粒结合的淀粉合酶)、Brittle和Shrunken 2(ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、Shrunken 1(蔗糖合酶)、分支酶I和II、淀粉合成酶、脱支酶、oleosins、谷蛋白和Betll(基础胚乳转移层)。本领域技术人员已知的在本发明的实践中有用的其他启动子也是本发明预期的。

此外，转录增强子或增强子的复制物可以用于提高来自特定启动子的表达。这些增强子的实例包括，但不限于，Adh intronl(Callis et al.，1987)、稻米肌动蛋白内含子(McElroy et al.，1991；美国专利No.5,641,876)、蔗糖合酶内含子(Vasil et al.，1989)、玉米HSP70内含子(也称为Zm.DnaK)(美国专利5,424,412，Brown et al.)、TMV Ω元件(Gallie et al.，1999)、CaMV35S增强子(美国专利5,359,142 &5,196,525，McPherson et al.)或章鱼碱合成酶增强子(美国专利5,290,924，Last et al.)。由于转录起始位点和编码序列的起点之间的DNA序列，即，非翻译前导序列可以影响基因表达，人们也可以希望采用特定的前导序列。可以采用本领域技术人员可获得的任何前导序列。优选的前导序列指导连接的基因的最佳表达水平，例如，通过提高或维持mRNA稳定性和/或通过防止不适当的翻译起始(Joshi，1987)。这种序列的选择处于本领域技术人员的处理能力之内。

本发明的DNA构建体可以包括靠近所述盒的3′末端的序列，其充当信号来终止异源核酸的转录，并指导产生的mRNA的多聚腺苷酸化。这些通常被成为3′非翻译区域或3′-UTR。可以作为转录终止信号的某些3′元件可以包括来自Agrobacterium tumefaciens的胭脂碱合成酶基因(nos)的那些(Bevan et al.，1983)、napin 3′非翻译区(Kridl et al.，1991)、球蛋白3′非翻译区(Belanger and Kriz，1991)、来自大豆的Adr12基因的3’非翻译区(发育素下调的)(Wang et al.，PCT公开WO200250295)或来自zein基因，例如Z27的一种(Lopes et al.，1995)。本领域已知的其他3′调节元件也可以用于本发明的载体中。

在此描述的核酸分子可以被克隆到任何适合的载体中，并可以用于转化或转染任何适合的宿主。载体的选择和构建它们的方法是本领域熟知的，在技术文献中一般地描述了(一般参见，“Recombinant DNAPart D”(1987))。所述载体将优选地包含调节序列，例如转录和翻译起始密码子以及终止密码子，其特异于载体将要导入其中的宿主类型，视情况地并考虑该载体是DNA还是RNA

可以制备环形或线形的载体构建体，含有连接到在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统的如上所述的完整核酸序列或其部分。复制系统可以来源于ColE1，2mμ质粒、λ噬菌体、f1丝状噬菌体、Agrobacterium物种(例如，A.tumefaciens和A.rhizogenes)等等。

除了复制系统和插入的核酸序列之外，所述载体可以包括容许选择转化或转染的宿主的一种或多种标记基因。标记基因包括抗生抗性，例如，对抗生素、重金属、除草剂等等的抗性，在营养缺陷宿主中的补足来提供原养，等等。

本发明提供了包含在此描述的核酸分子、任选的以载体形式的核酸分子的宿主细胞。适合的宿主包括植物、细菌和真菌细胞，包括Escherichia coli、Bacillus subtilis、Agrobacterium tumefaciens、Saccharomyces cerevisiae和Neurospora crassa。E.coli宿主包括TB-1、TG-2、DH5α、XL-Blue MRF’(Stratagene，Austin，TX)、SA2821、Y1090和TG02。植物细胞包括但不限于，大豆、Brassica campestris、油菜、含油种子油菜(oilseed rape)、油菜籽(rapeseed)、海甘蓝、芥菜、蓖麻、花生、芝麻、棉籽、亚麻籽、红花、油棕、亚麻、葵花、苜蓿、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、粟、高粱和稻米构成的组。

在宿主细胞中的表达可以以短暂的或稳定的方式实现。短暂的表达可以从导入的构建体发生，其含有在宿主细胞中起作用的表达信号，但是所述构建体不能复制并且很少在宿主细胞中整合，或者所述宿主细胞不能增殖。短暂表达也可以伴随着诱导与感兴趣的基因可操作连接的可调节启动子的活性，从而这种诱导系统经常展现很地的基础表达水平。通过导入可以整合到宿主基因组中、或可以在宿主细胞中自主复制的构建体，可以实现稳定的表达。通过使用位于所述表达构建体上、或用表达构建体转染的可选择标记，随后选择表达所述标记的细胞，可以选择感兴趣基因的稳定表达。当稳定的表达来自整合时，构建体的整合可以在宿主基因组内随机地发生，或可以通过使用含有与宿主基因组同源的区域的构建体，其足以将重组物靶向宿主基因座。当构建体被靶向内源基因座时，全部或某些转录和翻译调节区域可以由内源基因座提供。

宿主细胞中的表达可以涉及本领域技术人员已知的发酵技术。发酵的宿主细胞可以是原核生物，例如Escherichia coli，或真核生物，例如酵母Saccharomyces cerevisiae、或丝状真菌Neurospora crassa。通过发酵生产PUFA的实例包括Mortierella(美国专利6,319,698)和Thraustrochytriales(美国专利6,451,567)。

期待的是通过使用游离的或整合的表达载体，超过一个基因可以被导入并在宿主细胞中增殖。当两种或更多基因从独立的复制载体中表达时，希望的是每个载体具有不同的复制方式。每个导入的构建体，无论是整合的或不是，将具有不同的的选择方式，并且应当没有与另一个构建体的同源性，以维持稳定表达并防止构建体之间元件的重新分配。导入的构建体的调节区域、选择方式和增殖方法的明智选择可以实验上地确定，从而所有导入的多核苷酸以必需的水平表达来提供期望的产物的合成。

多肽

本发明提供了由在此描述的核酸分子编码的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。聚酮化合物合酶是由多功能的多肽组成的酶复合物，所述多肽以反复的方式催化复杂分子从单体底物的合成。在Moritella marina中，PKS复合物从丙二酰基-CoA和乙酰-CoA合成DHA。为了活化这种复合物，需要磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。所述多肽优选的包含氨基末端和羧基末端。所述多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸，或D-与L-氨基酸的混合物。

对天然氨基酸序列产生变体多肽的改变可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法来制备。例如，通过在合成时改变核酸分子的序列可以方便地将氨基酸替换引入所述多肽中。通过将包含修饰的序列的合成寡核苷酸连接到表达载体中，也可以引入位点特异性突变。作为选择，可以使用寡核苷酸指导的、位点特异性诱变步骤，例如在Walder et al.(1986)；Bauer et al.(1985)；和美国专利4,518,584和4,737,462.中公开的。

在本领域普通技术人员能力范围内的是选择合成的和天然发生的氨基酸，其作为对任何特定的天然发生氨基酸的保守性或中性替换。普通技术人员理想地将考虑进行任何特定氨基酸替换的环境，还考虑侧链的疏水性或极性、侧链的一般大小、在生理条件下具有酸性或碱性的侧链的pK值。例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸通常适合相互替换，更通常地是精氨酸和组氨酸。本领域已知的是，这是因为所有三个氨基酸都具有碱性侧链，而赖氨酸和精氨酸的侧链的pK值相互之间比组氨酸(约6)更接近(约10和12)。类似地，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通过适当地相互取代，条件是甘氨酸通常不适合替代该组的其他成员。这是因为当掺入到多肽中时这些氨基酸的每一个都是相对疏水性的，但是甘氨酸缺乏α碳容许了旋转的phi和psi角(在α碳周围)有这样大的构象自由度，从而甘氨酸残基可能触发在其他氨基酸相互替换时通常不发生的构象或二级结构中的改变。通常适合相互替换的其他氨基酸组包括但不限于，由谷氨酸和天冬氨酸构成的组；由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成的组；以及由丝氨酸、苏氨酸和任选的酪氨酸构成的组。另外，普通技术人员可以容易地分类合成氨基酸和天然发生的氨基酸。

如果期望，所述多肽可以被修饰，例如，通过糖基化、酰胺化、羧化作用或磷酸化，或通过加酸盐、酰胺、酯、特别是C-末端酯以及本发明的多肽的N-酰基衍生物的生成。通过根据本领域已知的方法与其他部分形成共价或非共价复合物，所述多肽还可以被修饰来产生蛋白衍生物。共价结合的复合物可以通过将化学部分连接到多肽包含的氨基酸的侧链的功能基团上，或连接到N-或C-末端来制备。理想地，这种修饰和结合不会有害地影响多肽(和其变体)的活性。虽然这种修饰和结合可能具有更大或更小的活性，所述活性期望地不是消极的，并且是未改变的多肽的特征。

所述多肽(和片段、变体和融合蛋白)可以通过多种常规技术的任何一种来制备。所述多肽可以是从天然发生的来源或从重组来源分离的或基本上纯化的。例如，对于重组蛋白来说，编码期望的蛋白质的DNA片段可以使用公知的分子遗传技术(参见，例如，Maniatis et al.，1989)和在此处的“实施例”中引用的其他参考文献)亚克隆到合适的载体中。片段可以被转录，蛋白随后在体外翻译。也可以采用商业上可获得的试剂盒(例如，由Clontech，Mountain View，CA；Amersham LifeSciences，Inc.，Arlington Heights，IL；Invitrogen，Carlsbad，CA等等生产的)。任选的可以在核酸的操作中采用聚合酶链式反应。

多肽也可以根据本领域已知的方法使用自动化肽合成仪来合成。作为选择，所述多肽(和片段、变体和融合蛋白)可以使用本领域普通技术人员公知的标准肽合成技术(例如，如Bodanszky(1984)中概述的)来合成。特别地，所述多肽可以使用固相合成的步骤来合成(参见，例如，Merrifield，1963；Barany et al.，1987；和美国专利5,424,398)。如果期望，这可以使用自动化肽合成仪来进行。t-丁氧基羧基(t-BOC)或9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸保护基团的去除以及蛋白从树脂上的分离可以伴随着例如在降低的温度下的酸处理。含多肽的混合物任何可以被提取，例如，使用二乙醚，来除去非肽有机化合物，合成的蛋白质可以从树脂粉未中提取(例如，使用约25％w/v乙酸)。在多肽的合成之后，任选地可以进行进一步的纯化(例如，使用HPLC)来消除任何不完整的蛋白质、多肽、肽或游离氨基酸。氨基酸和/或HPLC分析可以对合成的多肽进行来验证其身份。对于根据本发明的其他应用，优选的是产生所述多肽来作为更大的融合蛋白的部分，通过化学结合，或通过本领域已知的遗传学方法。就此来说，本发明还提供了包含所述多肽(或其片段)或其变体以及具有任何期望的性质或效应物功能的一种或多种其他多肽/蛋白的融合蛋白。

对于特定蛋白质的生产和鉴定的分析是基于各种物理-化学的、结构的、功能的，或蛋白质的其他性质。独特的物理-化学或结构性质容许通过电泳步骤，例如天然或变性凝胶电泳或等电聚焦，或者通过层析技术，例如离子交换或凝胶排阻层析来分离和鉴定。单独蛋白质的独特结构提供了使用特异性抗体来以例如ELISA分析的形式检测它们存在的机会。方法的组合可以用于实现更高的特异性，例如Western印迹，其中抗体被用于定位已经通过电泳技术分离的单独基因产物。其他技术可以用于确切地确认目标产物的身份，例如通过纯化后的氨基酸测序来评估。虽然这些是最常见的，也可以使用其他步骤。

分析过程可以通过蛋白质的功能来鉴定蛋白质的表达，特别是当表达的蛋白质是能够催化涉及特定底物和产物的化学反应的酶时。例如，在植物提取物中，这些反应可以通过物理和/或化学过程通过提供和测定反应的底物损失和产物生成来测量。

在很多情况下，基因产物的表达通过评估其表达的表型结果来确定。这种评估可以仅仅是视觉观察，或可以包括分析。这种分析可以采取许多形式，例如，分析植物的化学成分、形态学或生理性质方面的改变。通过表达编码酶或储存蛋白质的基因、或通过改变淀粉数量的酶、或通过改变油组成的酶，可以改变化学组成，所述储存蛋白质改变氨基酸组成并且这种改变可以通过氨基酸分析来检测，所述淀粉数量可以通过近红外反射光谱来分析，所述油组成可以通过气相色谱法来检测。形态改变可以包括更大的身材或更厚的茎杆。

本发明的核酸分子、DNA构建体和多肽可以用于农业方法和各种筛选分析中。例如，核酸分子可以用于在宿主细胞中经由载体表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，用于检测生物样品中编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的mRNA转录产物，用于经由Southern印迹来检测编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因中的遗传改变，用于抑制磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，或用于增量调节磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。所述多肽可以用于在植物中补偿磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的缺失，或补偿具有降低的活性或无活性的突变磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的存在，或用于在植物中处理磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的过多的底物水平，不管是直接还是间接的。做为选择，所述多肽可以用于根据调节它们活性的能力来筛选试剂。抗体可以用于检测和分离相应的多肽，以及降低这种多肽在体内的可用性。

植物转化

在本发明的优选的实施方式中，产生表达期望的蛋白质的转基因植物。向植物细胞中导入编码期望的蛋白质的期望的多核苷酸序列的各种方法是本领域已知的，包括(1)物理方法，例如显微注射、电穿孔和微粒介导的递送(biolistics或基因枪技术)；(2)病毒介导的递送；和(3)土壤杆菌介导的转化。

植物细胞转化的最常用的方法是土壤杆菌介导的DNA转移过程，以及biolistics或微注射微粒轰击介导的过程。一般地，核转化是期望的，但当专门地转化质体，例如叶绿体或淀粉体是期望的时，可以利用期望的多核苷酸的微粒介导的递送来转化植物质体。

土壤杆菌介导的转化通过使用属于土壤杆菌属的遗传工程化的土壤细菌来实现。带有Ti或Ri质粒的Agrobacterium tumefaciens和Agrobacterium rhizogenes的许多野生型和解除的菌株可以用于植物的基因转移。经由称为“T-DNA”的特定DNA的转移来进行向许多植物品种中的基因转移，所述特定DNA可以被遗传工程化来携带任何期望的DNA片段，如在例如Bidney等的美国专利6,265,638中进一步详细描述的，通过引用将其公开内容合并在此。

土壤杆菌介导的植物的遗传转化涉及几个步骤。第一步，其中强毒土壤杆菌和植物细胞首先相互接触，一般称为“接种”。接种优选地伴随着某些对一些植物细胞的损伤方法，其是否植物细胞成分，例如coumaryl醇类、sinapinate(其被还原为乙酰丁香酮)、芥子醇和松柏醇，其活化土壤杆菌中的致病因子。在接种之后，允许土壤杆菌和植物细胞/组织在适合生长和T-DNA转移的条件下一起生长几小时到几天或更久的一段时间。这个步骤称为“共培养”。在共培养和T-DNA递送之后，用杀细菌或抑细菌试剂处理植物细胞来杀死保持与外植体接触的和/或在含有外植体的器皿中的土壤杆菌。如果在缺乏任何选择性试剂的情况下进行这个步骤，以促进转基因植物细胞相对于非转基因植物细胞的优势生长，则这一般称为“延迟”步骤。如果在存在偏爱转基因植物细胞的选择压力的情况下进行这个步骤，则它被称为“选择”步骤。当使用“延迟”时，一般跟随着一个或多个“选择”步骤。

对于微粒轰击(美国专利No.5,550,318(Adams et al.)；美国专利No.5,538,880(Lundquist et.al.)、美国专利No.5,610,042(Chang et al.)；和PCT公开WO 95/06128(Adams et al.)；通过完全引用将它们每一个特别地合并在此)，用核酸包被微粒子，并通过推力递送到细胞中。示范性的颗粒包括由钨、铂和优选的金组成的那些。

通过加速将DNA递送到植物细胞中的方法的说明性实施方式是Biolistics颗粒递送系统(BioRad，Hercules，CA)，其可以用于将包被有DNA或细胞的颗粒通过筛子，例如不锈钢筛或Nytex筛推进到用悬浮液中培养的单子叶植物细胞覆盖的过滤器表面上。

微粒轰击技术是广泛可用的，可以用于转化实际上任何植物物种。已经通过微粒轰击转化的物种的实例包括单子叶植物物种，例如玉米(国际公开NO.WO 95/06128(Adams et al.))、大麦、小麦(美国专利NO.5,563,055(Townsend et al.)，通过完全引用合并在此)、稻米、燕麦、黑麦、甘蔗和高粱；以及许多双子叶植物，包括烟草、大豆(美国专利NO.5,322,783(Tomes et al.)，通过完全引用合并在此)、葵花、花生、棉花、番茄和一般的豆荚(美国专利No.5,563,055(Townsend etal.)，通过完全引用合并在此)。

为了对转化的植物细胞进行选择或记分而不考虑转化方法，被导入细胞中的DNA含有基因，其在可再生的植物组织中起作用来产生为植物组织赋予对其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可选择、可筛选或可记分标记物的目标基因将包括但不限于β-葡糖醛酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶(LUX)、抗生素或除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的实例包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉素)；氨甲蝶呤(和三甲氧苄二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四环素。编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子是本领域已知的，包括但不限于关于草甘膦耐受性的美国专利No.5,627,061(Barry，et al.，)、美国专利No5,633,435(Barry，et al.，)和美国专利No 6,040,497(Spencer，et al.，)中描述的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核苷酸分子和美国专利No.5,094,945(Comai)中描述的aroA；关于溴苯腈耐受性的美国专利No.4,810,648(Duerrschnabel，et al.，)中描述的编码溴苯腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；关于达草灭耐受性的在Misawa，et al.，(1993)和Misawa，et al.，(1994)中描述的编码八氢番茄红素脱饱和酶(CcrtI)的多核苷酸分子；Sathasiivanet al.(1990)中描述的针对磺酰脲除草剂的抗性的编码乙酰羟基酸合酶(AHAS，aka ALS)的多核苷酸分子；以及Wohlleben，et al.，(1988)中描述的pat基因和DeBlock，et al.，(1987)中描述的bar基因，其各自提供了glufosinate和bialaphos耐受性。

来自各种转化的外植体的植物的再生、发育和培养是本领域中充分记载了的。这种再生和生长过程一般包括选择转化的细胞和培养那些个体化的细胞的步骤，从一般的胚胎发育阶段到生根的植物苗阶段。类似地再生转基因胚芽和种子。然后将产生的转基因的生根的芽种植到合适的植物生长培养基，例如土壤中。在对选择性试剂的暴露下幸存的细胞，或在筛选分析中记分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的培养基中培养。在转移到温室或生长箱发育成熟之前，将发育的植物苗转移到少土的植物生长混合物中，并锻炼得耐寒。

本发明可以使用任何可转化的细胞或组织。在此使用的可转化是指细胞或组织能够进一步增殖来产生植物。本领域技术人员认识到，许多植物细胞或组织是可转化的，其中在外源DNA的插入和合适的培养条件之后，植物细胞或组织可以形成分化的植物。适合于这些目的的组织可以包括但不限于不成熟的胚芽、鳞片组织、悬浮细胞培养物、不成熟的花序、芽分生组织、结节外植体、愈伤组织、胚轴组织、籽叶、根和叶。以上引述的Tomes et al.‘783专利描述了一种方法，用细胞分裂素处理、随后孵育一段时期，足以允许子叶节组织中的未分化细胞分化成分生组织细胞，并允许细胞进入发育的G1和分裂期之间的阶段，声称其改善了转化的敏感性。

可以使用任何适合的植物培养基。适合的培养基包括但不限于，基于MS的培养基(Murashige and Skoog，1962)或基于N6的培养基(Chu et al.，1975)，补充有植物生长调节剂，包括但不限于发育素、细胞分裂素、ABA和赤霉素。本领域技术人员熟悉组织培养基的变化，当适当地补充时，其支持了植物组织生长和发育，并适合于植物转化和再生。这些组织培养基可以作为商业产品购买，或常规地制备或修改。本领域技术人员知道，用于转化和再生的培养基和培养基添加剂例如营养物和生长调节剂，以及其他培养条件，例如孵育期间的光强度、pH值和孵育温度，可以根据特定的目标品种来优化。

在DNA构建体被稳定地掺入到转基因植物中并被确认是可操作的之后，它可以通过有性杂交导入到相同其他植物或另一种有性相容的物种中。取决于要杂交的物种，可以使用许多标准育种技术的任一种。因而，本发明不仅包括从已经根据本发明转化的细胞直接转化或再生的植物，还包括这些植物的子代。如在此使用的，术语“子代”表示根据本发明制备的亲本植物的任何世代的后代，其中所述子代包括根据本发明制备的选定DNA构建体。如在此公开的，“杂交”植物来提供相对于起始植物系具有一个或多个添加的转基因或等位基因的植物系，被定义为通过杂交起始系与包含本发明的转基因或等位基因的供体植物系引起特定的序列被导入植物系的技术。为了实现这一点，例如，人们可以进行以下的步骤：(a)第一(起始系)和第二(包含期望的转基因或等位基因的供体植物系)亲本植物的植物种子；(b)将所述第一和第二亲本植物的种子生长成带有花朵的植物；(c)用来自第二亲本植物的花粉传粉到第一亲本植物的花；以及(d)收获带有受精的花朵的亲本植物上产生的种子。

回交在此被定义为包括以下步骤的过程：(a)将含有期望的基因、DNA序列或元件的第一基因型的植物与缺乏所述期望的基因、DNA序列或元件的第二基因型的植物杂交；(b)选择含有所述期望的基因、DNA序列或元件的一个或多个子代植物；(c)将所述子代植物与第二基因型的植物杂交；和(d)重复步骤(b)和(c)以将期望的DNA序列从第一基因型的植物转移到第二基因型的植物。

DNA元件向植物基因型中的基因渗入被定义为回交转变的过程的结果。DNA序列已经基因插入其中的植物基因型可以称为回交转化的基因型、系、自交体或杂交体。类似地，缺乏期望的DNA序列的植物基因型可以称为未转化的基因型、系、自交体或杂交体。

种子、粗粉、油和包含种子、粗粉和油的产品

本发明还提供了超过约1000、更优选的约20,000、再更优选的约40,000个种子的容器，其中超过约10％、更优选的约25％、更优选的约50％、再更优选的约75％，或更优选的约90％的种子是来自本发明的植物的种子。

本发明还提供了超过约10kg、更优选的约25kg、再更优选的约50kg种子的容器，其中超过约10％、更优选的约25％、更优选的约50％、再更优选的约75％，或更优选的约90％的种子是来自本发明的植物的种子。

本发明的任何植物或其部分可以被收获，以及任选的被加工来产生饲料、粗粉或油产品。为这个目的的特别优选的植物部分是收获的谷粒，但可以收获其他植物部分并用于干草或青贮料。产生饲料、粗粉和油产品的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。本发明的谷粒或粗粉可以与其他谷粒或粗粉混合。

方法

本发明提供了提供具有提高的DHA或EPA含量的转基因植物的方法。这种方法可以包括，例如，将编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和PKS复合物的DNA导入植物细胞中，并从所述转基因的细胞再生具有提高的DHA或EPA含量的植物。

更具体地，本发明提供了生产含有DHA或EPA的植物油的方法，包括步骤(a)生长包含用DNA构建体转化的宿主细胞的植物，所述DNA构建体包含与编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的DNA分子可操作连接的异源启动子，其中所述DNA分子选自以下构成的组：在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的条件下，与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8杂交的多核苷酸，或其互补物；编码SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列的多核苷酸；编码与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸；编码SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸；以及编码SEQ ID NO：3的多肽的多核苷酸，其中所述宿主细胞进一步包含聚酮化合物合酶；(b)产生种子；和(c)加工所述种子来获得油。

本发明进一步提供了提供转基因植物的方法，所述转基因植物可以含有提高的DHA或EPA水平，其中所述提高的水平大于在非转化的植物中存在的水平。

对于饮食补充，纯化的PUFA、转化的植物或植物部分、或其衍生物，可以掺入烹调油、脂肪或配制的人造黄油中，从而在正常使用中接受者将接受期望的数量。PUFA也可以掺入婴儿配制食品、营养增补剂或其他食物产品，可以用作抗炎试剂或胆固醇降低试剂。

如在此使用的，“可食用组合物”被定义为可以被哺乳动物摄食的组合物，例如食品、营养物质和药物组合物。如在此使用的，“食品”是指可以用作或被制备用作哺乳动物的食物的物质，包括可以在食物(例如油炸用油)或食物添加剂的制备中使用的物质。例如，食品包括用于人类消费的动物，或由此而来的任何产品，例如，鸡蛋。典型的食品包括但不限于饮料(例如，软饮料、充碳酸气的饮料、准备混合的饮料)、泡制的食物(例如，水果和蔬菜)、调味汁、调味料、色拉油、果汁、糖浆、餐后甜点例如，布丁、冻、结冰的和填满的、烘焙食品和冷冻甜食，例如冰淇淋和冰糕)、软冷冻食品(例如，软冷冻奶油、软冷冻冰淇淋和酸奶，软冷冻奶油，例如乳制的和非乳制的人造稠黄油)，油和乳化的产品(例如，起酥油、人造黄油、蛋黄酱、黄油、烹调油和色拉油)和半干食品(例如，米饭和狗粮)。

此外，在此描述的可食用组合物还可以作为食物和饮料中含有的添加剂或补充剂被摄食。这些可以与营养物质例如各种维生素和矿物质一起配制，并掺入基本上液体的组合物，例如营养饮料、豆浆和汤中，基本上固体的组合物；以及明胶，或用于形成粉末来包括入各种食物。在这种功能或健康食物中有效成分的含量可以类似于典型的药物试剂中含有的。

纯化的PUFA、转化的植物或植物部分也可以掺入到动物，特别是家畜的饲料中。这样，动物自己可以受益于富含PUFA的膳食，而来自这种家畜的食物产品的人类消费者也可以收益。

对于药物用途(人类或兽医)，所述组合物一般可以口服地施用，但是可以通过任何途径来使用，通过所述途径它们可以被成功地吸收，例如胃肠外的(即，皮下的、肌内注射的或静脉内的)、直肠的、阴道的或体表的，例如，皮肤软膏剂或洗液。本发明的PUFA、转化的植物或植物部分可以单独施用，或与药学上可接受的载体或赋形剂组合地施用。当可用时，胶囊是优选的口服施用形式。如以上阐述的膳食添加剂也可以提供口服的施用途径。本发明的不饱和酸可以以共轭的形式，例如，盐、酯、酰胺或脂肪酸的前药来施用。任何药学上可接受盐被本发明包括，特别优选的是钠、钾或锂盐。还包括的是N-烷基多羟基胺盐，例如N-甲基葡糖胺，在PCT公开WO 96/33155中找到。优选的酯是乙酯。对于固体盐，PUFA也可以以片剂形式施用。对于静脉内施用，PUFA或其衍生物可以掺入到商用配方，例如Intralipids中。

实施例

包括以下实例来说明本发明的实施方式。本领域的技术人员应当理解，在根据本发明人公开的当前技术的实施例中所公开的技术在本发明的实践中良好地运作。然而，本领域的技术人员根据当前公开的内容应当理解，可以在公开的特定的方案中进行许多变化，在不离开本发明的概念、精神和范围的情况下仍获得相象的或类似的结果。更具体地，显而易见的是，可以用化学上和生理学上都相关的某些试剂替换在此描述的试剂，而达到相同的或相似的结果。对于本领域的技术人员显而易见的所有这种相似的替换和修改都认为处在由附随的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。

实施例1

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶序列的克隆

克隆了三种细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。来自ShewanellaSCRC-2738的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Ppt)的氨基酸序列(SEQ IDNO：17)被用于检索公众数据库的在EPA或DHA生物合成中起作用的新的ppt。这种检索产生了来自Shewanella oneidensis MR-1(SEQ IDNO：1)(So-ppt)和Colwellia psychrerythraea(SEQ ID NO：3)(Cp-ppt)的推定的ppt。来自Shewanella oneidensis PCR MR-1(SEQ ID NO：2)和Colwellia psychrerythraea(SEQ ID NO：4)的ppt的核酸序列使用以下的引物配对使用Expand High Fidelity PCR系统(Roche，AppliedScience，Indianapolis，IN)来克隆：

Shew new 5′：tcgagctcgcatatgaagattgagcttttttttatacc(SEQ ID NO：9)

Shew 3′：tcttaattaattagtcagccaaactagccgc(SEQ ID NO：10)

Colwe new 5′：tcgagctcgcatatgacttctttttctcaatctg(SEQ ID NO：11)

Colwe 3′：tcttaattaattagatttcctgataaccaagtag(SEQ ID NO：12).

使用对于Shewanella和Colwellia ppt分别设置在55℃和52℃的熔解温度扩增基因25个循环。PCR产物用NdeI和PacI消化，并连接到NdeI和PacI消化的Novagen pACYC-Duet-1(EMD Biosciences，Darmstadt，Germany)，分别引起pMON68081(附图1)和pMON68080(附图2)的形成。

为了克隆Moritella marina磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Mm-ppt)，比对Shewanella SCRC-2738 ppt(SEQ ID NO：18)、C.psychrerythraeappt和S.oneidensis MR-1 ppt的核苷酸序列来鉴定这些序列的最保守的区域。So-ppt(SEQ ID NO：2的bps 425-635)和Cp-ppt(SEQ ID NO：4的bps 389-596)中的保守核苷酸序列的区域通过这种比对来鉴定出，选择这个区域中的序列来产生探针，利用来自C.psychrerythraea和S.oneidensis MR-1的基因组DNA作为模板DNA和以下的引物：

Shewanella F1 taggtgtcgatattgagcggg(SEQ ID NO：13)

Shewanella R1 tcaaaggcaaaggattttaac(SEQ ID NO：14)

Colwellia F1 tcggttgtgatgttgaaaatac(SEQ ID NO：15)

Colwellia R1 ttaaaactaaaatcagcgagt(SEQ ID NO：16).

根据厂家的方案使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)产生毛地黄毒苷标记的探针，用于94℃、55℃和65℃各30秒的30个循环，之后在65℃孵育7分钟，和随后在4℃孵育。毛地黄毒苷标记的探针用于Southern杂交来探测M.marina总基因组DNA中的同源序列，S.oneidensis MR-1和C.psychrerythraea作为阳性对照。根据厂家的方案使用DIG Easy Hyb(Roche)在30℃进行杂交。使用0.5×SSC、0.1％SDS在室温下洗涤滤过器两次。使用抗毛地黄毒苷-AP、Fab片段和Dig Wash和Block Buffer Set(Roche)根据厂家方案显现Dig标记的探针。

使用Colwellia探针获得了来自Mmarina DNA的最强信号。在某些情况下，这些信号与使用Shewanella探针从M.marina DNA获得的弱信号重合。

根据Southern杂交实验，选择M.marina DNA的BglII和PstI消化来克隆杂交片段。使用BglII或PstI消化总基因组DNA，在琼脂糖凝胶上大小分级，切下适当大小的片段。使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化DNA片段。分级的DNA的等分量在琼脂糖凝胶上跑动，使用Turboblotter(Schleicher & Schuell，Keene，NH)根据厂家的方案印迹在尼龙膜(Roche，Mannheim，Germany)上。目标片段通过利用Colwellia探针的Southern杂交来鉴定。

选择BglII级分5和PstI级分4来产生pSP72中的部分库(Promega，Madison，WI)。这些库转化到Escherichia coli DH5α中，克隆的库等分到96孔平板的反应孔中过夜生长。培养等分量进行旋转沉淀，丢弃上清液，细胞颗粒重悬浮在10μl 10％SDS溶液中。细胞颗粒加热1分钟到100℃，点样在尼龙膜(Roche)上。根据厂家方案，通过在含有1.5M NaCl的0.5M NaOH中孵育5分钟，通过在含有1.5M NaCl的0.5M Tris/HCl、pH7.6中孵育5分钟来中和，在2×SSC中洗涤5分钟，在Stratagene UV-Stratalinker 2400(Stratagene，La Jolla，CA)中通过1分钟UV孵育来固定，使DNA变性。使用Colwellia ppt探针探测所述印迹。阳性信号跟踪回来源反应孔，来自该反应孔的等分量平铺来获得单个菌落。这些单个的菌落接种到含有100mg/l carbampicillin的250μl LB中。生长细胞，重复如上所述的杂交操作来鉴定含有单个阳性克隆的反应孔。生长阳性克隆，分离质粒DNA，并用BglII、PvuII、PstI或SalI消化。这些消化物用于Southern杂交来确认阳性克隆。此时，所有剩余的克隆被发现是阳性的。

挑选最终的克隆中的三个(两个BglII克隆和一个PstI克隆)用于DNA测序分析。完整序列的生物信息学分析揭示了，PstI克隆仅含有部分Mm-ppt，而BglII克隆含有完整的开放阅读框。所有三个克隆的完整DNA序列被组装到一个重叠群(contig)中。选择一个BglII克隆用于进一步的克隆实验(pMON96400)。Mm-ppt的推定的氨基酸序列在SEQ ID NO：5中显示，如果起始密码子是TTG(称为长Mm-ppt)。使用Met的可选择起始密码子在SEQ ID NO：5的氨基酸43发现(产生称为短Mm-ppt的多肽，SEQ ID NO：7)。长Mm-ppt的核酸序列是SEQ ID NO：6。短Mm-ppt的核酸序列在SEQ ID NO：8中示出。本发明的Ppt的氨基酸相关性的比较在表1中示出。

表1：磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的氨基酸序列同一性

 

	Colwelliapsychrerythraea	ShewanellaSCRC 2738	Schewanellaoneidensis MRI
				Moritella marina(长)	60.9％	31.5％	30.0％
Colwellia psychrerythraea		32.4％	33.5％
				Shewanella SCRC 2738			46.6％

实施例2

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶序列在Escherichia coli中的表达

为了展现实施例1中描述的ppt的功能，将Moritella marina聚酮化合物合酶(PKS)基因克隆到Novagen pDUET载体(EMD，Biosciences，Darmstadt，Germany)中，一种4个相容的E.coli表达载体的组。这种PKS由核酸orf5(SEQ ID NO：20)、orf6(SEQ ID NO：22)、orf7(SEQ ID NO：24)和orf8(SEQ ID NO：26)编码的4个多肽组成，在6,140,486中分别被称为orf6、orf7、orf8和orf9。使用pDUET载体的3中构建了表达载体pMON94547(Orf5和Orf6)(附图3)、pMON94544(Orf7)(附图4)和pMON94534(Orf8)(附图5)。第四种pDUET载体被用于ppt表达。

为了获得酶活性的PKS，Orf5表达产物需要泛酰巯基乙胺基化，其由Ppt催化。将每种细菌ppt克隆到pACYC-DUET-1中。在实施例1中描述了pMON68081和pMON68080的构建。类似地，两种不同的推定的M.marina ppts，短Mm-ppt或长Mm-ppt被克隆到相同的基础载体中，Colwellia和Shewanella ppt分别产生pMON68084(附图6)和pMON68085(附图7)。long Mm-pptPCR引物(SEQ ID NO：27)将推定的TTG起始改变为ATG。然后每种ppt在E.coli中与M.marina PKS基因一起表达，孵育24小时，冻干的E.coli细胞直接用硫磺酸/甲醇来甲基化，通过气相色谱法分析脂肪酸甲基酯的EPA和DHA含量。结果在以下的表2中显示。

表2

 

基因组合	产生的DHA
		仅PKS	无
PKS+长Mm-ppt	有
		PKS+短Mm-ppt	有
PKS+So-ppt	有
		PKS+Cp-ppt	有
PKS-Orf8+Cp-ppt	无

在E.coli中完整的Moritella marina PKS与任何测试的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的共表达，引起了DHA的积累，而没有Ppt共表达的M.marina PKS的表达没有引起DHA积累。Cp-ppt与不完整的PKS(缺少Orf8)的共表达也不引起DHA积累。这些结果表明，所有测试的PPT泛酰巯基乙氨基化M.marina PKS，引起活性的多酶复合物的形成。

已经展现了Orf7(美国专利6,140,486中的Orf8)控制PUFA生产PKS的最终产物中的链长度。Shewanella putrefaciens的PKS产生EPA。在含有S.putrefaciens PKS簇的E.coli中的实验中，当用Moritellamarina orf7补足时，orf7缺失突变体产生了DHA。用于活化PKS的Ppt不改变产物，因而本发明的Ppt被用于在与EPA生产PKS组合时产生EPA，在与DHA生产PKS组合时产生DHA。

实施例3

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶序列在植物中的表达

为了展现M.marina PKS，包括M.marina ppt在植物中合成DHA的能力，产生了几个植物表达盒。修饰orf5-8的基因用于在双子叶植物中表达。已知的是，非内源蛋白编码序列可能不在植物中良好表达(美国专利5,880,275，通过引用合并在此)。因而，使用Orfs5-8的天然PKS多肽序列(SEQ ID NO：19、21、23和25)，通过(1)使用与高度表达的大豆蛋白类似的密码子利用率偏爱性，和2)消除早先表征的和已知影响植物中mRNA稳定性的RNA不稳定化元件(美国专利5,880,275)和通过在ATG起始密码子之前引入Kozak序列(Joshi et al.，1997)，设计和构建了人工蛋白质编码多核苷酸序列。产生的修饰的多核苷酸序列编码在序列上与天然多肽相同的多肽。

二元载体pMON97063(附图8)含有orf5的表达盒(密码子修饰的，SEQ ID NO：28)(在具有L-Ph.DnaK前导区的FMV.35S-enh启动子的控制下)和短Mm-ppt(SEQ ID NO：8)(在CaMV35S-enh启动子和L-CaMV35S前导区的控制下)。这个载体携带Bar基因作为可选择标记。二元载体pMON94563(附图9)通过克隆orf6的表达盒(密码子修饰的，SEQ ID NO：29)(在具有L-CaMV35S前导区的CaMV35S-enh启动子的控制下)、orf7(密码子修饰的，SEQ ID NO：30)(在具有L-Ph.DnaK前导区的FMV35S-enh启动子的控制下)和orf8(密码子修饰的，SEQ ID NO：31)(在具有L-CaMV35S前导区的CaMV35S-enh启动子的控制下)的表达盒来产生。pMON94563带有提供草甘膦抗性的CP4标记物。二元载体pMON97066(附图10)含有与pMON94563相同的表达盒，但是orf7盒在orf6盒之前而不是之后。所有构建体通过DNA测序来序列验证。

二元载体配对pMON97063和pMON94563、或pMON97063和pMON97066使用土壤杆菌介导的转化共转染到Arabidopsis thaliana中。再生植物，分析转化的R1 Arabidopsis植物的叶材料和这些植物的R2种子的脂肪酸含量和组成。

为了产生携带所有4种PKS基因和ppt的单个多基因二元载体，用HindIII和NotI消化低拷贝数的二元载体pMON83934，与由寡聚体MCS-3(SEQ ID NO：32)和MCS-4(SEQ ID NO：33)构成的多聚接头连接。产生的载体称为pMON68091。orf6、orf7、orf8和CP4可选择标记的表达盒通过HindIII/BsiWI消化从pMON94563上切除，并连接到HindIII/BsiWI消化的pMON68091中。产生的二元载体用AscI和BsiWI消化，并与含有通过BsiWI/AscI消化切除的、来自pMON97063的orf5和Mm-ppt的表达盒连接。产生的二元载体pMON96401(附图11)经由土壤杆菌介导的转化来转化到Arabidopsis thaliana和大豆中。植物进行再生，分析来自这些植物的叶和种子材料的脂肪酸含量和组成。

含有pMON96401的48个R1事件在Arabidopsis中产生。通过气相色谱法分析来自这项研究的成熟的R2种子。所分析的48个事件中的9个产生了DHA(表3)。

表3 含有pMON96401的种子的DNA含量

用pMON96401转化的R2 Arabidopsis种子的4个含DHA事件的分子特征在表4中表示。数据表明，通过

(Applied Biosystems，Foster City，CA)终点分析所测定的，产生DHA的事件对于5个转基因的存在是阳性的。

表4 Arabidopsis pMON96401基因存在

 

样品	DHA	PKS5	PKS-Ppt	PKS6	PKS7	PKS8
							对照	0	阴性	阴性	阴性	阴性	阴性
At_G3748	0.02	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性
							At_G3756	0.04	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性
At_G3764	0.04	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性
							At_G3764	0.07	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性

在pMON96401 Arabidopsis种子的R3世代中，通过气相色谱法，表型保持了0.025-0.1％范围的DHA。通过使用鱼油作为标准的气相色谱法/飞行时间质谱法，确认了气相色谱峰是DHA。

对于Moritella marina PKS的种子特异性表达，使用种子特异性启动子例如p7Sa、p7Sa’、Arcelin-5、USP88、pNapin、pFAE或pOleosin将天然的或密码子修饰的基因克隆为单个基因表达盒。随后，使用低拷贝数的二元载体例如pMON83934作为基础载体，组装这些表达盒来将所有五种基因组合到单个二元载体中。产生的五基因载体(它们的每一种携带所有四个PKS基因加上ppt表达盒)可以含有相互之间顺序或取向可变的表达盒。这些载体转化到大豆中，分析产生的大豆种子的脂肪酸含量和组成。

用于M.marina PKS和M.marina ppt的种子特异性表达的多基因载体的实例如下。双子叶植物密码子强化的PKS和ppt基因的种子特异性表达的表达盒如表5所描述的来组装。表达盒按照头接尾的取向组装，引起pMON78528(附图12)的形成。这种二元载体使用土壤杆菌介导的转化来转化到大豆和Arabidopsis中，分析产生的种子的脂肪酸含量和组成。

表5：M.marina PKS的种子特异性表达盒。

为了展现M.marina PKS与M.marina ppt一起来在玉米中合成DHA的能力，产生了几种植物表达盒。修饰orfs 5-8和ppt的基因用于在单子叶植物中表达。已知的是，非内源蛋白编码序列可能不在植物中良好表达(美国专利5,880,275，通过引用合并在此)。因而，使用早先描述的天然Orf和Ppt多肽序列，通过1)使用类似于高度表达的玉米蛋白质的密码子利用率偏爱，和通过2)消除早先表征的和已知影响植物中的mRNA稳定性的RNA不稳定化元件(美国专利5,880,275)，来设计和构建了人工蛋白质编码多核苷酸序列。产生的修饰的多核苷酸序列编码在序列上与天然多肽相同的多肽。用含有修饰的多核苷酸序列的载体通过根癌土壤杆菌介导的转化来获得转化的外植体。从转化的组织再生植物。然后对温室生长的植物分析目标基因表达水平以及油的组成，包括DHA或EPA。

实施例4

聚酮化合物合酶序列的克隆

从2个物种中克隆出八个候选的聚酮化合物合酶基因。M.marinaPKS基因的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：19、21、23和25)用于检索可用的数据库中的Shewanella oneidensis(ATCC#_700550)和Colwellia psychrerythreae(ATCC#_BAA-681)中的新的聚酮化合物合酶基因。S.oneidensis积累EPA，而C.psychrerythreae积累DHA。根据这一点，相信的是，这些细菌中的PUFA生产将来自PKS机制。检索从每种细菌产生了一组4个候选PKS基因。利用PCR克隆技术，将这些基因克隆到TOPO克隆载体中，证实序列，在Duet表达载体中亚克隆(参见表6)。S.oneidensis orf5与M.marina orf6、orf7、orf8和ppt一起在E.coli中的表达，如通过气相色谱法测定的，发现引起多达0.2％DHA的形成，证实了S.oneidensis orf5的预测的功能。类似地，通过在E.coli中与M.marina基因一起表达，或通过在E.coli中表达来自Shewanella或Colwellia的完整PKS基因或这两个物种的组合，确认了表6中所列的每个基因的功能。做为选择，功能在植物中展现。

表6：用于Shewanella和Colwellia PKS基因的E.coli表达载体。

 

来源有机体	基因名称	E.coli表达载体
			Shewanella oneidensis	orf5 SEQ ID NO：37	pMON108255
Shewanella oneidensis	orf6 SEQ ID NO：38	pMON108256
			Shewanella oneidensis	orf7 SEQ ID NO：39	pMON108258
Shewanella oneidensis	orf8 SEQ ID NO：40	pMON108259
			Moritella marinaShewanella oneidensis	orf6 SEQ ID NO：22orf5 SEQ ID NO：37	pMON108252
Colwellia psychrerythreae	orf5 SEQ ID NO：41	pMON108267
			Colwellia psychrerythreae	orf7 SEQ ID NO：43	pMON108269
Colwellia psychrerythreae	orf8 SEQ ID NO：44	pMON108270
			Colwellia psychrerythreae	orf5 SEQ ID NO：41orf6 SEQ ID NO：42	pMON108268

参考文献

以下列出的参考文献通过应用合并在此，达到它们补充、说明、提供背景、教导方法、技术和/或在此采用的组合物的程度。

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序列表

<110>申请人：Valentin，Henry

     Peng，Jiexin

     Screen，Steven

<120>发明名称：来自细菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶

<130>案卷号：MONS：097US

<140>当前申请号：US/11/668,354

<141>当前申请日：2007-01-29

<150>在先申请号：60/763644

<151>在先申请日：2006-01-31

<160>SEQ ID NOS数目：44

<170>软件：PatentIn version 3.3

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<212>类型：DNA

<213>生物体：Moritella marina

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<212>类型：DNA

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<212>类型：DNA

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<212>类型：DNA

<213>生物体：Moritella marina

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<213>生物体：Brassica napus

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<212>类型：DNA

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<213>生物体：Colwellia psychrerythraea

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<212>类型：DNA

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<211>长度：1599

<212>类型：DNA

<213>生物体：Colwellia psychrerythraea

<400>序列：44

Claims (25)

1.一种分离的多核苷酸，包含选自以下构成的组的序列：

(a)在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的条件下与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或其互补物杂交的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽；

(b)编码SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列的多核苷酸；和

(c)编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的、具有与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的多肽序列至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸。

2.权利要求1的分离的多核苷酸，进一步定义为与异源启动子可操作连接。

3.一种DNA构建体，其包含与权利要求1的分离的多核苷酸可操作连接的异源启动子。

4.权利要求3的DNA构建体，其中所述启动子是在原核细胞中有功能的。

5.权利要求3的DNA构建体，其中所述启动子是在真核细胞中有功能的。

6.权利要求5的DNA构建体，其中所述启动子是在植物细胞中有功能的。

7.权利要求6的DNA构建体，其中所述启动子是种子增强的启动子。

8.一种宿主细胞，用与在所述宿主细胞中有功能的启动子可操作连接的、编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的DNA分子转化，其中所述DNA分子包含选自以下构成的组的序列：

(a)权利要求1的分离的多核苷酸序列；

(b)编码与SEQ ID NO：1的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸；和

(c)编码与SEQ ID NO：3的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸。

9.权利要求8的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包括编码包含磷酸泛酰巯基乙胺附着位点的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子，其中所述编码聚酮化合物合酶多肽的DNA分子与异源启动子可操作连接。

10.权利要求9的宿主细胞，其中所述聚酮化合物合酶多肽包含来自Moritella marina的磷酸泛酰巯基乙胺附着位点。

11.权利要求9的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含编码与SEQ ID NO：19的多肽序列具有至少75％的序列同一性的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子。

12.权利要求8的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。

13.权利要求8的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌或细菌细胞。

14.权利要求8的宿主细胞，定义为相对于与所述宿主细胞相同基因型、但缺少所述DNA分子的细胞展现了改变的脂肪酸生物合成。

15.一种转基因植物，包含与在所述植物有功能的启动子可操作连接的、编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的DNA分子，其中所述DNA分子包含选自以下构成的组的序列：

(a)权利要求1的分离的多核苷酸序列；

(b)编码与SEQ ID NO：1的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸；和

(c)编码与SEQ ID NO：3的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸。

16.权利要求15的植物，其中所述植物选自由油菜、Brassicacampestris、含油种子油菜(oilseed rape)、油菜籽(rapeseed)、大豆、crambe、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、稻米、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿和高粱构成的组。

17.权利要求15的植物，进一步定义为包含编码聚酮化合物合酶的DNA分子。

18.权利要求15的转基因植物的种子，其中所述种子包含所包含的DNA分子。

19.一种生产食物或饲料的方法，包括步骤：

(a)获得权利要求15的转基因植物或其部分；和

(b)从中生产所述食物或饲料。

20.权利要求19的方法，其中所述食物或饲料是油、青贮料、粗粉、粮食、淀粉、粉末或蛋白质。

21.一种通过权利要求19的方法生产的、包含可检测的核酸分子的食物或饲料组合物，所述可检测的核酸分子包含权利要求1的分离的多核苷酸。

22.通过权利要求的方法生产的食物或饲料组合物，其中权利要求15的植物包含编码聚酮化合物合酶的DNA分子，其中所述食物或饲料组合物包含二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。

23.权利要求21的食物或饲料组合物，其中所述植物是在所述植物缺乏所述编码聚酮化合物合酶的DNA分子和编码具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽的DNA分子时不生产二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸的物种。

24.一种生产二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸的方法，包括步骤：

(a)在包含编码聚酮化合物合酶的DNA分子的植物的种子中表达选自以下构成的组的多核苷酸：(i)权利要求1的分离的多核苷酸序列，(ii)编码与SEQ ID NO：1的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸，和(iii)编码与SEQ ID NO：3的多肽序列具有至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸，来产生二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸；和

(b)从所述种子获得二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。

25.一种从根据权利要求24制备的植物产生的食物或饲料组合物，包含二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。

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