CN1816559A - 用于在含油酵母中生产多不饱和脂肪酸的密码子优化的基因 - Google Patents

用于在含油酵母中生产多不饱和脂肪酸的密码子优化的基因 Download PDF

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Abstract

本发明涉及脂肪酸去饱和酶和延伸酶，所述酶能够催化亚油酸(LA)转化成γ－亚麻酸(GLA)；α－亚油酸(ALA)转化成十八碳四烯酸(STA)；GLA转化成二高－γ－亚油酸(DGLA)；STA转化成二十碳四烯酸(ETA)；DGLA转化成ETA；二十碳五烯酸(EPA)转化成二十二碳五烯酸(DPA)；以及将花生四烯酸(ARA)转化成EPA。披露了编码密码子优化的去饱和酶和延伸酶的核酸序列，能与它杂交的核酸序列，包括密码子优化的去饱和酶或延伸酶的DNA构建体，以及能表达增高水平的去饱和酶或延伸酶的重组宿主微生物。

Description

用于在含油酵母中生产多不饱和脂肪酸的密码子优化的基因
本申请要求申请日为2003年5月7日的美国临时申请号60/468677和申请日为2003年5月7日的美国临时申请号60/468718的权益。
发明领域
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码可用于在含油酵母中生产长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)的酶的核酸片段的合成。
发明背景
很久以来就已经认识到，某些多不饱和脂肪酸，或PUFAs，是健康细胞的重要的生物学成分。例如，这样的PUFAs被认为是：
·″必需″脂肪酸，它不能够在哺乳动物体内从头合成，相反，必须从饮食中获得或者通过亚油酸(LA)或α-亚麻酸(ALA)的进一步去饱和及延伸产生；
·细胞质膜的成分，其中，它们能够以诸如磷脂或甘油三酯的形式存在；
·为正常发育所必需，特别是为婴儿脑发育和组织形成和修复所必需；和，
·在哺乳动物体内起着重要作用的若干种生物学活性类二十烷酸的前体，包括前列环素，类二十烷酸，白三烯和前列腺素。
在二十世纪70年代，发现格陵兰岛爱斯基摩人的心脏病的低发病率和大量摄入长链ω-3PUFAs相关(Dyerberg，J.等，Amer.J.Clin Nutr.28：958-966(1975)；Dyerberg，J.等，Lancet 2(8081)：117-119(July 15，1978))。更近一些的研究业已证实了ω-3 PUFAs的心血管保护作用(Shimokawa，H.，World Rev Nutr Diet，88：100-108(2001)；von Schacky，C.，和Dyerberg，J.，World Rev Nutr Diet，88：90-99(2001))。另外，业已发现，某些病症对用ω-3脂肪酸治疗有反应，如在血管成形术之后的再狭窄率，炎症症状和类风湿性关节炎，哮喘，牛皮癣和湿疹。业已证实γ-亚麻酸(GLA，一种ω-6PUFA)能降低与应激相关的血压升高，并且改善算术测验的表现。业已证实GLA和二高-γ-亚麻酸(DGLA，另一种ω-6PUFA)能抑制血小板聚集，导致血管舒张，降低胆固醇含量，并且抑制血管壁平滑肌和纤维组织的增殖(Brenner等，Adv.Exp.Med.Viol.83：85-101(1976))。施用单独的或者与二十碳五烯酸(EPA，ω-3PUFA)组合的GLA或DGLA，业已表现出能减轻或防止胃肠出血，和由非甾体类抗炎药物导致的其他副作用(U.S.4,666,701)。另外，业已证实GLA和DGLA能预防或治疗子宫内膜异位和经前综合征(U.S.4,758,592)，并且治疗肌痛性脑脊髓炎和在病毒感染之后的慢性疲劳(U.S.5,116,871)。其他证据表明，PUFAs可能与钙代谢的调控有关，表明了它们可用于治疗或预防骨质疏松症和肾或尿道结石。最后，PUFAs可用于治疗癌症和糖尿病(U.S.4,826,877；Horrobin等，Am.J.Clin.Nutr.57(Suppl.)：732S-737S(1993))。
PUFAs通常被划分成两种主要类型(由ω-6和ω-3脂肪酸组成)，它们是分别通过必需脂肪酸，LA和ALA的去饱和和延伸产生的(图1)。尽管PUFAs的多种商业来源来自天然来源(例如，月见草，琉璃苣和黑醋栗的种子；丝状真菌(Mortierella)，Porphyridium(红藻)，鱼油和海洋浮游生物(Cyclotella，Nitzschia，Crypthecodinium))，但是存在与所述生产方法相关的若干缺陷。首先，诸如鱼和植物的天然来源倾向于具有高度的不一致的油类组成。因此，从这些来源获得的油，可能需要高度纯化，以便分离或者富集一种或多种需要的PUFAs。天然来源同样会出现可利用性的无法控制的波动(例如，由于天气，疾病，或者对于鱼类资源来说的过度捕捞)；和产生PUFAs的作物通常在经济上无法与为了食物生产而培育的杂交作物竞争。能天然产生PUFAs的某些生物(例如，Porphyridium，被孢霉)的大规模发酵同样可能是昂贵的，和/或难以以商业化规模培养。
上述限制的结果是，为了达到以下目的必须进行大量的研究：1.)开发便于商业化生产的PUFAs的重组资源；和2.)修饰脂肪酸生物合成途径，以便能够生产需要的PUFAs。例如，在过去若干年中在从各种生物中分离，克隆并且操作脂肪酸去饱和酶和延伸酶基因方面取得了进展。对这些基因序列的了解，提供了在不能天然产生PUFAs的新的宿主生物中生产需要的脂肪酸和/或脂肪酸组合物的前景。以下文献披露了在酿酒酵母中的多种例子，如：
1.Domergue，F.，et al.(Eur.J.Biochem.269：4105-4113(2002))，其中海洋硅藻三角褐指藻来源的两种去饱和酶被克隆进酿酒酵母内，导致生成了EPA；
2.Beaudoin F.，et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12)：6421-6426(2000))，其中利用了秀丽新杆线虫来源的基因在酿酒酵母内重构了ω-3和ω-6 PUFA生物合成途径；
3.Dyer，J.M.et al.(Appl.Eniv.Microbiol.，59：224-230(2002))，其中在酿酒酵母内表达了植物脂肪酸去饱和酶(FAD2和FAD3)，导致生成了ALA；以及
4.U.S.6,136,574(Knutzon et al.，Abbott Laboratories)，其中将甘蓝型油菜来源的一种去饱和酶和真菌高山被孢霉来源的两种去饱和酶克隆进酿酒酵母内，导致生成了LA、GLA、ALA和STA。
不过，仍然需要合适的微生物系统，其中，上述类型的基因可以表达，以便提供商业化数量的一种或多种PUFAs的经济生产。另外，需要富集了特殊PUFAs，特别是EPA和DHA的油。
以前尚未作为PUFAs的生产平台检验的一种类型的微生物是含油酵母。这种微生物能够积累最多占它们的干细胞重量80％的油类。业已完善了用于生长具有高油含量的含油酵母的技术(例如，参见EP 0005 277 B1；Ratledge，C.，Prog.Ind.Microbiol.16：119-206(1982))，并且可以提供与生产ω-3或ω-6PUFAs的商业化微藻发酵相比的成本优势。完整的酵母细胞可能还体现了对ω-3或ω-6PUFA-富集的油进行包囊以便用于功能性食品和动物饲料添加剂的方便途径。
尽管具有上述优点，含油酵母天然上是ω-6和ω-3PUFAs缺陷型的，因为在这种微生物中天然产生的PUFAs局限于18:2脂肪酸(以及更不常见的是18:3脂肪酸)。因此，要解决的问题是，开发能积累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油类的含油酵母。为此，必须导入去饱和酶和延伸酶，这两种酶能够在含油酵母中合成和积累ω-3和/或ω-6脂肪酸。尽管可以利用来自多种来源的多种去饱和酶和延伸酶基因，但是，这些基因不能在诸如含油酵母的其他宿主中以最佳效率表达，因为这些基因的密码子不能体现所述其他宿主生物的典型的密码子选择。因此，必须克服与密码子选择相关的问题，以便优化PUFAs基因在含油酵母中的表达，以便能够在这些特殊宿主生物中高水平生产和积累ω-3和/或ω-6脂肪酸。
申请人通过开发对适合在油质宿主，即解脂耶氏酵母(YarrowiaLipolytica)中表达的去饱和酶和延伸酶基因进行密码子优化的方式解决了上述问题。本发明优化的典型基因是编码Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶和高亲和力PUFA延伸酶的基因，其中，在解脂耶氏酵母中，密码子优化将从LA到GLA(Δ6去饱和酶)的底物转化百分比提高了大约40％，从ARA到EPA(Δ17去饱和酶)的底物转化百分比提高大约2倍，而从GLA到DGLA(延伸酶)的底物转化百分比提高了大约57％。
发明概述
本发明涉及优化ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径上的各种基因，以便优化在耶氏酵母菌种中的表达。因此，本发明提供了选自下组的分离的核酸分子：
a)如SEQ ID NO：25所示的分离的核酸分子，它编码Δ6去饱和酶；或
b)完全互补于(a)的分离的核酸分子。
类似地，本发明提供了分离的核酸分子，它编码如SEQ ID NO：2所示的Δ6去饱和酶，其中，至少144个密码子是密码子优化的，以便在耶氏酵母菌种中表达。
在另一种实施方案中，本发明提供了选自下组的分离的核酸分子：
a)编码如SEQ ID NO：62所示Δ17去饱和酶的分离的核酸分子；或
b)完全互补于(a)的分离的核酸分子。
在另一种实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，它编码如SEQ ID NO：4所示的Δ17去饱和酶，其中，至少117个密码子是密码子优化的，以便在耶氏酵母菌种中表达。
类似地，本发明提供了选自下组的分离的核酸分子：
a)编码如SEQ ID NO：91所示延伸酶的分离的核酸分子；或
b)完全互补于(a)的分离的核酸分子。
另外，本发明提供了分离的核酸分子，它编码如SEQ ID NO：6所示的延伸酶，其中，至少85个密码子是密码子优化的，以便在耶氏酵母菌种中表达。
另外，本发明提供了本发明基因的遗传学嵌合体，以及用所述嵌合体转化过的宿主细胞。
在具体实施方案中，本发明提供了用于生产特殊ω-3和ω-6脂肪酸，如γ-亚麻酸(GLA)，二高-γ-亚油酸(DGLA)，十八碳四烯酸(STA)，二十碳四烯酸(ETA)，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳五烯酸(DPA)的方法，包括采用单个步骤的酶促反应，利用本发明的密码子优化的基因在耶氏酵母菌中由合适的前体生产。
在另一种实施方案中，本发明提供了优化基因以便在含油酵母中表达的方法，包括以下步骤：
a)获得含油酵母菌种的核苷酸编码区和相应的多肽的序列，以便形成密码子数据库；
b)分析所述密码子数据库，以便确定优先编码每一种氨基酸的密码子；
c)获得基因的序列，以便在含油酵母菌种中表达；
d)用步骤(b)的优选的密码子取代步骤(c)的序列上的非优选的密码子，其中，所述基因是密码子优化的，以便在含油酵母菌种中表达。
在另一种实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，它包括如SEQ ID NO：122所示的耶氏酵母属翻译起始位点。另外，提供了优化基因在耶氏酵母属宿主中表达的方法，它包括：
a)提供要在耶氏酵母属中表达的外源基因；
b)将步骤(a)的基因可操作地与SEQ ID NO：122所示的耶氏酵母属翻译起始位点可操作地连接，其中，所述外源基因是优化的，以便在耶氏酵母属中表达。
附图和序列描述的简要说明
图1表示ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途径。
图2表示用于解脂耶氏酵母中的质粒载体pY5的构建。
图3表示用于在解脂耶氏酵母中进行基因表达的质粒载体pY5-13和pY5-4的构建。
图4表示在解脂耶氏酵母中位于翻译起始密码子′ATG′周围的优选的共有序列。
图5表示高山被孢霉Δ6去饱和酶基因和密码子优化以便在解脂耶氏酵母中表达的合成基因的DNA序列的比较。
图6表示用于体外合成密码子优化的Δ6去饱和酶基因的方法。
图7表示用于在解脂耶氏酵母中表达密码子优化的Δ6去饱和酶基因的质粒。
图8表示异丝水霉Δ17去饱和酶基因和密码子优化以便在解脂耶氏酵母中表达的合成基因的DNA序列的比较。
图9表示用于体外合成密码子优化的Δ17去饱和酶基因的方法。
图10表示用于在解脂耶氏酵母中表达密码子优化的和野生型Δ17去饱和酶基因的质粒。
图11表示高山被孢霉延伸酶基因和密码子优化以便在解脂耶氏酵母中表达的合成基因的DNA序列的比较。
图12表示用于体外合成密码子优化的延伸酶基因的方法。
图13表示用于在解脂耶氏酵母中表达密码子优化的和野生型延伸酶基因的质粒。
图14A表示用密码子优化的和野生型Δ6去饱和酶基因转化过的解脂耶氏酵母生产的脂肪酸的气相层析分析，表现出大约30％的底物LA→GLA的转化百分比；而图14B表示用密码子优化的和野生型Δ6去饱和酶基因转化过的解脂耶氏酵母生产的脂肪酸的气相层析分析结果，表现出大约42％的LA→GLA的转化百分比。
图15表示用密码子优化的和野生型Δ17去饱和酶基因转化的解脂耶氏酵母生产的脂肪酸的气相层析分析结果，表现出大约23％的细胞内ARA→EPA的转化百分比；而图15B表示用密码子优化的和野生型Δ17去饱和酶基因转化的解脂耶氏酵母生产的脂肪酸的气相层析分析结果，表现出大约45％的细胞内ARA→EPA的转化百分比。
图16表示用密码子优化的和野生型延伸酶基因转化的解脂耶氏酵母生产的脂肪酸的气相层析分析结果，表现出大约30％的底物GLA→DGLA的转化百分比；而图16B表示用密码子优化的和野生型延伸酶基因转化过的解脂耶氏酵母生产的脂肪酸的气相层析分析结果，表现出大约47％的GLA→DGLA的转化百分比。
通过以下的详细说明和所附的序列说明能够更全面地理解本发明，这些内容构成了本发明的一部分。
以下序列符合37C.F.R.§1.821-1.825的规定(″Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or AminoAcid Sequence Disclosures-the Sequence Rules″)，并且，符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(Rules 5.2 and 49.5(a-bis)，and Section 208and Annex C of theAdministrative Instructions)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R.§1.822的规定。
SEQ ID NO：1表示高山被孢霉Δ6去饱和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO：2表示高山被孢霉Δ6去饱和酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3表示异丝水霉Δ17去饱和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO：4表示异丝水霉Δ17去饱和酶的相应的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5表示高山被孢霉高亲和力延伸酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO：6表示高山被孢霉高亲和力延伸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NOs：7和8分别相当于用于分离TEF启动子的引物TEF5′和TEF3′。
SEQ ID NOs：9和10分别相当于用于分离XPR2转录终止子的引物XPR5′和XPR3′。
SEQ ID NOs：11-24分别相当于用于质粒构建的引物YL1，YL2，YL3，YL4，YL23，YL24，YL5，YL6，YL9，YL10，YL7，YL8，YL61和YL62。
SEQ ID NO：25表示密码子优化以便在解脂耶氏酵母中表达的合成的Δ6去饱和酶基因的DNA序列。
SEQ ID NOs：26-53相当于14对寡核苷酸，它们一起组成了高山被孢霉Δ6去饱和酶基因的完整的密码子优化的编码区(例如，分别为D6-1A，D6-1B，D6-2A，D6-2B，D6-3A，D6-3B，D6-4A，D6-4B，D6-5A，D6-5B，D6-6A，D6-6B，D6-7A，D6-7B，D6-8A，D6-8B，D6-9A，D6-9B，D6-10A，D6-10B，D6-11A，D6-11B，D6-12A，D6-12B，D6-13A，D6-13B，D6-14A和D6-14B)。
SEQ ID NOs：54-61分别相当于引物D6-1，D6-4R，D6-5，D6-7R，D6-8，D6-10R，D6-11和D6-14R，用于在合成密码子优化的Δ6去饱和酶基因期间进行PCR扩增。
SEQ ID NO：62表示密码子优化以便在解脂耶氏酵母中表达的合成的Δ17去饱和酶基因的DNA序列。
SEQ ID NOs：63-84相当于11对寡核苷酸，它们共同组成了异丝水霉Δ17去饱和酶基因的完整的密码子优化的编码区(例如，分别为D17-1A，D17-1B，D17-2A，D17-2B，D17-3A，D17-3B，D17-4A，D17-4B，D17-5A，D17-5B，D17-6A，D17-6B，D17-7A，D17-7B，D17-8A，D17-8B，D17-9A，D17-9B，D17-10A，D17-10B，D17-11A和D17-11B)。
SEQ ID NOs：85-90分别相当于引物D17-1，D17-4R，D17-5，D17-8D，D17-8U和D17-11，用于在合成密码子优化的Δ17去饱和酶基因期间进行PCR扩增。
SEQ ID NO：91表示密码子优化以便在解脂耶氏酵母中表达的合成的高亲和力延伸酶基因的DNA序列。
SEQ ID NOs：92-111相当于10对寡核苷酸，它们共同构成了高山被孢霉高亲和力延伸酶基因的完整的密码子优化的编码区(例如，分别为EL-1A，EL-1B，EL-2A，EL-2B，EL-3A，EL-3B，EL-4A，EL-4B，EL-5A，EL-5B，EL-6A，EL-6B，EL-7A，EL-7B，EL-8A，EL-8B，EL-9A，EL-9B，EL-10A和EL-10B)。
SEQ ID NOs：112-115分别相当于引物EL-1，EL-5R，EL-6和EL-10R，用于在合成密码子优化的延伸酶基因期间进行PCR扩增。
SEQ ID NOs：116和117相当于引物EL-M1和EL-M2，用于定点诱变，以便产生pELS。
SEQ ID NOs：118和119相当于引物YL21A和YL22，用于从质粒pRSP19扩增异丝水霉的野生型Δ17去饱和酶基因。
SEQ ID NOs：120和121分别相当于引物YL53和YL54，用于定点诱变，以便产生pYSD17M。
SEQ ID NO：122相当于用于在耶氏酵母菌中优化表达的基因的密码子优化的翻译起始位点。
发明的详细说明
根据本发明，申请人业已确定了含油酵母-解脂耶氏酵母中结构基因的密码子选择。提供了编码Δ6去饱和酶(SEQ ID NO：25)，Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：62)和高亲和力延伸酶(SEQ ID NO：91)的密码子优化的基因，以及用于在解脂耶氏酵母的宿主中表达所述基因的DNA盒。另外，提供了能够改变含油酵母，如解脂耶氏酵母的长链多不饱和脂肪酸(PUFA)含量的方法和组合物。
本发明具有多种用途。通过本文所披露的方法制备的PUFAs，或它的衍生物可被用作饮食代用品，或补充物，特别是婴儿配方，用于静脉内喂饲的患者或用于预防或治疗营养不良。另外，可以将纯化的PUFAs(或它的衍生物)掺入烹饪油，脂肪，或配制的人造奶油中，以便在正常使用时，受体能接受到所需数量的饮食补充。还可将PUFAs掺入婴儿配方，营养补充物或其他食品中，并且可以用作抗炎剂或降胆固醇剂。可任选将所述组合物用于药物学用途(人或兽医)。在这种场合下，PUFAs通常是口服的，不过，可以通过能够成功地吸收它们的任何途径施用，例如，肠胃外(例如皮下，肌内或静脉内)，直肠内，阴道内或局部(例如，作为皮肤油膏或洗液)。
给人或动物补充通过重组方法生产的PUFAs，可以导致水平增加的添加的PUFAs，以及它们的代谢产物。例如，用花生四烯酸(ARA)治疗，不仅能够产生水平增加的ARA，而且还能产生ARA的下游产物，如前列腺素。复杂的调控机制，可能需要组合各种PUFAs，或者添加PUFAs的不同的缀合物，以便预防，控制或克服这样的机制，以便在个体内获得理想水平的特定的PUFAs。
定义
在本说明书中，使用了多种术语和缩写。提供了以下定义。
″开放读框″被缩写为ORF。
″聚合酶链反应″被缩写为PCR。
″美国典型培养物保藏中心″被缩写为ATCC。
″多不饱和脂肪酸″被缩写为PUFA(s)。
术语″脂肪酸″表示具有各种链长的长链脂族酸(链烷酸)，从大约C12-C22(不过已知可以采用更长和更短链长的酸)。主要的链长为C16至C22。脂肪酸的结构是通过简单的符号系统″X:Y″表示的，其中，X是在特定脂肪酸中的碳(C)原子的总数，而Y是双键的数量。
一般，脂肪酸被划分成饱和的或不饱和的。术语″饱和脂肪酸″表示在它们的碳主链之间没有″双键″的脂肪酸。相反，″不饱和脂肪酸″是沿它们的碳主链具有″双键″的顺式异构体。″单不饱和脂肪酸″沿碳主链只有一个″双键″(例如，对于棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)来说通常位于第9和第10个碳原子之间)，而″多不饱和脂肪酸″(或″PUFAs″)沿碳主链具有至少两个双键(例如，对于亚油酸(18:2)来说位于第9和第10和第12和第13个碳原子之间；对于α-亚麻酸(18:3)来说位于第9和第10，第12和第13，和第15和第16个碳原子之间)。
″PUFAs″可以划分成两种主要类型(根据最靠近脂肪酸碳链的甲基末端的第一个双键的位置(n))。因此，″ω-6脂肪酸″(ω-6或n-6)的第一不饱和的双键距离该分子的ω(甲基)末端六个碳原子，并且一共还具有两个或两个以上双键，每一个随后的不饱和出现在朝向该分子羧基末端的三个额外的碳原子。相反，″ω-3脂肪酸″(ω-3或n-3)的第一不饱和的双键距离该分子的ω末端三个碳原子，并且一共还具有三个或三个以上双键，每一个随后的不饱和出现在朝向该分子羧基末端的三个额外的碳原子。
在本说明书中，将利用ω-参考系统表示碳原子的编号，双键的编号，和最接近ω碳原子的双键的位置，从ω碳原子开始计数(它是用于这种目的的第1号)。在下面的表1中示出了这种命名方法，表示在标题为″简化符号″的栏目中。该表的其余部分归纳了ω-3和ω-6脂肪酸的常用名，在说明书中将要使用的缩写，以及每一种化合物的化学名称。
表1
多不饱和脂肪酸的命名
  常用名   缩写   化学名称   简化符号
  亚油酸   LA   顺-9，12-十八碳三烯酸   18:2ω-6
  γ-亚油酸   GLA   顺-6，9，12-十八碳三烯酸   18:3ω-6
  二高-γ-亚油酸   DGLA   顺-8，11，14-二十碳三烯酸   20:3ω-6
  花生四烯酸   ARA   顺-5，8，11，14-二十碳三烯酸   20:4ω-6
  α-亚麻酸   ALA   顺-9，12，15-十八碳三烯酸   18:3ω-3
  十八碳四烯酸   STA   顺-6，9，12，15-十八碳三烯酸   18:4ω-3
  二十碳三烯酸   ETA   顺-8，11，14，17-二十碳三烯酸   20:4ω-3
  二十碳五烯酸   EPA   顺-5，8，11，14，17-二十碳三烯酸   20:5ω-3
  二十二碳五烯酸   DPA   顺-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸   22:5ω-3
  二十二碳六烯酸   DHA   顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸   22:6ω-3
术语″必需脂肪酸″表示个体为了生存必须摄入的PUFA，因为所述个体不能从头合成所述特定必需脂肪酸。例如，哺乳动物不能合成必需脂肪酸亚油酸(18:2，ω-6)。其他必需脂肪酸包括GLA(ω-6)，DGLA(ω-6)，ARA(ω-6)，EPA(ω-3)和DHA(ω-3)。
术语″脂肪″表示脂类物质，它在25℃下是固体，并且通常是饱和的。
术语″油″表示在25℃下是液体并且通常是多不饱和的脂类。PUFAs存在于某些藻类，含油酵母和丝状真菌的油中。″微生物油″或″单细胞油″是由微生物在它们的生命过程中天然产生的油类。这种油类可能包括长链PUFAs。
术语″PUFA生物合成途径酶″表示与PUFA的生物合成相关的以下任何酶(以及编码所述酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ9去饱和酶和/或延伸酶。
术语″ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径″表示一组基因，当它们在合适的条件下表达时，编码能催化ω-3和/或ω-6脂肪酸生产的酶。通常，与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径相关的基因编码某些或所有以下的酶：Δ12去饱和酶，Δ6去饱和酶，延伸酶，Δ5去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ9去饱和酶和Δ4去饱和酶。在图1中示出了典型的途径，它可以通过各种空间产物将油酸转化成DHA，并且证实了如何由普通来源生产ω-3和ω-6脂肪酸。
术语″去饱和酶″表示能够对一种或多种脂肪酸去饱和以便产生单-或多不饱和脂肪酸或感兴趣的前体的多种酶复合物的多肽成分。尽管在本说明书中ω-参考系统被用于表示特殊的脂肪酸，更常见的是，利用Δ-系统从底物的羧基末端开始计数以表示去饱和酶的活性。本发明特别感兴趣的是：1.)Δ17去饱和酶，它能使脂肪酸的位于从该分子的羧基末端开始计数的第17和第18个碳原子之间去饱和，并且，例如，催化ARA转化成EPA和/或DGLA转化成ETA；2.)Δ6去饱和酶，它能催化LA转化成GLA和/或ALA转化成STA；3.)Δ5去饱和酶，它能催化DGLA转化成ARA和/或ETA转化成EPA；4.)Δ4去饱和酶，它能催化DPA转化成DHA；5.)Δ12去饱和酶，它能催化油酸转化成LA；6.)Δ15去饱和酶，它能催化LA转化成ALA；和7.)Δ9去饱和酶，它能催化棕榈酸酯或盐转化成棕榈油酸(16:1)和/或硬脂酸酯或盐转化成油酸(18:1)。
术语″延伸酶″表示能够延伸脂肪酸碳链，以便产生比延伸酶作用的脂肪酸底物长2个碳原子的单或多不饱和脂肪酸的多酶复合物的多肽成分。这种延伸过程是通过与脂肪酸合成酶相关的多步骤机制发生的，其中，CoA是酰基载体(Lassner等，The Plant Cell 8：281-292(1996))。简单地讲，丙二酰-CoA与长链酰基-CoA缩合，以便产生CO2和β-酮酰基-CoA(其中，酰基部分业已延长了两个碳原子)。随后的反应包括还原成β-羟酰基-CoA，脱水形成烯酰基-CoA，并且第二次还原，以便产生延长的酰基-CoA。由延伸酶催化的反应的例子是将GLA转化成DGLA，STA转化成ETA和将EPA转化成DPA。因此，延伸酶可以具有不同的特异性(例如，C16/18延伸酶优选C16底物，C8/20延伸酶优选Ci8底物，而C20/22延伸酶优选C20底物)。
术语″高亲和力延伸酶″表示它的底物特异性优选GLA的延伸酶(DGLA是延伸酶反应的产物)。在WO 00/12720中披露了一种这样的延伸酶。
术语″转化效率″和″底物转化百分比″表示特定的酶(例如，去饱和酶或延伸酶)可以将底物转化成产物的效率。转化效率是按照以下公式计算的：([产物]/[底物+产物])*100，其中′产物′包括产生它的途径上的中间产物和所有产物。
术语″含油的″表示倾向于以脂类形式储存它们的能源的生物(Weete，In：Fungal Lipid Biochemistry，2nd ed.，Plenum，1980)。一般，所述微生物的细胞PUFA含量遵循S形曲线，其中，脂类的浓度增加，直到在后对数期或早期静止生长期的最大值，然后在晚期静止期和死亡期逐渐减少(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ，Microbiol.57：419-25(1991))。
术语″含油酵母″表示被分类为酵母的微生物，它们能够积累占干细胞重量至少25％的油。含油酵母的例子包括，但不局限于以下属：耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。
术语″可发酵的碳源″表示微生物能够代谢以便产生能量的碳源。本发明的典型的碳源包括，但不局限于：单糖，寡糖，多糖，链烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油单酯，甘油二酯，甘油三酯，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸盐或酯以及含碳的胺。
术语″密码子优化的″表示用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区时，表示在所述核酸分子的基因或编码区中的密码子的改变，以便体现宿主生物的典型的密码子选择，而又不改变由所述DNA所编码的多肽。在本发明的范围内，基因和DNA编码区是利用在表4中收集的信息进行密码子优化的，以便在耶氏酵母菌中进行最佳表达。
在本文中，″分离的核酸片段″是单链或双链RNA或DNA，它任选包括合成的，非天然的或改变了的核酸碱基。DNA聚合物形式的分离的多核酸片段可能由一个或多个cDNA，基因组DNA或合成DNA的片段组成。
氨基酸或核苷酸序列的″主要部分″是包括多肽的一定数目的氨基酸序列或基因的核苷酸序列的部分，所述数目足够通过本领域技术人员对所述序列进行的人工评估，或通过计算机自动化的序列比较，以及使用诸如BLAST的算法的鉴定(Basic Local Alignment SearchTool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)而推测性地鉴定该多肽或基因。一般，核苷酸序列的″主要部分″包括足够的序列(例如，20-30个连续的核苷酸)，以便特异性地鉴定和/或分离包括所述序列的核酸片段。本说明书披露了编码一种或多种特定蛋白的部分或全部核苷酸序列。技术人员利用本文所提供的序列，可以将所披露序列的全部或主要部分用于本领域技术人员所公知的目的。因此，本发明包括在所附序列表中所提供的完整的序列，以及如上文所定义的这些序列的主要部分。
术语″互补的″被用于表示能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的相互关系。例如，对于DNA来说，腺嘌呤互补于胸腺嘧啶，而胞嘧啶互补于鸟嘌呤。因此，本发明还包括分离的核酸片段，它互补于在所附序列表中提供的完整序列，以及基本上类似的核酸序列。
″密码子简并性″表示遗传密码的性质，它允许改变核苷酸序列，而又不影响所编码的多肽的氨基酸序列。技术人员在用核苷酸密码子表示特定氨基酸时充分理解由特定宿主细胞所表现出来的″密码子偏倚″。因此，在合成用于改善在宿主细胞中的表达的基因时，需要设计所述基因，以便它的密码子选择的频率接近宿主细胞的优选密码子选择的频率。
表示DNA序列的″化学合成的″表示组成核苷酸是在体外组装的。DNA的人工化学合成，可以通过使用业已建立的方法完成；或可以利用多种商业化仪器中的一种进行自动化的化学合成。″合成基因″可以由寡核苷酸基本单位组装，它们是利用本领域技术人员所公知的方法化学合成的。将这些基本单位连接在一起并且退火，以便形成基因片段，然后酶促组装，以便构建完整的基因。因此，可以对基因进行修饰，以便根据核苷酸序列的优化优化基因表达，以便体现宿主细胞的密码子偏倚。如果密码子选择偏向宿主优选的密码子，技术人员可以理解成功的基因表达的可能性。优选密码子的确定可以根据对来自宿主细胞的基因的检查，其中，可以获得序列信息。
″基因″表示能表达特定蛋白的核酸片段，包括位于编码序列前面(5′非编码序列)和后面(3′非编码序列)的调控序列。″天然基因″表示天然与它自身的调控序列一起出现的基因。″嵌合基因″表示不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起存在的调控和编码序列。因此，嵌合基因可以包括来自不同来源的调控序列和编码序列，或来自相同的来源，但是以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。″内源基因″表示存在于生物基因组上的天然位置上的天然基因。″外源″基因表示正常情况下不存在于宿主生物中，而是通过基因转移导入所述宿主生物的基因。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。″转基因″是业已通过转化方法导入所述基因组的基因。″密码子优化的基因″是具有经过设计以便模拟宿主细胞的优选的密码子选择频率的密码子选择频率的基因。
″编码序列″表示编码特定氨基酸序列的DNA序列。″合适的调控序列″表示位于编码序列上游(5′非编码序列)，序列内，或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，并且，它能影响相关编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或翻译。调控序列可以包括启动子，翻译前导序列，内含子，聚腺苷酸化识别序列，RNA加工位点，效应物结合位点和茎-环结构。
″启动子″表示能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般，编码序列位于启动子序列的3′侧。启动子可能完全来自天然基因，或者由来自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域技术人员可以理解的是，不同的启动子能够指导基因在不同的组织或细胞类型中的表达，或者在发育的不同阶段的表达，或者对不同的环境或生理学条件作出反应的表达。能导致基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称作″组成型启动子″。还应当理解的是，由于在大多数场合下，调控序列的确切边界未能完全确定，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语″3′非编码序列″或″转录终止子″表示位于编码序列下游的DNA序列。它包括聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常以影响聚腺苷酸添加在mRNA前体的3′末端为特征。所述3′区能够影响相关编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或翻译。
″RNA转录物″表示由RNA聚合酶催化的DNA序列转录而得到的产物。当RNA转录物是所述DNA序列的完整的互补拷贝时，它被称作初级转录物，或者它可以是来自初级转录物的转录后加工的RNA序列，并且被称作成熟的RNA。″信使RNA″或″mRNA″表示没有内含子，并且能够由细胞翻译成蛋白的RNA。″cDNA″表示双链DNA，它是互补于mRNA并且由mRNA衍生的。″有义″RNA表示包括mRNA，并能够由细胞翻译成蛋白的RNA转录物。″反义″RNA表示互补于靶初级转录物或mRNA的全部或部分的RNA，并且它能抑制靶基因的表达(U.S.5,107,065；WO 99/28508)。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录物的任何部分，即，位于5′非编码序列，3′非编码序列，或编码序列互补的。″功能性RNA″表示反义RNA，核酶RNA，或不能翻译，但仍然能影响细胞加工的其他RNA。
术语″可操作地连接的″表示核酸序列缔合在一个核酸片段上，以便其中一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它就是与该编码序列可操作地连接的(即，所述编码序列受所述启动子的转录控制)。编码序列能够沿有义或反义方向可操作地与调控序列连接。
在本文中，术语″表达″表示来自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以表示mRNA翻译成多肽。
″成熟″蛋白表示翻译后加工的多肽；即，业已除去了存在于初级翻译产物中的所有前肽或原肽的蛋白。″前体″蛋白表示mRNA翻译的初级产物；即，仍然存在前肽和原肽。前肽和原肽可以是(但不局限于)细胞内定位信号。
″转化″表示将核酸分子转入宿主生物，导致了遗传学稳定的遗传性。例如，核酸分子可以是能自主复制的质粒；或者它可以整合到宿主生物的基因组中。包括转化的核酸片段的宿主生物被称作″转基因″或″重组″或″转化过的″生物。
术语″质粒″，″载体″和″盒″表示染色体外元件，它通常携带有不是细胞的中央代谢部分的基因，并且通常是环状双链DNA片段形式的。所述基因可以是自主复制的序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列，线性或环状的单或双链DNA或RNA，可以来自任何来源，其中，多个核苷酸序列业已连接或重组成独特的结构，它能够将启动子片段和选定的基因产物的DNA序列，以及合适的3′非翻译序列导入细胞。
″转化盒″表示包括外源基因，并且除了外源基因之外还具有能促进在特定宿主细胞中转化的元件的特定载体。″表达盒″表示包括外源基因，并且除了外源基因之外，还具有能够增强基因在外源宿主中表达的元件的特定载体。
术语″改变了的生物学活性″表示与由核苷酸序列编码的蛋白相关的活性，它可以通过测定方法测定，其中，所述活性大于或小于与天然序列相关的活性。″增强了的生物学活性″表示大于与天然序列相关的活性的改变了的活性。″减弱了的生物学活性″是小于与天然序列相关的活性的改变了的活性。
术语″序列分析软件″表示可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。″序列分析软件″可以是通过商业渠道获得的或者独立开发的。典型的序列分析软件包括，但不局限于：1.)GCG程序组(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；和4.)采用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本申请的范围内应当理解的是，在将序列分析软件用于分析时，分析的结果是基于有关程序的″预设值″的，除非另有说明。在本文中，″预设值″表示任何组的值或参数，它是在初次初始化时最初随所述软件加载的。
本发明所使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且披露于以下文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(此后称作″Maniatis″)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等，Current ProtocolsinMolecular Bioloqy，由Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience(1987)出版。
脂肪酸的微生物生物合成
一般，在含油微生物中的脂类的积累是反应于存在于生长培养基中的总的碳与氮的比例引发的。当细胞耗尽了可利用的氮源时(例如，当碳与氮的比例超过大约40时)，细胞一磷酸腺苷(AMP)的消耗，导致了线粒体中AMP-依赖型异柠檬酸脱氢酶活性的终止和柠檬酸的积累，并且将柠檬酸转移到细胞质，并且随后通过ATP-柠檬酸裂解酶裂解，产生乙酰-CoA。乙酰-CoA是脂肪酸从头合成的主要基本单位。尽管任何能够有效代谢产生乙酰-CoA的化合物都可用作脂肪酸的前体，葡萄糖是这种类型反应中的主要碳源。通过糖酵解将葡萄糖转化成丙酮酸，并且然后将丙酮酸转入线粒体，在这里，它能够通过丙酮酸脱氢酶转化成乙酰-CoA。由于乙酰-CoA不能直接通过线粒体膜转入细胞质，乙酰-CoA上的两个碳与草酰乙酸缩合，以便产生柠檬酸(通过柠檬酸合酶催化)。柠檬酸被直接转入细胞质，在这里，它被ATP-柠檬酸酶裂解，以便再生乙酰-CoA和草酰乙酸。草酰乙酸通过转化成苹果酸重新进入三羧酸循环。
丙二酰-CoA的合成是脂肪酸生物合成的第一个关键步骤，它是在细胞质中进行的。丙二酰-CoA是通过乙酰-CoA羧化酶催化由乙酰-CoA的羧化产生的。脂肪酸合成是通过多种酶脂肪酸合酶复合物(″FAS″)催化的，并且通过八种二碳片段(来自乙酰-CoA的乙酰基团)的缩合进行，以便形成16-碳饱和脂肪酸棕榈酸。更具体地讲，FAS催化一系列的7个反应，该系列包括以下反应(Smith，S.FASEB J，8(15)：1248-59(1994))：
1.乙酰-CoA和丙二酰-CoA被转移到FAS的酰基载体肽(ACP)上。所述乙酰基团然后被转移到丙二酰基团上，形成β-酮丁酰基-ACP，并且释放CO2。
2.所述β-酮丁酰基-ACP发生还原(通过β-酮酰基还原酶)和脱水(通过β-羟酰基脱水酶)，以便形成反式-单不饱和的脂肪酰基。
3.通过NADPH还原双键，产生比最初的基团长两个碳原子的饱和脂肪酰基。然后再生了丁酰基-基团与新的丙二酰基团缩合，并且重复所述延伸过程的能力。
4.当脂肪酰基变成16个碳原子长时，硫酯酶活性水解它，释放游离的棕榈酸。
棕榈酸(16:0)是长链饱和和不饱和脂肪酸(例如，硬脂酸(18:0)，棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1))的前体，通过存在于内质网膜中的延伸酶和去饱和酶的作用产生棕榈酸。通过Δ9去饱和酶的作用分别将棕榈酸和硬脂酸转化成它们的不饱和衍生物，即棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)。
三酰基甘油(脂肪酸的主要储存单位)是通过将两个分子的酰基-CoA酯化成甘油-3-磷酸产生1，2-磷酸二酰基甘油的(通常被称为磷脂酸)。然后通过磷脂酸磷酸酶除去磷酸，以便得到1，2-二酰基甘油。三酰基甘油是通过二酰基甘油-酰基转移酶的作用添加第三个脂肪酸形成的。
Ω脂肪酸的生物合成
简单地讲，将LA转化成GLA，DGLA和ARA(ω-6途径)和ALA转化成STA，ETA，EPA，DPA和DHA(ω-3途径)的代谢过程涉及通过添加碳原子延长碳链，和通过添加双键使分子去饱和(图1)。这需要存在于内质网膜中的一系列特殊去饱和和延伸酶。
ω-6脂肪酸
通过Δ12去饱和酶的作用将油酸转化成LA(18:2)，它是ω-6脂肪酸的第一个。按以下方法产生后续的ω-6脂肪酸：1.)通过Δ6去饱和酶的活性将LA转化成GLA；2.)通过延伸酶的作用将GLA转化成DGLA；和3.)通过Δ5去饱和酶的作用将DGLA转化成ARA。
ω-3脂肪酸
通过Δ15去饱和酶的作用将亚油酸(LA)转化成ALA，即ω-3脂肪酸的第一个。通过一系列类似于ω-6脂肪酸的步骤产生后续的ω-3脂肪酸。具体地讲：1.)通过Δ6去饱和酶的活性将ALA转化成STA；2.)通过延伸酶的活性将STA转化成ETA；和3.)通过Δ5去饱和酶的活性将ETA转化成EPA。另外，ETA和EPA可以通过Δ17去饱和酶的活性分别由DGLA和ARA产生。还可以通过延伸酶和Δ4去饱和酶的活性进一步将EPA转化成DHA。
与Ω脂肪酸生产相关的基因
很多微生物，包括藻类，细菌，霉菌和酵母都可以通过正常细胞代谢过程合成PUFAs和ω脂肪酸。进行过充分研究的是包括Schizochytrium aggregatm，破囊壶菌属的种和高山被孢菌在内的真菌。很多沟鞭藻类(Dinophyceaae)都能天然产生高浓度的PUFAs。因此，业已通过遗传学方法鉴定了与油类产生相关的多个基因，并且某些基因的DNA序列可以公开获得(非限定性例子如下面的表2所示)：
表2
某些可公开获得的与PUFA生产相关的基因
  GenBank登录号   描述
  AY131238   Argania spinosaΔ6去饱和酶
  YO55118   Echium pitardii var.pitardiiΔ6去饱和酶
  AY055117   Echium gentianoidesΔ6去饱和酶
  AF296076   鲁克氏毛霉Δ6去饱和酶
  AF007561   Borago officinalisΔ6去饱和酶
  L11421   Synechocystis sp.Δ6去饱和酶
  NM_031344   褐家鼠Δ6脂肪酸去饱和酶
  AF465283，AF465281，AF110510   高山被孢霉Δ6脂肪酸去饱和酶
  AF465282   深黄被孢霉Δ6脂肪酸去饱和酶
  AF419296   畸雌腐霉Δ6脂肪酸去饱和酶
  AB052086   卷枝毛霉Δ6脂肪酸去饱和酶的D6d mRNA
  AJ250735   Ceratodon purpureus Δ6脂肪酸去饱和酶的mRNA
  AF126799   人Δ6脂肪酸去饱和酶
  AF126798   小鼠Δ6脂肪酸去饱和酶
  AF199596，AF226273   人Δ5去饱和酶
  AF320509   褐家鼠肝Δ5去饱和酶
  AB072976   小鼠Δ5去饱和酶的D5D mRNA
  AF489588   破囊壶菌种ATCC21685 Δ5脂肪酸去饱和酶
  AJ510244   大雄疫霉Δ5脂肪酸去饱和酶的mRNA
  AF419297   畸雌腐霉Δ5脂肪酸去饱和酶
  AF07879   秀丽新杆线虫Δ5脂肪酸去饱和酶
  AF067654   高山被孢霉Δ5脂肪酸去饱和酶
  AB022097   Dictyostelium discoideumΔ5脂肪酸去饱和酶的mRNA
  AF489589.1   破囊壶菌种ATCC21685 Δ4脂肪酸去饱和酶
  AY332747   Paylovalutheri Δ4脂肪酸去饱和酶
  AAG36933   Emencella nidulans油酸Δ12去饱和酶
  AF110509，AB020033   高山被孢霉Δ12脂肪酸去饱和酶mRNA
  AAL13300   高山被孢霉Δ12脂肪酸去饱和酶
  GenBank登录号   描述
  AF417244   高山被孢霉ATCC16266 Δ12脂肪酸去饱和酶基因
  AF161219   鲁克氏毛霉Δ12去饱和酶mRNA
  X86736   Spiruline platensis Δ12去饱和酶
  AF240777   秀丽新杆线虫Δ12去饱和酶
  AB007640   Chlamydomonas reinhardtii Δ12去饱和酶
  AB075526   普通小球藻Δ12去饱和酶
  AP002063   拟南芥微粒体Δ12去饱和酶
  NP_441622，BAA18302，BAA02924   Synechocystis sp.PCC 6803Δ15去饱和酶
  AAL36934   Perilla frutescens Δ15去饱和酶
  AF338466   Acheta domesticus Δ9去饱和酶3mRNA
  AF438199   Picea glauca去饱和酶Δ9(Des9)mRNA
  E11368   AnabaenaΔ9去饱和酶
  E11367   SynechocystisΔ9去饱和酶
  D83185   Pichia angustaΔ9脂肪酸去饱和酶的DNA
  U90417   Synechococcus vulcanus Δ9酰基-脂类脂肪酸-去饱和酶(desC)基团
  AF085500   高山被孢霉Δ9去饱和酶mRNA
  AY504633   Emericella nidulansΔ9硬脂酸去饱和酶(sdeB)基因
  NM_069854   秀丽新杆线虫必需脂肪酸去饱和酶，硬脂酰-CoA去饱和酶(39.1KD)(脂肪-6)完整mRNA
  AF230693   Brassica oleracea cultivar Rapid Cycling硬脂酰-ACP去饱和酶(Δ9-B0-1)基因，外显子序列
  AX464731   高山被孢霉延伸酶基因(也见WO 02/08401)
  NM_119617   拟南芥脂肪酸延伸酶1(FAE1)(At4g34520)mRNA
  NM_134255   小鼠ELOVL家族成员5，长链脂肪酸的延伸(酵母)(Elov15)，mRNA
  NM_134383   褐家鼠脂肪酸延伸酶2(rELO2)，mRNA
  NM_134382   褐家鼠脂肪酸延伸酶1(rELO1)，mRNA
  NM_068396，NM_068392，NM_070713NM_068746，NM_064685   秀丽新杆线虫脂肪酸延伸(elo-6)，(elo-5)，(elo-2)，(elo-3)和(elo-9)mRNA
另外，专利文献提供了与PUFA生产相关的很多其他基因的DNA序列(和/或与上述若干基因相关的细节以及它们的分离方法)。例如，参见：U.S.5,968,809(Δ6去饱和酶)；U.S.2003/0196217A1(Δ17去饱和酶)；U.S.5,972,664和U.S.6,075,183(Δ5去饱和酶)；WO 91/13972和U.S.5,057,419(Δ9去饱和酶)；WO 93/11245(Δ15去饱和酶)；WO 94/11516，U.S.5,443,974和WO 03/099216(Δ12去饱和酶)；WO 02/090493(Δ4去饱和酶)；和WO 00/12720和U.S.2002/0139974A1(延伸酶)。上述每一份专利和专利申请都以它们的全文形式收作本文参考。
正如本领域技术人员所了解的，导入用于生产特定的PUFA最终产物的宿主生物所需要的特殊功能，取决于宿主细胞(以及它的天然PUFA谱和/或去饱和酶谱)，底物的可利用性和需要的最终产物。正如在共同未决的美国临时申请60/467677(被以全文形式收作本文参考)所披露的以及在图1中所示出的，LA，GLA，DGLA，ARA，ALA，STA，ETA，EPA，DPA和DHA都可以在含油酵母中生产，这是通过导入以下PUFA酶功能的各种组合：Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ9去饱和酶和/或延伸酶。根据可公开获得的文献(例如，GenBank)，专利文献，以及对具有生产PUFAs的能力的微生物进行的实验分析，本领域技术人员能够鉴定编码上述每一种酶的各种候选基因。所述序列可来自任何来源，例如，从天然来源中分离(从细菌，藻类，真菌，植物，动物等中分离)，通过半合成途径生产，或从头合成。不过，正如本领域技术人员所了解的，异源基因能够以不同的效率在不同的宿主中表达。因此，因此选择特定的去饱和酶或延伸酶能够优化ω-3和/或ω-6PUFA生产，它在异源宿主中的表达水平优选与其他去饱和酶或延伸酶在感兴趣的宿主生物中的表达水平相关。
尽管导入宿主的去饱和酶和延伸酶基因的特定来源并不重要，选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑因素包括：1.)所述多肽的底物特异性；2.)所述多肽或它的成分是否是限速酶；3.)所述去饱和酶或延伸酶是否是合成需要的PUFA所必需的；和/或4.)所述多肽所需要的辅助因子。所表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的部位的生物化学环境相容的参数。例如，所述多肽可能必须与宿主细胞中的其他酶竞争底物。因此，在确定特定多肽修饰PUFA在特定宿主细胞中的生产的合适性时，需要考虑KM和所述多肽比活性的分析。用于特定宿主细胞中的多肽是这样的多肽，它能在存在于预期宿主细胞中的生物化学条件下起作用，但原本可以是具有能够修饰需要的PUFA的具有去饱和酶或延伸酶活性的任何多肽。
不过，对于本发明的研究来说，其中，最终目的是培育能积累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油类的含油酵母，需要鉴定具有去饱和酶和延伸酶活性的能够在含油酵母中相对有效地起作用的多肽。因此，在含油酵母中表达各种去饱和酶和延伸酶，并且在底物-补给实验中筛选它们产生ω-3和/或ω-6脂肪酸的能力。一旦鉴定了合适的酶(根据底物转化的总百分比)，就对这些基因进行下文所述的密码子优化技术，以便进一步优化每一种酶在其他含油酵母宿主中的表达。这能够使ω-3和/或ω-6脂肪酸的产量最大化。
本领域技术人员了可以理解的是，在本文中被选择用于密码子优化的特殊的PUFA基因仅仅是代表性的，而不是要限定本发明的范围；可以对来自各种来源的多种其他异源去饱和酶(具有Δ4，Δ5，Δ6，Δ9，Δ12，Δ15和/或Δ17去饱和酶活性)和延伸酶可以进行密码子优化，以便增强它们在含油酵母宿主中的表达。
对Ω脂肪酸基因进行密码子优化以便在含油酵母中表达
正如本领域技术人员所公知的，使用宿主优选的密码子能够显著增强编码多肽的外源基因的表达。一般，可以在特定的感兴趣的宿主物种中确定宿主优选的密码子，包括检查蛋白中的密码子选择(优选大量表达的蛋白)，并且确定哪些密码子是以最高频率使用的。然后，可以使用在所述宿主物种中优选的密码子完成或部分合成具有去饱和酶或延伸酶活性的感兴趣的多肽的编码序列。因此，优化在感兴趣的特定宿主生物中表达的基因的方法通常需要以下步骤：
a)获得感兴趣的特定宿主生物的核苷酸编码区和相应的多肽的序列，以便形成密码子数据库；
b)分析所述密码子数据库，以便确定哪些密码子优先编码每一种氨基酸；
c)获得要在感兴趣的特定宿主生物中表达的基因的序列(例如，去饱和酶或延伸酶)；
d)用步骤(b)的优选的密码子取代步骤(c)的序列中的非优选密码子，其中，所述基因是密码子优化的，以便在感兴趣的特定宿主生物中表达。
也可以合成所述DNA的全部(或部分)，以便除去可能出现在转录的mRNA上的任何去稳定化序列或二级结构区。还可以合成所述DNA的全部(或部分)，以便改变将碱基组成改变成在需要的宿主细胞中更优选形式。
对于本发明来说，需要修饰编码具有PUFA去饱和酶和延伸酶活性的要在外源宿主中表达的特定多肽的密码子的一部分，以便修饰过的多肽使用替代宿主(即，含油酵母)所优选的密码子。具体地讲，需要修饰编码具有Δ17去饱和酶活性，Δ6去饱和酶活性和延伸酶活性的多肽的密码子的一部分，以便增强基因在解脂耶氏酵母中的表达。因此，确定了解脂耶氏酵母的密码子选择谱，参见表4(实施例3)。另外，业已发现，翻译起始密码子′ATG′周围的核苷酸序列能影响在酵母细胞中的表达。如果多肽在酵母中的表达较差，就可以修饰外源基因的核苷酸序列，以便包括有效的酵母翻译起始序列，以便获得最佳基因表达。因此，为了进一步优化在解脂耶氏酵母中的基因表达，还确定了′ATG′起始密码子周围的共有序列(图4；SEQ ID NO：122)。
根据解脂耶氏酵母密码子选择谱和′ATG′起始密码子周围的共有序列，修饰了Δ17去饱和酶基因，Δ6去饱和酶基因和延伸酶基因的核酸序列，以便使用宿主优选的密码子。更具体地讲，选择高山被孢霉(ATCC#16266)Δ6去饱和酶(GenBank登录号AF465281；U.S.5,968,809)导入将LA转化成GLA和/或将ALA转化成STA的酶促活性。这种野生型去饱和酶具有457个氨基酸(SEQ ID NO：2)，并且推测的分子量为51.8kD；在本发明产生的密码子优化的基因上，对1374bp编码区(相当于144个密码子)上的152bp进行密码子优化，并且修饰翻译起始位点。用类似方法，选择野生型异丝水霉(ATCC#56851)Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：4；U.S.2003/0196217A1)，以便导入将DGLA转化成ETA和/或将ARA转化成EPA的酶促活性；不过，修饰翻译起始位点，并且对1077bp编码区(包括117个密码子)的127bp进行密码子优化。最后，选择野生型高山被孢霉高亲和力PUFA延伸酶(GenBank登录号AX464731；WO 00/12720)，具有318个氨基酸(SEQ ID NO：6)，并且推测的分子量为40.5kD，优化它在含油酵母中的表达，以便将GLA转化成DGLA，将STA转化成ETA和/或将EPA转化成DPA。具体地讲，对957bp编码区(相当于85个密码子)的94bp进行密码子优化，并且修饰翻译起始位点。因此，本发明包括合成的密码子优化的基因的完整序列，正如在所附序列表中所示出的，这些完整序列的互补序列，以及这些序列的主要部分。
技术人员了可以理解的是，本文所披露的优化方法同样可应用于其他基因(例如，在ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径中的基因)，并且对异丝水霉Δ17去饱和酶和高山被孢霉Δ6去饱和酶和高山被孢霉延伸酶的调节仅仅是示例的。
通过基因突变优化密码子优化的基因
尽管密码子优化是体内生产分别具有去饱和酶或延伸酶活性，在体内具有在含油酵母中起作用的更理想的物理和动物学参数的多肽的有用方法，还可利用其他方法进一步增强多肽在宿主细胞中的活性。具体地讲，用于合成序列并且将这些序列组合在一起的方法在文献中业已完善。例如，体外诱变和选择，定点诱变，易错PCR(Melnikov等，Nucleic Acids Research，27(4)：1056-1062(February 15，1999))，″基因改组″或其他方法可用于获得天然存在的或密码子优化的去饱和酶或延伸酶基因的突变。这样使得能够生产去饱和酶或延伸酶多肽，它们分别具有，例如更长的半衰期或需要的PUFA在体内生产的更高速度。
如果需要，对酶促活性重要的密码子优化的去饱和酶或延伸酶多肽的区可以通过常规诱变，所得到的突变多肽的表达以及确定它们的活性而确定。突变体可以包括缺失，插入或点突变，或它们的组合。典型的功能性分析始于缺失诱变，以便确定功能所需要的蛋白的N-末端和C-末端限制，然后进行内部缺失，进行插入或点突变，以便进一步确定功能所需要的区。还可以使用其他技术，如盒诱变或完全合成。例如，缺失诱变是通过使用核酸外切酶依次去掉5′或3′编码区实现的。可以获得用于这种技术的试剂盒。在缺失之后，在5′或3′缺失之后通过将包括起始或终止密码子的寡核苷酸分别连接在缺失的编码区上获得所述编码区。另外，通过各种方法将编码起始或终止密码子的寡核苷酸插入所述编码区，包括定点诱变，诱变PCR或通过连接到在现有限制位点上消化过的DNA上。内部缺失同样可以通过多种方法实现，包括使用DNA上的现有限制位点，通过使用诱变引物进行定点诱变或诱变PCR。插入是通过诸如接头-扫描诱变，定点诱变或诱变PCR的方法完成的。点突变是通过诸如定点诱变或诱变PCR的技术完成的。
还可将化学诱变用于鉴定对活性重要的去饱和酶或延伸酶多肽区。表达突变的构建体，并且测定所得到的改变了的蛋白作为去饱和酶或延伸酶的能力。这种结构-功能分析，可以确定哪些区可以缺失，哪些区能够承受插入，以及哪些点突变使得突变的蛋白能够以基本上与天然(或密码子优化的)的去饱和酶或延伸酶相同的方式起作用。
ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生产
ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生产与从诸如鱼或植物的天然来源中纯化相比具有若干优点。例如：
1.)已知与高等生物相比，很多微生物具有大大简化了的油类组成，使得对需要成分的纯化更容易；
2.)微生物生产不容易出现由外部因素导致的波动，如天气和食物供应；
3.)微生物生产的油基本上不会受到环境污染物的污染；
4.)微生物能够以可能具有特殊用途的特定形式提供PUFAs；和，
5.)微生物油类生产可以通过控制培养条件操纵，特别是通过提供用于微生物表达的酶的特定底物，或通过添加化合物或通过遗传工程手段抑制不希望的生物化学途径。
除了上述优点之外，用重组微生物生产ω-3和/或ω-6脂肪酸，提供了通过在宿主中提供新的生物合成途径或通过抑制不希望的途径而改变天然存在的微生物脂肪酸特性的能力，从而提高需要的PUFAs，或它的缀合形式的水平，以及降低不需要的PUFAs的水平。例如，可以改变所生产的ω-3与ω-6脂肪酸的比例，专门生产ω-3或ω-6脂肪酸，同时消除其他ω脂肪酸的生产，或工程生产特定PUFA，而又没有其他PUFA下游或上游产物的大量积累。
表达系统，盒和载体
本发明所披露的序列的密码子优化的基因和基因产物可以在异源微生物宿主细胞中生产，特别是在含油酵母(例如，解脂耶氏酵母)的细胞中生产。在重组微生物宿主中的表达，可用于生产各种PUFA途径中间产物，或用于调控业已存在于宿主中的PUFA途径，以便利用所述宿主合成迄今为止不可能的新的产物。
包括能指导外源蛋白高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员所熟知的。它们都可用于构建嵌合基因，以便生产本发明密码子优化的序列的任何基因产物。然后可以通过转化将所述嵌合基因导入合适的微生物，以便提供所编码酶的高水平表达。
因此，预计导入受合适启动子控制的编码PUFA生物合成途径(例如，本文所披露的密码子优化的Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶，和延伸酶)的嵌合基因，会导致ω-3和/或ω-6脂肪酸产量的增加。预计，可将它用于在宿主微生物中表达本发明密码子优化的基因的各种组合。
另外，预计除了本文所披露的一种或多种密码子优化的基因之外，所述载体还可以包括编码其他酶的一种或多种基因。例如，可能需要构建的表达盒包括编码下列一种或多种酶促活性的基因：Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ9去饱和酶和/或延伸酶(其中，上述任何基因可任选进行密码子优化，以便增强在特定生物宿主中的表达)。正如本领域所公知的，在特定表达盒中所包含的特定基因取决于宿主细胞(以及它的PUFA谱和/或去饱和酶谱)，底物的可利用性和需要的最终产物。
这样，本发明涉及生产PUFAs的方法，包括让脂肪酸底物与本文所披露的PUFA酶接触，以便将所述底物转化成需要的脂肪酸产物。因此，可以将本文所披露的每一种PUFAs基因和相应的酶产物直接或间接用于生产PUFAs。PUFAs的直接生产是这样进行的，将脂肪酸底物直接转化成需要的脂肪酸产物，而没有任何中间步骤或中间途径。例如，EPA能够在能产生或提供了ARA的宿主细胞中进行，包括向所述细胞中添加或导入能提供Δ17去饱和酶活性的表达盒。
相反，编码PUFA生物合成途径的多个基因可以组合使用，以便发生一系列反应，以便产生需要的PUFA。例如，编码延伸酶，Δ5去饱和酶，Δ17去饱和酶和Δ4去饱和酶活性(其中每一种基因任选进行密码子优化，以便在宿主细胞中表达)的表达盒使得宿主细胞天然产生GLA，而不是产生DHA(以便通过延伸酶将GLA转化成DGLA；然后可以通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成ARA；然后通过Δ17去饱和酶将ARA转化成EPA，再通过延伸酶将后者转化成DPA；和通过Δ4去饱和酶将DPA转化成DHA)。在优选实施方案中，其中，宿主细胞是含油酵母，编码PUFA生物合成所必需的每一种酶的表达盒都需要导入所述生物，因为在这些生物中天然产生的PUFAs局限于18:2脂肪酸(即，LA)，并且更不常见的是18:3脂肪酸(即，ALA)。另外，可能需要底物补给。
用于转化合适的宿主细胞的载体或DNA盒为本领域所公知。存在于所述构建体中的序列的具体选择取决于需要的表达产物(同上)、宿主细胞的性质以及推荐的分离转化细胞与未转化细胞的方式。不过，通常，所述载体或盒包括指导相关基因转录和翻译的序列，选择标记，和使得它能够自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括所述基因的5′区，它控制转录起始，和DNA片段的3′区，它控制转录终止。最优选的是，当两个控制区都来自转化过的宿主细胞的基因时是最优选的，不过，可以理解的是，所述控制区不一定来自被选择用作生产宿主的特定物种的天然基因。
可用于在需要的宿主细胞中驱动去饱和酶和/或延伸酶ORFs表达的起始控制区或启动子是多种多样的，并且为本领域技术人员所熟知。实际上，能够指导这些基因在选定的宿主细胞中表达的任何启动子都适合本发明。在宿主细胞中的表达能够以瞬时或稳定的方式进行。瞬时表达可以通过诱导可操作地连接在感兴趣的基因上的可调控启动子的活性而实现。稳定表达可以通过使用可操作地与感兴趣的基因连接的组成型启动子而实现。例如，当宿主细胞是酵母时，提供能够在酵母细胞中起作用的转录和翻译区，特别是来自宿主物种的那些。例如，转录起始调控区可以从以下渠道获得：1.)糖酵解途径上的基因，如醇脱氢酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(参见美国专利申请号60/482263)，磷酸甘油变位酶(参见美国专利申请号60/482263)，果糖二磷酸醛缩酶(参见美国专利申请号60/519971)，磷酸葡萄糖异构酶，磷酸甘油酸激酶等；或2.)可调控的基因，如酸性磷酸酶，乳糖酶，金属硫蛋白，葡糖淀粉酶，翻译延伸因子EF1-α(TEF)蛋白(U.S.6,265,185)，核糖体蛋白S7(U.S.6,265,185)等。可以使用多种调控序列中的任意一种，这取决于是需要组成型转录还是诱导型转录，启动子在表达感兴趣的ORF方面的效率，以及构建的方便性等。
通过修饰外源基因的翻译起始密码子′ATG′周围的核苷酸序列，以便它们包括有效的酵母翻译起始序列可以在酵母中获得最佳基因表达。具体地讲，可以通过定点诱变增加低效表达的基因的表达，其中，所述低效表达的基因与内源酵母基因框内融合，优选与高表达的基因融合。另外，正如本发明中在解脂耶氏酵母中所证实的，可以确定宿主中的共有翻译起始序列，并且通过工程手段将该序列结合到异源基因上，以便它们在感兴趣的宿主中实现最佳表达。
终止区可源于所述基因的3′区，所述起始区是从该基因上获得的或者从不同的基因上获得的。大量终止区是已知的，并且能在多种宿主中发挥令人满意的作用(当在与产生它们的相同和不同的属和种中使用时)。终止区通常在更大程度上是根据方便性选择的，而不是因为任何特殊特性。优选的是，终止区源于酵母基因，特别是糖酵母属，裂殖酵母属，假丝酵母属，耶氏酵母属或克罗维酵母属。同样已知编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3′-区在酵母中起作用。终止控制区还可以来自优选宿主天然具有的各种基因。终止位点可以任选是必需的；不过，如果具有，它是最优选的。
正如技术人员所了解的，仅仅将基因插入克隆载体，不能确保它能够在需要的水平上成功地表达。根据对高表达速度的需要，业已通过操纵多种不同的遗传因子产生了多种特化的表达载体，这些遗传因子能控制来自宿主细胞的转录，翻译，蛋白稳定性，含氧极限，以及从宿主的分泌。更具体地讲，业已对某些分子特征进行了操作，以便控制基因表达，包括：1.)相关转录启动子和终止子序列的性质；2.)克隆基因的拷贝数量以及所述基因是质粒携带的或者是整合到宿主细胞的基因组上的；3.)合成的外源蛋白的最终细胞定位；4.)宿主生物的翻译效率；和5.)克隆的基因蛋白在宿主细胞中的内在稳定性。上述每一种类型的修饰包括在本发明中，作为进一步优化密码子优化的PUFA生物合成途径酶表达的手段。
微生物宿主的转化
一旦获得了适合在含油酵母中表达的编码密码子优化的去饱和酶或延伸酶多肽的DNA，将它放入能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体上，或者将它直接整合到宿主细胞的基因组上。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地进行，或者可以通过使用含有与宿主基因组具有足够同源性以靶定宿主基因座内的重组的区域的构建体靶定。当所述构建体被靶定于内源基因座时，转录和翻译调控区的全部或某些可以通过内源基因座提供。
当两个或两个以上的基因由独立的复制载体表达时，希望每一个载体具有不同的选择方式，并且应当缺少与其他构建体的同源性，以便保持稳定表达，并且防止构建体之间的元件的重新分类。对调控区，选择方式和导入的构建体的繁殖方法的明智的选择，可以通过实验确定，以便所有导入的基因在需要的水平上表达，以便提供需要产物的合成。
可以通过任何标准技术将包括感兴趣的基因的构建体导入宿主细胞。所述技术包括转化(例如，乙酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])，原生质体融合，bolistic冲击，电穿孔，显微注射，或能够将感兴趣的基因导入宿主细胞的任何其他方法。可用于含油酵母(即，解脂耶氏酵母)的更具体的技术包括美国专利号4,880,741和5,071,764和Chen，D.C.等(Appl MicrobiolBiotechnol.48(2)：232-235(1997))。
为了方便起见，业已通过任何方法操作以摄入DNA序列(例如，表达盒)的宿主细胞在本文中被称作″转化过的″或″重组的″。转化过的宿主具有至少一个拷贝的表达构建体，并且可以具有两个或两个以上拷贝，这取决于所述基因是整合在所述基因组上，扩增的，或者存在于具有多个拷贝的染色体外元件上。转化过的宿主细胞可以通过选择包含在导入的构建体上的标记而鉴定。另外，可以将独立的标记构建体与需要的构建体共同转化，因为很多转化技术能将很多DNA分子导入宿主细胞。通常，选择转化过的宿主在选择性培养基上生长的能力。选择性培养基可以掺入抗生素或缺少未转化的宿主生长所需要的因子，如养分或生长因子。导入的标记基因可以产生抗生素抗性，或者编码必须的生长因子或酶，以便当它在转化过的宿主中表达时能够在选择培养基上生长。当所表达的标记蛋白可以直接或间接检测时，还可以进行转化宿主的选择。所述标记蛋白可以单独表达，或者作为与另一种蛋白的融合体形式表达。标记蛋白可以通过以下方法检测：1.)它的酶促活性(例如，β-半乳糖苷酶可以将底物X-gal[5-溴-4-氯-3-吲哚基--D-半乳吡喃糖苷]转化成有颜色的产物；荧光素酶可以将荧光素转化成发光产物)；或2.)它的产生光或修饰特征(例如，Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白在用兰色光线照射时会发出荧光)。另外，例如，可将抗生素用于检测存在于感兴趣的蛋白上的标记蛋白或分子量标记。例如，能表达标记蛋白或标记的细胞可以肉眼筛选，或者通过诸如FACS的技术或使用抗生素淘选。为了选择酵母转化体，可以使用能够在酵母中起作用的任何标记。理想的是，对卡那霉素，潮霉素和氨基糖苷G418的抗性是感兴趣的，以及在缺少尿嘧啶或亮氨酸的培养基上生产的能力。
在转化之后，将适合本发明的密码子优化的序列的基因产物(并且任选包括在宿主细胞中表达的其他PUFA酶)可以由所述宿主天然地或转基因地生产，或者它们可以外源提供。
ω-3和/或ω-6脂肪酸在微生物中的生物合成的代谢工程
对本发明基因的密码子优化的序列以及优化其他PUFA基因以便在含油酵母中表达的方法的了解，可用于操作在含油酵母中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成；特别是在解脂耶氏酵母中。这可能需要在PUFA生物合成途径上的直接的代谢工程或途径的其他操作，这些操作可以将碳贡献给PUFA生物合成途径。可用于操作生物化学途径的方法为本领域技术人员所公知。
上调需要的生物合成途径的技术
可以将额外拷贝的去饱和酶和延伸酶基因导入宿主，以便提高ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径的产量。去饱和酶或延伸酶基因的表达还可以通过使用较强的启动子(调控型的或组成型的)而在转录水平上加强，以便导致增强了的表达，包括从mRNA或编码的蛋白上去掉/缺失去稳定化序列，或者向mRNA增加稳定化序列(U.S.4,910,141)。正如本发明所证实的，增强去饱和酶或延伸酶基因表达的另一个途径是提高所编码的mRNAs的翻译效率，包括用能在选定的宿主中优化基因表达的密码子取代天然基因上的密码子。
下调不希望的生物合成途径的技术
相反，可以通过基因破坏消除或通过其他方式(例如，反义mRNA)下调与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生物化学途径，或干扰特定PUFA最终产物产生的天然PUFA生物合成途径酶。为了进行基因破坏，将外源DNA片段(通常是选择标记基因)插入要破坏的结构基因，以便破坏它的编码序列，并因此功能性灭活所述基因。将所述破坏盒转化入宿主细胞，导致了非通过同源重组用无功能的破坏的基因替代功能性天然基因(例如，参见：Hamilton等J.Bacteriol.171：4617-4622(1989)；Balbas等Gene 136：211-213(1993)；Gueldener等Nucleic Acids Res.24：2519-2524(1996)；和Smith等Methods Mol.Cell.Biol.5：270-277(1996))。
当靶基因的序列已知时，反义是下调基因的另一种方法。为了实现这一目的，克隆了来自所需基因的核酸片段，并且可操作地与启动子连接，以便RNA的反义链能够转录。然后将该构建体导入宿主细胞，并且生产RNA的反义链。反义RNA能通过抑制编码感兴趣的蛋白的mRNA的积累，抑制基因表达。本领域技术人员可以理解的是，特殊考虑与使用反义技术相关，以便减弱特定基因的表达。例如，反义基因的适当水平的表达可能需要使用不同的嵌合基因，其中采用本领域技术人员所公知的不同的调控元件。
尽管当序列已知时，定向基因破坏和反义技术提供了下调基因的有效方法，业已开发了不是基于序列的其他特异性更低的方法，例如，细胞可以暴露于UV辐射，然后筛选需要的表型。用化学试剂进行的诱变同样能有效产生突变体，并且通常使用的物质包括能影响非复制DNA的化学物质(例如，HNO2和NH2OH)，以及能影响复制DNA的试剂(例如，吖啶染料，特别是导致移码突变)。使用辐射或化学试剂产生突变体的特定方法在现有技术有大量报导。例如，参见：Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，2nd ed.(1989)Sinauer Associates：Sunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)。
基因破坏的另一种非特异性方法是使用可转座元件或转座子。转座子是遗传元件，它能随机地插入DNA，但是随后可以根据序列回收，以便确定是否发生了插入。体内和体外转座转座方法是公知的。这两种方法涉及组合使用可转座元件和转座酶。当可转座元件或转座子在存在转座酶的条件下与核酸片段接触时，可转座元件能随机地插入所述核酸片段。这种技术可用于随机诱变，并且用于基因分离，因为受到破坏的基因可以根据可转座元件的序列鉴定。用于体外转座的试剂盒可以通过商业渠道获得[例如，参见：1.)The Primer IslandTransposition Kit，可以从Perkin Elmer Applied Biosystems获得，Branchburg，NJ，基于酵母Ty1元件；2.)The Genome Priming System，可以从New England Biolabs获得，Beverly，MA，基于细菌转座子Tn7；和3.)EZ：TN转座子插入系统，可以从Epicentre Technologies获得，Madison，WI，基于Tn5细菌转座因子]。
在本发明的范围内，可以通过上述另一种方法将它用于调控脂肪酸生物合成途径的表达。例如，本发明提供了编码导致产生ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成途径上的关键酶的密码子优化的基因。所述密码子优化的基因包括Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶和PUFA延伸酶。特别适用于在含油酵母中表达这些基因，所述酵母天然不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径，并且调控这些和其他PUFA生物合成基因的表达，以便使用各种方法使优选的PUFA产物的产量最大化，用于宿主生物的代谢工程。同样，为了用这些基因使PUFA产量最大化，可能需要破坏竞争通向PUFA生物合成的碳流量的途径。
用于重组表达密码子优化的基因的优选的细菌宿主
用于表达本发明的密码子优化的基因和核酸片段的宿主细胞可以包括在大范围的温度和pH值下，在多种饲料上生长的微生物宿主，所述饲料包括简单的或复杂的碳水化合物，有机酸和醇，和/或烃。尽管在本发明中所披露的基因是密码子优化的，以便在含油酵母中表达，特别是在解脂耶氏酵母中表达，预计，由于转录，翻译和蛋白生物合成细胞器是高度保守的，任何细菌，酵母和/或丝状真菌都是适合表达本发明的核酸片段的宿主。
优选的微生物宿主是含油酵母。这些生物可天然地进行油类合成和积累，所述油包括超过大约25％的细胞干重，更优选超过大约30％的细胞干重，最优选超过大约40％的细胞干重。通常被确定为含油酵母的属包括，但不局限于：耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地讲，典型的油类合成酵母包括：类酵母红冬孢，斯达氏油脂酵母，产油油脂酵母，拉可夫氏假丝酵母，铁红假丝酵母，热带假丝酵母，产朊假丝酵母，茁芽丝孢酵母，皮状丝孢酵母，胶粘红酵母，禾木科红酵母，和解脂耶氏酵母(以前被划分为解脂假丝酵母)。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而在其他实施方案中，最优选的是解脂耶氏酵母菌株，被命名为ATCC#20362，ATCC#8862，ATCC#18944，ATCC#76982和/或LGAM S(7)1(Papanikolaou S.，和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。
PUFA生产的发酵方法
转化过的微生物宿主细胞是在能优化去饱和酶和延伸酶的活性并且产生最大的和最经济的优选PUFAs的产量的条件下生长的。一般，可以优化的培养基条件包括碳源的类型和用量，氮源的类型和用量，碳-氮的比例，氧气含量，生长温度，pH，生物量生产期的长度，油积累期的长度，以及细胞收获时间。感兴趣的微生物，如含油酵母在复杂培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养液(YPD))或缺少生长所必需的成分，以便强制选择需要的表达盒的特定基本培养基)(例如，Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生长。
本发明的发酵培养基必须包括合适的碳源。合适的碳源包括，但不局限于：单糖(例如，葡萄糖，果糖)，二糖(例如，乳糖，蔗糖)，寡糖，多糖(例如，淀粉，纤维素或它们的混合物)，糖醇(例如，甘油)或可更新饲料的混合物(例如，干酪乳清渗透物，玉米浆，甜菜糖浆，大麦芽)。另外，碳源可以包括链烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油单酯，甘油二酯，甘油三酯，磷脂，和脂肪酸的各种商业来源，包括植物油(例如，大豆油)和动物脂肪。另外，碳源可以包括一-碳源(例如，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸和含碳胺)，业已证实了其转化成关键生物化学中间产物的代谢转化。因此，预计，用于本发明的碳源包括可以包括多种含碳源，并且仅仅局限于宿主生物的选择。尽管上述所有碳源及其混合物预计都适合本发明，优选的碳源是糖和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖和/或含有10-22个碳的脂肪酸。
氮可以由无机(例如，(NH4)2SO4)或有机来源(例如，尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳和氮源之外，发酵培养基必须还包括合适的矿物质，盐，辅因子，缓冲液，维生素，和本领域技术人员已知的适合微生物生长，并且促进PUFA生产所需要的酶促途径的其他成分。特别关注若干金属离子(例如，Mn+2，Co+2，Zn+2，Mg+2)，它们能促进脂类和PUFAs的合成(Nakahara，T.等，Ind.Appl.Single CellOils，D.J.Kyle and R.Colin，eds.pp 61-97(1992))。
本发明的优选的生长培养基是常见的商业制备的培养基，如酵母Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。其他确定的或合成的生长培养基也可以使用，并且适合特定微生物生长的培养基是微生物学或发酵科学领域的技术人员所公知的。用于发酵的合适的pH范围通常为大约pH4.0-pH8.0，其中pH5.5-pH7.0是起始生长条件的优选范围。发酵可以在需氧或厌氧条件下进行，其中，微需氧条件是优选的。
通常，高水平PUFAs在含油酵母细胞中的积累，需要两个阶段的过程，因为在脂肪的生长和合成/储存之间的代谢状态必须是″平衡的″。因此，最优选的是，需要两个阶段的发酵过程在含油酵母中生产PUFAs。在该方法中，发酵的第一阶段被用于制备和积累细胞物质，并且以快速细胞生长和细胞分裂为特征。在发酵的第二阶段，优选在培养物中建立氮剥夺条件，以便促进高水平的脂类积累。这种氮剥夺的作用是降低细胞中AMP的有效浓度，以便减弱线粒体的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶的活性。当出现这种情况时，将积累柠檬酸，因此在细胞质中形成了乙酰-CoA的丰富的资源，并且启动了脂肪酸合成。因此，这一阶段以细胞分裂终止，随后是脂肪酸的合成和油的积累为特征。
尽管细胞通常是在大约30℃下生长的，某些研究业已在较低温度下增加了不饱和脂肪酸的合成(Yongmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.57：419-25(1991))。根据工艺的经济学，这种温度偏移可能在两个阶段的发酵的第一阶段之后发生，此时，业已出现了大量的微生物生长。
预计，可以采用多种发酵工艺设计，其中，使用本发明的密码子优化的基因商业化生产ω脂肪酸是理想的。例如，用重组微生物宿主商业生产PUFAs，可以通过分批发酵，补料-分批发酵活连续发酵工艺生产。
分批发酵工艺是封闭的系统，其中，培养基组成是在工艺开始时确定的，并且不再进行超出在工艺过程中维持pH和氧气含量需要的进一步补充。因此，在培养过程开始时，用需要的微生物接种所述培养基，并且可以在不向培养基中添加其他来源(即，碳和氮源)条件下具有生长或代谢活性。在分批发酵工艺中，该系统的代谢物和生物量组成经常地改变，直到培养终止。在典型的分批发酵工艺中，细胞从停滞阶段发展到高速生长的对数期，并最终达到静止期，在这里，生长速度减弱或终止。在不处理的条件下，静止阶段的细胞会最终死亡。标准的分批发酵工艺的变化是补料-分批发酵工艺，其中，在发酵过程中将碳源连续地添加到发酵罐中。补料-分批发酵工艺同样适用于本发明。当代谢物抑制倾向于抑制细胞代谢或希望在任何时间在培养基中具有有限数量的来源时，补料-分批工艺是有用的。测定补料-分批系统中的碳源是困难的，因此，可以根据可测定因子的变化估算，如pH，溶解氧和废气(例如，CO2)的分压。分批和补料-分批培养方法是本领域技术人员所公知的和熟悉的，并且其例子可以参见以下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology.2nd ed.，(1989)Sinauer Associates：Sunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)，在此收作本文参考。
利用本发明的密码子优化的基因商业化生产ω脂肪酸的方法还可以通过连续发酵工艺实现，其中，将确定成分的培养基连续添加到生物反应器中，同时取出等量的培养物体积，用于产物回收。连续培养通常将细胞保持在恒定细胞密度的对数生长期。连续或半连续培养方法能够调节会影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或多种因素中的任意一种。例如，一种方法可以限制碳源，并且允许所有其他参数适当地代谢。在其他系统中，可以连续地改变影响生长的多种因素，同时保持通过培养基浊度测定的细胞浓度恒定。连续系统试图保持稳态生长，因此，细胞生长速度必须与由于将培养基从培养物中排出而导致的细胞减少。调节连续培养工艺的营养成分和生长因子的方法，以及用于增加生产形成速度的技术为工业微生物学领域所熟知，并且上文提到的Brock详细披露了多种方法。
PUFAs的纯化
PUFAs可以作为游离脂肪酸形式出现在宿主微生物中，或者以诸如酰基甘油，磷脂，硫脂或醣脂的脂化形式出现，并且可以通过本领域所熟知的多种方法从宿主细胞中提取。酵母脂类的提取技术，品质分析和可接受性标准的一种概述是以下文献：Z.Jacobs(CriticalReviews in Biotechnology 12(5/6)：463-491(1992))。有关下游加工的简单概述还可以参见A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45：271-312(1997))。
一般，纯化PUFAs的方法可以包括用有机溶剂萃取，超声波处理，超临界流体萃取(例如，使用二氧化碳)，皂化和物理方法，如压力，或它们的组合。特别感兴趣的是用甲醇和氯仿在存在水的条件下萃取(E.G.，Bligh & W.J.Dyer，Can.J.Biochem.Physiol。37：911-917(1959))。如果需要，可以将含水层酸化，以便使带负电荷的部分质子化，并因此增加了想得到的产物向有机层中的分配。在萃取之后，可以通过在氮气流下蒸发除去有机溶剂。当以缀合形式分离时，可以对所述产物进行酶促或化学裂解，以便释放游离的脂肪酸或感兴趣的更低复杂性的缀合物，并且然后可以进行进一步的操作，以便生产需要的最终产物。理想的是，用氢氧化钾裂解脂肪酸的缀合形式。
如果需要进一步纯化，可以采用标准方法。所述方法可以包括萃取，用尿素处理，分级结晶化，HPLC，分级蒸馏，硅胶层析，高速离心或蒸馏，或这些技术的组合。对诸如酸或烯基的活性基团的保护，可以在任何步骤通过已知技术(例如，烷基化，离子化)完成。所使用的方法包括脂肪酸甲基化，以便产生甲酯。类似地，可以在任何步骤除去保护基团。理想的是，纯化含有GLA，STA，ARA，DHA和EPA的级份可以通过用尿素处理和/或分级蒸馏实现。
优选实施方案的说明
本文所披露的研究工作的最终目的是开发含油酵母，它能积累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油类。为此，必须鉴定ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径的去饱和酶和延伸酶，它能够在含油酵母中有效地起作用，以便能够在这些宿主中合成并且积累ω脂肪酸。
在本发明中，申请人证明了适合对去饱和酶和延伸酶基因进行密码子优化的技术，其中，所得到的合成的密码子优化的基因能够以较高的转化效率在诸如解脂耶氏酵母的含油酵母中起作用。这些方法在本发明的教导中实施，特别是涉及密码子优化的Δ6去饱和酶(它具有将LA转化成GLA和/或将ALA转化成STA的酶促能力)，密码子优化的Δ17去饱和酶(负责将DGLA转化成ETA和/或将ARA转化成EPA)和密码子优化的高亲和力PUFA延伸酶(能够将GLA转化成DGLA，将STA转化成ETA和/或将EPA转化成DPA)的合成。本领域技术人员能够方便地将本文所披露的技术用于优化ω-3和/或ω-6生物合成的脂肪酸途径上的其他基因，以便形成预计在耶氏酵母属中表达时转化效率增加的合成基因。因此，本发明的教导具有用于开发能积累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油类的含油酵母的重大用途。
申请人选择了三种典型的野生型基因用于在模型含油酵母即解脂耶氏酵母中进行密码子优化。野生型基因中的每一个是从来自Ross产品(Columbus，OH)的质粒中获得的，参见下面的表3。
表3
从Ross产品中获得的基因和源质粒
  基因   生物   包括所述基因的质粒   参考文献
  Δ6去饱和酶   高山被孢霉   pCGR5   U.S.5,968,809
  延伸酶   高山被孢霉   pRPB2   WO 00/12720
  Δ17去饱和酶   异丝水霉   pRSP19   U.S.2003/0196217A1
在微生物宿主中证实了每一种野生型酶的活性之后(通过底物-补料实验)，对每一个基因进行密码子优化(其中，将至少9％的天然密码子修饰成使用宿主优选的密码子)。
Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶和高亲和力PUFA延伸酶基因的密码子优化首先需要在解脂耶氏酵母中确定密码子选择和结构基因标志。然后设计并且体外合成密码子优化的基因，使用能显著缩短合成完整长度的基因序列所需时间量的方法。该方法并不局限于本发明合成的特定基因，因此，应当能广泛地应用于多种普通用途。与体外基因合成相关的基本步骤由以下步骤组成：
1.合成多对寡核苷酸(各自的长度为大约100bp)，每一个寡核苷酸序列相当于要合成的完整长度的基因序列的一部分；并且，每一个有义链寡核苷酸序列与相应的反义链寡核苷酸在该序列的5′末端具有大约4bp的重叠。
2.通过激酶反应将所有寡核苷酸的5′和3′末端磷酸化，然后对每一个对有义和反义链寡核苷酸进行各个退火反应，以便生产短的(大约100bp)双链DNA片段。
3.然后将短的(大约100bp)的双链DNA片段的合并物连接在一起，其中使用所述大约4bp的重叠，该重叠部分是根据寡核苷酸的合成设计的，以便得到较长的(大约300-400bp)的DNA片段。
4.在连接之后通过PCR扩增较长的片段，将其产物克隆到合适的载体上，并且转化入宿主细胞。
5.从宿主细胞中纯化含有每一种PCR产物的质粒DNA，然后进行限制酶消化，以便分离相当于要合成的基因的每一个大约300-400bp片段的PCR产物。
6.将要合成的大约300-400bp的基因片段连接在一起，然后进行PCR扩增，以便生产完整长度的合成序列。
在合成密码子优化的Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶和高亲和力PUFA延伸酶基因基因之后，各自被分别转化入解脂耶氏酵母。补料实验(使用合适的底物)确定了密码子优化的基因与相应的天然野生型基因相比能够更有效地在解脂耶氏酵母中表达。具体地讲，密码子优化的Δ6去饱和酶能将比它的野生型对应体多出大约40％的LA转化成GLA，密码子优化的Δ17去饱和酶与野生型酶相比能将多出大约2倍的ARA转化成EPA，并且密码子优化的高亲和力PUFA延伸酶能将多出大约57％的GLA转化成DGLA，所述酶是在解脂耶氏酵母中在相同的生物学条件下表达的。
实施例
本发明还确定了以下实施例。应当理解的是，在这些实施方案中，尽管指明了是本发明的优选实施方案，但是，是以说明形式提供的。通过上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的实质性特征，并且，在不超出本发明的构思和范围的前提下，可以对本发明进行各种改变和改进，以便适应各种用途和条件。
一般方法
用于实施例中的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知的，并且披露于以下文献中：1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enquist，Experiments withGene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和3.)Ausubel，F.M.等，Current Protocols in MolecularBiology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-interscience(1987)。
适合微生物培养物维持和生长的材料和方法为本领域所公知。适合在以下实施例中使用的技术可以参见以下文献：Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Philips，Eds)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或参见Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbookof Industrial Microbiology，2nd ed.，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)。用于生长和保持微生物细胞的所有试剂，限制酶和材料都是从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，或Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)获得的，除非另有说明。
大肠杆菌TOP10细胞和大肠杆菌electromax DH10B细胞是从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得的。大肠杆菌DH5α的最大效率感受态细胞是从GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)获得的。大肠杆菌(XL1-Blue)感受态细胞是从Stratagene公司(San Diego，CA)购买的。大肠杆菌菌株通常是在37℃下在Luria Bertani(LB)平板上生长的。
解脂耶氏酵母的亮氨酸营养缺陷型菌株是从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD；ATCC #76982)购买的，并且用于功能分析。解脂耶氏酵母菌株通常是在28℃下，在YPD琼脂(1％酵母提取物，2％细菌蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)上生长。为了选择转化体，使用基本培养基(0.17％酵母氮基质(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)，没有硫酸铵或氨基酸，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，pH6.1)。以0.01％的最终浓度添加腺嘌呤，亮氨酸，赖氨酸和/或尿嘧啶的补充物。
按照标准方法(Sambrook等，同上)进行一般分子克隆。寡核苷酸是由Sigma-Genosys(Spring，TX)合成的。用Stratagene′sQuickChangeTM定点诱变试剂盒进行定点诱变，按照生产商的说明进行。当聚合酶链反应(PCR)或定点诱变与亚克隆相关时，对所述构建体进行测序，以便证实没有将误差导入所述序列。将PCR产物克隆到Promega′s pGEM-T-easy载体(Madison，WI)上。
遗传序列的操作是使用可以从Genetics Computer Group Inc.(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)获得的程序组进行的。使用了所述GCG程序″Pileup″，空位形成预设值为12，空位延伸预设值为4。使用了GCG″Gap″或″Bestfit″程序，预设的空位形成罚分为50，预设的空位延伸罚分为3。除非另有说明，在所有其他场合下，都使用GCG程序的预设参数。
缩写的含义如下：″sec″表示秒，″min″表示分钟，″h″表示小时，″d″表示天，″μL″表示微升，″mL″表示毫升，″L″表示升，″μM″表示微摩尔，″mM″表示毫摩尔，″M″表示摩尔，″mmol″毫摩尔，″μmole″表示微摩尔，″g″表示克，″μg″表示微克，″ng″表示纳克，″U″表示单位，″bp″表示碱基对，而″kB″表示千碱基。
实施例1
构建适合在解脂耶氏酵母中表达异源基因的质粒
构建了质粒pY5，即pINA532(由Dr.Claude Gaillardin馈赠，Insitut National Agronomics，Centre de biotechnologie Agro-Industrielle，laboratoire de Genetique Moleculaire et Cellularie INRA-CNRS，F-78850Thiverval-Grignon，France)衍生物，用于在解脂耶氏酵母中表达异源基因，如图2所示。
首先，将包括pINA532的ARS18序列和LEU2基因的部分消化的3598bp EcoRl片段亚克隆到pBluescript(Strategene，San Diego，CA)的EcoRl位点上，以便制备pY2。
通过PCR扩增来自解脂耶氏酵母基因组DNA的TEF启动子(Muller S.，等，Yeast，14：1267-1283(1998))，用TEF5′(SEQID NO：7)和TEF3′(SEQ ID NO：8)作引物。PCR扩增是在50μl的总体积中进行的，它包括：100ng耶氏酵母属基因组DNA，含有10mM KCl的PCR缓冲液，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH8.75)，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，100μg/mL BSA(最终浓度)，200μM每一种脱氧核糖核苷三磷酸，10皮摩尔每一种引物和1μl的PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。扩增是按以下方法进行的：首先在95℃下变性3分钟，然后进行35轮以下循环：95℃1分钟，56℃30秒，72℃1分钟。在72℃下进行了10分钟的最终延伸，然后在4℃下终止反应。将418的PCR产物连接到pCR-Blunt上，以便制备pIP-tef。将pIP-tef的BamHI/EcoRV片段亚克隆到pY2的BamHI/Smal位点上，以便制备pY4。
使用pINA532作模板，用XPR5′(SEQ ID NO：9)和XPR3′(SEQID NO：10)作引物，通过PCR扩增XPR2转录终止子。PCR扩增是在50μl的总体积中进行的，使用上述成分和条件。用SacII消化179bp的PCR产物，然后连接到pY4的SacII位点上，以便制备pY5。因此，pY5(参见图2和3)可用作耶氏酵母属-大肠杆菌穿梭质粒，它包括：
1.)耶氏酵母属自主复制序列(ARS18)；
2.)ColE1质粒复制起点；
3.)氨苄青霉素-抗性基因(AmpR)，用于在大肠杆菌中选择；
4.)耶氏酵母属LEU2基因，用于在耶氏酵母属中选择；
5.)翻译延伸启动子(TEFP)，用于在耶氏酵母属中表达异源基因；和
6.)细胞外蛋白酶基因终止子(XPR2)，用于在耶氏酵母属中表达的异源基因的转录终止。
作为pY5的衍生物构建了pY5-4和pY5-13(图3)，以便促进在解脂耶氏酵母中的亚克隆和异源基因表达。
具体地讲，用pY5作模板，通过三轮定点诱变构建了pY5-4。用寡核苷酸YL1和YL2(SEQ ID NOs：11和12)将位于LEU2报道基因上的NcoI位点位点从pY5除去，以便制备pY5-1。通过用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NOs：13和14)进行定点诱变将NcoI位点导入pY5-1的TEF启动子和XPR2转录终止子之间，以便制备pY5-2。然后使用寡核苷酸YL23和YL24(SEQ ID NOs：15和16)将PacI位点导入pY5-2的TEF启动子和XPR2转录终止子之间，以便制备pY5-4。
用pY5作模板，通过6轮定点诱变构建pY5-13。通过用寡核苷酸YL5和YL6(SEQ ID NOs：17和18)进行定点诱变将SaII和ClaI位点从pY5上消除，以便制备pY5-5。通过用寡核苷酸YL9和YL10(SEQID NOs：19和20)进行定点诱变将SaII位点导入pY5-5的LEU2基因和TEF启动子之间，以便制备pY5-6。用寡核苷酸YL7和YL8(SEQID NOs：21和22)将PacI位点导入pY5-6的LEU2基因和ARS18之间，以便制备pY5-8。使用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NOs：13和14)将NcoI位点导入pY5-8的TEF启动子的翻译起始密码子周围，以便制备pY5-9。使用YL1和YL2寡核苷酸(SEQ ID NOs：11和12)将pY5-9的LEU2基因的NcoI位点消除，以便制备pY5-12。最后，用寡核苷酸YL61和YL62(SEQ ID NOs：23和24)将BsiWI位点导入pY5-12的ColEl和XPR2区之间，以便制备pY5-13。
实施例2
在解脂耶氏酵母中分析野生型Δ6和Δ17去饱和酶和高亲和力 PUFA延伸酶的转化效率
为了确保野生型Δ6去饱和酶，延伸酶和Δ17去饱和酶在解脂耶氏酵母中的功能(在密码子优化之前)，测定了每一种野生型蛋白的转化效率。具体地讲，高山被孢霉Δ6去饱和酶，异丝水霉Δ17去饱和酶和高山被孢霉高亲和力PUFA延伸酶是在其他宿主中表达的，并且在底物补料实验中筛选活性。发现每一种酶都能够将至少23％的底物转化成产物。
野生型高山被孢霉(登录号#AF465281)Δ6去饱和酶
将包括高山被孢霉Δ6去饱和酶基因(SEQ ID NO：1)的1384bp的pCGR5的NcoI/NotI片段(U.S.5,968,809)插入pY5-2的NcoI/NotI位点(实施例1)上，以便制备pY54。
野生型异丝水霉(ATCC#56851)Δ17去饱和酶
通过PCR，用寡核苷酸YL21A(SEQ ID NO：118)和YL22(SEQID NO：119)作引物，由质粒pRSP19(US2003/0196217A1)扩增异丝水霉的野生型Δ17去饱和酶基因。PCR扩增是在50μl的总体积中进行的，它包括PCR缓冲液，该缓冲液含有：10ng模板，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH8.75)，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，100pg/mL BSA(最终浓度)，200μM每一种脱氧核糖核苷三磷酸，10pmole每一种引物，和1μl的PfuTurbo DNA聚合酶。(Stratagene，San Diego，CA)。扩增是按以下方法进行的：在95℃下初始变性3分钟，然后进行35轮以下循环：95℃，1分钟，56℃，30秒，72℃，1分钟。在72℃下进行10分钟的最终延伸，然后在4℃下终止反应。用NcoI/PacI消化PCR产物，然后连接到NcoI/PacI-消化过的pY5-4上(图3；参见实施例1)，以便制备pYSD17。
野生型高山被孢霉(登录号#AX464731)高亲和力延伸酶
将包括高山被孢霉高亲和力PUFA延伸酶基因的编码区(SEQ IDNO：5)的pRPB2的973bp的NotI片段(WO00/12720)插入pY5的NotI位点(实施例1；图2和3)，以便制备pY58(图13B)。
解脂耶氏酵母的转化
按照Chen，D.C.等(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)：232-235-(1997))的方法将质粒pY54，pYSD17和pY58分别转化到解脂耶氏酵母ATCC#76982中。
简单地讲，将耶氏酵母属的亮氨酸营养缺陷型在YPD平板上划线，并且在30℃下生长大约18小时。将几个大环的细胞从平板上刮下来，并且重新悬浮在1mL的转化缓冲液中，该缓冲液包括：
·2.25mL的50％PEG，平均分子量3350；
·0.125mL的2M乙酸锂，pH6.0；
·0.125mL的2M DTT；和
·50μg的剪切的鲑鱼精子DNA。
在100μl的重新悬浮的细胞中温育大约500ng的质粒DNA，并且在39℃下保持1小时，以15分钟的间隔进行涡旋混合。将细胞铺平板到缺少亮氨酸的基本培养基平板上，并且在30℃下保持2-3天。
底物转化百分比的测定
含有pY54，pYSD17或pY58的转化解脂耶氏酵母的单个菌落分别在3mL基本培养基(20g/L葡萄糖，1.7g/L酵母氮基质，不含氨基酸，1g/L L-脯氨酸，0.1g/L L-腺嘌呤，0.1g/L L-赖氨酸，pH6.1)中，在30℃下生长到OD600大约为1.0。为了进行底物补料，将100μl的细胞放在含有10μg底物的3mL基本培养基中在30℃下继代培养大约24小时。然后通过离心收集细胞，并且按照披露于以下文献中的方法提取脂类：Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917(1959))。脂肪酸甲酯是通过酯类提取物与甲醇钠的脂交换反应制备的(Roughan，G.，and Nishida I.Arch Biochem Biophys.276(1)：38-46(1990))，并且随后用装有30-m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890GC进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟的速度从170℃(25分钟保持时间)提高到185℃。底物转化百分比按以下公式测定：([产物]/[底物+产物])*100)。
野生型高山被孢霉Δ6去饱和酶的底物转化百分比
高山被孢霉Δ6去饱和酶能将LA转化成GLA和/或将ALA转化成STA。含有pY54的解脂耶氏酵母菌株按上述方法生长(不需要补充底物)，并且分析脂类。结果表明，具有pY54的耶氏酵母属菌株能将大约30％LA转化成GLA。
野生型异丝水霉Δ17去饱和酶的底物转化百分比
异丝水霉Δ17去饱和酶能将ARA转化成EPA和/或将DGLA转化成ETA。含有pYSD17的解脂耶氏酵母菌株是从单菌落生长的，在含有10μg的ARA的基本培养基中继代培养，并且按上述方法进行脂类分析。ARA补料实验的结果表明具有PYSD17的耶氏酵母属菌株能将大约23％的细胞内ARA转化成EPA。
野生型高山被孢霉高亲和力延伸酶的底物转化百分比
高山被孢霉高亲和力PUFA延伸酶能将GLA转化成DGLA，将STA转化成ETA和/或将EPA转化成DPA。包括pY58的解脂耶氏酵母菌株是从单菌落生长的，在含有10μg的GLA基本培养基中继代培养，并且按上述方法进行脂类分析。GLA补料实验的结果表明，具有pY58的耶氏酵母属菌株能将大约30％的细胞内GLA转化成DGLA。
实施例3
在解脂耶氏酵母中测定优选的密码子选择
在National Center for Biotechnology Information公共数据库中发现了大约100个解脂耶氏酵母的基因。通过DNAStar的Editseq程序将包括121,167bp的这些基因的编码区翻译成相应的40,389个氨基酸，并且制成表格，以便确定由表4所示的解脂耶氏酵母密码子选择谱。标题为″No.″的栏表示编码特定氨基酸的特定密码子在40,389个氨基酸的样品中出现的次数。标题为″％″的栏表示编码特定氨基酸的特定氨基酸的频率。用粗体字符表示的代码表示解脂耶氏酵母中优选的密码子。
表4
解脂耶氏酵母的密码子选择
  密码子   氨基酸   No.   ％
  GCAGCCGCGGCUAGAAGGCGACGCCGGCGU   Ala(A)Ala(A)Ala(A)Ala(A)Arg(R)Arg(R)Arg(R)Arg(R)Arg(R)Arg(R)   35915232561023263911133108209189   11.448.18.132.313.24.656.85.41.09.5
  AACAAU   Ans(N)Ans(N)   1336255   84.016.0
  GACGAU   Asp(D)Asp(D)   1602795   66.833.2
  UGCUGU   Cys(C)Cys(C)   268236   53.246.8
  CAACAG   Gln(Q)Gln(Q)   3071490   17.083.0
  GAAGAG   Glu(E)Glu(E)   5661893   23.077.0
  GGAGGCGGGGGU   Gly(G)Gly(G)Gly(G)Gly(G)   856986148893   29.734.25.131.0
  CACCAU   His(H)His(H)   618326   65.534.5
  AUAAUCAUU   Ile(I)Ile(I)Ile(I)   421106910   2.153.744.2
  CUACUCCUGCUUUUAUUG   Leu(L)Leu(L)Leu(L)Leu(L)Leu(L)Leu(L)   1661029137959154323   4.729.138.916.71.59.1
  密码子   氨基酸   No.   ％
  AAAAAG   Lys(K)Lys(K)   3441987   14.885.2
  AUG   Met(M)   1002   100
  UUCUUU   Phe(F)Phe(F)   996621   61.138.9
  CCACCCCCGCCU   Pro(P)Pro(P)Pro(P)Pro(P)   2071125176655   9.652.08.230.2
  AGCAGUUCAUCCUCGUCU   Ser(S)Ser(S)Ser(S)Ser(S)Ser(S)Ser(S)   335201221930488779   11.36.87.531.516.526.4
  UAAUAGUGA   TermTermTerm   383013   46.937.016.1
  ACAACC   Thr(T)Thr(T)   3061245   12.751.6
  ACGACU   Thr(T)Thr(T)   269595   11.124.6
  UGG   Trp(W)   488   100
  UACUAU   Tyr(Y)Tyr(Y)   988200   83.216.8
  GUAGUCGUGGUU   Val(V)Val(V)Val(V)Val(V)   1181052948703   4.237.333.624.9
为了进一步优化在解脂耶氏酵母中的基因表达，检查了79个基因的′ATG′起始密码子周围的共有序列。在图4中，加下划线的ATG翻译起始密码子的第一个′A′被设为+1。分析过的基因的77％在-3号位置上出现″A″，表明了″A″在该位置上的强烈偏好。还存在′A′或′C′在-4，-2和-1号位置上的偏好，′A′，′C′或′T′在+5号位置上的偏好，以及′G′或′C′在+6号位置上的偏好。因此，用于基因在解脂耶氏酵母中优化表达的密码子优化的翻译起始位点的优选的共有序列是′MAMMATGNHS′(SEQ ID NO：122)，其中使用了如下的核酸简并性密码：M＝A/C；S＝C/G；H＝A/C/T；和N＝A/C/G/T。
实施例4
密码子优化的Δ6去饱和酶基因的合成
来自高山被孢霉的Δ6去饱和酶基因(SEQ ID NO：1)的长度为1374bp(U.S.5,968,809；GenBank #AF465281)。根据高山被孢霉DNA序列，按照耶氏酵母属密码子选择方式，ATG翻译起始密码子周围的共有序列，以及RNA稳定性的一般性规则，设计了密码子优化的Δ6去饱和酶基因(Guhaniyogi，G.and J.Brewer，Gene 265(1-2)：11-23(2001))。除了修饰翻译起始位点之外，还对1374bp编码区(相当于144个密码子)的152bp进行了密码子优化。在图5中示出了密码子优化的基因(SEQ ID NO：25)和来自高山被孢霉的完整长度的野生型序列(SEQ ID NO：1)进行了比较，其中，用粗体字符表示的核苷酸相当于在密码子优化的基因上修饰过的核苷酸。对密码子优化的基因的修饰，不会改变所编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
在图6中示出了用于合成密码子优化的Δ6去饱和酶基因的方法。首先，设计了14对寡核苷酸，以便延长高山被孢霉Δ6去饱和酶基因(例如，D6-1A，D6-1B，D6-2A，D6-2B，D6-3A，D6-3B，D6-4A，D6-4B，D6-5A，D6-5B，D6-6A，D6-6B，D6-7A，D6-7B，D6-8A，D6-8B，D6-9A，D6-9B，D6-10A，D6-10B，D6-11A，D6-11B，D6-12A，D6-12B，D6-13A，D6-13B，D6-14A和D6-14B，相当于SEQ ID NOs：26-53)的密码子优化的编码区的完整长度(即，1374bp)。每一对有义(A)和反义(B)寡核苷酸是互补的，只有位于每一个5′-末端的4bp的突出部分例外。引物D6-1A在它的5′末端包括NcoI位点；引物D6-4B和D6-5A包括StuI位点；而引物D6-7B，D6-8A，和D6-10B各自包括BamHI位点，用于随后的亚克隆。在37℃下对100ng的每一种寡核苷酸进行1小时的磷酸化，反应是在包括50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM亚精胺，0.5mM ATP和10单位的T4多核苷酸激酶的20μl的体积中进行的。混合每一对有义和反义寡核苷酸，并且在热循环仪中退火，使用以下参数：95℃(2min)，85℃(2min)，65℃(15min)，37℃(15min)，24℃(15min)，和4℃(15min)。因此，将D6-1A(SEQ ID NO：26)与D6-1B(SEQID NO：27)退火，以便产生双链产物″D6-1AB″。类似地，将D6-2A(SEQ ID NO：28)与D6-2B(SEQ ID NO：29)退火，以便产生双链产物″D6-2AB″等。
然后将四个独立的退火的双链寡核苷酸集合连接在一起，这些集合如下：
·集合1：包括D6-1AB，D6-2AB，D6-3AB，和D6-4AB；
·集合2：包括D6-5AB，D6-6AB，和D6-7AB；
·集合3：包括D6-8AB，D6-9AB，和D6-10AB；和
·集合4：包括D6-11AB，D6-12AB，D6-13AB，和D6-14AB。
将每一个退火的寡核苷酸集合与10个单位的T4DNA连接酶在20μl的体积中混合，并且连接反应是在16℃下温育过夜中的。
然后通过PCR扩增每一种连接反应的产物。具体地讲，使用连接的″集合1″混合物(即，D6-1AB，D6-2AB，D6-3AB和D6-4AB)作模板，并且用寡核苷酸D6-1(SEQ ID NO：54)和D6-4R(SEQ ID NO：55)作引物，通过PCR扩增密码子优化的Δ6去饱和酶基因的第一部分。PCR扩增是在50μl的总体积中进行的，它包括PCR缓冲液，该缓冲液含有10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH8.75)，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，100μg/mL BSA(最终浓度)，200μM每一种脱氧核糖核苷三磷酸，10pmole每一种引物和1μl的PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。扩增是按如下方法进行的，在95℃初始变性3分钟，然后进行35轮以下循环：95℃，1min，56℃，30sec，72℃，40sec。在72℃下进行10分钟的最终延伸，然后在4℃下终止反应。将380bp PCR片段亚克隆到pGEM-T easy载体(Promega)上，以便制备pT6(1-4)。
用连接的″集合2″混合物(即，D6-5AB，D6-6AB和D6-7AB)作模板，并且用寡核苷酸D6-5(SEQ ID NO：56)和D6-7R(SEQ ID NO：57)作引物，通过PCR以类似方式扩增了密码子优化的Δ6去饱和酶基因的第二部分，并且克隆到pGEM-T-easy载体上，以便制备pT6(5-7)。用″集合3″连接混合物(即，D6-8AB，D6-9AB，和D6-1OAB)作模板，并且用寡核苷酸D6-8(SEQ ID NO：58)和D6-10R(SEQ IDNO：59)作引物，通过PCR以类似方式扩增了密码子优化的Δ6去饱和酶基因的第三部分，并且克隆到pGEM-T-easy载体上，以便制备pT6(8-10)。最后，使用″集合4″连接混合物(即，D6-11AB，D6-12AB，D6-13AB和D6-14AB)作模板，并且用寡核苷酸D6-11(SEQ ID NO：60)和D6-14R(SEQ ID NO：61)作引物，通过PCR以类似方式扩增了密码子优化的Δ6去饱和酶基因的第四部分，并且克隆到pGEM-T-easy载体上，以便制备pT6(11-14)。
分别用pT6(1-4)，pT6(5-7)，pT6(8-10)和pT6(11-14)转化大肠杆菌，并且纯化从氨苄青霉素-抗性转化体中分离的质粒DNA，并且用合适的限制性内切核苷酸酶消化，以便释放pT6(1-4)的380bpNcoI/StuI片段，pT6(5-7)的310bp StuI/BamHI片段，pT6(8-10)的320bp BamHI片段，和pT6(11-14)的410bp BamHI/NotI片段。然后合并这些片段，沿正确的方向连接在一起，并且插入pY5-13的NcoI/NotI位点，以便制备pYD6S(图7)。
实施例5
密码子优化的Δ17去饱和酶基因的合成
来自异丝水霉(SEQ ID NO：3)的Δ17去饱和酶基因的长度为1077bp。根据异丝水霉DNA序列，按照耶氏酵母属密码子选择方式，ATG翻译起始密码子周围的共有序列，以及RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi和Brewer，同上)设计了密码子优化的Δ17去饱和酶基因。除了修饰翻译起始位点之外，对1077bp编码区(包括117个密码子)的127bp密码子优化。在图8中示出了该密码子优化的DNA序列(SEQ ID NO：62)和异丝水霉Δ17去饱和酶基因DNA序列(SEQ IDNO：3)之间的比较，其中，用粗体字符表示的核苷酸相当于在密码子优化的基因上修饰过的核苷酸。对密码子优化的基因的修饰不会改变所编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
在图9中示出了用于合成密码子优化的Δ17去饱和酶基因的方法。首先，设计了十一对寡核苷酸，以便延长异丝水霉Δ17去饱和酶基因(例如，D17-1A，D17-1B，D17-2A，D17-2B，D17-3A，D17-3B，D17-4A，D17-4B，D17-5A，D17-5B，D17-6A，D17-6B，D17-7A，D17-7B，D17-8A，D17-8B，D17-9A，D17-9B，D17-10A，D17-10B，D17-11A和D17-11B，相当于(SEQ ID NOs：63-84)的密码子优化的编码区的完整长度。每一对有义(A)和反义(B)寡核苷酸是互补的，只有位于每一个5′-末端的4bp的突出部分例外。另外，引物D17-1A，D17-4B，D17-5A，D17-8A和D17-8B还导入了NcoI，BglIIH SalI限制位点以便随后分别进行亚克隆。
采用在实施例4中所披露的方法，用T4多核苷酸激酶对100ng的每一种寡核苷酸进行磷酸化。然后混合每一对有义和反义寡核苷酸，并且退火。因此，D17-1A(SEQ ID NO：63)与D17-1B(SEQ IDNO：64)退火，以便产生双链产物″D17-1AB″。类似地，D17-2A(SEQID NO：65)与D17-2B(SEQ ID NO：66)退火，以便产生双链产物″D17-2AB″等。
然后将三个独立的退火的，双链寡核苷酸的集合连接在一起，如下文所述：
·集合1：包括D17-1AB，D17-2AB，D17-3AB和D17-4AB；
·集合2：包括D17-5AB，D17-6AB，D17-7AB和D17-8AB；和
·集合3：包括D17-9AB，D17-10AB和D17-11AB。
每一个退火的寡核苷酸集合在16℃下在20μl的体积中连接过夜。
然后通过PCR扩增每一个连接反应的产物。具体地讲，使用连接的″集合1″混合物(即，D17-1AB，D17-2AB，D17-3AB和D17-4AB)作模板，并且用寡核苷酸D17-1(SEQ ID NO：85)和D17-4R(SEQ IDNO：86)作引物，通过PCR扩增密码子优化的Δ17去饱和酶基因的第一部分。PCR扩增是在总体积为50μl的总体积中进行的，使用了实施例4中所使用的PCR条件和热循环程序。将430bp PCR片段亚克隆到pGEM-T easy载体(Promega)上，以便制备pT17(1-4)。
用连接的″集合2″混合物(即，D17-5AB，D17-6AB，D17-7AB和D17-8AB)作模板，并且用寡核苷酸D17-5(SEQ ID NO：87)和D17-8D(SEQ ID NO：88)作引物，通过PCR以类似方式扩增了密码子优化的Δ17去饱和酶基因的第二部分，并且克隆到pGEM-T-easy载体上，以便制备pT17(5-8)。最后，用″集合3″连接混合物(即，D17-9AB，D17-10AB和D17-11AB)作模板，并且用寡核苷酸D17-8U(SEQ IDNO：89)和D17-11(SEQ ID NO：90)作引物，通过PCR以类似方式扩增了密码子优化的Δ17去饱和酶基因的第三部分，并且克隆到pGEM-T-easy载体上，以便制备pT17(9-11)。
用pT17(1-4)，pT17(5-8)和pT17(9-11)分别转化大肠杆菌，并且从氨苄青霉素-抗性转化体中分离质粒DNA。纯化质粒DNA，并且用合适的限制性内切核酸酶消化，以便释放pT17(1-4)的420bpNcoI/BglII片段，pT17(5-8)的400bp BglII/SalI片段，和pT17(9-11)的300bp SalI/NotI片段。然后合并这些片段，连接在一起，并且用作模板扩增整个合成的Δ17去饱和酶基因，用D17-1(SEQ ID NO：85)和D17-11(SEQ ID NO：90)作引物。PCR扩增是在50μl的总体积中进行的，使用上述针对Δ17去饱和酶基因的每一部分描述的条件，以及以下的热循环程序：首先在95℃下变性3分钟，然后进行35轮以下循环：95℃，1min，56℃，30sec，72℃，1.1min。在72℃下进行10分钟的最终的延伸循环，然后在4℃下终止反应。用NcoI/NotI消化1.1kB PCR产物，并且亚克隆到NcoI/NotI-消化过的pY5-13，以便制备pYSD17S(图10A)。
作为用野生型和密码子优化的Δ17去饱和酶进行的对照底物补料实验中的额外的″对照″，通过定点诱变，用YL53(SEQ ID NO：120)和YL54(SEQ ID NO：121)作引物，除去pYSD17(参见实施例2)的富含AT-的PacI位点，以便制备pYSD17M(图10B)。
实施例6
密码子优化的高亲和力PUFA延伸酶基因的合成
来自高山被孢霉的高亲和力PUFA延伸酶基因(SEQ ID NO：5)的长度为957bp(GenBank#AX464731；WO00/12720)。根据高山被孢霉DNA序列，按照耶氏酵母属密码子选择方式，′ATG′翻译起始密码子周围的共有序列，以及RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi和Brewer，同上)设计了密码子优化的高亲和力PUFA延伸酶基因。除了修饰翻译起始位点之外，还对957bp编码区(相当于85个密码子)的94bp进行了密码子优化。在图11中示出了这种密码子优化的基因(SEQ ID NO：91)和来自高山被孢霉的完整长度的野生型序列(SEQ1D NO：5)的比较，其中，用粗体字符表示的核苷酸相当于在密码子优化的基因上修饰过的核苷酸。对密码子优化的基因的修饰，不会改变所编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
在图12中示出了用于合成高亲和力延伸酶基因的方法。具体地讲，设计了十对寡核苷酸，以便延伸高山被孢霉高亲和力延伸酶编码区(即，EL-1A，EL-1B，EL-2A，EL-2B，EL-3A，EL-3B，EL-4A，EL-4B，EL-5A，EL-5B，EL-6A，EL-6B，EL-7A，EL-7B，EL-8A，EL-8B，EL-9A，EL-9B，EL-10A和EL-10B，相当于SEQ ID NOs：92-111)的整个长度。每一对有义(A)和反义(B)寡核苷酸是互补的，只有位于5′-末端的4bp的突出部分例外。
按照实施例4的方法，用T4多核苷酸激酶对100ng每一种寡核苷酸进行磷酸化。然后混合每一对有义和反义寡核苷酸并且退火。因此，EL-1A(SEQ ID NO：92)与EL1-1B(SEQ ID NO：93)退火，以便产生双链产物″EL-1AB″，EL-2A(SEQ ID NO：94)与EL-2B(SEQ IDNO：95)退火，以便产生双链产物″EL-2AB″等。
然后将两个独立的退火的，双链寡核苷酸的集合连接在一起，所述集合如下：
·集合1：包括EL-1AB，EL-2AB，EL-3AB，EL-4AB和EL-5AB；和
·集合2：包括EL-6AB，EL-7AB，EL-8AB，EL-9AB和EL-10AB。
在16℃下，用10单位的T4DNA连接酶在20μl体积中连接每一个退火的寡核苷酸集合过夜。
然后通过PCR扩增每一种连接反应产物。具体地讲，使用连接的″集合1″混合物(即，EL-1AB，EL-2AB，EL-3AB，EL-4AB和EL-5AB)作模板，并且用寡核苷酸EL-1(SEQ ID NO：112)和EL-5R(SEQ IDNO：113)作引物，通过PCR扩增密码子优化的延伸酶基因的第一部分。PCR扩增是在50μl的反应混合物中按照实施例4所述方法进行的。扩增是按以下方法进行的：在95℃下初始变性3分钟，然后进行35轮以下循环：95℃，1min，56℃，30sec，72℃，1min。在72℃下进行10分钟的最终延伸循环，然后在4℃下终止反应。将500bp PCR片段亚克隆到pGEM-T easy载体(Promega)上，以便制备pTEL(1-5)。
用连接的″集合2″混合物(即，EL-6AB，EL-7AB，EL-8AB，EL-9AB和EL-10AB)作模板，并且用寡核苷酸EL-6(SEQ ID NO：114)和EL-10R(SEQ ID NO：115)作引物，通过PCR以类似方法扩增密码子优化的延伸酶基因的第二部分。并且亚克隆到pGEM-T easy载体上，以便制备pTEL(6-10)。
分别用pTEL(1-5)和pTEL(6-10)转化大肠杆菌细胞，并且纯化来自氨苄青霉素抗性转化体的质粒DNA，并且用合适的限制性内切核酸酶消化，以便释放pTEL(1-5)的500bp NcoI/SalI片段，和pTEL(6-10)的470bp SalI/NotI片段。混合所述片段，并且连接在NcoI/NotI消化过的pY5-13上，以便制备pELS-1。
对pELS-1插入片段进行的DNA序列分析，确定了在+65号位置(其中，将′ATG′翻译密码子的′A′确定为+1)上存在一个′C′→′T′碱基取代，它导致了氨基酸从Thr(ACC)改变成Ser(AGC)。然后使用寡核苷酸EL-M1(SEQ ID NO：116)和EL-M2(SEQ ID NO：117)作引物，通过定点诱变纠正这种突变，以便制备pELS(图13A)。
实施例7
用密码子优化的Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶和高亲和力PUFA延 伸酶基因转化解脂耶氏酵母
按照实施例2所述方法将包括野生型和密码子优化的Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶和高亲和力PUFA延伸酶基因的质粒分别转化入解脂耶氏酵母ATCC#76982。使用该技术，获得了包括以下质粒的转化体：
表5
转化体解脂耶氏酵母中质粒的概述
  质粒 描述
  pYSD6-来自实施例2 野生型Δ6去饱和酶
  pYD6S-来自实施例4 密码子优化的Δ6去饱和酶
  pYSD17-来自实施例2 野生型Δ17去饱和酶
  PYSD17M-来自实施例5 野生型Δ17去饱和酶，去掉富含AT的PacI位点
  pYSD17S-来自实施例5 密码子优化的Δ17去饱和酶
  pY58-来自实施例2 野生型延伸酶
  pELS-来自实施例6 密码子优化的延伸酶
实施例8
在解脂耶氏酵母中分析密码子优化的Δ6和Δ17去饱和酶和高亲和 力延伸酶的转化效率
在分别比较野生型和密码子优化的Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶和高亲和力延伸酶的转化效率之后，证实了在解脂耶氏酵母中密码子优化将LA转化成GLA(Δ6去饱和酶)的底物转化百分比提高了大约40％，ARA转化成EPA(Δ17去饱和酶)的底物转化百分比提高了大约2倍，而GLA转化成DGLA(延伸酶)的底物转化百分比提高了大约57％。
使用密码子优化的Δ6去饱和酶的底物转化百分比
Δ6去饱和酶能将LA转化成GLA和/或ALA转化成STA(参见图1)。为了比较野生型和密码子优化的Δ6去饱和酶基因的转化效率，在含有每一种替代的质粒构建体(即，pYSD6或pYD6S)的解脂耶氏酵母中测定底物转化百分比([产物]/[底物+产物])*100)。具体地讲，含有pYSD6或pYD6S的解脂耶氏酵母在3mL基本培养基中从单菌落生长，在含有10μg的LA的基本培养基中继代培养，并且按实施例2所述进行脂类分析。
该实验的结果表明，含有pYSD6的耶氏酵母属菌株能将大约30％的底物LA转化成GLA(图14A)，而含有pYD6S的耶氏酵母属菌株能将大约42％的LA转化成GLA(图14B)。根据这一发现，含有密码子优化的Δ6去饱和酶基因的耶氏酵母属在解脂耶氏酵母中能转化的LA比野生型高山被孢霉Δ6去饱和酶基因多大约40％或以上。
使用密码子优化的Δ17去饱和酶的底物转化百分比
Δ17去饱和酶能将DGLA转化成ETA和/或将ARA转化成EPA(参见图1)。为了比较野生型和密码子优化的Δ17去饱和酶基因的转化效率，在含有pYSD17，pYSD17M和pYSD17S的解脂耶氏酵母中测定了底物转化百分比。每一种转化体是在3mL的基本培养基中从单菌落生长的，在含有10μg的ARA的基本培养基中继代培养，并且按实施例2所述方法进行脂类分析。
ARA补料实验的结果表明，具有对照质粒pYSD17或pYSD17M的耶氏酵母属菌株能将大约23％的细胞内ARA转化成EPA(图15A)，而在pYSD17S上包括密码子优化的Δ17去饱和酶基因的菌株能将大约45％的细胞内ARA转化成EPA(图15B)。因此，包括密码子优化的Δ17去饱和酶基因的耶氏酵母属可以转化的ARA比包括野生型异丝水霉基因的菌株多出大约2倍。
使用密码子优化的延伸酶的底物转化百分比
高山被孢霉的高亲和力PUFA延伸酶主要负责催化GLA转化成DGLA(参见图1；WO 00/12720)。为了比较野生型和密码子优化的延伸酶基因的转化效率，在含有pY58和pELS的解脂耶氏酵母中测定了底物转化百分比。转化体是在3mL的基本培养基中从单菌落生长的，在含有10μg的GLA的基本培养基中继代培养，并且按实施例2所述方法进行脂类分析。
GLA补料实验的结果表明，包括pY58的解脂耶氏酵母能将大约30％的底物GLA转化成DGLA(图16A)，而包括pELS的菌株能将大约47％的GLA转化成DGLA(图16B)。根据这一结果，在解脂耶氏酵母中，与野生型高山被孢霉延伸酶基因相比，密码子优化的延伸酶基因能转化多出大约57％的GLA。
                   序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Company，Inc.
<120>用于在油质酵母中生产多不饱和脂肪酸的密码子优化的基因
<130>CL2234 PCT
<150>US60/468718
<151>2003-05-07
<150>US60/468677
<151>2003-05-07
<160>122
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1374
<212>DNA
<213>高山被孢霉AF465281
<400>1
atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg aggttttgaa tgccgaggct    60
ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca cccttcttga tgatcatcga caacaaggtg    120
tacgatgtcc gcgagttcgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt    180
ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact tttcaccccg aggctgcttg ggagactctt    240
gccaactttt acgttggtga tattgacgag agcgaccgcg atatcaagaa tgatgacttt    300
gcggccgagg tccgcaagct gcgtaccttg ttccagtctc ttggttacta cgattcttcc    360
aaggcatact acgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggttt gtcgacggtc    420
attgtggcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgcttttg    480
ggtctgttct ggcagcagtg cggatggttg gctcacgact ttttgcatca ccaggtcttc    540
caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggcttc    600
tcgtcctcgt ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ccgcccccaa cgtccacggc    660
gaggatcccg acattgacac ccaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc gttggagatg    720
ttctcggatg tcccagatga ggagctgacc cgcatgtggt cgcgtttcat ggtcctgaac    780
cagacctggt tttacttccc cattctctcg tttgcccgtc tctcctggtg cctccagtcc    840
attctctttg tgctgcctaa cggtcaggcc cacaagccct cgggcgcgcg tgtgcccatc    900
tcgttggtcg agcagctgtc gcttgcgatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc    960
ctgttcatca aggatcccgt caacatgctg gtgtactttt tggtgtcgca ggcggtgtgc    1020
ggaaacttgt tggcgatcgt gttctcgctc aaccacaacg gtatgcctgt gatctcgaag    1080
gaggaggcgg tcgatatgga tttcttcacg aagcagatca tcacgggtcg tgatgtccac    1140
ccgggtctat ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact atcagatcga gcaccacttg    1200
ttcccttcga tgcctcgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gaccctgtgc    1260
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agccgtctga acgaggtctc caaggctacc tccaagatgg gtaaggcgca gtaa          1374
<210>2
<211>457
<212>PRT
<213>高山被孢霉AF465281
<400>2
Met Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Val Leu
1               5                   10                  15
Asn Ala Glu Ala Leu Asn Glu Gly Lys Lys Asp Ala Glu Ala Pro Phe
            20                  25                  30
Leu Met Ile Ile Asp Asn Lys Val Tyr Asp Val Arg Glu Phe Val Pro
        35                  40                  45
Asp His Pro Gly Gly Ser Val Ile Leu Thr His Val Gly Lys Asp Gly
    50                  55                  60
Thr Asp Val Phe Asp Thr Phe His Pro Glu Ala Ala Trp Glu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Ala Asn Phe Tyr Val Gly Asp Ile Asp Glu Ser Asp Arg Asp Ile Lys
                85                  90                  95
Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gln
            100                 105                 110
Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val
        115                 120                 125
Ser Phe Asn Leu Cys Ile Trp Gly Leu Ser Thr Val Ile Val Ala Lys
    130                 135                 140
Trp Gly Gln Thr Ser Thr Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu
145                 150                 155                 160
Gly Leu Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His
                165                 170                 175
His Gln Val Phe Gln Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe
            180                 185                 190
Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys
        195                 200                 205
His Asn Thr His His Ala Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp
    210                 215                 220
Ile Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met
225                 230                 235                 240
Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe
                245                 250                 255
Met Val Leu Asn Gln Thr Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala
            260                 265                 270
Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser Ile Leu Phe Val Leu Pro Asn Gly
        275                 280                 285
Gln Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu
    290                 295                 300
Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe
305                 310                 315                 320
Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Leu Val Tyr Phe Leu Val Ser
                325                 330                 335
Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His
            340                 345                 350
Asn Gly Met Pro Val Ile Ser Lys Glu Glu Ala Val Asp Met Asp Phe
        355                 360                 365
Phe Thr Lys Gln Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe
    370                 375                 380
Ala Asn Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val
                405                 410                 415
Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Asn Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met
            420                 425                 430
Ile Glu Gly Thr Ala Glu Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys
        435                 440                 445
Ala Thr Ser Lys Met Gly Lys Ala Gln
    450                 455
<210>3
<211>1077
<212>DNA
<213>异丝水霉(ATCC #56851)
<400>3
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gataacgttc tgctccacgc gctcgtttgc gccacctaca tctacgtgca gggcgtcatc    240
ttctggggct tcttcacggt cggccacgac tgcggccact cggccttctc gcgctaccac    300
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tggcgcgtga cgcaccgcca ccaccacaag aacacgggca acattgataa ggacgagatc    420
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ggcctctact actatgcgcc gctctttgtc tttgcttcgt tcctcgtcat tacgaccttc    720
ttgcaccaca acgacgaagc gacgccgtgg tacggcgact cggagtggac gtacgtcaag    780
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gcgcagatct tcacgctcaa agagtcggcc gcggccgcca aggccaagtc ggactaa       1077
<210>4
<211>358
<212>PRT
<213>异丝水霉(ATCC #56851)
<400>4
Met Ala Glu Asp Lys Thr Lys Val Glu Phe Pro Thr Leu Thr Glu Leu
1               5                   10                  15
Lys His Ser Ile Pro Ash Ala Cys Phe Glu Ser Asn Leu Gly Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Tyr Tyr Thr Ala Arg Ala Ile Phe Asn Ala Ser Ala Ser Ala Ala
        35                  40                  45
Leu Leu Tyr Ala Ala Arg Ser Thr Pro Phe Ile Ala Asp Asn Val Leu
    50                  55                  60
Leu His Ala Leu Val Cys Ala Thr Tyr Ile Tyr Val Gln Gly Val Ile
65                  70                  75                  80
Phe Trp Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Cys Gly His Ser Ala Phe
                85                  90                  95
Ser Arg Tyr His Ser Val Asn Phe Ile Ile Gly Cys Ile Met His Ser
            100                 105                 110
Ala Ile Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Arg Val Thr His Arg His His
        115                 120                 125
His Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Lys Asp Glu Ile Phe Tyr Pro His
    130                 135                 140
Arg Ser Val Lys Asp Leu Gln Asp Val Arg Gln Trp Val Tyr Thr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ala Trp Phe Val Tyr Leu Lys Val Gly Tyr Ala Pro Arg Thr
                165                 170                 175
Met Ser His Phe Asp Pro Trp Asp Pro Leu Leu Leu Arg Arg Ala Ser
            180                 185                 190
Ala Val Ile Val Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Phe Phe Ala Ala Tyr
        195                 200                 205
Ala Tyr Leu Thr Tyr Ser Leu Gly Phe Ala Val Met Gly Leu Tyr Tyr
    210                 215                 220
Tyr Ala Pro Leu Phe Val Phe Ala Ser Phe Leu Val Ile Thr Thr Phe
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Leu His His Asn Asp Glu Ala Thr Pro Trp Tyr Gly Asp Ser Glu Trp
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        275                 280                 285
Leu Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Asn Glu Ala Thr Lys His
    290                 295                 300
Phe Ala Ala Ala Tyr Pro His Leu Val Arg Arg Asn Asp Glu Pro Ile
305                 310                 315                 320
Ile Thr Ala Phe Phe Lys Thr Ala His Leu Phe Val Asn Tyr Gly Ala
                325                 330                 335
Val Pro Glu Thr Ala Gln Ile Phe Thr Leu Lys Glu Ser Ala Ala Ala
            340                 345                 350
Ala Lys Ala Lys Ser Asp
        355
<210>5
<211>957
<212>DNA
<213>高山被孢霉AX464731
<400>5
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<211>318
<212>PRT
<213>高山被孢霉AX464731
<400>6
Met Glu Ser Ile Ala Pro Phe Leu Pro Ser Lys Met Pro Gln Asp Leu
1               5                   10                  15
Phe Met Asp Leu Ala Thr Ala Ile Gly Val Arg Ala Ala Pro Tyr Val
            20                  25                  30
Asp Pro Leu Glu Ala Ala Leu Val Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ile Pro
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Ala Tyr Gln Ala Asn Tyr Gly Leu Phe Glu Asn Ala Ala Asp His Thr
    130                 135                 140
Phe Lys Gly Leu Pro Met Ala Lys Met Ile Trp Leu Phe Tyr Phe Ser
145                 150                 155                 160
Lys Ile Met Glu Phe Val Asp Thr Met Ile Met Val Leu Lys Lys Asn
                165                 170                 175
Asn Arg Gln Ile Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ser Ser Ile Phe
            180                 185                 190
Thr Ile Trp Trp Leu Val Thr Phe Val Ala Pro Asn Gly Glu Ala Tyr
        195                 200                 205
Phe Ser Ala Ala Leu Asn Ser Phe Ile His Val Ile Met Tyr Gly Tyr
    210                 215                 220
Tyr Phe Leu Ser Ala Leu Gly Phe Lys Gln Val Ser Phe Ile Lys Phe
225                 230                 235                 240
Tyr Ile Thr Arg Ser Gln Met Thr Gln Phe Cys Met Met Ser Val Gln
                245                 250                 255
Ser Ser Trp Asp Met Tyr Ala Met Lys Val Leu Gly Arg Pro Gly Tyr
            260                 265                 270
Pro Phe Phe Ile Thr Ala Leu Leu Trp Phe Tyr Met Trp Thr Met Leu
        275                 280                 285
Gly Leu Phe Tyr Asn Phe Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Leu Ala Lys Gln
    290                 295                 300
Ala Lys Ala Asp Ala Ala Lys Glu Lys Ala Arg Lys Leu Gln
305                 310                 315
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物TEF5’
<400>7
agagaccggg ttggcggcg                                                 19
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物TEF3’
<400>8
ttggatcctt tgaatgattc ttatactcag                                     30
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物XPR5’
<400>9
tttccgcggc ccgagattcc ggcctcttc                                      29
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物XPR3’
<400>10
tttccgcgga cacaatatct ggtcaaattt c                                   31
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL1
<400>11
cagtgccaaa agccaaggca ctgagctcgt                                     30
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL2
<400>12
gacgagctca gtgccttggc ttttggcact g                                   31
<210>13
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL3
<400>13
gtataagaat cattcaccat ggatccacta gttcta                              36
<210>14
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL4
<400>14
tagaactagt ggatccatgg tgaatgattc ttatac                              36
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL23
<400>15
atggatccac tagttaatta actagagcgg ccgcca                              36
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL24
<400>16
tggcggccgc tctagttaat taactagtgg atccat                              36
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL5
<400>17
cccccctcga ggtcgatggt gtcgataagc ttgatatcg                           39
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL6
<400>18
cgatatcaag cttatcgaca ccatcgacct cgagggggg                           39
<210>19
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL9
<400>19
tggtaaataa atgatgtcga ctcaggcgac gacgg                               35
<210>20
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL10
<400>20
ccgtcgtcgc ctgagtcgac atcatttatt tacca                               35
<210>21
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL7
<400>21
caaccgattt cgacagttaa ttaataattt gaatcga                             37
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL8
<400>22
tcgattcaaa ttattaatta actgtcgaaa tcggttg                             37
<210>23
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL61
<400>23
acaattccac acaacgtacg agccggaagc ata                                 33
<210>24
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL62
<400>24
tatgcttccg gctcgtacgt tgtgtggaat tgt                                 33
<210>25
<211>1374
<212>DNA
<213>高山被孢霉
<400>25
atggctgccg ctccctctgt gcgaaccttt acccgagccg aggttctgaa cgctgaggct    60
ctgaacgagg gcaagaagga cgctgaggct cccttcctga tgatcatcga caacaaggtg    120
tacgacgtcc gagagttcgt ccctgaccat cctggaggct ccgtgattct cacccacgtt    180
ggcaaggacg gcaccgacgt ctttgacacc tttcatcccg aggctgcttg ggagactctc    240
gccaacttct acgttggaga cattgacgag tccgaccgag acatcaagaa cgatgacttt    300
gccgctgagg tccgaaagct gcgaaccctg ttccagtctc tcggctacta cgactcctct    360
aaggcctact acgccttcaa ggtctccttc aacctctgca tctggggact gtccaccgtc    420
attgtggcca agtggggtca gacctccacc ctcgccaacg tgctctctgc tgccctgctc    480
ggcctgttct ggcagcagtg cggatggctg gctcacgact ttctgcacca ccaggtcttc    540
caggaccgat tctggggtga tctcttcgga gccttcctgg gaggtgtctg ccagggcttc    600
tcctcttcct ggtggaagga caagcacaac actcaccatg ccgctcccaa cgtgcatggc    660
gaggatcctg acattgacac ccaccctctc ctgacctggt ccgagcacgc tctggagatg    720
ttctccgacg tccccgatga ggagctgacc cgaatgtggt ctcgattcat ggtcctgaac    780
cagacctggt tctacttccc cattctctcc ttcgctcgac tgtcttggtg cctccagtcc    840
attctctttg tgctgcccaa cggtcaggct cacaagccct ccggagctcg agtgcccatc    900
tccctggtcg agcagctgtc cctcgccatg cactggacct ggtacctcgc taccatgttc    960
ctgttcatca aggatcctgt caacatgctc gtgtacttcc tggtgtctca ggctgtgtgc    1020
ggaaacctgc tcgccatcgt gttctccctc aaccacaacg gtatgcctgt  gatctccaag   1080
gaggaggctg tcgacatgga tttctttacc aagcagatca tcactggtcg agatgtccat    1140
cctggactgt tcgccaactg gttcaccggt ggcctgaact accagatcga gcatcacctg    1200
ttcccttcca tgcctcgaca caacttctcc aagatccagc ctgccgtcga gaccctgtgc    1260
aagaagtaca acgtccgata ccacaccact ggtatgatcg agggaactgc cgaggtcttc    1320
tcccgactga acgaggtctc caaggccacc tccaagatgg gcaaggctca gtaa          1374
<210>26
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-1A
<400>26
ccatggctgc cgctccctct gtgcgaacct ttacccgagc cgaggttctg aacgctgagg    60
ctctgaacga gggcaagaag gacgctgag                                      89
<210>27
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-1B
<400>27
gagcctcagc gtccttcttg ccctcgttca gagcctcagc gttcagaacc tcggctcggg    60
taaaggttcg cacagaggga gcggcagcca t                                   91
<210>28
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-2A
<400>28
gctcccttcc tgatgatcat cgacaacaag gtgtacgacg tccgagagtt cgtccctgac    60
catcctggag gctccgtgat tctcacccac gt                                  92
<210>29
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-2B
<400>29
gccaacgtgg gtgagaatca cggagcctcc aggatggtca gggacgaact ctcggacgtc    60
gtacaccttg ttgtcgatga tcatcaggaa gg                                  92
<210>30
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-3A
<400>30
tggcaaggac ggcaccgacg tctttgacac ctttcatccc gaggctgctt gggagactct    60
cgccaacttc tacgttggag acattgacga                                     90
<210>31
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-3B
<400>31
ggactcgtca atgtctccaa cgtagaagtt ggcgagagtc tcccaagcag cctcgggatg    60
aaaggtgtca aagacgtcgg tgccgtcctt                                     90
<210>32
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-4A
<400>32
gtccgaccga gacatcaaga acgatgactt tgccgctgag gtccgaaagc tgcgaaccct    60
gttccagtct ctcggctact acgactcctc taaggcctac                          100
<210>33
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-4B
<400>33
cgtagtaggc cttagaggag tcgtagtagc cgagagactg gaacagggtt cgcagctttc    60
ggacctcagc ggcaaagtca tcgttcttga tgtctcggtc                          100
<210>34
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-5A
<400>34
ctaaggccta ctacgccttc aaggtctcct tcaacctctg catctgggga ctgtccaccg    60
tcattgtggc caagtggggt cagacctcca ccctcgccaa c                        101
<210>35
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-5B
<400>35
gcacgttggc gagggtggag gtctgacccc acttggccac aatgacggtg gacagtcccc    60
agatgcagag gttgaaggag accttgaagg cgtagtaggc c                        101
<210>36
<211>104
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-6A
<400>36
gtgctctctg ctgccctgct cggcctgttc tggcagcagt gcggatggct ggctcacgac    60
tttctgcacc accaggtctt ccaggaccga ttctggggtg atct                     104
<210>37
<211>104
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-6B
<400>37
gaagagatca ccccagaatc ggtcctggaa gacctggtgg tgcagaaagt cgtgagccag    60
ccatccgcac tgctgccaga acaggccgag cagggcagca gaga                     104
<210>38
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-7A
<400>38
cttcggagcc ttcctgggag gtgtctgcca gggcttctcc tcttcctggt ggaaggacaa    60
gcacaacact caccatgccg ctcccaacgt gcatggcgag gatcc                    105
<210>39
<211>103
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-7B
<400>39
caggatcctc gccatgcacg ttgggagcgg catggtgagt gttgtgcttg tccttccacc    60
aggaagagga gaagccctgg cagacacctc ccaggaaggc tcc                      103
<210>40
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-8A
<400>40
gaggatcctg acattgacac ccaccctctc ctgacctggt ccgagcacgc tctggagatg    60
ttctccgacg tccccgatga ggagctgacc cgaatgtggt ctcgat                   106
<210>41
<211>108
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-8B
<400>41
atgaatcgag accacattcg ggtcagctcc tcatcgggga cgtcggagaa catctccaga    60
gcgtgctcgg accaggtcag gagagggtgg gtgtcaatgt caggatcc                 108
<210>42
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-9A
<400>42
tcatggtcct gaaccagacc tggttctact tccccattct ctccttcgct cgactgtctt    60
ggtgcctcca gtccattctc tttgtgctgc ccaacggtca ggctca                   106
<210>43
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-9B
<400>43
cttgtgagcc tgaccgttgg gcagcacaaa gagaatggac tggaggcacc aagacagtcg    60
agcgaaggag agaatgggga agtagaacca ggtctggttc aggacc                   106
<210>44
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-10A
<400>44
caagccctcc ggagctcgag tgcccatctc cctggtcgag cagctgtccc tcgccatgca    60
ctggacctgg tacctcgcta ccatgttcct gttcatcaag gatcc                    105
<210>45
<211>103
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-10B
<400>45
caggatcctt gatgaacagg aacatggtag cgaggtacca ggtccagtgc atggcgaggg    60
acagctgctc gaccagggag atgggcactc gagctccgga ggg                      103
<210>46
<211>104
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-11A
<400>46
aggatcctgt caacatgctc gtgtacttcc tggtgtctca ggctgtgtgc ggaaacctgc    60
tcgccatcgt gttctccctc aaccacaacg gtatgcctgt gatc                     104
<210>47
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-11B
<400>47
tggagatcac aggcataccg ttgtggttga gggagaacac gatggcgagc aggtttccgc    60
acacagcctg agacaccagg aagtacacga gcatgttgac aggatc                   106
<210>48
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-12A
<400>48
tccaaggagg aggctgtcga catggatttc tttaccaagc agatcatcac tggtcgagat    60
gtccatcctg gactgttcgc caactggttc accggtggcc tgaac                    105
<210>49
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-12B
<400>49
ggtagttcag gccaccggtg aaccagttgg cgaacagtcc aggatggaca tctcgaccag    60
tgatgatctg cttggtaaag aaatccatgt cgacagcctc ctcct                    105
<210>50
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-13A
<400>50
taccagatcg agcatcacct gttcccttcc atgcctcgac acaacttctc caagatccag    60
cctgccgtcg agaccctgtg caagaagtac aacgtccgat ac                       102
<210>51
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-13B
<400>51
tgtggtatcg gacgttgtac ttcttgcaca gggtctcgac ggcaggctgg atcttggaga    60
agttgtgtcg aggcatggaa gggaacaggt gatgctcgat ct                       102
<210>52
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-14A
<400>52
cacaccactg gtatgatcga gggaactgcc gaggtcttct cccgactgaa cgaggtctcc    60
aaggccacct ccaagatggg caaggctcag taagcgg                             97
<210>53
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-14B
<400>53
gcggccgctt actgagcctt gcccatcttg gaggtggcct tggagacctc gttcagtcgg    60
gagaagacct cggcagttcc ctcgatcata ccagtgg                             97
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-1
<400>54
ccatggctgc cgctccctct g                                              21
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-4R
<400>55
cgtagtaggc cttagaggag                                                20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-5
<400>56
ctaaggccta ctacgccttc                                                20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-7R
<400>57
caggatcctc gccatgcacg                                                20
<210>58
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-8
<400>58
gaggatcctg acattgacac c                                              21
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-10R
<400>59
caggatcctt gatgaacagg                                                20
<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-11
<400>60
aggatcctgt caacatgctc g                                              21
<210>61
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D6-14R
<400>61
gcggccgctt actgagcctt gcccatc                                        27
<210>62
<211>1077
<212>DNA
<213>异丝水霉
<400>62
atggctgagg ataagaccaa ggtcgagttc cctaccctga ctgagctgaa gcactctatc    60
cctaacgctt gctttgagtc caacctcgga ctctcgctct actacactgc ccgagcgatc    120
ttcaacgcat ctgcctctgc tgctctgctc tacgctgccc gatctactcc cttcattgcc    180
gataacgttc tgctccacgc tctggtttgc gccacctaca tctacgtgca gggtgtcatc    240
ttctggggtt tctttaccgt cggtcacgac tgtggtcact ctgccttctc ccgataccac    300
tccgtcaact tcatcattgg ctgcatcatg cactctgcca ttctgactcc cttcgagtcc    360
tggcgagtga cccaccgaca ccatcacaag aacactggca acattgataa ggacgagatc    420
ttctaccctc atcggtccgt caaggacctc caggacgtgc gacaatgggt ctacaccctc    480
ggaggtgctt ggtttgtcta cctgaaggtc ggatatgctc ctcgaaccat gtcccacttt    540
gacccctggg accctctcct gcttcgacga gcctccgctg tcatcgtgtc cctcggagtc    600
tgggctgcct tcttcgctgc ctacgcctac ctcacatact cgctcggctt tgccgtcatg    660
ggcctctact actatgctcc tctctttgtc tttgcttcgt tcctcgtcat tactaccttc    720
ttgcatcaca acgacgaagc tactccctgg tacggtgact cggagtggac ctacgtcaag    780
ggcaacctga gctccgtcga ccgatcgtac ggagctttcg tggacaacct gtctcaccac    840
attggcaccc accaggtcca tcacttgttc cctatcattc cccactacaa gctcaacgaa    900
gccaccaagc actttgctgc cgcttaccct cacctcgtga gacgtaacga cgagcccatc    960
attactgcct tcttcaagac cgctcacctc tttgtcaact acggagctgt gcccgagact    1020
gctcagattt tcaccctcaa agagtctgcc gctgcagcca aggccaagag cgactaa       1077
<210>63
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-1A
<400>63
catggctgag gataagacca aggtcgagtt ccctaccctg actgagctga agcactctat    60
ccctaacgct tgctttgagt ccaacctcgg actctcgctc tacta                    105
<210>64
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-1B
<400>64
cagtgtagta gagcgagagt ccgaggttgg actcaaagca agcgttaggg atagagtgct    60
tcagctcagt cagggtaggg aactcgacct tggtcttatc ctcagc                   106
<210>65
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-2A
<400>65
cactgcccga gcgatcttca acgcatctgc ctctgctgct ctgctctacg ctgcccgatc    60
tactcccttc attgccgata acgttctgct ccacgctctg gtttgc                   106
<210>66
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-2B
<400>66
gtggcgcaaa ccagagcgtg gagcagaacg ttatcggcaa tgaagggagt agatcgggca    60
gcgtagagca gagcagcaga ggcagatgcg ttgaagatcg ctcggg                   106
<210>67
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-3A
<400>67
gccacctaca tctacgtgca gggtgtcatc ttctggggtt tctttaccgt cggtcacgac    60
tgtggtcact ctgccttctc ccgataccac tccgtcaact tcatc                    105
<210>68
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-3B
<400>68
ccaatgatga agttgacgga gtggtatcgg gagaaggcag agtgaccaca gtcgtgaccg    60
acggtaaaga aaccccagaa gatgacaccc tgcacgtaga tgtag                   105
<210>69
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-4A
<400>69
attggctgca tcatgcactc tgccattctg actcccttcg agtcctggcg agtgacccac    60
cgacaccatc acaagaacac tggcaacatt gataaggacg agatc                    105
<210>70
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-4B
<400>70
tagaagatct cgtccttatc aatgttgcca gtgttcttgt gatggtgtcg gtgggtcact    60
cgccaggact cgaagggagt cagaatggca gagtgcatga tgcag                    105
<210>71
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-5A
<400>71
acgagatctt ctaccctcat cggtccgtca aggacctcca ggacgtgcga caatgggtct    60
acaccctcgg aggtgcttgg tttgtctacc tgaaggtcgg atatg                    105
<210>72
<211>107
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-5B
<400>72
aggagcatat ccgaccttca ggtagacaaa ccaagcacct ccgagggtgt agacccattg    60
tcgcacgtcc tggaggtcct tgacggaccg atgagggtag aagatct                  107
<210>73
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-6A
<400>73
ctcctcgaac catgtcccac tttgacccct gggaccctct cctgcttcga cgagcctccg    60
ctgtcatcgt gtccctcgga gtctgggctg ccttcttcgc tgcct                    105
<210>74
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-6B
<400>74
aggcgtaggc agcgaagaag gcagcccaga ctccgaggga cacgatgaca gcggaggctc    60
gtcgaagcag gagagggtcc caggggtcaa agtgggacat ggttcg                   106
<210>75
<211>104
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-7A
<400>75
acgcctacct cacatactcg ctcggctttg ccgtcatggg cctctactac tatgctcctc    60
tctttgtctt tgcttcgttc ctcgtcatta ctaccttctt gcat                     104
<210>76
<211>103
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-7B
<400>76
ttgtgatgca agaaggtagt aatgacgagg aacgaagcaa agacaaagag aggagcatag    60
tagtagaggc ccatgacggc aaagccgagc gagtatgtga ggt                      103
<210>77
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-8A
<400>77
cacaacgacg aagctactcc ctggtacggt gactcggagt ggacctacgt caagggcaac    60
ctgagctccg tcgaccgatc gtacggagct ttcgtggaca acctgt                   106
<210>78
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-8B
<400>78
gtgagacagg ttgtccacga aagctccgta cgatcggtcg acggagctca ggttgccctt    60
gacgtaggtc cactccgagt caccgtacca gggagtagct tcgtcg                   106
<210>79
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-9A
<400>79
ctcaccacat tggcacccac caggtccatc acttgttccc tatcattccc cactacaagc    60
tcaacgaagc caccaagcac tttgctgccg cttaccctca cc                       102
<210>80
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-9B
<400>80
cacgaggtga gggtaagcgg cagcaaagtg cttggtggct tcgttgagct tgtagtgggg    60
aatgataggg aacaagtgat ggacctggtg ggtgccaatg tg                       102
<210>81
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-10A
<400>81
tcgtgagacg taacgacgag cccatcatta ctgccttctt caagaccgct cacctctttg    60
tcaactacgg agctgt                                                    76
<210>82
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-10B
<400>82
cgggcacagc tccgtagttg acaaagaggt gagcggtctt gaagaaggca gtaatgatgg    60
gctcgtcgtt acgtct                                                    76
<210>83
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-11A
<400>83
gcccgagact gctcagattt tcaccctcaa agagtctgcc gctgcagcca aggccaagag    60
cgactaa                                                              67
<210>84
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-11B
<400>84
ttagtcgctc ttggccttgg ctgcagcggc agactctttg agggtgaaaa tctgagcagt    60
ct                                                                   62
<210>85
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-1
<400>85
tttccatggc tgaggataag accaaggtcg ag                                  32
<210>86
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-4R
<400>86
ccctagaaga tctcgtcctt atcaatgttg ccag                                34
<210>87
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-5
<400>87
cccacgagat cttctaccct catcggt                                        27
<210>88
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-8D
<400>88
gaaagctccg tacgatcggt cgac                                           24
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-8U
<400>89
gtcgaccgat cgtacggagc tttc                                           24
<210>90
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D17-11
<400>90
aaagcggccg cttagtcgct cttggccttg gctg                                34
<210>91
<211>957
<212>DNA
<213>高山被孢霉
<400>91
atggagtcca ttgctccctt cctgccctcc aagatgcctc aggacctgtt catggacctc    60
gccaccgcta tcggtgtccg agctgctccc tacgtcgatc ccctggaggc tgccctggtt    120
gcccaggccg agaagtacat tcccaccatt gtccatcaca ctcgaggctt cctggttgcc    180
gtggagtctc ccctggctcg agagctgcct ctgatgaacc ccttccacgt gctcctgatc    240
gtgctcgcct acctggtcac cgtgtttgtg ggtatgcaga tcatgaagaa ctttgaacga    300
ttcgaggtca agaccttctc cctcctgcac aacttctgtc tggtctccat ctccgcctac    360
atgtgcggtg gcatcctgta cgaggcttat caggccaact atggactgtt tgagaacgct    420
gccgatcaca ccttcaaggg tctccctatg gctaagatga tctggctctt ctacttctcc    480
aagatcatgg agtttgtcga caccatgatc atggtcctca agaagaacaa ccgacagatt    540
tcctttctgc acgtgtacca ccactcttcc atcttcacca tctggtggct ggtcaccttc    600
gttgctccca acggtgaagc ctacttctct gctgccctga actccttcat ccacgtcatc    660
atgtacggct actactttct gtctgccctg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc    720
tacatcactc gatcccagat gacccagttc tgcatgatgt ctgtccagtc ttcctgggac    780
atgtacgcca tgaaggtcct tggccgacct ggatacccct tcttcatcac cgctctgctc    840
tggttctaca tgtggaccat gctcggtctc ttctacaact tttaccgaaa gaacgccaag    900
ctcgccaagc aggccaaggc tgacgctgcc aaggagaagg ccagaaagct ccagtaa       957
<210>92
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-1A
<400>92
ccatggagtc cattgctccc ttcctgccct ccaagatgcc tcaggacctg ttcatggacc    60
tcgccaccgc tatcggtgtc cgagctgctc cctacgtcga                          100
<210>93
<211>103
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-1B
<400>93
ggggatcgac gtagggagca gctcggacac cgatagcggt ggcgaggtcc atgaacaggt    60
cctgaggcat cttggagggc aggaagggag caatggactc cat                      103
<210>94
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-2A
<400>94
cccctggagg ctgccctggt tgcccaggcc gagaagtaca ttcccaccat tgtccatcac    60
actcgaggct tcctggttgc cgtggagtct cccctggctc g                        101
<210>95
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-2B
<400>95
ctctcgagcc aggggagact ccacggcaac caggaagcct cgagtgtgat ggacaatggt    60
gggaatgtac ttctcggcct gggcaaccag ggcagcctcc a                        101
<210>96
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-3A
<400>96
agagctgcct ctgatgaacc ccttccacgt gctcctgatc gtgctcgcct acctggtcac    60
cgtgtttgtg ggtatgcaga tcatgaagaa ctttgaacga                          100
<210>97
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-3B
<400>97
cgaatcgttc aaagttcttc atgatctgca tacccacaaa cacggtgacc aggtaggcga    60
gcacgatcag gagcacgtgg aaggggttca tcagaggcag                          100
<210>98
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-4A
<400>98
ttcgaggtca agaccttctc cctcctgcac aacttctgtc tggtctccat ctccgcctac    60
atgtgcggtg gcatcctgta cgaggcttat caggccaact                          100
<210>99
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-4B
<400>99
ccatagttgg cctgataagc ctcgtacagg atgccaccgc acatgtaggc ggagatggag    60
accagacaga agttgtgcag gagggagaag gtcttgacct                          100
<210>100
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-5A
<400>100
atggactgtt tgagaacgct gccgatcaca ccttcaaggg tctccctatg gctaagatga    60
tctggctctt ctacttctcc aagatcatgg agtttgtcga c                        101
<210>101
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-5B
<400>101
tggtgtcgac aaactccatg atcttggaga agtagaagag ccagatcatc ttagccatag    60
ggagaccctt gaaggtgtga tcggcagcgt tctcaaacag t                        101
<210>102
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-6A
<400>102
accatgatca tggtcctcaa gaagaacaac cgacagattt cctttctgca cgtgtaccac    60
cactcttcca tcttcaccat ctggtggct                                      89
<210>103
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-6B
<400>103
gaccagccac cagatggtga agatggaaga gtggtggtac acgtgcagaa aggaaatctg    60
tcggttgttc ttcttgagga ccatgatca                                      89
<210>104
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-7A
<400>104
ggtcaccttc gttgctccca acggtgaagc ctacttctct gctgccctga actccttcat    60
ccacgtcatc atgtacggct actactttc                                      89
<210>105
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-7B
<400>105
gacagaaagt agtagccgta catgatgacg tggatgaagg agttcagggc agcagagaag    60
taggcttcac cgttgggagc aacgaaggt                                      89
<210>106
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-8A
<400>106
tgtctgccct gggcttcaag caggtgtcgt tcatcaagtt ctacatcact cgatcccaga    60
tgacccagtt ctgcatgatg tctgtccagt c                                   91
<210>107
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-8B
<400>107
ggaagactgg acagacatca tgcagaactg ggtcatctgg gatcgagtga tgtagaactt    60
gatgaacgac acctgcttga agcccagggc a                                   91
<210>108
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-9A
<400>108
ttcctgggac atgtacgcca tgaaggtcct tggccgacct ggatacccct tcttcatcac    60
cgctctgctc tggttctaca tgtggaccat                                     90
<210>109
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-9B
<400>109
gagcatggtc cacatgtaga accagagcag agcggtgatg aagaaggggt atccaggtcg    60
gccaaggacc ttcatggcgt acatgtccca                                     90
<210>110
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-10A
<400>110
gctcggtctc ttctacaact tttaccgaaa gaacgccaag ctcgccaagc aggccaaggc    60
tgacgctgcc aaggagaagg ccagaaagct ccagtaa                             97
<210>111
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-10B
<400>111
cttactggag ctttctggcc ttctccttgg cagcgtcagc cttggcctgc ttggcgagct    60
tggcgttctt tcggtaaaag ttgtagaaga gacc                                94
<210>112
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-1
<400>112
tttccatgga gtccattgct cccttcc                                        27
<210>113
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-5R
<400>113
tggtgtcgac aaactccatg atc                                            23
<210>114
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-6
<400>114
tttgtcgaca ccatgatcat ggtcctcaag aag                                 33
<210>115
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-10R
<400>115
aaagcggccg cttactggag ctttctggcc ttctc                               35
<210>116
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-M1
<400>116
tcatggacct cgccaccgct atcggtgtcc                                     30
<210>117
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EL-M2
<400>117
ggacaccgat agcggtggcg aggtccatga                                     30
<210>118
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL21A
<400>118
tttccatggc tgaggataag acgaaggtcg agt                                 33
<210>119
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL22
<400>119
cccttaatta attagtccga cttggccttg gcggcc                              36
<210>120
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL53
<400>120
gccaagtcgg actaagctgc taactagagc ggccgc                              36
<210>121
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL54
<400>121
gcggccgctc tagttagcag cttagtccga cttggc                              36
<210>122
<211>10
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>n是a，c，g，或t
<400>122
mammatgnhs                                                           10

Claims (31)

1.选自下组的分离的核酸分子：
a)如SEQ ID NO：25所示的分离的核酸分子，它编码Δ6去饱和酶；或
b)完全互补于(a)的分离的核酸分子。
2.编码SEQ ID NO：2所示Δ6去饱和酶的分离的核酸分子，其中，至少144个密码子是密码子优化的，以便在耶氏酵母属中表达。
3.选自下组的分离的核酸分子：
a)编码SEQ ID NO：62所示Δ17去饱和酶的分离的核酸分子；或
b)完全互补于(a)的分离的核酸分子。
4.编码SEQ ID NO：4所示Δ17去饱和酶的分离的核酸分子，其中，至少117个密码子是密码子优化的，以便在耶氏酵母属中表达。
5.选自下组的分离的核酸分子：
a)编码SEQ ID NO：91所示的延伸酶的分离的核酸分子；或
b)完全互补于(a)的分离的核酸分子。
6.编码SEQ ID NO：6所示延伸酶的分离的核酸分子，其中，至少85个密码子是密码子优化的，以便在耶氏酵母属中表达。
7.一种嵌合基因，包括可操作地与合适的调控序列连接的如权利要求1-6中任意一项的分离的核酸分子。
8.一种转化过的耶氏酵母菌种，包括权利要求7的嵌合基因。
9.如FLUZONE8的转化过的耶氏酵母菌种，选自下组：解脂耶氏酵母ATCC#20362，解脂耶氏酵母ATCC#8862，解脂耶氏酵母ATCC#18944，解脂耶氏酵母ATCC#76982和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
10.一种生产γ-亚麻酸的方法，包括：
a)提供耶氏酵母菌种，它包括：
(i)编码Δ6去饱和酶多肽的如权利要求1或2的核酸分子，该核酸分子受合适的调控序列的控制；和
(ii)由亚油酸组成的去饱和酶底物来源；
b)在存在合适的可发酵碳源的条件下生长步骤(a)的耶氏酵母菌种，其中表达权利要求1或2的核酸分子，并且将亚油酸转化成γ-亚麻酸；和
c)任选回收步骤(b)的γ-亚麻酸。
11.如权利要求10的方法，其中，所述去饱和酶底物来源对耶氏酵母菌种来说是内源的。
12.一种生产十八碳四烯酸的方法，包括：
a)提供耶氏酵母菌种，它包括：
(i)编码Δ6去饱和酶多肽的如权利要求1或2的核酸分子，该核酸分子受合适的调控序列的控制；和
(ii)由α-亚油酸组成的去饱和酶底物来源；
b)在存在合适的可发酵碳源的条件下生长步骤(a)的耶氏酵母菌种，其中，表达如权利要求1或2的核酸分子，并且将α-亚油酸转化成十八碳四烯酸；和
c)任选回收步骤(b)的十八碳四烯酸。
13.如权利要求12的方法，其中，所述去饱和酶底物来源对耶氏酵母菌种来说是内源的。
14.一种生产二十碳四烯酸的方法，包括：
a)提供耶氏酵母菌种，它包括：
(i)编码Δ17去饱和多肽的如权利要求3或4的核酸分子，该核酸分子受合适的调控序列的控制；和
(ii)由二高-γ-亚油酸组成的去饱和酶底物来源；
b)在存在合适的可发酵碳源的条件下生长步骤(a)的耶氏酵母菌种，其中，表达如权利要求3或4的核酸分子，并且将二高-γ-亚油酸转化成二十碳四烯酸；和
c)任选回收步骤(b)的二十碳四烯酸。
15.如权利要求14的方法，其中，所述去饱和酶底物来源对耶氏酵母菌种来说是内源的。
16.一种生产二十碳五烯酸的方法，包括：
a)提供耶氏酵母菌种，它包括：
(i)编码Δ17去饱和多肽的如权利要求3或4的核酸分子，该核酸分子受合适的调控序列的控制；和
(ii)由花生四烯酸组成的去饱和酶底物来源；
b)在存在合适的可发酵碳源的条件下生长步骤(a)的耶氏酵母菌种，其中，表达如权利要求3或4的核酸分子，并且将花生四烯酸转化成二十碳五烯酸；和
c)任选回收步骤(b)的二十碳五烯酸。
17.如权利要求16的方法，其中，所述去饱和酶底物来源对耶氏酵母菌种来说是内源的。
18.一种生产二高-γ-亚油酸的方法，包括：
a)提供耶氏酵母菌种，它包括：
(i)编码延伸酶多肽的如权利要求5或6的核酸分子，该核酸分子受合适的调控序列的控制；和
(ii)由γ-亚麻酸组成的延伸酶底物来源；
b)在存在合适的可发酵碳源的条件下生长步骤(a)的耶氏酵母菌种，其中，表达如权利要求5或6的核酸分子，并且将γ-亚麻酸转化成二高-γ-亚油酸；和
c)任选回收步骤(b)的二高-γ-亚油酸。
19.如权利要求18的方法，其中，所述延伸酶底物来源对耶氏酵母菌种来说是内源的。
20.一种生产二十碳四烯酸的方法，包括：
a)提供耶氏酵母菌种，它包括：
(i)编码延伸酶多肽的如权利要求5或6的核酸分子，该核酸分子受合适的调控序列的控制；和
(ii)由十八碳四烯酸组成的延伸酶底物来源；
b)在存在合适的可发酵碳源的条件下生长步骤(a)的耶氏酵母菌种，其中，表达如权利要求5或6的核酸分子，并且将十八碳四烯酸转化成二十碳四烯酸；和
c)任选回收步骤(b)的二十碳四烯酸。
21.如权利要求20的方法，其中，所述延伸酶底物来源对耶氏酵母菌种来说是内源的。
22.一种生产二十二碳五烯酸的方法，包括：
a)提供耶氏酵母菌种，它包括：
(i)编码延伸酶多肽的如权利要求5或6的核酸分子，该核酸分子受合适的调控序列的控制；和
(ii)由二十碳五烯酸组成的延伸酶底物来源；
b)在存在合适的可发酵碳源的条件下生长步骤(a)的耶氏酵母菌种，其中，表达如权利要求5或6的核酸分子，并且将二十碳五烯酸转化成二十二碳五烯酸；和
c)任选回收步骤(b)的二十二碳五烯酸。
23.如权利要求22的方法，其中，所述延伸酶底物来源对耶氏酵母菌种来说是内源的。
24.一种优化基因以便在含油酵母中表达的方法，包括以下步骤：
a)获得含油酵母菌种的核苷酸编码区和相应多肽的序列，以便形成密码子数据库；
b)分析所述密码子数据库，以便确定优先编码每一种氨基酸的密码子；
c)获得要在含油酵母菌种中表达的基因的序列；
d)用步骤(b)中的优选密码子取代步骤(c)中的序列的非优选密码子，其中，所述基因是密码子优化的，以便在含油酵母菌种中表达。
25.如权利要求24的方法，其中，所述含油酵母选自下组：耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。
26.如权利要求25的方法，其中，所述宿主细胞选自下组：解脂耶氏酵母ATCC#20362，解脂耶氏酵母ATCC#8862，解脂耶氏酵母ATCC#18944，解脂耶氏酵母ATCC#76982和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
27.如权利要求24的方法，其中，要优化的基因编码选自下组的酶：Δ12去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ9去饱和酶，延伸酶，Δ5去饱和酶，Δ4去饱和酶，Δ17去饱和酶和Δ12去饱和酶。
28.分离的核酸分子，包括如SEQ ID NO：122所示的耶氏酵母属翻译起始位点。
29.一种用于优化基因在耶氏酵母属宿主中表达的方法，包括：
a)提供要在耶氏酵母属中表达的外源基因；
b)将步骤(a)的基因可操作地与权利要求28的分离的核酸分子连接，其中，所述外源基因是优化过的，以便在耶氏酵母属中表达。
30.如权利要求29的方法，其中，所述外源基因编码选自下组的酶：Δ12去饱和酶，Δ6去饱和酶，延伸酶，Δ5去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ9去饱和酶和Δ4去饱和酶。
31.通过权利要求10-27中任意一项的方法生产的微生物油。
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