DE102009007402A1 - Biosynthese und Gewinnung von Substanzen aus Zellen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese und Gewinnung von Substanzen aus Zellen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Industrie, insbesondere die Nahrungsmittelindustrie, aber auch alle weiteren Zweige, die Medizin und die Pharmazie. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Substanzen aus Zellen, ist dadurch gekennzeichnet, dass die die gewünschten Substanzen produzierendech Behandlung des Kulturmediums mit Hochspannungsimpulsen aus den Zellen freigesetzt oder für eine Extraktion zugänglich gemacht werden und anschließend aus dem Medium extrahiert werden.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese und Gewinnung von Substanzen aus Zellen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Industrie, insbesondere die Nahrungsmittelindustrie, aber auch alle weiteren Zweige, die Medizin und die Pharmazie.
  • Stand der Technik
  • Die Verwendung von Mikroorganismen zur Herstellung von Zielsubstanzen ist gut bekannt und wird bereits vielfach genutzt. Vor allem Hefen sind ein beliebter Organismus, was die Produktion unterschiedlichster Substanzen betrifft. So ist beispielsweise von Picataggio et al. in US 2005/0136519 oder von MaCool et al. in US 2007/0087420 die Herstellung von ungesättigten Fettsäuren in sogenannten „Fetthefen” beschrieben.
  • Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) sowie auch methylverzweigte Fettsäuren (BCFAs) sind ernährungsphysiologisch und pharmazeutisch von großem Interesse. Die bisherige Quelle für spezielle PUFAs sind Fischöle und einige wenige Pflanzenöle, z. B. aus der Nachtkerze (Oenothera biennis). Damit verbunden sind Umweltprobleme wie Überfischung der Meere und Überdüngung von Feldern. Die bisherige Aufarbeitung nutzt organisch chemische Lösungsmittel.
  • Die Biosynthese der PUFAs ist bekannt, die der BCFAs wurde bisher nur in Bakterien untersucht. Die genetische Überexpression der zur PUFA Synthese benötigten Enzyme (Desaturasen) wurde in Saccharomyces cerevisiae erfolgreich nachgewiesen (siehe auch US 2004/253621 oder WO 2004/101753 ). Studien zum Metabolismus der Fettsäuren in Hefen sind ebenfalls bekannt (Garbe & Tressl 2003 und 2004). Dabei konnte unter anderem die Stereoselektivität von Desaturasen (Biosynthese PUFA) sowie der Metabolismus von (oxygenierten) Fettsäuren in verschiedenen Hefen gezeigt werden. Darüber hinaus wurden Schlüsselreaktionen zum Abbau von methylverzweigten Fettsäuren in Hefen aufgeklärt (Richter 2005).
  • Für den industriellen Einsatz von mikrobiellen Systemen sind die Ausbeuten bisher jedoch zu gering. Ein weiteres grundsätzliches Problem für diese Art von Synthese ergibt sich, wenn die zu produzierenden Substanzen nicht von selbst, beispielsweise aus Gründen ihrer Beschaffenheit, von den Mikroorganismen in das umgebende Medium abgegeben werden.
  • Bisher konnte eine Isolierung der Zielsubstanzen aus den produzierenden Zellen lediglich mit Verfahren realisiert werden, welche diese Zellen während der Aufarbeitung zerstören.
  • Dies ist nachteilig, da die Wirtszellen erst wieder angezogen werden müssen, bevor das nächste Produktionsintervall gestartet wird, zudem muss die Vorgängergeneration aus den Bioreaktoren entfernt und das Gleichgewicht mit der neuen Kultur immer wieder neu eingestellt werden, d. h. der Prozess ist nicht kontinuierlich automatisierbar.
  • Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem effektiv verschiedene Zielsubstanzen in Zellen synthetisiert und aus diesen Zellen isoliert werden können, ohne dass dabei die produzierenden Zellen zerstört werden.
  • Diese Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst. Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß Anspruch 1, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
  • Der Erfindung lag die überraschende Erkenntnis zu Grunde, dass die Zielverbindungen aus den produzierenden Zellen mittels des Aufarbeitungsverfahrens der Hochspannungsimpulstechnologie (HSI) schonend extrahiert werden können, ohne diese Zellen zu zerstören.
  • Durch die beim Einsatz der Hochspannungsimpulstechnologie entstehenden Poren gehen die in den Zellen enthaltenen Zielsubstanzen, beispielsweise Fettsäuren, in das umgebende Medium über. Zum Medium wird im Falle der Fettsäuren eine lipophile Phase zugegeben, aus der das Endprodukt extrahiert wird. Auf diese Weise wird eine kontinuierliche Gewinnung/Isolierung ermöglicht.
  • Es ist praktikabel, die HSI-Behandlung kontinuierlich durchzuführen. Das erfolgt zweckmäßigerweise dadurch, dass die Biomasse zu einem gegebenen Zeitpunkt über einen Bypass aus dem Bioreaktor heraus und durch eine Behandlungskammer hindurch gepumpt wird. Nach erfolgter Behandlung gelangt die Biomasse zurück in den Fermenter und kann für die weitere Fermentation eingesetzt werden. So kann im Laufe mehrfacher Behandlungszyklen, die Zielsubstanz (hier Fettsäure) in der lipophilen Phase angereichert und später isoliert werden.
  • Die Phase zum Isolieren der Zielsubstanzen kann variieren, welche jeweils eingesetzt wird, ist abhängig von der Zielsubstanz. Denkbar sind hierbei lipophile Extraktionsmittel, wässrige Lösungen mit Zugabe von fettbindenden Substanzen sowie Extraktionsmittelgemische verschiedener Viskosität und Wasseraufnahmekapazität.
  • Das Spektrum der Zielsubstanzen sowie ihre Ausbeute werden über den gesamten Prozessverlauf hinweg verfolgt. Zu diesem Zweck werden zu ausgewählten Zeitpunkten Proben entnommen und mittels Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektor (GC-FID) und Gaschromatographie mit massenspektrometrischem Detektor (GC-MS) analysiert. Darüber hinaus werden Untersuchungen zur Optimierung der Stabilität der Produkte (z. B. gegenüber Oxidationsvorgängen) durchgeführt und wirksame Antioxidantien bzw. Stabilisatoren eingesetzt. Dafür wird verstärkt die Elektronenspinresonanzspektrometrie (ESR) verwendet.
  • Erfindungsgemäß wird mit dem Einsatz neuer Integrations-/Expressionssysteme für die einzubringenden Fremdgene ermöglicht, die Zellen genetisch so zu verändern, dass sie die Zielsubstanzen effektiver als bisher produzieren.
  • Durch Biotransformationen ganzer Zellen mit geeigneten isotopenmarkierten Vorstufen der Zielprodukte und anschließender GC-MS Analytik der Produkte, werden die an der Synthese dieser Zielprodukte beteiligten Schlüsselenzyme postuliert und im folgenden Schritt z. B. durch Knock-out Mutanten charakterisiert. Mit diesem innovativen Verfahren wird die Ausbeute und Reinheit der gewünschten Produkte der Biotransformation erhöht.
  • Am Beispiel von Fetthefen soll dieses Verfahren im Folgenden näher erläutert werden. Ein Fließschema für den Verfahrensablauf ist in 1 dargestellt.
  • Da Fetthefen nur in der Lage sind, Vorstufen der gewünschten Fettsäuren (PUFAs und BCFAs) anzureichern, ist eine molekulargenetische Modifikation (metabolic engineering) erforderlich. In einem ersten analytischen Screening stellten sich insbesondere verschiedene Hefen der Gattungen Lipomyces, Hansenula, Candida und Rhodotorula aufgrund ihres Fettsäurespektrums als besonders geeignet für ein metabolic engineering heraus. Zur Gewinnung der PUFAs sind verschiedene Gene des ω-3 und ω-6 Metabolismus, insbesondere das Gen für Δ6-Desaturase getestet worden. Bezüglich des in Hefe nicht realisierten BCFA Metabolismus werden heterologe Gene verschiedener Schlüsselenzyme eingebracht, die den Stoffwechsel in Richtung BCFA modifizieren. Die ausgewählten Fetthefen sind bisher wenig oder gar nicht molekulargenetisch charakterisiert. Um molekulargenetische Veränderungen vornehmen zu können, wurde ein entsprechendes Integrations-/Expressionssystem für die einzubringenden Fremdgene entwickelt und verschiedene Transformationsmethoden getestet.
  • Fetthefen, die im erfindungsgemäßen Verfahren als Wirtszellen genutzt werden, sind verbesserte Produktionsorganismen, da eine hohe Anreicherung von Fettsäuren auf natürliche Weise erfolgt. Zur Überexpression der Gene zur Synthese von BCFAs sind bisher keine Daten publiziert worden. Da Ganzzellbiotransformationen neben der gewünschten Reaktion häufig auch zu Nebenreaktionen wie dem Abbau der Produkte führen, ist auch der Metabolismus der PUFAs und BCFAs charakterisiert worden. Insbesondere spezielle oxidative Abbaureaktionen in den Peroxisomen der Hefen, dem Ort des Metabolismus von Fettsäuren, waren bisher kaum untersucht.
  • Um die von den Fetthefen in der stationären Phase produzierten Fettsäuren in ausreichendem Maß zu gewinnen, ist es weiter notwendig gewesen, die Ölausbeute (d. h. die Biosyntheseleistung der Hefen) zu optimieren. Die wichtigsten Parameter für die Optimierung der Fermentation sind Wachstumsgeschwindigkeit, Zelldichte und Zeitpunkt/Menge der Fetteinlagerung. Durch den Einsatz von Glycerol als Kohlenstoffquelle werden Kosten eingespart und zugleich die Nachhaltigkeit der Fermentation erhöht, da die Verbindung in großen Mengen bei der Produktion von Biodiesel anfällt.
  • Da für die Fermentation ganze Zellen genutzt werden, erfolgt neben der Synthese der Produkte in der Zelle auch immer ein Abbau. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist daher die stoffwechselbezogene Analytik mit dem Ziel, Enzymsysteme auszuschalten, die einen Abbau der Zielprodukte verantworten. Die prozessbegleitende Analytik wird ständig über den gesamten Ablauf der Produktion, Aufarbeitung und Isolierung der Produkte weitergeführt.
  • Zu Beginn werden mit dem Wildtyp, als auch mit ersten gentechnisch optimierten Zellen Vorversuche im Labormaßstab durchgeführt, bevor ein „scale-up” auf den Bioreaktormaßstab erfolgt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Substanzen aus Zellen zeichnet sich dadurch aus, dass Zellen, welche die Zielsubstanzen bilden, kultiviert und die gebildeten Substanzen nach Behandlung des Kulturmediums mit Hochspannungsimpulsen aus den Zellen gewonnen werden.
  • Vorzugsweise sind die dafür eingesetzten Zellen Hefezellen, Bakterien, Zellkulturen, Gewebekulturen und Zellverbände.
  • In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die eingesetzten Zellen Hefezellen. Vorteilhafterweise sind diese Hefezellen genetisch so verändert, dass sie die zu gewinnenden Substanzen überproduzieren.
  • Als besonders vorteilhaft hat sich der Einsatz von fettbildenden Hefen wie z. B. die Gattungen Lipomyces sp., Hansenula sp., Rhodotorula sp., oder Candida sp. erwiesen. Insbesondere die Hefespezies Lipomyces lipofer, Hansenula anomala, Rhodotorula minuta und Candida boidinii werden verwendet.
  • Die Fermentation der Zellen erfolgt in Bioreaktoren, dabei können die Zellen im Batch Modus, im Fed-Batch-Modus oder kontinuierlich fermentiert werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die synthetisierten Substanzen Fettsäuren. Besonders geeignet ist der Einsatz von Zellen, welche lipophile Substanzen wie z. B. gesättigter Fettsäuren und/und oder verzweigtkettiger Fettsäuren (BCFAs; branched chain fatty acids) synthetisieren.
  • Dabei ist der Einsatz von Zellen, welche die Synthese ein- und/oder mehrfach ungesättigter Fettsäuren durchführen, besonders geeignet. In einer ganz besonderen Ausführungsvariante der Erfindung sind die synthetisierten Fettsäuren omega-3-Fettsäuren bzw. omega-6-Fettsäuren.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die synthetisierten Substanzen hydrophile Substanzen. Hierfür sind Zellen zur Synthese organischer Säuren, Zucker, Polyalkohole, Aminosäuren und Alkohole besonders geeignet.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich ferner dadurch aus, dass die Hochspannungsimpulsbehandlung auf verschiedene Arten realisiert werden kann. In einer Ausführungsvariante der Erfindung, wird die Hochspannungsimpulsbehandlung im batch Modus durchgeführt. In einer anderen Ausführungsvariante wird die Hochspannungsimpulsbehandlung kontinuierlich durchgeführt.
  • Weiter können bei der Hochspannungsimpulsbehandlung unterschiedliche Pulsformen verwendet werden. In einer Variante wird die Hochspannungsimpulsbehandlung mit Rechteckimpulsen durchgeführt. In einer anderen Variante werden bei der Hochspannungsimpulsbehandlung exponentielle Pulse verwendet.
  • Weiter ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass den Zellen nach der Hochspannungsimpulsbehandlung ein Extraktionsmittel zugegeben wird. Dabei können als Extraktionsmittel Neutrallipide, organische Lösungsmittel, Emulgatoren und/oder fettbindende Substanzen, aber auch wässrige Medien eingesetzt werden. Eine Vorbehandlung von Hefen mit Enzymen wie z. B. Chitinasen, Glucuronidasen oder ß-Glucanasen kann erfolgen, um die Hefezellwand zu schädigen oder zu schwächen.
  • Sind die Zielsubstanzen lipophile Substanzen, wird eine lipophile Extraktion und/oder eine wässrige Extraktion mit Emulgatoren durchgeführt. Vorzugsweise werden für die lipophile Extraktion Miglyol und/oder andere definierte Triglyceridgemische verwendet. Bei der wässrigen Extraktion wird eine wässrige Lösung mit einem Zusatz an fettbindenden Substanzen, wie Chitosan oder Emulgatoren eingesetzt.
  • In der Ausführungsvariante zur Synthese und Isolierung von hydrophilen Zielsubstanzen wird nur eine wässrige Extraktion durchgeführt. Bei dieser Extraktion werden vorzugsweise Wasser, Puffer und/oder Kultivierungsmedium als Extraktionsmittel verwendet.
  • Bei jeder Extraktion ist es anschließend notwendig, dass die im Extraktionsmittel enthaltenen Substanzen von dem Extraktionsmittel getrennt werden. Dies kann mit Hilfe herkömmlicher Verfahren realisiert werden.
  • Vorzugsweise werden dafür jedoch chromatographische Methoden eingesetzt.
  • Im weiteren sollen einige weitere positive Effekte der Erfindung aufgezeigt werden. Dies sind beispielsweise die Vermeidung der Nutzung von Fischprodukten, wodurch umweltrelevante Probleme wie Überfischung, Aquakulturen etc. vermieden werden. Die Biotransformation zur Herstellung der Zielsubstanzen erfolgt in Fermentern. Damit ist eine Nutzung von landwirtschaftlichen Flächen, einschließlich Düngung und Nutzung von Pestiziden etc. nicht notwendig. Ebenso werden die Zielverbindungen aus den Zellen durch HSI extrahiert und beispielsweise durch Membranverfahren oder Zweiphasensysteme kontinuierlich nach der Fermentation lösungsmittelfrei extrahiert. Damit entlasten sowohl die Produktion als auch die Aufarbeitung im erfindungsgemäßen Verfahren die Umwelt nachhaltig.
  • Weitere vorteilhafte Eigenschaften und Merkmale der Erfindung werden aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen ersichtlich, welche als nicht erschöpfende Beispiele zur Erläuterung dienen sollen.
  • Ausführungsbeispiel 1
  • Extraktion von Speicherfetten aus Fetthefen
  • Dieses Ausführungsbeispiel beschreibt die Vorgehensweise bei der Extraktion von Speicherfetten aus Fetthefen mittels HSI-Technologie. Nach einer kurzen Beschreibung der Kultivierung der Hefen wird im Weiteren auf die Hochspannungsparameter, die Extraktion und die Aufreinigung der gewünschten Fette aus dem Extraktionsmittel eingegangen.
  • Kultivierung:
  • Die Fermentation der Hefen wird optimiert im Hinblick auf Wachstumsgeschwindigkeit und Fetttröpfchenbildung. Die Kultivierung wird in einem geeigneten Kultivierungsmedium (mit Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Glycerol u. a. als Kohlenstoffquelle) bei einer Temperatur von 15–35°C, einem pH-Wert von pH 3,5–7, einer Belüftung von 0–5 vvm durchgeführt. Um eine möglichst effektive HSI-Behandlung zu gewährleisten, eigenen sich insbesondere Medien, die eine niedrige elektrische Leitfähigkeit aufweisen (≤ 5 mS/cm).
  • Hochspannungsimpulsbehandlung:
  • Für die Hochspannungsimpulsbehandlung bietet sich ein breites Spektrum an Modifikationsmöglichkeiten. Die Gewinnung der Fettsäuren durch die Hochspannungsimpulsbehandlung kann sowohl kontinuierlich als auch semikontinuierlich durchgeführt werden. Dabei ist es wichtig, ein Gleichgewicht aus potentieller Extraktionsmenge und Restvitalität der Zellen einzustellen. Die wichtigsten Parameter für die Behandlungsbedingungen umfassen die elektrische Feldstärke (0,1–50 kV/cm), die Pulsfrequenz (je nach Anlage bis zu 100 Hz) und den Energieeintrag, welcher theoretisch unbegrenzt hoch gewählt werden kann, aber im erfindungsgemäßen Verfahren idealerweise bis maximal 100 kJ/kg eingestellt wird. Die Behandlung wird sowohl im Batch-Modus als auch kontinuierlich durchgeführt. Bei der kontinuierlichen Behandlung können zwei verschiedene Pulsformen z. B. Rechteckpulse und exponentielle Pulse eingestellt werden. Diese Varianten haben wiederum einen Einfluss auf die Zellen. Je nach Behandlungsbedingungen wird die Hefepopulation unterschiedlich große Fraktionen an vitalen, letalen und subletalen Zellen aufweisen.
  • Extraktion:
  • Nach der HSI-Behandlung wird ein Extraktionsmittel eingesetzt, um aus den permeabilisierten Zellen, die Fette zu extrahieren, ohne die vitale Fraktion der Zellen zu inaktivieren. Dabei wird z. B. das Neutrallipid Miglyol, oder auch Emulgatoren oder fettbindende Substanzen (z. B. Chitosan) eingesetzt.
  • Aufreinigung:
  • Im Anschluss an die Extraktion werden die gewonnenen Fette aus dem Extraktionsmittel aufgereinigt. Dies wird in diesem Beispiel über chromatographische Methoden erreicht.
  • Ausführungsbeispiel 2
  • Variationsmöglichkeiten zu Ausführungsbeispiel 1
  • In diesem Ausführungsbeispiel werden verschiedene Varianten zu Ausführungsbeispiel 1 dargestellt.
  • Hefen:
  • Im Rahmen des Verfahrens können verschiedene fettbildende Hefen zum Einsatz kommen. Neben Lipomyces lipofer handelt es sich um Hansenula anomala, Rhodotorula minute und/oder Candida boidinii.
  • Medien und Wachstumsbedingungen:
  • Es können weiterhin verschiedene Kultivierungsmedien für Hefen eingesetzt werden, vorzugsweise werden angewendet:
    Standard Hefemedien wie – YED (Hefeextrakt, Glucose), – YEG (Hefeextrakt, Glycerol), – YEPD (Hefeextrakt, Pepton, Glucose)
    Minimalmedien – Medien enthaltend:
    Yeast Nitrogen Base YNB (Sigma Aldrich), Glucose, gegebenenfalls eine Stickstoffquelle z. B. NH4SO4 und/oder NH4Cl und/oder
    – Molkenpermeat (angereichert mit einer Stickstoffquelle z. B. NH4SO4 und/oder NH4Cl)
  • Die Kultivierung kann entweder im Batch oder im Fed-Batch Modus durchgeführt werden.
  • Die anschließende Hochspannungsimpulsanwendung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden.
  • Mögliche HSI-Parameter sind:
    • – Spannung • 1–10 kV
    • – Feldstärke • 0,1–50 kV/cm
    • – Energieeintrag • Idealerweise < 100 kJ/kg • Theoretisch beliebig hoch wählbar
    • – Pulsform (beide Pulsformen sind mono- und bipolar einsetzbar) • Exponentielle Pulse • Rechteck Pulse
    • – Pulsbreite • Exponentiell • 0,1–100 μs • Rechteck • 3–8 μs
    • – Pulszahl • 1–300 Pulse • ideal < 150 Pulse (um thermischen Einfluss gering zu halten)
  • Extraktion:
    • – lipohile Extraktion (z. B. Miglyol und andere definierte Triglyceridgemische)
    • – wässrige Extraktion mit Zusatz fettbindender Substanzen (z. B. Chitosan)
  • Zusätze zum Extraktionsmedium:
    • – Evtl. Zugabe von Enzymen, welche die Hefezellwand schädigen oder schwächen: • Chitinasen ß-Glucanasen
  • Alle in der vorangehenden Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und der Abbildung (1: Fließschema für den Verfahrensablauf) dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
  • Literatur:
    • Garbe, LA, Tressl, R: Metabolism of Deuterated threo-Dihydroxy Fatty Acids in Saccharomyces cerevisiae Enantioselective Formation and Characterization of Hydroxylactones and γ-Lactones Helv. Chim. Acta 2004, 87, 180-196
    • Garbe, LA, Tressl, R: Metabolism of Deuterated Isomeric 6,7-Dihydroxydodecanoic Acids in Saccharomyces cerevisiae- Diastereo- and Enantioselective Formation and Characterization of 5-Hydroxy-γ-decanolactone Isomers Helv. Chim. Acta 2003, 86, 2349-2363
    • Nevoigt E, Pilger R, Mast-Gerlach E, Schmidt U, Freihammer S, Eschenbrenner M, Garbe L, Stahl U.: Genetic engineering of brewing yeast to reduce the content of ethanol in beer. FEMS Yeast Res. 2002, 2, 2225-2232
    • Nguyen HT, Dieterich A, Athenstaedt K, Truong NH, Stahl U, Nevoigt E.: Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of L-glycerol 3-phosphate. Metab. Eng. 2004, 6, 155-63
    • Richter, F: Metabolismus isotopenmarkierter methylverzweigter Carbonsäuren in Saccharomyces cerevisiae. Diplomarbeit im FG Molekularanalytik 2005
    • Veen M, Lang C.: Production of lipid compounds in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004, 63, 635-646
    • Veen M, Stahl U, Lang C. Combined overexpression of genes of the ergosterol biosynthetic pathway leads to accumulation of sterols in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 2003, 4, 87-95
    • Rohn S, Kroh LW. Electron Spin Resonance – A spectroscopic method for determining the antioxidative activity. Molecular Nutrition & Food Research 2005, 49, 898-907
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • - US 2005/0136519 [0002]
    • - US 2007/0087420 [0002]
    • - US 2004/253621 [0004]
    • - WO 2004/101753 [0004]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Garbe & Tressl 2003 und 2004 [0004]
    • - Richter 2005 [0004]

Claims (30)

  1. Verfahren zur Gewinnung von Substanzen aus Zellen, dadurch gekennzeichnet, – dass die die gewünschten Substanzen produzierenden Zellen kultiviert, – die gebildeten Substanzen durch Behandlung des Kulturmediums mit Hochspannungsimpulsen aus den Zellen freigesetzt oder für eine Extraktion zugänglich gemacht werden und – anschließend aus dem Medium extrahiert werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Zellen Hefezellen, Bakterien, Zellkulturen, Gewebekulturen und Zellverbände sind.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Zellen Hefezellen sind.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen eingesetzt werden, die genetisch so verändert sind, dass sie die zu gewinnenden Substanzen überproduzieren.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass fettbildende Hefen wie z. B. die Gattungen Lipomyces sp., Hansenula sp., Rhodotorula sp., oder Candida sp., insbesondere die Hefespezies Lipomyces lipofer, Hansenula anomala, Rhodotorula minute und Candida boidinii verwendet werden.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in Bioreaktoren fermentiert werden.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen im Batch Modus, im Fed-Batch-Modus oder kontinuierlich fermentiert werden.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetisierten Substanzen lipophile Substanzen sind.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetisierten Substanzen Fettsäuren sind.
  10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetisierten Fettsäuren gesättigte Fettsäuren und/oder verzweigtkettige Fettsäuren (BCFAs; branched chain fatty acids) sind.
  11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetisierten Fettsäuren ein- und/oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind.
  12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetisierten Fettsäuren omega-3-Fettsäuren bzw. omega-6-Fettsäuren sind.
  13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetisierten Substanzen hydrophile Substanzen sind.
  14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochspannungsimpulsbehandlung im batch Modus durchgeführt wird.
  15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochspannungsimpulsbehandlung kontinuierlich durchgeführt wird.
  16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochspannungsimpulsbehandlung mit unterschiedlichen Pulsformen durchgeführt wird.
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochspannungsimpulsbehandlung mit Rechteckimpulsen durchgeführt wird.
  18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochspannungsimpulsbehandlung mit exponentiellen Pulsen durchgeführt wird.
  19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass den Zellen nach der Hochspannungsimpulsbehandlung ein Extraktionsmittel zugegeben wird.
  20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Extraktionsmittel organische Lösungsmittel, Neutrallipide, Emulgatoren, wässrige Lösungen und/oder fettbindende Substanzen eingesetzt werden.
  21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Extraktionsmittel Extraktionsmittelgemische verschiedener Viskosität und Wasseraufnahmekapazität eingesetzt werden.
  22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Extraktion eine Vorbehandlung der Hefen mit Enzymen, die die Hefezellwand schädigen oder schwächen, wie Chitinasen, Glucuronidasen oder ß-Glucanasen, durchgeführt wird.
  23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für lipophile Substanzen eine lipophile Extraktion und/oder eine wässrige Extraktion mit Emulgatoren durchgeführt wird.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die lipophile Extraktion mit Miglyol und/oder anderen definierten Triglyceridgemischen durchgeführt wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Extraktion mit Zusatz fettbindender Substanzen, wie Chitosan oder mit Emulgatoren durchgeführt wird.
  26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für hydrophile Substanzen eine wässrige Extraktion durchgeführt wird.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Extraktion mit Wasser, Puffer und/oder Kultivierungsmedium durchgeführt wird.
  28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die im Extraktionsmittel enthaltenen Substanzen von dem Extraktionsmittel getrennt werden.
  29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen von dem Extraktionsmittel mit Hilfe herkömmlicher Verfahren getrennt werden
  30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen von dem Extraktionsmittel mit chromatographische Methoden getrennt werden.
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