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Gebiet der
vorliegenden Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhöhen der
Konzentrationen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA)
um 0,5- bis 5-mal in Protisten Thraustochytrid-Protisten, indem die Zellen unter kalten
Bedingungen gelagert werden, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Inokulieren
der Protisten in ein Kulturmedium, Wachsenlassen der Kultur für 2 bis
5 Tage bei Zimmertemperatur, Ernten der Zellen mittels Zentrifugation,
um Biomasse zu erhalten, Lagern der Biomasse bei ungefähr 10°C für eine Zeitdauer
im Bereich zwischen 12 und 48 Stunden, und Erhalten von vermehrten
PUFA aus der gelagerten Biomasse.
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Hintergrund
und Literatur zum Stand der Technik der vorliegenden Erfindung
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Fettsäuren sind
Bestandteile von Lipiden, die von allen lebenden Organismen zum
Wachstum, Überleben
und der Fortpflanzung benötigt
werden. Unter den Fettsäuren
sind gesättigte
Fettsäuren
diejenigen mit einer chemischen Struktur, in der die Kohlenstoffatome
miteinander nur durch einfache Bindungen verbunden sind, und enthalten
keine Doppelbindungen. Ungesättigte
Fettsäuren
sind diejenigen, in denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome miteinander
durch Doppelbindungen verbunden sind. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die
hiernach als PUFAs bezeichnet werden, sind diejenigen, in denen mehr
als eine solche Doppelbindung gefunden wird.
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Unter
den PUFAs werden zwei als äußerst wichtig
für die
Gesundheit von Tier und Mensch angesehen. Diese sind die Docosahexaenoic-Säure und
die Eicosapentaenoic-Säure,
die hiernach als DHA und EPA bezeichnet werden. Die Molekülstruktur
von sowohl DHA als auch EPA ist dergestalt, daß die erste Doppelbindung dem
dritten Kohlenstoffatom vom Methylende der Fettsäurestruktur folgt. Deshalb
werden diese auch als Omega-3-PUFAs bezeichnet. DHA enthält 22 Kohlenstoffatome,
zwischen denen sechs Doppelbindungen gefunden werden. EPA enthält 20 Kohlenstoffatome,
zwischen denen fünf
Doppelbindungen auftreten.
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Es
ist sowohl für
DHA als auch EPA gezeigt worden, daß diese für die menschliche Gesundheit und
die Ernährung
von Tieren wichtig sind. Hinsichtlich der menschlichen Gesundheit
ist gezeigt worden, daß DHA
und EPA bei der Gehirnentwicklung von Kindern, der Verhinderung
von Arteriosklerose, der Verhinderung von Nachtblindheit, neurologischen Störungen und
sogar für
eine mögliche
Verhinderung von Krebs wichtig sind (Bajpai, P. and P. K. Bajpai. 1993.
Journal of Biotechnology 30: 161–183; Barclay, W.R. et al.
1994. Journal of Applied Phycology 6: 123–129; Singh, A. and O.P. Ward.
1997. Advances in applied microbiology, 45: 271–312).
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Es
ist gezeigt worden, daß diese
beiden Omega-3-PUFAs das Wachstum und die Fortpflanzung in Crustaceen,
wie etwa Krabben, verbessern, die als Aquakulturtiere zum menschlichen
Verzehr sehr wichtig sind (Harrison, K. E. 1990. Journal of Shellfish
Research 9: 1–28).
Der Einbau von DHA und EPA in menschliche und tierische Nahrung
wird deshalb als wichtig angesehen. Die DHA- und EPA-Konzentrationen
von Thraustochytrid-Protisten kann über ihre natürlichen
Konzentrationen hinaus verstärkt
werden, indem man die Zellen in einem Medium mit erhöhter Viskosität wachsen
läßt, und
ihre Zellen können
von einem noch besseren Nutzen als Ergänzung zur menschlichen Nahrung
und als Futter für
Tiere im Vergleich mit gegenwärtig
bekannten Prozessen sein. Thraustochytriden können in großem Maßstab kultiviert werden unter
Verwendung von gut etablierten Fermentationstechniken. Die so erhaltenen
Zellen können
als Tierfutter verwendet werden, indem man ihre Zellen in geeigneter
Weise verarbeitet und konserviert, wie beispielsweise mittels Sprühtrocknung
und Einfrieren. Die Zellbiomasse, die in Omega-3-Fettsäuren angereichert
ist, kann auch geerntet werden und DHA und EPA in einer Reinform
extrahiert werden. Diese können
verwendet werden, um menschliche Nahrung zu ergänzen, die an diesen essentiellen
Omega-3-PUFAs-arm sind.
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Eine
Hauptquelle von EPA und DHA für
den menschlichen Verbrauch ist in der Form von Fischöl. Jedoch
hat Fischöl
den Nachteil eines Geruchs, der für viele menschliche Verbraucher
unangenehm ist. Fische, enthaltend DHA und EPA, sind jedoch stark saisonabhängig und
hinsichtlich ihres Gehalts an Omega-3-PUFA variabel. Darüberhinaus
ist ein Großteil
des Fischöls
hydriert, und die Omega-3-PUFAs sind zerstört. Aus diesen Gründen werden
Mikroorganismen, enthaltend EPA und DHA, die in einem großen Maßstab kultiviert
werden können, zur
Verwendung bei der menschlichen Ernährung und tierischem Futter
als geeignet angesehen (Bajpai, P. and P.K. Bajpai. 1993. Journal
of Biotechnology 30: 161–183).
Mehrere einzellige Pflanzen, die Algen, enthalten hohe Konzentrationen
an EPA und DHA und sind für
die besagten Zwecke in Erwägung gezogen
werden. Es kann Bezug genommen werden auf A. Singh und O.P. Ward
(Singh, A und O.P. Ward, 1997. Advances in Applied Microbiology
45: 272–312).
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Mikroorganismen
können
unter Verwendung von billigen Nährstoffen
in leichter Weise auf einem großen
Maßstab
kultiviert werden. Mehrere Gruppen von Mikroorganismen enthalten
hohe Mengen an EPA und DHA. Solche Organismen können direkt als Futter verwendet
werden, oder die besagten PUFAs können aus ihnen zur weiteren
Verwendung extrahiert werden. Eine Suche nach Mikroorganismen, die hohe
Mengen an DHA und EPA enthalten, hat gezeigt, daß Thraustochytrid-Protisten
Mengen an DHA und EPA enthalten, die zu den höchsten Mengen gehören. Thraustochytriden
werden bereits für
kommerziell wichtig gehalten. Ihre Zellen werden in Tierfutter oder
zur Extraktion von PUFAs zur kommerziellen Verwendung verwendet
(Lewis, T.E. et al., 1999, The Biotechnological potential of thraustochytrids. Marine
Biotechnology 1: 580–587;
US Patent No. 6,451,567 vom 17. September 2002).
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Das
japanische Patent Nr. 9633263 (1996) beschreibt einen Stamm eines
Thraustochytriden zur Anwendung in der Nahrungsmittelindustrie,
wie etwa Nahrungszusatzstoffe, Ernährungsergänzungen, wie etwa Zusatzstoffe
für Kleinkindmilchformulierungen, Nahrungsmittel
und Arzneizusatzstoffe. Der Stamm enthält wenigstens 2% Trockengewicht
als DHA. Ein anderes japanisches Patent Nr. 980 3671 (1998) beschreibt
die Produktion mittels Fermentation von DHA und einer anderen PUFA,
Docosapentaenoic-Säure
(DPA) aus Lipiden von Thraustochytrid-Protisten. Die Zellen von
Thraustochytrid-Protisten können
direkt als Futter in einer Aquakultur verwendet werden (US Patent
Nr. 5,908,622 vom 1. Juni 1999). Alternativ können DHA und EPA aus Thraustochytrid-Zellen
unter Verwendung geeigneter Technologien extrahiert werden (japanische
Patente
JP 103105555 vom
24. 11.1998 und
JP 10310556 vom 12.5.1997).
US Patent Nr. 5,340,594 beschreibt einen Prozeß zur Produktion von ganzzelligen
oder extrahierten mikrobiellen Produkten unter Verwendung von Thraustochytrid-Protisten
mit einer hohen Konzentration der Omega-3 PUFAs. Es gibt ein Potential zur
Verwendung von Thraustochytrid-Protisten als humane Nutrazeutika
(„nutraceuticals") (Anmeldung A428
der Australia New Zealand Food Authority (ANZFA), 12. Dezember 2001).
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Die
Herstellung von DHA und EPA aus Thraustochytrid-Protisten erfordert,
daß sie
unter geeigneten Bedingungen in Fermentern wachsen gelassen werden,
um kommerziell nützliche
Mengen der beiden PUFAs zu ergeben. Mehrere Forschungsveröffentlichungen
und Patente betreffen das Thema von geeigneten Bedingungen zum Wachstum
und der Produktion von DHA und EPA in Thraustochytriden. US Patent
Nr. 5,340,742 offenbart einen Prozeß zum Wachsenlassen der Thraustochytrid-Protisten
in definierten Medien, die zu ihrem Wachstum geeignet sind. US Patent
Nr. 6,461,839 vom 8.10.2002 stellt ein Verfahren zum Herstellen von
PUFAs in Labyrinthula sp. bereit, unter Verwendung eines Kulturmediums,
enthaltend Öl
oder Fettsäure
als Kohlenstoffquelle. Yokochi et al., (1999; Applied Microbiology and
Biotechnology, 49, 72–76)
beschreiben Salinität, Temperatur,
Kohlenstoffquelle, Öl-
und Stickstoffquellen zur Herstellung von großen Mengen an DGA in dem Thraustochytriden
Schizochytrium Iimacinum. Ein optimaler pH und Medium-Inhaltsstoffe
sind ebenfalls für
Thraustochytrium aureum beschrieben worden (Iida T. et al., Journal
of Fermentation and Biogengineering, 81: 76–78).
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Die
vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die DHA- und EPA-Konzentration
in Thraustochytrid-Protisten zu erhöhen, unabhängig von den Inhaltsstoffen
in dem Kulturmedium, so daß sie
noch höhere
kommerzielle Ausbeuten der besagten PUFAs bereitstellen werden.
Darüberhinaus
raten die oben erwähnten
Patente nach dem Stand der Technik von einer großen Anzahl von Stämmen ab, die
nur moderate DHA und EPA-Konzentrationen haben können. In der vorliegenden Erfindung
können sogar
Stämme
mit mäßigen Mengen
an DHA und EPA dazu gebracht werden, große Mengen dieser PUFAs zu produzieren,
indem man sie kalten Bedingungen unterzieht. Bajpai et al.. (1991;
JAOCS, 68: 509–514)
stellt fest, daß der
Gehalt an PUFA in Thraustochytrium aureum erhöht werden kann, indem man sie
bei niedrigerer Temperatur wachsen läßt (bis zu 15°C). US Patent
Nr. 5,340,594 stellt fest, daß das Aussetzen
von Thraustochytriden gegenüber
Streß mit
niedriger Temperatur während
des Wachstums eine große
Menge an aufgelöstem
Sauerstoff in dem Medium hält.
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Jedoch
ist das Halten von großen
Volumina von Thraustochytrid-Kultur, was bis zu mehreren Hundert
Litern sein können,
unter kalten Bedingungen ein teurer Prozeß. Darüberhinaus bezieht sich US-Patent
Nr. 5,340,594 nicht auf die Tatsache, daß, sogar wenn die Zellbiomasse
aus dem wäßrigen Medium
mit hohem Sauerstoffgehalt entnommen worden ist, sondern unter kalten
Bedingungen gelagert wird, ihr PUFA-Gehalt erhöht werden kann. Darüberhinaus
gibt es keinen Hinweis, die Anmelder dahingehend zu motivieren,
sich auf Variationen hinsichtlich der Konzentrationen in der PUFA
zu konzentrieren. Die Anmelder haben Hunderte von Experimenten durchgeführt und
haben das Verfahren der vorliegenden Anmeldung entwickelt. Zusätzlich motiviert das
US-Patent keinen Fachmann, es für
eine Ableitung der Konzentration von PUFA zu verwenden. Stattdessen überwindet
die Erfindung der vorliegenden Anmeldung die obigen Probleme, indem
Zellen bei Umgebungstemperatur wachsen gelassen werden, die Zellen
geerntet und bei kalter Temperatur gelagert werden. Die DHA- und
EPA-Gehalte steigen aufgrund
dieser Lagerung an.
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All
die obigen Patente beziehen sich auf das Screenen von zahlreichen
Thraustochytrid-Kulturen, das
Auswählen
des Stammes mit dem höchsten DHA-
und EPA-Gehalt, das Herstellen von mutanten Stämmen dieser und das Kultivieren
solcher Stämme unter
optimalen Kulturbedingungen zur kommerziellen Herstellung. US-Patent
Nr. 6,410,282 stellt ein Verfahren zum Erhöhen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren bereit,
bei dem die Inhaltsstoffe des Kulturmediums nicht verändert werden
müssen,
sondern bei dem nur die Viskosität
des Mediums durch Zugabe von Polyvinylpyrrolidon (PVP) erhöht wird.
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Aufgaben der
vorliegenden Erfindung
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Die
Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Mengen an PUFAs
in Thraustochytrid-Protisten zu erhöhen, was die oben ausgeführten Nachteile
vermeidet.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Stämme von Thraustochytriden herzustellen,
um höhere
Mengen an DHA und EPA zu produzieren, als sie normalerweie unter
optimalen Nährstoffbedingungen
produzieren. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, die Konzentration dieser Fettsäuren zu erhöhen, indem man die Kulturen
der Thraustochytrid-Protisten in einem Standardmedium bei Umgebungstemperaturen
wachsenläßt, die
Zellen erntet und sie unter kalten Bedingungen lagert.
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Noch
eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zum Erhöhen
der Konzentrationen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA)
um 0,5- bis 5-mal in Protisten Thraustochytrid-Protisten zu erhöhen, indem
man die Zellen unter kalten Bedingungen lagert.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhöhen der
Konzentrationen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA)
um 0,5- bis 5-mal in Protisten Thraustochytrid-Protisten durch Lagern der Zellen unter
kalten Bedingungen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Inokulieren
der Protisten in ein Kulturmedium, Wachsenlassen der Kultur für 2 bis
5 Tage bei Zimmertemperatur, Ernten der Zellen mittels Zentrifugation,
um Biomasse zu erhal ten, Lagern der Biomasse bei ungefähr 10°C für eine Zeitdauer
im Bereich zwischen 12 bis 48 Stunden, und Erhalten der vermehrten
PUFA aus der gelagerten Biomasse.
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Detaillierte
Beschreibung der vorliegenden Erfindung
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Entsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der
Konzentrationen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) um
0,5- bis 5-mal in Protisten Thraustochytrid-Protisten durch Lagern
der Zellen unter kalten Bedingungen, wobei das Verfahren die Schritte
umfaßt:
Inokulieren der Protisten in ein Kulturmedium, Wachsenlassen der
Kultur für
2 bis 5 Tage bei Zimmertemperatur, Ernten der Zellen mittels Zentrifugation,
um Biomasse zu erhalten, Lagern der Biomasse bei ungefähr 10°C für eine Zeitdauer
im Bereich von 12 bis 48 Stunden und Erhalten von vermehrten PUFA
aus der gelagerten Biomasse.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfaßt
ein Verfahren zum Erhöhen
der Konzentrationen von mehrfach gesättigten Fettsäuren (PUFA)
um 0,5- bis 5-mal in Protisten Thraustochytrid-Protisten durch Lagern
der Zellen unter kalten Bedingungen die Schritte:
- • Inokulieren
der Protisten in ein Kulturmedium,
- • Wachsenlassen
der Kultur für
2 bis 5 Tage bei Zimmertemperatur,
- • Ernten
der Zellen mittels Zentrifugation, um Biomasse zu erhalten,
- • Lagern
der Biomasse bei ungefähr
10°C für eine Zeitdauer
im Bereich zwischen 12 bis 48 Stunden, und
- • Erhalten
von vermehrten PUFA aus der gelagerten Biomasse.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist PUFA Docosahexaenoic-Säure (DHA) und Eicosapentaenoic-Säure (EHA).
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In
noch einer anderen Ausführungsform
werden die erhöhten
PUFA in Tierfutter, menschlicher Nahrung und Nahrungszusatzstoffen
verwendet.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
liegt die Zimmertemperatur im Bereich zwischen 25 bis 30°C.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind die Thraustochytrid-Protisten Thraustochytrium,
Schizochytrium und Ulkenia.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfaßt
das Kulturmedium Pepton in einer Konzentration im Bereich zwischen 0,3
Gew.% bis 3,0 Gew.%, Hefeextrakt in einer Konzentration im Bereich
zwischen 0,005 Gew.% bis 0,5 Gew.%, Glucose in einer Konzentration
im Bereich zwischen 0,005 Gew.% bis 5,0 Gew.% und Meerwasser.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration an Peptonen ungefähr 1,5 Gew.%.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration an Hefeextrakt
ungefähr
0,1 Gew.%.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration an Glucose ungefähr 1,0 Gew.%.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung erzeugen sogar Zellen, die mäßige Mengen
an PUFA enthalten, unter normalen Bedingungen hohe Mengen.
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Die
vorliegende Erfindung sieht vor, daß die Kulturen der Thraustochytrid-Protisten
in einem Standardmedium bei Umgebungstemperatur wachsengelassen,
die Zellen geerntet und sie unter kalten Bedingungen gelagert werden.
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Entsprechend
sieht die vorliegende Erfindung ein Kühlverfahren zum Erhöhen der
Konzentrationen an mehrfach ungesättigten Fettsäurekonzentrationen
in Thraustochytrid-Protisten vor, das umfaßt: (a) Bereitstellen einer
Thraustochytrid-Pilzkultur, die zu einer Gattung gehört, wie
etwa Thraustochytrium, Schizochytrium und Ulkenia; (b) Kultivieren
der Kulturen der obigen Protisten in einem Kulturmedium für 2 bis
5 Tage bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 30°C; (c) Ernten
der Zellen aus der obigen Kultur mittels Zentrifugation; (g) Lagern
der Zellbiomasse unter kalten Temperaturbedingungen für bis zu
48 Stunden, und (h) Extrahieren der erhöhten Mengen an Docosahexaenoic-Säure (DHA)
und Eicosapentaenoic-Säure (EPA).
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erhöhen der
Konzentrationen der PUFAs in Zellen von Thraustochytrid-Protisten
bereitgestellt.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfidnung sind DHA und EPA in Zellen von Thraustochytrid-Protisten
erhöht,
indem man die Kulturen in einem Standardmedium wachsen läßt, die
Zellen erntet und sie unter kalten Bedingungen lagert.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfaßt
das Kulturmedium, das verwendet wird, Pepton im Bereich von 0,5 Gew.%
bis 1,5 Gew.%, bevorzugt 1,5 Gew.%, Hefextrakt im Bereich von 0,01
Gew.% bis 0,1 Gew.%, bevorzugt 0,1 Gew.%, Glucose im Bereich von
0,01 Gew.% bis 1,0 Gew.%, bevorzugt 1,0 Gew.% und 100 ml Meerwasser.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung variiert die Länge der Lagerung bei niedrigen
Temperaturen von 12 h bis 40 h.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind die PUFAs, die erhöht sind,
DHA und EPA.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhöhen der
Konzentrationen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in
Thraustochytrid-Protisten. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein
Verfahren zum Erhöhen
der mehrfach ungesättigten
Fettsäuren,
Docosahexaenoic-Säure
und Eicosapentaenoic-Säure
in Zellen von Mikroorganismen, die zu der Gruppe der Protisten gehören, die
als Thraustochytriden bezeichnet werden, indem die Zellen unter
kalten Bedingungen gelagert werden. Die so hinsichtlich der mehrfach
ungesättigten
Fettsäuren (PUFAs)
angereicherten Zellen können
dann erfolgreicher verwendet werden als Zellen, die nicht in den PUFAs
angereichert sind, in verschiedenen vorteilhaften Anwendungen, die
mehrfach ungesättigte Fettsäuren erfordern,
wie etwa Tierfutter, menschlicher Nahrung und der Extraktion der
PUFAs zur Nahrungsmittelergänzung.
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Entsprechend
bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der
Konzentrationen von mehrfach ungesättigten Fettsäurekonzentrationen
in Thraustochytrid-Protisten bereit, unter Verwendung von Standardkulturmedien
oder Medien, die zur Produktion von DHA und EPA optimiert worden
sind, und Lagern der geernteten Zellbiomasse bei kalter Temperatur.
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Schritt
a: Bereitstellen einer Kultur eines Thraustochytrid-Pilzes, der
DHA und EPA enthält; Schritt
b: Inokulieren des obigen Stammes in ein Kulturmedium; Schritt c:
Wachsenlassen der Kultur für
2 Tage; Schritt d: Erhalten der Kulturen zur Verwendung als Impfkultur
unter Verwendung des obigen Mediums, um ein Standardmedium zum Kultivieren von
Thraustochytriden oder ein Medium, das zur Produktion von EPA und
DHA in diesem bestimmten Stamm optimiert worden ist, zu inokulieren;
Schritt e: Lagern der Kultur separat für 2 bis 5 Tage bei einer Temperatur
im Bereich von 25 bis 30°C;
Schritt f: Ernten der Zellen aus der obigen Kultur mittels Zentrifugation
oder anderen geeigneten Verfahren; Schritt g: Wachsenlassen der
Zellen bei einer Temperatur von 10°C für 12 Stunden bis 48 Stunden
und Extrahieren der erhöhten
Mengen an Docosahexaenoic-Säure (DHA)
und Eicosapentaenoic-Säure
(EPA) oder Verwenden der Zellbiomasse für verschiedene Zwecke.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Kultur einer Kandidatenspezies des Thraustochytrid-Pilzes,
der die Omega-3 PUFAs DHA und EPA enthält, zuerst in ein flüssiges Nährmedium
inokuliert. Protistenstämme,
die zu anderen Thraustochytrid-Protisten gehören, wie etwa diejenigen mit
den Hinterlegungsnummern der American Type Culture Collection, ATCC
18906, 18907, 20890, 20891, 20892, 26185, die zu Thraustochytrium
sp., gehören, Nr.
28210, das zu Thraustochytrium roseum Gaertner gehört, und
Nr. 34304, das zu Thraustochytrium aureum Goldstein gehört, können ebenfalls
verwendet werden. Zusätzlich
zu den Thraustochytriden kann ein Mitglied der Labyrinthulid-Protisten,
die mit den Thraustochytriden verwandt sind, wie etwa Spezies von
Labyrinthula oder Aplanochytrium, ebenfalls verwendet werden.
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Ein
geeignetes Medium ist zum Beispiel eines, das Pepton, Hefeextrakt,
Glucose und Meerwasser enthält.
Jedes andere Medium, das gutes Wachstum des Pilzes unterstützt, kann
ebenfalls verwendet werden. Die Kultur wird für 2 Tage bei Zimmertemperatur
im Bereich von 25 bis 30°C
wachsen gelassen. Diese Kultur wird als Impfkultur verwendet und
wird verwendet, um ein Standardmedium, wie oben, zu inokulieren,
oder ein Medium, das für
die Produktion von DHA und EPA für
den individuellen Thraustochytrid-Stamm optimiert worden ist. Die
Kulturen können
in Kolben auf einem Rotationsschüttler im
Labor oder in einem Fermenter wachsen gelassen werden, wenn eine
Kultivierung im großen
Maßstab erforderlich
ist. Man läßt die Kultur
bei Zimmertemperatur von 25 bis 30°C oder jeglicher Temperatur wachsen,
bei der der jeweilige Stamm am besten wächst.
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Nach
einer geeigneten Periode, z.B. 2 bis 7 Tage Wachstum, können die
Zellen aus der Kultur geerntet werden. Dies kann mit jedem geeigneten
Verfahren, wie etwa Zentrifugation, kontinuierlicher Durchflußzentrifugation,
Filtration etc. gemacht werden. Die Zellbiomasse wird dann bei einer
Temperatur von näherungsweise
10°C für 12 Stunden
bis 48 Stunden gelagert. Anschließend können die so gelagerten Zellen
für alle
Anwendungen verwendet werden, die Thraustochytrid-Zellen erfordern.
Eine solche Verwendung kann Zellbiomasse für Tierfutter, menschliche Nahrungsmittelergänzung oder
die Extraktion von reinem DHA und EPA einschließen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Erhöhen der
Konzentrationen der Omega-3-PUFAs, DHA und EPA. Mit diesem Prozeß können Stämme von
Kulturen von Thraustochytriden dazu gebracht werden, höhere Konzentrationen
dieser PUFAs zu erzeugen, als sie dies unter anderen Bedingungen
tun. Außerdem
können
sogar Stämme, die
nur mäßige Mengen
dieser PUFAs unter normalen Bedingungen enthalten, dazu gebracht
werden, größere Mengen
innerhalb ihrer Zellen zu produzieren. Die Erfindung wird hiernach
unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, die nur
dargeboten werden, um die Erfindung zu veranschaulichen.
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Die
Erfindung wird hiernach unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen
beschrieben, die nur dargeboten werden, um die Erfindung zu veranschaulichen.
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Kurze Beschreibung
der begleitenden Zeichnungen
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1 stellt
den DHA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-1 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus dem Genus Schizochytrium Goldstein
und Belsky, bei Wachstum in flüssigem
Nährkulturmedium.
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2 stellt
den EPA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-2 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus dem Genus Schizochytrium Goldstein
und Belsky, bei Wachstum in einem flüssigem Nährkulturmedium.
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3 stellt
den DHA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-2 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus der Spezies Thraustochytrium Sparrow,
bei Wachstum in einem flüssigem Nährkulturmedium.
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4 stellt
den EPA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-2 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus der Spezies Thraustochytrium Sparrow,
bei Wachstum in einem flüssigem Nährkulturmedium.
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5 stellt
den DHA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-3 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus der Spezies Ulkenia Gaertner, bei
Wachstum in einem flüssigem
Nährkulturmedium.
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6 stellt
den EPA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-3 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus der Spezies Ulkenia Gaertner, bei
Wachstum in einem flüssigem
Nährkulturmedium.
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7 stellt
den DHA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-4 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus dem Genus Ulkenia Gaertner, bei
Wachstum in einem flüssigem
Nährkulturmedium.
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8 stellt
den EPA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-1 dar; entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus dem Genus Ulkenia Gaertner, bei
Wachstum in einem flüssigem
Nährkulturmedium.
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9 stellt
den DHA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-1 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus dem Genus Schizochytrium sp., wenn
die Zellbiomasse unter kalten Bedingungen für verschiedene Zeitdauern gelagert
wurde.
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10 stellt
den EPA-Gehalt von Thraustochytrid NIOS-1 dar, entsprechend in seiner
Morphologie und dem Lebenszyklus dem Genus Schizochytrium sp., wenn
die Zellbiomasse unter kalten Bedingungen für verschiedene Zeitdauern gelagert
wurde.
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Die
folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Illustration der vorliegenden
Erfindung angegeben und sollten deshalb nicht dahingehend interpretiert
werden, daß sie
den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken.
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Beispiel 1
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Eine
Thraustochytrid-Kultur, die zum Stamm #NIOS-1 gehört, entsprechend
in seiner Morphologie und dem Lebenszyklus dem Genus Schizochytrium Goldstein
und Belsky, wurde in 100 ml eines Kulturmediums inokuliert, enthaltend:
Gelatine-Pepton 1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose 1,0 Gew.% und
Meerwasser 100 ml. Kulturen wurden für zwei Tage auf einem Schüttler bei
Zimmertermperatur von 25–30°C wachsengelassen.
Diese Kulturen wurden als Impfkultur für das Experiment verwendet.
Kulturen wurden unter Verwendung eines Mediums mit der selben Zusammensetzung
wie oben angesetzt. Die Kulturen wurden für fünf Tage auf einem Schüttler bei Zimmertemperatur
bei 25–30°C wachsengelassen. Am
Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet.
Ein Satz an Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Ein anderer Satz
der geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 24 Stunden
gelagert, wonach Fettsäuren
extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Die
in dem Kühlschrank gelagerte
Zellbiomasse enthielt beinahe 0,5- mal mehr DHA als diejenige, die
nicht im Kühlschrank
gelagert wurde (1).
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Beispiel 2
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-1 gehört, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Schizochytrium
Goldstein und Belsky, wurde in 100 ml Kulturmedium inokuliert, enthaltend:
Gelatine-Pepton 1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose 1,0 Gew.%
und Meerwasser 100 ml. Die Kulturen wurden für zwei Tage in einem Schüttler bei
Zimmertermperatur von 25–30°C wachsengelassen.
Diese Kulturen wurden als Impfkultur für das Experiment verwendet. Die
Kulturen wurden unter Verwendung eines Mediums mit der selben Zusammensetzung
wie oben angesetzt. Die Kulturen wurden für 5 Tage auf einem Schüttler bei
Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation
geerntet. Ein Satz an Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Ein anderer Satz
der geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 24 Stunden
gelagert, wonach die Fettsäuren
extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Die in
dem Kühlschrank
gelagerte Zellbiomasse enthielt nahezu 3 mal mehr EPA als diejenige,
die nicht im Kühlschrank
gelagert wurde (2).
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Beispiel 3
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-2 gehörte, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Thraustochytrium
Gaertner, wurde in 100 ml Kulturmedium inokuliert, enthaltend: Gelatine-Pepton
1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose 1,0 Gew.% und Meerwasser
100 ml. Die Kulturen wurden für zwei
Tage auf einem Schüttler
bei Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Diese Kulturen wurden als Impfkultur für das Experiment verwendet.
Die Kulturen wurden unter Verwendung eines Mediums mit der selben
Zusammensetzung wie oben angesetzt. Die Kulturen wurden für fünf Tage
auf einem Schüttler
bei Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation
geerntet. Ein Satz der Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Ein anderer Satz
der geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 24 Stunden
gelagert, wonach die Fettsäuren
extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Die in
dem Kühlschrank
gelagerte Zellbiomasse enthielt nahezu 2 mal mehr DHA als diejenige,
die nicht im Kühlschrank
gelagert wurde (3).
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Beispiel 4
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-2 gehörte, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Thraustochytrium
Gaertner, wurde in 100 ml eines Kulturmediums inokuliert, enthaltend:
Gelatine-Pepton 1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose 1,0 Gew.%
und Meerwasser 100 ml. Die Kulturen wurden für zwei Tage auf einem Schüttler bei
Zimmertermperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Diese Kulturen wurden als Impfkultur für das Experiment verwendet. Die
Kulturen wurden unter Verwendung eines Mediums mit der selben Zusammensetzung
wie oben angesetzt. Die Kulturen wurden für fünf Tage auf einem Schüttler bei
Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation
geerntet. Ein Satz an Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Ein anderer Satz
der geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 24 Stunden
gelagert, wonach die Fettsäuren
extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Während die
Kontrollkulturen keine EPA enthielten, enthielt die Zellbiomasse,
die im Kühlschrank
gelagert worden war, eine große
Menge dieser PUFA (4).
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Beispiel 5
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-3 gehörte, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Ulkenia Gaertner,
wurde in 100 ml eines Kulturmedium inokuliert, enthaltend: Gelatine-Pepton
1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose 1,0 Gew.% und Meerwasser
100 ml. Die Kulturen wurden für
zwei Tage auf einem Schüttler
bei Zimmertermperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Diese Kulturen wurden als Impfkultur für das Experiment verwendet.
Die Kulturen wurden unter Verwendung eines Mediums mit der selben
Zusammensetzung wie oben angesetzt. Die Kulturen wurden für fünf Tage
auf einem Schüttler bei
Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation
geerntet. Ein Satz an Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Ein anderer Satz
der geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 24 Stunden
gelagert, wonach die Fettsäuren
extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Die
Zellbiomasse, die in dem Kühlschank
gelagert worden war, enthielt nahezu 0,5- bis 2- mal mehr DHA als
diejenige, die nicht im Kühlschrank
gelagert worden war (5).
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Beispiel 6
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-3 gehört, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Ulkenia Gaertner,
wurde in 100 ml eines Kulturmedium inokuliert, enthaltend: Gelatine-Pepton
1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose 1,0 Gew.% und Meerwasser
100 ml. Die Kulturen wurden für
zwei Tage auf einem Schüttler
bei Zimmertermperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Diese Kulturen wurden als Impfkultur für das Experiment verwendet.
Die Kulturen wurden unter Verwendung eines Mediums mit der selben
Zusammensetzung wie oben angesetzt. Die Kulturen wurden für fünf Tage
auf einem Schüttler bei
Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation
geerntet. Ein Satz der Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Ein anderer Satz
der geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 24 Stunden
gelagert, wonach die Fettsäuren
extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Die
im Kühlschrank
gelagerte Zellbiomasse enthielt nahezu 0,5- bis 4- mal mehr EPA
als diejenige, die nicht in dem Kühlschrank gelagert worden war
(6).
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Beispiel 7
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-4 gehörte, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Ulkenia Gaertner,
wurde in 100 ml eines Kulturmediums inokuliert, enthaltend: Gelatine-Pepton
1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose 1,0 Gew.% und Meerwasser
100 ml. Die Kulturen wurden für
zwei Tage auf einem Schüttler
bei Zimmertermperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Diese Kulturen wurden als Impfkultur für das Experiment verwendet.
Die Kulturen wurden unter Verwendung eines Mediums mit der selben
Zusammensetzung wie oben angesetzt. Die Kulturen wurden für fünf Tage
auf einem Schüttler bei
Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation
geerntet. Ein Satz der Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Ein anderer Satz
der geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 24 Stunden
gelagert, wonach die Fettsäuren
extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Die
in dem Kühlschrank
gelagerte Zellbiomasse enthielt nahezu 0,5- bis 2- mal mehr DHA
als diejenige, die nicht im Kühlschrank
gelagert wurde (7).
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Beispiel 8
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-4 gehörte, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Ulkenia Gaertner,
wurde in 100 ml eines Kulturmediums inokuliert, enthaltend: Gelatine-Pepton
1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose 1,0 Gew.% und Meerwasser
100 ml. Die Kulturen wurden für
zwei Tage auf einem Schüttler
bei Zimmertermperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Diese Kulturen wurden als Impfkultur für das Experiment verwendet.
Die Kulturen wurden angesetzt unter Verwendung eines Mediums mit
der selben Zusammensetzung wie oben. Die Kulturen wurden für fünf Tage
auf einem Schüttler bei
Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation
geerntet. Ein Satz der Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäweextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Ein anderer Satz
der geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 24 Stunden
gelagert, wonach die Fettsäuren
extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Die
Zellbiomasse, die in dem Kühlschrank
gelagert worden war, enthielt nahezu 0,5 bis 2 mal mehr EPA als
diejenige, die nicht im Kühlschrank
gelagert wurde (8).
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Beispiel 9
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-1 gehörte, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Schizochytrium
Goldstein und Belsky, wurde in 100 ml eines Kulturmediums inokuliert,
enthaltend: Gelatine-Pepton 1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose
1,0 Gew.% und Meerwasser 100 ml. Die Kulturen wurden für zwei Tage
auf einem Schüttler
bei Zimmertermperatur mit 25–30°C wachsengelassen. Diese
Kulturen wurden als Impfkultur für
das Experiment verwendet. Die Kulturen wurden angesetzt unter Verwendung
eines Mediums mit der selben Zusammensetzung wie oben. Sechs Kultursätze wurde für fünf Tage
auf einem Schüttler
bei Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet.
Ein Satz der Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Die anderen fünf Sätze der
geernteten Zellbiomasse wurden in einem Kühlschrank bei 10°C für 6, 12,
24, 48 bzw. 72 Stunden gelagert, wonach die Fettsäuren extrahiert
und mittels Gaschromatographie analysiert wurden. Die in dem Kühlschrank
für 6 Stunden
gelagerte Zellbiomasse zeigte keine Zunahme hinsichtlich DHA, die für 12–48 Stunden
gelagert wurde, zeigte ungefähr eine
50%-ige Zunahme, und diejenige, die für 72 Stunden gelagert wurde,
zeigte keine Zunahme an DHA (9).
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Beispiel 10
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Eine
Kultur eines Thraustochytriden, der zum Stamm #NIOS-1 gehörte, entsprechend
in seiner Morphologie und Lebenszyklus dem Genus Schizochytrium
Goldstein und Belsky, wurde in 100 ml eines Kulturmediums inokuliert,
enthaltend: Gelatine-Pepton 1,5 Gew.%; Hefeextrakt 0,1 Gew.%; Glukose
1,0 Gew.% und Meerwasser 100 ml. Die Kulturen wurden für zwei Tage
auf einem Schüttler
bei Zimmertermperatur mit 25–30°C wachsengelassen. Diese
Kulturen wurden als Impfkultur für
das Experiment verwendet. Die Kulturen wurden unter Verwendung eines
Mediums mit der selben Zusammensetzung wie oben angesetzt. Sechs
Kultursätze
wurde für
fünf Tage
auf einem Schüttler
bei Zimmertemperatur mit 25–30°C wachsengelassen.
Am Ende dieser Periode wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet.
Ein Satz der Zellbiomasse wurde unmittelbar zur Fettsäureextraktion
und Analyse mittels Gaschromatographie verwendet. Die anderen fünf Sätze der
geernteten Zellbiomasse wurde in einem Kühlschrank bei 10°C für 6, 12,
24, 48 bzw. 72 Stunden gelagert, wonach Fettsäuren extrahiert und mittels Gaschromatographie
analysiert wurden. Die in dem Kühlschrank
für 6 Stunden
gelagerte Zellbiomasse zeigte keine Zunahme hinsichtlich DHA, die
für 12 Stunden
gelagerte zeigte ein geringfügige
Zunahme an DHA, diejenige, die für
24 Stunden gelagert worden war, zeigte ein Zunahme von nahezu 100%,
diejenige, die für
48 Stunden gelagert worden war, zeigte eine Zunahme von nahezu 300%,
und diejenige, die für
72 Stunden gelagert worden war, zeigte keine Zunahme an EPA (10).
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Die
Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung sind:
- 1.
Die DHA- und EPA-Konzentrationen der Thraustochytriden, die normalerweise
in der Kultur vorhanden sind, kann unter Verwendung einer einfachen
Technik weiter verbessert werden.
- 2. Sogar diejenigen Stämme,
die nur mäßige Mengen
an DHA und EPA haben, können
hinsichtlich dieser Fettsäuren
angereichert werden.
- 3. Eine Zunahme an DHA- und EPA-Konzentrationen wird durch Lagern
der Zellbiomasse in der Kälte,
für eine
Periode von 12–48
Stunden, bewirkt.