ES2275142T3 - Procedimiento para potenciar los niveles de acidos grasos polinsaturados en los protistas thraustochytrium. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de potenciar los niveles de ácidos grasos poliinsaturados (AGP) de 0, 5 a 5 veces en protistas thraustochytrium almacenando las células en condiciones de frío, comprendiendo dicho procedimiento etapas de: a. inocular los protistas en un medio de cultivo, b. dejar proliferar el cultivo de 2 a 5 días a temperatura ambiente, c. recoger las células por centrifugación obteniendo la biomasa, d. almacenar la biomasa a aproximadamente 10ºC durante un tiempo que varía en el intervalo entre 12 y 48 horas y e. obtener AGP incrementados de la biomasa almacenada.
Description
Procedimiento para potenciar los niveles de
ácidos grasos poliinsaturados en los protistas
thraustochytrium.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de potenciar los niveles de ácidos grasos
poliinsaturados (AGP) de 0,5 a 5 veces en protistas
thraustochytrium almacenando las células en condiciones de
frío, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de inocular los
protistas en un medio de cultivo, dejar proliferar el cultivo de 2
a 5 días a temperatura ambiente, recoger las células por
centrifugación obteniendo la biomasa, almacenar la biomasa a
aproximadamente 10ºC durante un tiempo que varía en el intervalo
entre 12 y 48 horas y obtener más AGP de la biomasa almacenada.
Los ácidos grasos son constituyentes de los
lípidos, que son necesarios para el crecimiento, supervivencia y
reproducción de todos los organismos vivos. Entre los ácidos grasos,
los ácidos grasos saturados son los que tienen una estructura
química en la que los átomos de carbono están conectados entre sí
mediante enlaces sencillos y no contienen enlaces dobles. Los
ácidos grasos insaturados son aquellos en los que uno o más de los
átomos de carbono están conectados entre sí por enlaces dobles. Los
ácidos grasos poliinsaturados, denominados AGP en lo sucesivo, son
aquellos en los que se encuentra más de uno de tales enlaces
dobles.
Entre los AGP, dos se consideran extremadamente
esenciales para la salud de los animales y los seres humanos. Estos
son el ácido docosahexaenoico y el ácido eicosapentaenoico,
denominados DHA y EPA en lo sucesivo. La estructura molecular tanto
de DHA como de EPA es tal que el primer enlace doble sigue al tercer
átomo de carbono desde el extremo metilo de la estructura del ácido
graso. Por lo tanto, estos se denominan también AGP
omega-3. DHA contiene 22 átomos de carbono, entre
los que se encuentran seis enlaces de carbono dobles. EPA contiene
20 átomos de carbono, entre los que se encuentran cinco enlaces
dobles.
Se ha demostrado que tanto DHA como EPA son
importantes para la salud humana y en la nutrición de animales. En
la salud humana, se ha demostrado que DHA y EPA son importantes para
el desarrollo cerebral de los niños, la prevención de
aterosclerosis, la prevención de la ceguera nocturna, los trastornos
neurológicos e incluso para la posible prevención del cáncer
(Bajpai, P. y P. K. Bajpai. 1993. Journal of Biotechnology 30:
161-183; Barclay, W. R. y cols. 1994. Journal of
Applied Phycology 6: 123-129; Singh, A. y O. P.
Ward. 1997. Advances in applied microbiology, 45:
271-312).
Se ha demostrado que estos dos AGP
omega-3 mejoran el crecimiento y la reproducción de
los crustáceos, tales como gambas, que son muy importantes como
animales de acuicultura para el consumo humano (Harrison, K. E.
1990. Journal of Shellfish Research 9: 1-28). Por lo
tanto, se considera importante la incorporación de DHA y EPA a los
alimentos de seres humanos y animales. Los niveles de DHA y EPA de
los protistas thraustochytrium pueden potenciarse de forma
que sean superiores a sus niveles naturales dejando proliferar las
células en un medio con mayor viscosidad y sus células pueden tener
un uso todavía mejor como suplemento de la nutrición humana y como
pienso para animales comparado con los procedimientos conocidos
actualmente. Los thraustochytrium pueden cultivarse a gran
escala, usando técnicas de fermentación bien establecidas. Las
células así obtenidas pueden usarse como pienso para animales,
procesando y conservando sus células de forma adecuada, tal como
mediante secado por pulverización y liofilización. La biomasa de las
células, con ácidos grasos omega-3 potenciados
pueden recogerse también y extraer DHA y EPA de forma pura. Estos
pueden usarse para suplementar la alimentación humana que es
deficitaria en estos AGP omega-3 esenciales.
Una fuente principal de EPA y DHA para el
consumo humano es en forma de aceite de pescado. Sin embargo, el
aceite de pescado tiene la desventaja del olor, que es desagradable
para muchos consumidores humanos. Los pescados que contienen DHA y
EPA también son muy estacionales y su contenido en AGP
omega-3 es muy variable. Además, la mayoría del
aceite de pescado se hidrogena y se destruyen los AGP
omega-3. Por estas razones, los microorganismos que
contienen EPA y DHA, que pueden cultivarse a gran escala, se
consideran adecuados para su uso en la nutrición humana y en
piensos para animales (Bajpai, P. y P. K. Bajpai. 1993. Journal of
Biotechnology 30: 161-183). Varias plantas
monocelulares, las algas, contienen niveles elevados de EPA y DHA y
se han considerado para dichos fines. Puede remitirse a A. Singh y
O.P. Ward (Singh, A. y O.P. Ward, 1997. Advances in Applied
Microbiology 45: 272-312). Los microorganismos
pueden cultivarse a gran escala fácilmente usando nutrientes
baratos. Diversos grupos de microorganismos contienen cantidades
elevadas de EPA y DHA. Tales organismos pueden usarse directamente
como alimento, o pueden extraerse dichos AGP de ellos para su uso
ulterior. La investigación en búsqueda de microorganismos que
contuvieran cantidades elevadas de DHA y EPA ha demostrado que los
protistas thraustochytrium contienen algunas de las
cantidades más elevadas de DHA y EPA. Ya se considera que los
thraustochytrium tienen importancia comercial. Sus células
se usan piensos para animales o para la extracción de AGP para uso
comercial use (Lewis, T.E. y cols., 1999, The Biotechnological
potential of Thraustochytrid. Marine Biotechnology 1:
580-587; patente de Estados Unidos n.º 6.451.567 de
17 de septiembre de 2002).
La patente japonesa n.º 9633263 (1996) describe
una cepa de un thraustochytrium para su aplicación en la
industria alimentaria como aditivos alimentarios, suplementos
nutricionales, como aditivos para la leche en polvo para bebés,
alimentos y aditivos para fármacos. La cepa contiene al menos el 2%
de peso en seco de DHA. Otra patente japonesa n.º 980 3671 (1998)
describe la producción por fermentación de DHA y otro AGP, ácido
docosapentaenoico (DPA) a partir de los lípidos de protistas
thraustochytrium. Las células de protistas
thraustochytrium pueden usarse directamente como pienso en
acuicultura (patente de Estados Unidos n.º 5.908.622 de 1 de junio
de 1999). De forma alternativa, pueden extraerse DHA y EPA de
células de thraustochytrium, usando tecnologías apropiadas
(patentes japonesas JP 103105555 de
24-11-1998 y JP 10310556 de
12-5-1997). La patente de Estados
Unidos n.º 5.340.594 describe un procedimiento para la producción
de células enteras o productos microbianos extraídos usando
protistas thraustochytrium con una concentración elevada de
los AGP omega-3. Existe un potencial para el uso de
protistas thraustochytrium como suplementos nutricionales
(solicitud A428 de la Australia New Zealand Food Authority (ANZFA),
12 de diciembre de 2001). La producción de DHA y EPA a partir de
protistas thraustochytrium requiere que se cultiven en
condiciones adecuadas en fermentadores, para proporcionar cantidades
comercialmente útiles de los dos AGP. Diversos informes de
investigaciones y patentes se refieren al tema de proporcionar
condiciones adecuadas para el cultivo y producción de DHA y EPA en
thraustochytrium. La patente de Estados Unidos n.º 5.340.742
describe un procedimiento para cultivar los protistas
thraustochytrium en medios definidos adecuados para su
cultivo. La patente de Estados Unidos n.º 6.461.839 de
8-10-2002 proporciona un
procedimiento para la producción de AGP en Labyrinthula sp.,
usando un medio de cultivo que contiene aceite o ácido graso como
fuente de carbono. Yokochi y cols., (1999; Applied Microbiology and
Biotechnology, 49, 72-76) describen la salinidad,
temperatura, fuente de carbono y fuentes de aceite y nitrógeno para
la producción de cantidades elevadas de DGA en el
thraustochytrium Schizochytrium limacinum. También se han
descrito el pH e ingredientes óptimos para los medios de
Thraustochytrium aureum (lida T. y cols., Journal of
Fermentation and Biogengineering, 81: 76-78).
La presente invención pretende incrementar los
niveles de DHA y EPA en protistas thraustochytrium
independientemente de los ingredientes del medio de cultivo, de
forma que proporcionen rendimientos comerciales todavía mayores de
dichos AGP. Además, las patentes de la técnica anterior mencionadas
más arriba rechazan un gran número de cepas, que pueden tener
concentraciones de DHA y EPA sólo moderadas. En la presente
invención, puede hacerse que las cepas con cantidades moderadas de
DHA y EPA puedan producir grandes cantidades de estos AGP
sometiéndolos a condiciones de frío. Bajpai y cols. (1991; JAOCS,
68: 509-514) refieren que el contenido en AGP de
Thraustochytrium aureum puede incrementarse cultivando a una
temperatura inferior (hasta 15ºC). La patente de Estados Unidos n.º
5.340.594 refiere que al someter a los thraustochytrium a
agresión por temperaturas bajas durante el crecimiento, se mantiene
una gran cantidad de oxígeno disuelto en el medio.
Sin embargo, mantener grandes volúmenes de
cultivo de thraustochytrium, que suponen varios cientos de
litros, en condiciones de frío es un procedimiento caro. Además, la
patente de Estados Unidos n.º 5.340.594 no hace referencia al hecho
de que puede potenciarse el contenido en AGP incluso cuando la
biomasa celular ha sido retirada del medio de cultivo acuoso rico
en oxígeno, pero se ha almacenado en condiciones de frío. Además,
no existe ninguna clave que motive a los solicitantes a centrarse en
las variaciones del nivel de los AGP. Los solicitantes han
realizado cientos de experimentos y han desarrollado el
procedimiento de la presente solicitud. Además, dicha patente de
Estados Unidos no motiva a ninguna persona experta en la técnica a
usarla para deducir los niveles de AGP. En vez de eso, la invención
de la presente solicitud soluciona los problemas anteriores
cultivando las células a temperaturas ambiente, recogiendo las
células y almacenándolas a temperatura fría. El contenido en DHA y
EPA aumenta debido a este almacenamiento.
Todas las patentes anteriores se refieren a la
búsqueda de numerosos cultivos de thraustochytrium, a
seleccionar la cepa con el mayor contenido en DHA y EPA, a preparar
cepas mutantes de estos y a cultivar tales cepas en condiciones de
cultivo óptimas para la producción comercial. El documento US n.º
6.410.282 proporciona un procedimiento para potenciar los ácidos
grasos poliinsaturados por el que no es necesario alterar los
ingredientes del medio de cultivo, sino que sólo se incrementa la
viscosidad del medio mediante la adición de polivinilpirrolidona
(PVP).
El principal objeto de la presente invención es
potenciar las cantidades de AGP en protistas
thraustochytrium, evitando los inconvenientes detallados
anteriormente.
Otro objeto de la invención es preparar cepas de
thraustochytrium que produzcan cantidades mayores de DHA y
EPA que las que producen normalmente usando condiciones óptimas de
nutrientes. Todavía otro objeto de la presente invención es
potenciar los niveles de estos ácidos grasos dejando proliferar los
cultivos de protistas thraustochytrium en un medio estándar
a temperaturas ambientales, recogiendo las células y almacenándolas
en condiciones de
frío.
frío.
Todavía otro objeto de la presente invención es
desarrollar un procedimiento de potenciar los niveles de ácidos
grasos poliinsaturados (AGP) de 0,5 a 5 veces en protistas
thraustochytrium almacenando las células en condiciones de
frío.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de potenciar los niveles de ácidos grasos
poliinsaturados (AGP) de 0,5 a 5 veces en protistas
thraustochytrium almacenando las células en condiciones de
frío, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de inocular los
protistas en un medio de cultivo, dejar proliferar el cultivo de 2
a 5 días a temperatura ambiente, recoger las células por
centrifugación obteniendo la biomasa, almacenar la biomasa a
aproximadamente 10ºC durante un tiempo que varía en el intervalo
entre 12 y 48 horas y obtener AGP incrementados de la biomasa
almacenada.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento de potenciar los niveles de ácidos grasos
poliinsaturados (AGP) de 0,5 a 5 veces en protistas
thraustochytrium almacenando las células en condiciones de
frío, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de inocular los
protistas en un medio de cultivo, dejar proliferar el cultivo de 2
a 5 días a temperatura ambiente, recoger las células por
centrifugación obteniendo la biomasa, almacenar la biomasa a
aproximadamente 10ºC durante un tiempo que varía en el intervalo
entre 12 y 48 horas y obtener AGP incrementados a partir de la
biomasa almacenada.
En otra realización de la presente invención, en
la que un procedimiento de potenciar los niveles de ácidos grasos
poliinsaturados (AGP) de 0,5 a 5 veces en protistas
thraustochytrium almacenando las células en condiciones de
frío, comprendiendo dicho procedimiento etapas de
- \bullet
- inocular los protistas en un medio de cultivo,
- \bullet
- dejar proliferar el cultivo de 2 a 5 días a temperatura ambiente,
- \bullet
- recoger las células por centrifugación obteniendo la biomasa,
- \bullet
- almacenar la biomasa a aproximadamente 10ºC durante un tiempo que varía en el intervalo entre 12 y 48 horas y
- \bullet
- obtener AGP incrementados de la biomasa almacenada.
En otra realización de la presente invención, en
la que los AGP son ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido
eicosapentaenoico (EHA).
Todavía en otra realización de la presente
invención, en la que se usan los AGP incrementados en piensos para
animales, nutrición humana, suplemento alimentario.
Todavía en otra realización de la presente
invención, en la que temperatura ambiente varía en el intervalo
entre 25 y 30ºC.
Todavía en otra realización de la presente
invención, en la que los protistas thraustochytrium son
Thraustochytrium, Schizochytrium y Ulkenia.
Todavía en otra realización de la presente
invención, en la que el medio de cultivo comprende peptona a una
concentración que varía en el intervalo entre 0,3% en peso y 3,0% en
peso, extracto de levadura a una concentración que varía en el
intervalo entre 0,005% en peso y 0,5% en peso, glucosa a una
concentración que varía en el intervalo entre 0,005% en peso y 5,0%
en peso y agua de mar.
Todavía en otra realización de la presente
invención, en la que la concentración de peptonas es aproximadamente
1,5% en peso.
Todavía en otra realización de la presente
invención, en la que la concentración de extracto de levadura es
aproximadamente 0,1% en peso.
Todavía en otra realización de la presente
invención, en la que la concentración de glucosa es aproximadamente
1,0% en peso.
Todavía en otra realización de la presente
invención, en la que incluso células que contienen una cantidad
moderada de AGP en condiciones normales producen grandes
cantidades.
La presente invención proporciona, dejar
proliferar los cultivos de protistas thraustochytrium en un
medio estándar a temperaturas ambientales, recoger las células y
almacenarlas en condiciones de frío.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento de refrigeración para potenciar los
niveles de ácidos grasos poliinsaturados en protistas
thraustochytrium y que comprende: (a) proporcionar un cultivo
de hongo thraustochytrium que pertenece a géneros tales como
Thraustochytrium, Schizochytrium y UIkenia; (b) dejar
proliferar los cultivos de los protistas anteriores en un medio de
cultivo de 2 a 5 días a una temperatura que varía en el intervalo
de 25 a 30 grados C; (c) recoger las células del cultivo anterior
por centrifugación; (g) almacenar la biomasa celular en condiciones
de temperatura fría hasta 48 horas y (h) extraer las cantidades
potenciadas de ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido
eicosapentaenoico (EPA).
\newpage
En una realización de la presente invención, se
proporciona un procedimiento de potenciar los niveles de los AGP en
células de protistas thraustochytrium.
Todavía en otra realización de la presente
invención, se potencian DHA y EPA en células de protistas
thraustochytrium dejando proliferar los cultivos en un medio
estándar, recogiendo las células y almacenándolas en condiciones de
frío.
Todavía en otra realización de la presente
invención, el medio de cultivo que se usa comprende peptona en el
intervalo del 0,5% en peso al 1,5% en peso, preferiblemente, 1,5% en
peso; extracto de levadura en el intervalo del 0,01% en peso al
0,1% en peso, preferiblemente, 0,1% en peso; glucosa en el intervalo
del 0,01% al 1,0% en peso, preferiblemente, 1,00% en peso y 100 ml
de agua de mar.
Todavía en otra realización de la presente
invención, la duración del almacenamiento a temperaturas bajas
varía de 12 horas a 48 horas.
Todavía en otra realización de la presente
invención, los AGP que se potencian son DHA y EPA.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para potenciar los niveles de ácidos grasos
poliinsaturados en protistas thraustochytrium. La presente
invención se refiere en particular a un procedimiento para potenciar
los ácidos grasos poliinsaturados, ácido docosahexaenoico y ácido
eicosapentaenoico en células de microorganismos que pertenecen al
grupo de protistas denominados thraustochytrium, almacenando
las células en condiciones de frío. Las células así enriquecidas en
dichos ácidos grasos poliinsaturados (AGP) pueden utilizarse después
con más éxito que las células que no están enriquecidas en los AGP,
en diversas aplicaciones beneficiosas que requieren ácidos grasos
poliinsaturados, tales como en piensos para animales, nutrición
humana y extracción de los AGP para suplemento nutricional.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento para potenciar los niveles de ácidos
grasos poliinsaturados en protistas thraustochytrium, usando
medios de cultivo estándar o medios optimizados para la producción
de DHA y EPA y almacenando la biomasa celular recogida a temperatura
fría. Etapa a: Proporcionar un cultivo de un hongo
thraustochytrium que contiene DHA y EPA; Etapa b: Inocular
dicha cepa anterior en un medio de cultivo; Etapa c: Dejar
proliferar el cultivo durante 2 días; Etapa d: Obtener los cultivos
para usar como inóculo usando dicho medio para inocular un medio
estándar para cultivar thraustochytrium, o un medio
optimizado para la producción de EPA y DHA en esa cepa particular;
Etapa e: Dejar proliferar el cultivo por separado de 2 a 5 días a
una temperatura que varía en el intervalo de 25 a 30 grados C; Etapa
f: Recoger las células del cultivo anterior por centrifugación u
otros procedimientos apropiados; Etapa g: Almacenar las células a
una temperatura de 10ºC de 12 horas a 48 horas y extraer las
cantidades potenciadas de ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido
eicosapentaenoico (EPA) o usar la biomasa celular para diversos
fines.
De acuerdo con la presente invención, el cultivo
de una especie candidata del hongo thraustochytrium, que
contiene los AGP omega-3 DHA y EPA se inocula
primero en un medio nutritivo líquido. También pueden usarse cepas
de protistas que pertenecen a otros protistas
thraustochytrium, tales como las de la American Type
Culture Collection, ATCC números 18906, 18907, 20890, 20891, 20892,
26185 que pertenecen a Thraustochytrium sp., n.º 28210 que
pertenece a Thraustochytrium roseum Gaertner y n.º. 34304 que
pertenece a Thraustochytrium aureum Goldstein. Además de los
thraustochytrium, también puede usarse un miembro de los
protistas Labyrinthulidae, que están relacionados con los
thraustochytrium, tales como especies de Labyrinthula
o Aplanochytrium.
Un medio adecuado por ejemplo, es uno que
contiene peptona, extracto de levadura, glucosa y agua de mar.
También puede usarse cualquier otro medio que fomente un buen
crecimiento de los hongos. El cultivo se deja proliferar durante 2
días a una temperatura ambiente que varía en el intervalo de 25 a 30
grados C. Este cultivo se usa como inóculo y se usa para inocular
un medio estándar tal como anteriormente o un medio que ha sido
optimizado para la producción de DHA y EPA para la cepa de
thraustochytrium particular. Los cultivos pueden dejarse
proliferar en matraces en una agitadora orbital en el laboratorio o
en un fermentador cuando sea necesario un cultivo a gran escala. El
cultivo se deja proliferar a temperatura ambiente de 25 a 30 grados
C o a cualquier temperatura a la que la cepa particular crezca
mejor.
Después de un periodo adecuado, por ejemplo 2 a
7 días de cultivo, las células del cultivo se recogen. Esto puede
realizarse mediante cualquier procedimiento apropiado, tal como
centrifugación, centrifugación de flujo continuo, filtración, etc.
La biomasa celular después se almacena a una temperatura de
aproximadamente 10ºC de 12 horas a 48 horas. Subsiguientemente, las
células así almacenadas pueden usarse para todas las aplicaciones
que requieran células de thraustochytrium. Dicho uso puede
incluir biomasa celular para piensos para animales, suplemento
alimentario o extracción de DHA y EPA puros.
La presente invención así se refiere a un
procedimiento de potenciar los niveles de los AGP
omega-3, DHA y EPA. Mediante este procedimiento,
puede hacerse que las cepas de cultivos de thraustochytrium
produzcan niveles de estos AGP mayores de los que se consiguen en
otras condiciones. Además, pueden hacerse que incluso las cepas que
contienen únicamente cantidades moderadas de estos AGP en
condiciones normales produzcan cantidades mayores en sus células.
La invención se describe en detalle a continuación haciendo
referencia a los dibujos que se acompañan que se proporcionan
únicamente para ilustrar la invención.
A continuación se describe la invención en
detalle haciendo referencia a los dibujos que se acompañan que se
proporcionan únicamente para ilustrar esta invención.
La Fig. 1 representa el contenido en DHA de una
cepa de thraustochytrium NIOS-1, que
corresponde en su morfología y ciclo vital a los géneros
Schizochytrium Goldstein y Belsky, cuando se cultiva en un
medio de cultivo nutritivo líquido.
La Fig. 2 representa el contenido en EPA de un
thraustochytrium NIOS-1, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Schizochytrium
Goldstein y Belsky, cuando se cultiva en un medio de cultivo
nutritivo líquido.
La Fig. 3 representa el contenido en DHA de una
cepa de thraustochytrium NIOS-2, que
corresponde en su morfología y ciclo vital a la especie
Thraustochytrium Sparrow, cuando se cultiva en un medio de
cultivo nutritivo líquido.
La Fig. 4 representa el contenido en EPA de un
thraustochytrium NIOS-2, que corresponde en
su morfología y ciclo vital a la especie Thraustochytrium
Sparrow, cuando se cultiva en un medio de cultivo nutritivo
líquido.
La Fig. 5 representa el contenido en DHA de una
cepa de thraustochytrium NIOS-3, que
corresponde en su morfología y ciclo vital a la especie
Ulkenia Gaertner, cuando se cultiva en un medio de cultivo
nutritivo líquido.
La Fig. 6 representa el contenido en EPA de un
thraustochytrium NIOS-3, que corresponde en
su morfología y ciclo vital a la especie Ulkenia Gaertner,
cuando se cultiva en un medio de cultivo nutritivo líquido.
La Fig. 7 representa el contenido en DHA de una
cepa de thraustochytrium NIOS-4, que
corresponde en su morfología y ciclo vital al género Ulkenia
Gaertner, cuando se cultiva en un medio de cultivo nutritivo
líquido.
La Fig. 8 representa el contenido en EPA de un
thraustochytrium NIOS-1, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Ulkenia Gaertner,
cuando se cultiva en un medio de cultivo nutritivo líquido.
La Fig. 9 representa el contenido en DHA de un
thraustochytrium NIOS-1, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Schizochytrium sp.
cuando la biomasa celular se almacenó en condiciones de frío
durante extensiones de tiempo diferentes.
La Fig. 10 representa el contenido en EPA de un
thraustochytrium NIOS-1, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Schizochytrium sp.
cuando la biomasa celular se almacenó en condiciones de frío
durante extensiones de tiempo diferentes.
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo
de ilustración de la presente invención y por lo tanto, no deben
interpretarse como limitantes del alcance de la presente
invención.
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-1, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Schizochytrium
Goldstein y Belsky, se inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que
contenía: peptona de gelatina - - 1,5% en peso; extracto de
levadura - - 0,1% en peso; glucosa - - 1,0% en peso y
agua de mar - - 100 ml. Los cultivos se dejaron proliferar
durante 2 días en una agitadora a temperatura ambiente de
25-30 grados C. Estos cultivos se usaron como
inóculo para el experimento. Los cultivos se prepararon usando un
medio con la misma composición que anteriormente. Los cultivos se
dejaron proliferar durante 5 días en una agitadora a temperatura
ambiente de 25-30 grados C. Al final de este
periodo, las células se recogieron por centrifugación. Un lote de
la biomasa celular se usó inmediatamente para la extracción de
ácidos grasos y el análisis por cromatografía de gases. Otro lote
de la biomasa celular recogida se almacenó en un frigorífico a 10
grados C durante 24 horas, al final de las cuales se extrajeron los
ácidos grasos y se analizaron por cromatografía de gases. La
biomasa celular almacenada en el frigorífico contenía casi 0,5 veces
más DHA que la no almacenada en el frigorífico (Fig. 1).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-1, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Schizochytrium
Goldstein y Belsky, se inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que
contenía: peptona de gelatina - - 1,5% en peso; extracto de
levadura - - 0,1% en peso; glucosa - - 1,0% en peso y
agua de mar - - 100 ml. Los cultivos se dejaron proliferar
durante 2 días en una agitadora a temperatura ambiente de
25-30 grados C. Estos cultivos se usaron de inóculo
para el experimento. Los cultivos se prepararon usando un medio con
la misma composición que anteriormente. Los cultivos se dejaron
proliferar durante 5 días en una agitadora a temperatura ambiente
de 25-30 grados C. Al final de este periodo, las
células se recogieron por centrifugación. Un lote de la biomasa
celular se usó inmediatamente para la extracción de ácidos grasos y
el análisis por cromatografía de gases. Otro lote de la biomasa
celular recogida se almacenó en un frigorífico a 10 grados C
durante 24 horas, al final de las cuales se extrajeron los ácidos
grasos y se analizaron por cromatografía de gases. La biomasa
celular almacenada en el frigorífico contenía casi 3 veces más EPA
que la no almacenada en el frigorífico (Fig. 2).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-2, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Thraustochytrium
Gaertner, se inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que contenía:
peptona de gelatina - - 1,5% en peso; extracto de levadura
- - 0,1% en peso; glucosa - - 1,0% en peso y agua de
mar - - 100 ml. Los cultivos se dejaron proliferar durante 2
días en una agitadora a temperatura ambiente de
25-30 grados C. Estos cultivos se usaron de inóculo
para el experimento. Los cultivos se prepararon usando un medio con
la misma composición que anteriormente. Los cultivos se dejaron
proliferar durante 5 días en una agitadora a temperatura ambiente
de 25-30 grados C. Al final de este periodo, las
células se recogieron por centrifugación. Un lote de la biomasa
celular se usó inmediatamente para la extracción de ácidos grasos y
el análisis por cromatografía de gases. Otro lote de la biomasa
celular recogida se almacenó en un frigorífico a 10 grados C
durante 24 horas, al final de las cuales se extrajeron los ácidos
grasos y se analizaron por cromatografía de gases. La biomasa
celular almacenada en el frigorífico contenía casi 2 veces más DHA
que la no almacenada en el frigorífico (Fig. 3).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-2, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Thraustochytrium
Gaertner, se inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que contenía:
peptona de gelatina - - 1,5% en peso; extracto de levadura
- - 0,1% en peso; glucosa - - 1,0% en peso y agua de
mar - - 100 ml. Los cultivos se dejaron proliferar durante 2
días en una agitadora a temperatura ambiente de
25-30 grados C. Estos cultivos se usaron de inóculo
para el experimento. Los cultivos se prepararon usando un medio con
la misma composición que anteriormente. Los cultivos se dejaron
proliferar durante 5 días en una agitadora a temperatura ambiente
de 25-30 grados C. Al final de este periodo, las
células se recogieron por centrifugación. Un lote de la biomasa
celular se usó inmediatamente para la extracción de ácidos grasos y
el análisis por cromatografía de gases. Otro lote de la biomasa
celular recogida se almacenó en un frigorífico a 10 grados C
durante 24 horas, al final de las cuales se extrajeron los ácidos
grasos y se analizaron por cromatografía de gases. Mientras que los
cultivos de control no contenían EPA, la biomasa celular almacenada
en el frigorífico contenía una gran cantidad de este AGP (Fig.
4).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-3, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Ulkenia Gaertner, se
inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que contenía: peptona de
gelatina - - 1,5% en peso; extracto de levadura - - 0,1%
en peso; glucosa - - 1,0% en peso y agua de mar - - 100
ml. Los cultivos se dejaron proliferar durante 2 días en una
agitadora a temperatura ambiente de 25-30 grados C.
Estos cultivos se usaron de inóculo para el experimento. Los
cultivos se prepararon usando un medio con la misma composición que
anteriormente. Los cultivos se dejaron proliferar durante 5 días en
una agitadora a temperatura ambiente de 25-30
grados C. Al final de este periodo, las células se recogieron por
centrifugación. Un lote de la biomasa celular se usó inmediatamente
para la extracción de ácidos grasos y el análisis por cromatografía
de gases. Otro lote de la biomasa celular recogida se almacenó en un
frigorífico a 10 grados C durante 24 horas, al final de las cuales
se extrajeron los ácidos grasos y se analizaron por cromatografía
de gases. La biomasa celular almacenada en el frigorífico contenía
casi de 0,5 a 2 veces más DHA que la no almacenada en el
frigorífico (Fig. 5).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-3, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Ulkenia Gaertner, se
inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que contenía: peptona de
gelatina - - 1,5% en peso; extracto de levadura - - 0,1%
en peso; glucosa - - 1,0% en peso y agua de mar - - 100
ml. Los cultivos se dejaron proliferar durante 2 días en una
agitadora a temperatura ambiente de 25-30 grados C.
Estos cultivos se usaron de inóculo para el experimento. Los
cultivos se prepararon usando un medio con la misma composición que
anteriormente. Los cultivos se dejaron proliferar durante 5 días en
una agitadora a temperatura ambiente de 25-30
grados C. Al final de este periodo, las células se recogieron por
centrifugación. Un lote de la biomasa celular se usó inmediatamente
para la extracción de ácidos grasos y el análisis por cromatografía
de gases. Otro lote de la biomasa celular recogida se almacenó en un
frigorífico a 10 grados C durante 24 horas, al final de las cuales
se extrajeron los ácidos grasos y se analizaron por cromatografía
de gases. La biomasa celular almacenada en el frigorífico contenía
casi de 0,5 a 4 veces más EPA que la no almacenada en el
frigorífico (Fig. 6).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-4, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Ulkenia Gaertner, se
inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que contenía: peptona de
gelatina - - 1,5% en peso; extracto de levadura - - 0,1%
en peso; glucosa - - 1,0% en peso y agua de mar - - 100
ml. Los cultivos se dejaron proliferar durante 2 días en una
agitadora a temperatura ambiente de 25-30 grados C.
Estos cultivos se usaron de inóculo para el experimento. Los
cultivos se prepararon usando un medio con la misma composición que
anteriormente. Los cultivos se dejaron proliferar durante 5 días en
una agitadora a temperatura ambiente de 25-30
grados C. Al final de este periodo, las células se recogieron por
centrifugación. Un lote de la biomasa celular se usó inmediatamente
para la extracción de ácidos grasos y el análisis por cromatografía
de gases. Otro lote de la biomasa celular recogida se almacenó en un
frigorífico a 10 grados C durante 24 horas, al final de las cuales
se extrajeron los ácidos grasos y se analizaron por cromatografía
de gases. La biomasa celular almacenada en el frigorífico contenía
casi de 0,5 a 2 veces más DHA que la no almacenada en el
frigorífico (Fig. 7).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-4, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Ulkenia Gaertner, se
inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que contenía: peptona de
gelatina - - 1,5% en peso; extracto de levadura - - 0,1%
en peso; glucosa - - 1,0% en peso y agua de mar - - 100
ml. Los cultivos se dejaron proliferar durante 2 días en una
agitadora a temperatura ambiente de 25-30 grados C.
Estos cultivos se usaron de inóculo para el experimento. Los
cultivos se prepararon usando un medio con la misma composición que
anteriormente. Los cultivos se dejaron proliferar durante 5 días en
una agitadora a temperatura ambiente de 25-30
grados C. Al final de este periodo, las células se recogieron por
centrifugación. Un lote de la biomasa celular se usó inmediatamente
para la extracción de ácidos grasos y el análisis por cromatografía
de gases. Otro lote de la biomasa celular recogida se almacenó en un
frigorífico a 10 grados C durante 24 horas, al final de las cuales
se extrajeron los ácidos grasos y se analizaron por cromatografía
de gases. La biomasa celular almacenada en el frigorífico contenía
casi de 0,5 a 2 veces más DHA que la no almacenada en el
frigorífico (Fig. 8).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-1, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Schizochytrium
Goldstein y Belsky, se inoculó en 100 ml de un medio de cultivo que
contenía: peptona de gelatina - - 1,5% en peso; extracto de
levadura - - 0,1% en peso; glucosa - - 1,0% en peso y
agua de mar - - 100 ml. Los cultivos se dejaron proliferar
durante 2 días en una agitadora a temperatura ambiente de
25-30 grados C. Estos cultivos se usaron de inóculo
para el experimento. Los cultivos se prepararon usando un medio con
la misma composición que anteriormente. Se cultivaron seis lotes de
cultivos durante 5 días en una agitadora a temperatura ambiente de
25-30 grados C. Al final de este periodo, las
células se recogieron por centrifugación. Un lote de la biomasa
celular se usó inmediatamente para la extracción de ácidos grasos y
el análisis por cromatografía de gases. Los otros 5 lotes de la
biomasa celular recogida se almacenaron en un frigorífico a 10
grados C durante 6, 12, 24, 48 y 72 horas respectivamente, al final
de las cuales se extrajeron los ácidos grasos y se analizaron por
cromatografía de gases. La biomasa celular almacenada en el
frigorífico durante 6 horas no mostró aumento del DHA, la almacenada
durante 12-48 horas mostró un aumento de
aproximadamente el 50% y la almacenada durante 72 horas no mostró
aumento del DHA (Fig. 9).
Un cultivo de un thraustochytrium que
pertenecía a la cepa n.º NIOS-1, que corresponde en
su morfología y ciclo vital al género Schizochytrium
Goldstein y Belsky, se inoculó en 100 ml de un medio de cultivo
que contenía: peptona de gelatina - - 1,5% en peso; extracto
de levadura - - 0,1% en peso; glucosa - - 1,0% en peso
y agua de mar - - 100 ml. Los cultivos se dejaron proliferar
durante 2 días en una agitadora a temperatura ambiente de
25-30 grados C. Estos cultivos se usaron de inóculo
para el experimento. Los cultivos se prepararon usando un medio con
la misma composición que anteriormente. Los cultivos se dejaron
proliferar durante 5 días en una agitadora a temperatura ambiente
de 25-30 grados C. Al final de este periodo, las
células se recogieron por centrifugación. Un lote de la biomasa
celular se usó inmediatamente para la extracción de ácidos grasos y
el análisis por cromatografía de gases. Otras 5 fracciones de la
biomasa celular se almacenaron en un frigorífico a 10 grados C
durante 6, 12, 24, 48 y 72 horas respectivamente, al final de las
cuales se extrajeron los ácidos grasos y se analizaron por
cromatografía de gases. La biomasa celular almacenada en el
frigorífico durante 6 horas no mostró aumento del DHA, la
almacenada durante 12 reveló un aumento marginal del DHA, la
almacenada durante 24 horas mostró un aumento de casi el 100%, la
almacenada durante 48 horas mostró un aumento de casi el 300% y la
almacenada durante 72 horas no mostró aumento de EPA (Fig. 10).
Las ventajas principales de la presente
invención son:
1. Los niveles de DHA y EPA de los
thraustochytrium presentes habitualmente en los cultivos
pueden potenciarse más usando una técnica simple.
2. Incluso aquellas cepas que tienen únicamente
cantidades moderadas de DHA y EPA pueden enriquecerse en estos
ácidos grasos.
3. El aumento de los niveles de DHA y EPA se
logra almacenando la biomasa celular en frío, durante un periodo de
12 a 48 horas.
Claims (10)
1. Un procedimiento de potenciar los niveles de
ácidos grasos poliinsaturados (AGP) de 0,5 a 5 veces en protistas
thraustochytrium almacenando las células en condiciones de
frío, comprendiendo dicho procedimiento etapas de:
- a.
- inocular los protistas en un medio de cultivo,
- b.
- dejar proliferar el cultivo de 2 a 5 días a temperatura ambiente,
- c.
- recoger las células por centrifugación obteniendo la biomasa,
- d.
- almacenar la biomasa a aproximadamente 10ºC durante un tiempo que varía en el intervalo entre 12 y 48 horas y
- e.
- obtener AGP incrementados de la biomasa almacenada.
2. Un procedimiento tal como se reivindica en la
reivindicación 1, en el que los AGP son ácido docosahexaenoico
(DHA) y ácido eicosapentaenoico (EHA).
3. Un procedimiento tal como se reivindica en la
reivindicación 1, en el que se usan los AGP incrementados en
piensos para animales, nutrición humana, suplemento alimentario.
4. Un procedimiento tal como se reivindica en la
reivindicación 1, en el que temperatura ambiente varía en el
intervalo entre 25 y 30ºC.
5. Un procedimiento tal como se reivindica en la
reivindicación 1, en el que los protistas thraustochytrium
son Thraustochytrium, Schizochytrium y Ulkenia.
6. Un procedimiento tal como se reivindica en la
reivindicación 1, en el que el medio de cultivo comprende peptona a
una concentración que varía en el intervalo entre 0,3% en peso y
3,0% en peso, extracto de levadura a una concentración que varía en
el intervalo entre 0,005% en peso y 0,5% en peso, glucosa a una
concentración que varía en el intervalo entre 0,005% en peso y 5,0%
en peso y agua de mar.
7. Un procedimiento tal como se reivindica en la
reivindicación 6, en el que la concentración de peptonas es
aproximadamente 1,5% en peso.
8. Un procedimiento tal como se reivindica en la
reivindicación 6, en el que la concentración de extracto de
levadura es aproximadamente 0,1% en peso.
9. Un procedimiento tal como se reivindica en la
reivindicación 6, en el que la concentración de glucosa es
aproximadamente 1,0% en peso.
10. Un procedimiento tal como se reivindica en
la reivindicación 1, en el que incluso células que contienen una
cantidad moderada de AGP en condiciones normales producen grandes
cantidades.
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