EP1102859A1 - VERFAHREN ZUR PRÄPARATIVEN GEWINNUNG VON FETTSÄUREN AUS BIOMASSE DURCH $i(IN- SITU)-EXTRAKTION-REAKTION-CHROMATOGRAPHIE MIT VERDICHTETEN GASEN - Google Patents

VERFAHREN ZUR PRÄPARATIVEN GEWINNUNG VON FETTSÄUREN AUS BIOMASSE DURCH $i(IN- SITU)-EXTRAKTION-REAKTION-CHROMATOGRAPHIE MIT VERDICHTETEN GASEN

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EP1102859A1
EP1102859A1 EP99938281A EP99938281A EP1102859A1 EP 1102859 A1 EP1102859 A1 EP 1102859A1 EP 99938281 A EP99938281 A EP 99938281A EP 99938281 A EP99938281 A EP 99938281A EP 1102859 A1 EP1102859 A1 EP 1102859A1
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EP
European Patent Office
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extraction
reaction
fatty acid
fatty acids
ethanol
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99938281A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Kiy
Christoph Siffrin
Heinz Engelhardt
Dirk Fabritius
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Celanese Sales Germany GmbH
Original Assignee
Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
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Publication date
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Application filed by Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG filed Critical Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Publication of EP1102859A1 publication Critical patent/EP1102859A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/003—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fatty acids with alcohols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C11B1/104—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting using super critical gases or vapours
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B7/00—Separation of mixtures of fats or fatty oils into their constituents, e.g. saturated oils from unsaturated oils
    • C11B7/0008—Separation of mixtures of fats or fatty oils into their constituents, e.g. saturated oils from unsaturated oils by differences of solubilities, e.g. by extraction, by separation from a solution by means of anti-solvents
    • C11B7/005—Separation of mixtures of fats or fatty oils into their constituents, e.g. saturated oils from unsaturated oils by differences of solubilities, e.g. by extraction, by separation from a solution by means of anti-solvents in solvents used at superatmospheric pressures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C11C3/10—Ester interchange

Definitions

  • the invention relates to a method for the preparative production of fatty acid esters - for the production of fatty acids, preferably polyunsaturated fatty acids (PUFA) - from biological sources by means of a continuous in situ extraction-reaction chromatography with compressed gases.
  • fatty acids preferably polyunsaturated fatty acids (PUFA) - from biological sources by means of a continuous in situ extraction-reaction chromatography with compressed gases.
  • PUFA polyunsaturated fatty acids
  • PUFAs occur in nature in relatively high concentrations in linseed oil, nut oil, poppy seed oil, hemp oil and in fish oils. Numerous attempts have already been made to obtain these valuable substances from such biological sources and to isolate them in more or less high purity. However, since the PUFAs are usually chemically bound as esters in lip (o) iden, in addition to extraction, they must be converted into the free acids (hydrolysis) or into corresponding monoesters (transesterification).
  • Lip (o) ide mostly contain fatty acids bound in glycerides (mono-, di-, tri-glycerides), phosphatides, glycolipids and aminolipids. These bound fatty acids as well as free native fatty acids and their derivatives differ on the one hand in the frequency of their occurrence in biological sources, and on the other hand in their effect on the human organism.
  • native fatty acids and their derivatives are obtained from biological sources. especially by extraction with the help of compressed gases (eg supercritical carbon dioxide, etc.).
  • compressed gases eg supercritical carbon dioxide, etc.
  • SFE supercritical fluid extraction
  • Organic acids serve as catalysts here, "Coulping chemical derivatization reactions with supercritical fluid extraction", JA Fields, J. Chromatogr. A, 785 (1997), pp. 239-249) and solid catalysts (e.g. ion exchange resins (C. Vieville, Z. Mouloungui, A. Gaset; Colloq. - Inst. Natl. Rech. Agron. (1995), 71 (Valorisations Non-Alimentraires des Grandes Productions Agricoles), 179-82 .; acidic aluminum oxide ( BW Wenclawiak, M. Krappe, A. Otterbach; J. Chromatogr. A (1997), 785, 263-267)) or combinations thereof (C. Vieville, Z. Mouloungui, A. Gaset; Ind. Eng. Chem. Res (1993), 32 (9), 2065-8).
  • ion exchange resins C. Vieville, Z. Mouloungui, A. Gaset; Collo
  • Enzymatic reactions by means of lipases are also known, which carry out the fat cleavage either in solution or immobilized with subsequent extraction in the presence of supercritical gases (R. Hashizume, Y. Tanaka, H. Ooguchi, Y.Noguchi, T. Funada; JP-196722 and A. Marty, D. Combes, JS Condoret; Prog. Biotechnol. (1992), 8 (Biocatalysis in Non-conventional Media), 425-32).
  • the SFE and SFR processes can be carried out as a continuous (continuous flow) or discontinuous (batch) process.
  • King et. al carry out extraction and transesterification in the presence of compressed gases as a batch process (J.W. King, J.E. France, J.M. Snyder; Fresenius J. Anal. Chem. (1992), 344, 474-478).
  • lipids are first extracted from a biological source (here: seeds), followed by transesterification on the catalyst to methyl esters.
  • the alumina catalyst is physisorbed with methanol.
  • the complex insertion of the samples onto the catalyst is disadvantageous, as a result of which a reaction only takes place at the catalyst / sample interface. This is insufficient in the context of a preparative implementation.
  • the present invention has for its object to provide a method for the preparative preparation of unsaturated and saturated fatty acid esters and their selective isolation from biological sources.
  • the object is achieved in that a method for producing and isolating fatty acid esters from biological sources is provided by means of continuous in-situ extraction-reaction chromatography. In the presence of a compressed gas stream and a 0.5 to 5% C1-C5 alcohol modifier
  • reaction is carried out on an inert catalyst in full contact with the biological source
  • reaction products are chromatographed on the inert catalyst from (a), which has chromatographic retention and only desorbs and elutes the reaction products;
  • reaction products produced are harmless to health and food chemistry, because
  • Carbon dioxide can be used as the reaction / extraction medium or mobile phase. Neither the starting materials nor the products thus come into contact with toxic substances at any point in the process.
  • Carbon dioxide serves as a protective gas atmosphere to prevent oxidation and gentle extraction and elution.
  • the toxicity of the substances used in the present case is so low that they can be safely used for the production of food additives or pharmaceutical products.
  • reaction products are obtained in pure form as a substance or in high concentrations in a suitable solvent and can easily be processed further.
  • the reaction products are selectively separated from the starting materials, the intermediate or by-products in the process according to the invention.
  • the process can be carried out continuously. In the case of liquid educts, they can be fed into the flow system.
  • the biological source can be used directly. Limiting the amount of biomass from the biological source is not necessary and is therefore suitable for large-scale use.
  • the process combines and combines the extraction, reaction and chromatography process stages to form a functional unit and can therefore reduce the costs for large-scale use.
  • “In situ extraction-reaction chromatography” in the sense of this invention means that the fatty acid esters from the biological source are provided, chromatographed and extracted from the biological source by means of compressed gases (in short: SF-REC).
  • the catalyst according to the invention serves as a stationary phase in which the fatty acid esters produced are selectively desorbed from the catalyst and eluted in the presence of the compressed gas. Therefore, the inventive Moderate catalyst have a chromatographic retention in which the product does not adsorb.
  • the parameters (conditions) according to the invention are selected such that the lip (o) ide remain on the catalyst and the fatty acid esters are selectively eluted. These specific parameters are explained in the examples.
  • the method of in situ reaction extraction chromatography according to the invention is carried out as a continuous method. It can also be used synonymously with the term “(continious) batch flow method”.
  • the term continuous method is understood as a flow system in which, under continuous reaction in the gas / modifier stream, the reaction products on the solid or consistent biological
  • the source in contact with the inert catalyst is chromatographed and extracted
  • a liquid biological source can be added to the gas / ethanol stream and ensures a continuous process.
  • compressed gases in the sense of this invention encompasses liquid, supercritical and two-phase or subcritical gases or gas mixtures.
  • gases which are known to the person skilled in the field of SFE and SFR technology are expressly included here compressed gas for extraction and is used as a reaction medium
  • the gas also serves as a mobile phase and is used as an extraction medium, and compressed carbon dioxide is particularly preferred.
  • modifier means an additional stream in the presence of the compressed gas.
  • 0.5-5% by volume of lower alcohols are used.
  • An ethanol modifier of 0.5-5% by volume is preferred.
  • the modifier serves as a reactant for the transesterification of lip (o) ides on the inert catalyst.
  • fatty acid esters are obtainable from all branched and unbranched fatty acids as well as fatty acid derivatives, such as hydroxy fatty acids, which have a carbon chain of at least 12 carbon atoms.
  • Fatty acid esters are preferred as fatty acid ethyl esters, since the alcohol required for the preparation has the lowest toxicity of the lower alcohols.
  • the invention can be carried out for unbranched or branched C1-C5 alcohols.
  • Educts are preferably lip (o) ide from biological sources and other bound fatty acids; Reaction products are fatty acid esters. Since ethanol is preferably used as the reactant and modifier for the reaction (transesterification), fatty acid ethyl esters are preferably obtained. Of course, free fatty acids and their salts are converted into their fatty acid esters in the biological sources.
  • complete conversion means the conversion of all the fatty acids contained in the starting materials into the corresponding fatty acid ethyl esters while the unreacted starting materials remain (adsorption) on the inert catalyst.
  • Inert catalyst in the sense of this invention means that in full contact with the biological source, this catalyst on the one hand accelerates the reaction (transesterification) into the reaction products and on the other hand serves as a stationary phase. For this, the catalyst must have chromatographic retention. The catalyst must not be toxic to the biological source and is therefore available to the reaction in an inert manner.
  • Alumina which is commercially available, has proven to be advantageous and inexpensive, which can also be easily mixed and / or rubbed with the biological source, possibly with other auxiliaries and additives (e.g. sea sand).
  • any biological source can be used and used in the method according to the invention.
  • the term biological source is therefore preferably to be applied to easily cultivable microorganisms.
  • Preferred are microorganisms with a high content of highly unsaturated fatty acids (PUFA) that can be easily broken down. nen. Be it chemical, enzymatic, but preferably mechanical.
  • Microorganisms with a fatty acid spectrum which predominantly contain one or only a few bound or native fatty acids are particularly preferred. Organisms are preferred here, as follows:
  • Bacillariophyta genus Nitzschia, Navicula, Cyclotella
  • FIG. 1 describes the schematic structure and arrangement of the functional units, the terms having the following meaning:
  • Catalyst steel chamber filled with alumina. Location of in situ extraction-reaction chromatography.
  • Restrictor valve or narrow capillary that opposes a flowing medium and regulates the pressure system in the presence of the "CO 2", “sample”, “ethanol” pump.
  • Alcohol 0.5 vol% to 5 vol% ethanol
  • Catalyst separation medium 7g aluminum oxide A for column chromatography (ICN, acidic, activity I) (possibly also other, e.g. basic, neutral, coated with acids, different grain sizes or also on silica gel, zirconium oxide or other basis)
  • ICN organic compound
  • activity I possibly also other, e.g. basic, neutral, coated with acids, different grain sizes or also on silica gel, zirconium oxide or other basis
  • the lower chromatogram in FIG. 2 shows the analysis (on aminopropyl phase 4.6x500mm, 10 ⁇ m; 5% ethanol as modifier, 150 bar 40 ° C.) of the substances originating from the system during the process. Under the given conditions (1% EtOH) only the ethyl ester is removed from the system. The upper chromatogram shows the substances removed from the system with the addition of 10% EtOH. Under these conditions, all substances (except glycerin) are eluted from the system. This is tantamount to stopping the reaction. You can see peaks for the ethyl ester, the triglyceride and the corresponding mono- and diglycerides
  • Trap trap with glass balls (0.25 - 0.5 mm);
  • GC-MS is used for qualitative analysis and for the identification of the products.
  • SFC is used for quantification.
  • a qualitative analysis of the fatty acid ethyl esters is particularly important for determining the fatty acid spectrum for the real samples. This is examined using GC-MS. For this purpose, the esters dissolved in n-heptane were separated on a DB5 column and identified by their mass spectra. The exact chromatographic conditions are listed in the appropriate place.
  • the quantitative analysis of the ethyl esters formed and the unreacted triglycerides is used to determine the yield of the SF-REC.
  • the problem arises of being able to determine all products (ethyl esters, mono- and diglycerides; not glycerol) and the starting material (triglyceride) using a chromatographic method.
  • ethyl esters mono- and diglycerides; not glycerol
  • triglyceride chromatographic method.
  • only volatile esters methyl or ethyl esters
  • the glycerides must therefore first be converted into the esters of lower alcohols.
  • the problem of UV detection arises in HPLC.
  • the glycerides and the ethyl esters must e.g. be converted into the phenacyl esters.
  • SFC on amino phases and ethanol as modifiers, the ethyl esters and the glycerides can be separated and also detected underivatized at
  • the SF-REC was carried out on the commercial HEWLETT-PACKARD system SFE Module 7860T.
  • the conversion rate was checked after certain time intervals: after the start of the reaction, ie the introduction of the sample into the reaction vessel with catalyst and setting of the conditions (pressure, temperature, flow, etc.) on the device, were carried out continuously over a certain period of time the substances removed from the reaction vessel are collected.
  • This collection process by means of a trap with solid sorbent is carried out in two steps: The extraction of the substances from the reaction chamber takes place in a so-called dynamic step, ie the extraction medium flows through the system, dissolves the sample and separates it after the fluid has been released , on the solid support of the trap.
  • a second step this is rinsed with a suitable solvent (here: n-heptane) and the extracted substances are transferred to a collecting vessel.
  • a suitable solvent here: n-heptane
  • This rinsing step takes about six minutes. During this time the flow of the fluid is stopped, but the pressure and temperature in the The reaction chamber is retained. The reaction continues during this time. This step can therefore be called an additional so-called static step.
  • the trap is rinsed after certain times (see above) to determine how much product has formed after this time. If the abscissa of the course of the reaction is labeled "time [min]" in the following, this means that only the dynamic steps have been added up. Two different reactions with the same sequence of steps are therefore comparable.
  • the labeling of the time axis with "total reaction time [min]” means that the six minutes of the static course of the reaction during the rinsing process were added to each dynamic step. This should be taken into account when comparing the kinetics recorded!
  • the collecting vessels are filled automatically.
  • the amount of the n-heptane solution can be determined by weighing the vials before and after the step.
  • the respective vials for each reaction step are injected three times for the quantification.
  • the mean value of the peak areas of the three injections is formed for evaluation.
  • the concentration is calculated from the calibration line and, with the amount of solution, the amount of substance.
  • the theoretically achievable amount of oleic acid ethyl ester (EA) is calculated from this, which corresponds to 100% reaction yield.
  • the determined amount of 18: 1 EE is based on this.
  • the conditions for the transesterification using SF-REC can be varied within a wide range.
  • the reaction or extraction conditions such as pressure, flow rate, modifier content and temperature can be independent of each other can be varied. This provides a number of parameters for optimizing the yield. If you consider the apparatus structure ( Figure 1), the individual points result as follows: Table 1 :
  • the trap can be cooled to prevent the sample from evaporating or to condense, increase its viscosity, or freeze it. It should be noted that "blowing off" the sample in the form of droplets from the trap material must be prevented by the rapid gas flow. This point is particularly problematic when working with modifiers. This also separates out as a liquid. Since the amount of liquid exceeds the absorption capacity of the trap, there are losses because the sample dissolved in the modifier is "blown" by the trap. Therefore, when modifier is added, the trap must be heated above the boiling point of the modifier, so that it is gaseous like C0 2 and can no longer dissolve the sample. At this temperature, however, the volatility of the sample can lead to losses due to evaporation.
  • the sample After being caught on the trap, the sample is eluted from the solid sorbent in a rinsing step (rinse) with a suitable solvent (rinse solvent).
  • the second option is to introduce the relaxed gas, in which small sample droplets or particles are entrained, into a suitable solvent.
  • the sample can dissolve in the solvent if it has enough time to come into contact with it. This contact time depends on the flow rate of the C0 2 .
  • the solvent is placed in a flask and the gas flow is passed through a capillary.
  • the second problem arises especially when collecting for a longer period of time by evaporating the solvent. Feeding the solvent with the amount per time, which also evaporates per time, can keep the amount of solvent in the receiver constant, but does not prevent the losses due to evaporation of the sample itself. A reduction in the template temperature counteracts this. However, the temperature must not be reduced to such an extent that the capillary is blocked by freezing of the C0 2 (for example by acetone / dry ice).
  • Nozzle temperature during extraction 90 ° C
  • Nozzle temperature for the rinse step 70 ° C
  • the traps with solvent (10 ml of n-heptane in the receiver) are cooled to 0 ° C in an ice bath.
  • an external pump is used to add n-heptane.
  • the n-heptane is fed directly to the outlet of the nozzle and flows through the capillary into the template.
  • the flow rate is chosen so that approximately the amount of n-heptane that evaporates per time is balanced.
  • the gas flow escapes through small channels on the plug of the flask (50 ml volumetric flask) after it has passed the template. With this arrangement, only 35% of the 18: 1 EA is recovered.
  • the trap technique with RP-C18 material leads particularly well to a quantitative recovery. This is used in the following for all further optimization attempts. It can also be scaled up if the amount of sorbent is increased. The separate rinsing step is disadvantageous. On a preparative, technical scale, cyclone separators can be used that collect the pure product without working with solvents.
  • sample preparation includes various options for how and where the sample is added to the system.
  • the model substance triolein is liquid at room temperature.
  • the reactor is about 4/5 filled with catalyst.
  • Triolein is then weighed directly onto the catalyst. Then you fill the reactor with catalyst.
  • the sample is thus in direct contact with the catalyst and is surrounded by it.
  • the direction of the fluid flow is chosen so that 4/5 of the catalyst is available as a "reaction path", ie it is extracted from the end where the sample was placed through the reactor. This technique is used for all optimizations with triolein.
  • solid samples are weighed in with the catalyst and ground in a mortar in order to produce the largest possible contact area.
  • Acidic aluminum oxide with activity level Super I (name: Alox A Sl) was used with the following weights:
  • the modifier content affects the extraction on the one hand and the reaction on the other. For the latter, the higher the proportion of the reactant ethanol, the higher the reaction yield that can be achieved. On the other hand, it should be noted that with increasing modifier content, the extraction yield increases not only for 18: 1 -EE, but also for the educt triolein. Therefore, the addition of ethanol in the fluid must be optimized in addition to the pre-loading of the catalyst with ethanol.
  • the SF-REC for triolein is carried out under the same conditions, with 1% and 2% ethanol being added as a modifier in the first case. A faster reaction and a higher yield are found for the higher ethanol content.
  • the increase in the ethanol content is limited by the increased extraction of triolein. It must be prevented that the educt is removed before it can react.
  • the density and thus the solvent strength can be adjusted via the pressure and the temperature of the fluid. This is crucial for the extraction yield. It can be used to control the selectivity of the extraction between the ethyl ester product and the triglyceride starting material. As shown in the previous chapter, the modifier content also affects this selectivity. Overall, the SF-REC condition must therefore be selected so that, with the highest possible modifier content, the density is so low that only the ethyl ester is selectively extracted from the reaction space. However, the temperature, like the ethanol content, also has an effect on the reaction rate. If the temperature is increased at the same density, the yield per time increases, as shown in FIG. 4: In principle, the temperature in the given system can be increased by up to 150 ° C.
  • Temperature and modifier content have a direct influence on the reaction yield, i.e. the turnover rate of the transesterification. They should both be as high as possible in order to achieve a quick implementation.
  • the extraction of the product from the reaction space should be as selective as possible with respect to the starting material, i.e. the solvent strength of the fluid must be sufficient to achieve extraction of the ethyl ester which is as complete as possible but extraction of the triglyceride as low as possible. Accordingly, the following strategy was used for optimization: By lowering the pressure while simultaneously increasing the temperature and the modifier content, the extraction can be sufficiently selective, but the conversion rate can be correspondingly high. The optimized conditions are listed below:
  • Nozzle temperature during extraction 90 ° C
  • a lecithin with two oleic acids dioleylphosphatidylcholine was chosen as the second model substance. This was implemented under the conditions optimized for triolein. The reaction kinetics can be seen in FIG. 5: If one compares the kinetics with that for the transesterification of the triolein, it is found that the reaction proceeds more slowly under the same conditions for the phospholipid (FIG. 5).
  • the solvent strength of the fluid can be adjusted. This allows selective extraction of the product ethyl ester.
  • the reaction rate is increased by increasing the reaction temperature and the ethanol content, while at the same time keeping the density so low that the selectivity of the extraction / chromatography is retained.
  • the SF-REC conditions can thus be optimized so that a quantitative transesterification from triolein to oleic acid ethyl ester can take place.
  • Example 13 Application to a biological source / matrix: dry biomass GLA strain:
  • a freeze-dried (lyophilized) powder which is obtained from the fermentation of microorganisms, is referred to as dry organic matter.
  • the first dry biomass comes from a so-called GLA strain. This contains a particularly large amount of ⁇ -linolenic acid (GLA), which is usually bound in phosphatides.
  • GLA ⁇ -linolenic acid
  • the n-heptane solution obtained from the second step was analyzed by GC-MS to identify the fatty acid ethyl esters present.
  • the chromatogram and a section are shown in FIG. 6.
  • fatty acid ethyl esters in addition to the GLA-EE, a number of other fatty acid ethyl esters can be found in FIG. 6, in particular oleic and linoleic acid ethyl esters (18: 1-EE and 18: 2-EE), but also C14, C16 and C20 fatty acids.
  • the aqueous suspension of the biomass (without lyophilization) is called the bio-moist mass. If these are converted directly in an SF-REC, the excess water does not cause the lipids to be transesterified into the ethyl esters, but instead hydrolyses them to the free acids. This is confirmed by the analysis using GC-MS (FIG. 7).
  • the SF-REC was carried out under the following conditions: Flow: 1.0 ml / min
  • the lyophilized biomass of the DHA strain mainly contains docosapentaenoic acid (DPA 22: 5).
  • the total lipidanteii of the dry biomass is about 40% by weight. This in turn contains 40% of the fatty acids DHA.
  • the lipid content is almost exclusively in the form of triglycerides.
  • the dry biomass was ground in a mortar with ten times the amount of acidic aluminum oxide activity Super I, which was coated with 15% ethanol, and filled into the reactor. The SF-REC was carried out under the following conditions:
  • the amount of DHA-EE was determined using a DHA standard (90%, KD-PHARMA, Bexbach).
  • both the lyophilized and an aqueous suspension of the biomass could be implemented.
  • the ethyl esters are formed in a transesterification reaction with ethanol
  • the free acids are formed by hydrolysis.
  • the fatty acids as ethyl esters could also be obtained from the dry biomass of the DHA strain, which mainly contains docosahexaenoic and docosapentaenoic acid.
  • Example 16 Application of SF-REC - extraction of valuable biogenic substances from algae: The aim of the experiments carried out here is to examine the possibility of extracting valuable substances from algae using various extraction methods. The main focus is on polyunsaturated fatty acids, which are found in algae in quite high concentrations. Arachidonic acid (5,8,11, 14-eicosatetraenoic acid; ERA) and eicosapentaenoic acid (EPA) are particularly worth mentioning here. In addition, unsaturated fatty acids with 18 carbon atoms such as gamma-linolenic acid (GLA) are of particular importance.
  • GLA gamma-linolenic acid
  • algae In addition to these substances, depending on the strain, algae also contain a number of dyes such as chlorophyll, xanthophylls (carotenoids), but also some specific ones, such as the class of phycobiliproteins. In red algae (Rhodophytha) in particular the phycoerythrins are found.
  • SFE with pure C0 2 represents the first step in the extraction of fatty acids from algae.
  • Polar compounds can then be extracted in the second step by using ethanol as a modifier.
  • An extraction of polar compounds, especially those that show good water solubility, cannot be done with CO 2 , so that these can then be extracted with water in a third step.
  • the chlorophyll With increasing pressure and also by using 10% ethanol as a modifier, the chlorophyll can be removed from the algae material almost completely after several hours of extraction.
  • Example 20 Extraction in the presence of an adsorbent / in-situ transesterification by SF-REC:
  • the algae were now ground with an adsorbent (aluminum oxide) instead of sea sand and extracted under the same conditions as above. It is found that the fractions which were obtained without a modifier are not green, but only slightly yellow.
  • the UV spectrum up to 600 nm chlorophyll could be recorded using a diode array detector.
  • the yellow fraction therefore contains no chlorophyll.
  • the peak at 3.1 min was identified as yellow dyes by moving a thin-layer plate past the outlet of the SFC at a defined speed. A bluish fluorescent spot was found on it at 3.1 min under UV light. It is thus possible to transesterify the valuable fatty acids from the algae in situ and to isolate them as ethyl esters without chlorophyll being extracted.
  • the direct extraction of the algae with ethanol provides green solutions.
  • the chlorophyll can therefore be removed from the algae with ethanol.
  • Example 22 Extraction with water A purple solution can be obtained from water both from the algae “pre-cleaned” with SFE and from the untreated algae. When excited with UV light (366 nm), this solution shows orange fluorescence. The purple dye can thus be separated from the fats and chlorophyll in an aqueous step.
  • the aluminum oxide initially used can be separated from the algae residues in water by sedimentation. It shows a mint green color, which suggests adsorbed chlorophyll.
  • the color of the yellow solution can be explained in the spectrum by the flank, which extends from the UV range to 500 nm. An absorption maximum can be seen in the UV range at 282.4 nm. The cause of the green coloration of the chlorophyll solution is the absorption maximum at 662.6 nm. Numerous maxima of lower height can be found in the range of visible light. The highest maximum is 410 nm. The purple solution absorbs most strongly in the visible range at 545.5 nm (according to the literature, the algal dye B-phycoerythrin has an absorption maximum at 546 nm). In the UV range there is a maximum at 272.2 nm, which may be due to light scattering from the slightly cloudy solution. The examples show that extraction and separation of the desired substances, for example from the given algae, is possible.
  • the valuable polyunsaturated fatty acids can be obtained as ethyl esters. They are extracted along with yellow dyes, which are probably xanthophylls. These can be processed in a further processing step e.g. can be separated using preparative SFC.
  • the disruptive chlorophyll can either be removed from the matrix using SFE with more than 10% ethanol as a modifier and higher pressure (higher density) or by direct extraction with ethanol. The purple dye of the algae is not extracted.
  • the advantages of the methods used lie in the fact that any contact with toxic solvents can be avoided, so that the substances obtained are available for pharmaceutical or food technology use.
  • the conversion of the triglyceride triolein to oleic acid ethyl ester served as a model example for the transesterification using ethanol on acidic aluminum oxide.
  • the SF-REC was optimized for this example in terms of equipment conditions and process control. An almost quantitative transesterification was achieved with a yield of 93%.
  • the SF-REC could also be carried out for the model substance of the phosphatide dioleylphosphatidylchoii ⁇ .

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur präparativen Darstellung von Fettsäureestern und Fettsäuren, vorzugsweise ungesättigten Fettsäureethylestern, aus biologischen Quellen mit Hilfe einer kontinuierlichen kombinierten in-situ-Extraktion-Reaktion-Chromatographie, die dadurch gekennzeichnet ist, daß ort- und zeitgleich in Gegenwart eines verdichteten Gases einschließlich eines 0,5 - 5 %-igen Stroms niederer Alkohole als Modifier sowie in Gegenwart eines inerten Katalysators eine vollständige Umesterung der Fettsäuren aus ihren nativen Fettsäurevorkommen erfolgt, welche unter den angegebenen Bedingungen selektiv desorbiert und eluiert werden.

Description

Beschreibung
Verfahren zur präparativen Gewinnung von Fettsäuren aus Biomasse durch in situ - Extraktion - Reaktion - Chromatographie mit verdichteten Gasen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur präparativen Herstellung von Fettsäuree- stern - zur Gewinnung von Fettsäuren, vorzugsweise mehrfach ungesättigten Fettsäuren (engl. PUFA) - aus biologischen Quellen durch eine kontinuierliche in situ- Extraktion-Reaktion-Chromatographie mit verdichteten Gasen.
In der Natur kommen PUFAs neben der Ölsäure in relativ hohen Konzentrationen in Leinöl, Nußöl, Mohnöl, Hanföl und in Fischölen vor. Es wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, diese wertvollen Substanzen aus solchen biologischen Quellen zu gewinnen und in mehr oder weniger hoher Reinheit zu isolieren. Da die PUFAs aber meist chemisch als Ester gebunden in Lip(o)iden vorliegen, muß neben einer Extraktion eine Überführung in die freien Säuren (Hydrolyse) oder in entspre- chende Monoester (Umesterung) erfolgen.
Nachdem die biologischen Quellen, insbesondere Fischöl, nicht unbegrenzt zur Verfügung stehen, ist es von Interesse die Isolierung der PUFAs aus Mikroorganismen wie Bakterien, Algen etc., die diese Fettsäuren innerhalb der Zellen oder in den Zellmembranen als Lipide gespeichert haben, vorzunehmen.
Das Interesse der Industrie an technischen Verfahren zur präparativen Herstellung von Fettsäureestern, insbesondere von ernährungsphysiologisch wichtigen Fettsäureestern, vorzugsweise mehrfach ungesättigte Fettsäureestern, ist groß. Lip(o)ide enthalten Fettsäuren zumeist gebunden in Glyceriden (Mono-, Di-, Trigiyceriden), Phosphatiden, Glykolipiden und Aminolipiden. Diese gebundenen Fettsäuren sowie freie native Fettsäuren und ihre Derivate unterscheiden sich zum einen in der Häufigkeit ihres Vorkommens in biologischen Quellen, zum anderen in ihrer Wirkung auf den menschlichen Organismus.
Die Gewinnung von nativen Fettsäuren und ihren Derivaten aus biologischen Quei- len erfolgt neben klassischer Lösemittelextraktioπ der entsprechenden Lip(o)ide, insbesondere durch Extraktion mit Hilfe verdichteter Gase (z.B. überkritisches Kohlendioxid, etc). Diese als SFE (supercritical fluid extraction) bezeichnete Methode stellt unter Wahrung der biologischen Kompatibilität ein schonendes vielbeschriebenes Extraktionsverfahren dar, welches in der Routineanalytik und in der Verfah- renstechnik Anwendung findet.
Eine direkte chromatographische Trennung extrahierter Lip(o)ide in die einzelnen Triglyceride ist nicht durchführbar, da meist eine Permutation von zahlreichen natürlich vorkommenden Fettsäuren an den drei Positionen des Triglycerids zu einer Vielzahl von Verbindungen führt, die nur schwer chromatographisch zu trennen sind.
Daher erfolgt die Extraktion der Fettsäuren mittels einer vor- oder nachgestellten Reaktion durch Spaltung der Lip(o)ide (sog. Fettspaltung) in die einzelnen Fettsäuren mittels (katalytischer) Umesterung in die Ester niederer Alkohole oder mittels (katalytischer) Hydrolyse zu den freien Säuren, auch in Gegenwart eines verdichte- ten Gases im Reaktionsmedium (SFR= supercritical fluid reaction).
Hierbei dienen als Katalysatoren organische Säuren (Ameisensäure, Essigsäure, Zitonensäure, usw. "Coulping chemical derivatisation reactions with supercritical fluid extraction", J.A. Fields, J. Chromatogr. A, 785 (1997), S. 239-249) sowie feste Katalysatoren (z.B. lonenaustauscherharze (C. Vieville, Z. Mouloungui, A. Gaset; Colloq. - Inst. Natl. Rech. Agron. (1995), 71 (Valorisations Non-Alimentraires des Grandes Productions Agricoles), 179-82.; saures Aluminiumoxid (B.W. Wenclawiak, M. Krappe, A. Otterbach; J. Chromatogr. A (1997), 785, 263-267)) oder Kombinationen davon (C. Vieville, Z. Mouloungui, A. Gaset; Ind. Eng. Chem. Res. (1993), 32(9), 2065-8).
Bekannt sind ebenfalls enzymatische Reaktionen mittels Lipasen, die entweder in Lösung oder immobilisiert die Fettspaltung durchführen mit anschließender Extraktion in Gegenwart überkritscher Gase (R. Hashizume, Y. Tanaka, H. Ooguchi, Y. No- guchi, T. Funada; JP-196722 und A. Marty, D. Combes, J.S. Condoret; Prog. Bio- technol. (1992), 8 (Biocatalysis in Non-conventional Media), 425-32). Prinzipiell können die SFE und SFR Verfahren als kontinuierliches (continious flow) oder diskontinuierliches (batch) Verfahren ausgeführt werden.
King et. al führen eine Extraktion und Umesterung in Gegenwart verdichteter Gase als diskontinuierliches Verfahren aus (J.W. King, J.E. France, J.M. Snyder; Freseni- us J. Anal. Chem. (1992), 344, 474-478). Hierbei findet zuerst eine Extraktion von Lipiden aus einer biologischen Quelle (hier: Samenkörner) statt, mit daran anschließender Umesterung am Katalysator zu Methylestern. Der Aluminiumoxid-Katalysator wird mit Methanol physisorbiert. Nachteilig ist jedoch das aufwendige Einsetzen der Proben an den Katalysator, wodurch eine Reaktion nur an der Grenzfläche Kataly- sator/Probe erfolgt. Dies ist im Rahmen einer präparativen Umsetzung unzureichend.
King et al. beschreiben eine nahezu quantitative Umsetzung (>98%) von Triglyceri- den zu den Methylestern an immobilisierter Lipase, welches als kontinuierliches Verfahren durchgeführt wird. Hierbei werden Kornöl und als Modifier Methanol dem Kohlendioxid zugepumpt. Dies wird ebenfalls für konsistente biologische Quellen wie Sojaflocken ausgeführt (M.A. Jackson, J.W. King; J. Am. Oil. Chem. Soc. (1996), 73(3),353-6).
Die Verwendung von Lipasen im kontinuierlichen Verfahren hat jedoch den Nachteil der zu geringen zeitlichen Umsatzrate.
Alle im Stand der Technik beschriebenen Ausführungen haben den Nachteil, daß sie eine räumliche Trennung von Extraktion und Reaktion aufweisen und somit keine in situ Voraussetzungen erfüllen und daher keine quantitative Umsetzung erzielen. (Vgl. ebenfalls im Fall einer Veresterung JP 61261398, JP 07062385 A2 und im Fall einer Hydrolyse K. Fujita, M. Himi; Nippon Kagaku Kaishi (1995), (1 )). Zudem liegt im Stand der Technik keine vorteilhafte kostengünstige Kombination von Reaktion, Extraktion und Chromatographie vor.
Die vorliegende Erfindung hat zur Aufgabe, ein Verfahren zur präparativen Herstellung von ungesättigten und gesättigten Fettsäureestern und deren selektiven Isolierung aus biologischen Quellen bereitzustellen. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Fettsäureestern aus biologischen Quellen mittels einer kontinuierlichen in-situ Extraktion-Reaktion-Chromatographie bereitgestellt wird. In Gegenwart eines verdichteten Gasstromes und eines 0,5 bis 5 %-igen C1-C5 Alkoholmodifier
(a) erfolgt die Reaktion an einem inerten Katalysator in vollständigem Kontakt mit der biologischen Quelle;
(b) erfolgt die Chromatographie der Reaktionsprodukte am inerten Katalysator aus (a), welcher chromatographische Retention aufweist und ausschließlich die Reaktionsprodukte desorbiert und eluiert;
(c) erfolgt die Extraktion der desorbierten und eluierten Reaktionsprodukte aus (b).
Das vorliegende Verfahren bringt Vorteile gegenüber bekannten Ausführungen:
Die hergestellten Reaktionsprodukte sind gesundheitlich und nahrungsmittelchemisch unbedenklich, da
1.) bevorzugt Ethanol als Modifier und Reaktionspartner sowie
2.) festes inertes Aluminiumoxid als Katalysator/stationäre Phase und
3.) Kohlendioxid als Reaktions-/Extraktionsmedium bzw. mobile Phase verwendet werden. Weder die Edukte noch die Produkte kommen somit zu irgendeinem Zeitpunkt des Verfahrens mit toxischen Substanzen in Kontakt.
Kohlendioxid dient als Schutzgasatmosphäre zur Verhinderung von Oxidationen und der schonenden Extraktion und Eluation.
Im Gegensatz zu den erwähnten Verfahren ist im vorliegenden Fall die Toxizität der verwendeten Stoffe so gering, daß diese bedenkenlos zur Herstellung von Nahrungsmittelzusatzstoffen oder Pharmaprodukten herangezogen werden können.
Die Reaktionsprodukte fallen in reiner Form als Substanz oder in hoher Konzentra- tion in einem geeigneten Lösemittel an und können leicht weiterverarbeitet werden. Zudem werden die Reaktionsprodukte in dem erfindungsgemäßen Verfahren von den Edukten, den Zwischen- bzw. Nebenprodukten selektiv abgetrennt.
Das Verfahren kann kontinuierlich ausgeführt werden. Bei flüssigen Edukten kann eine Zuspeisung in das Fließsystem erfolgen.
Aufgrund der vorzugsweisen Verwendung des kostengünstigen Aluminiumoxids als inerter Katalysator/stationäre Phase ist ein wirtschaftlich sinnvoller, großtechnischer, präparativer Maßstab durchführbar.
Die biologische Quelle kann direkt eingesetzt werden. Eine Limitierung der Menge an Biomasse aus der biologischen Quelle ist nicht erforderlich und daher für eine großtechnische Nutzung geeignet.
Das Verfahren vereint und kombiniert die Verfahreπsstufen Extraktion, Reaktion und Chromatographie zu einer funktionellen Einheit und kann daher die Kosten für eine großtechnische Nutzung senken.
Durch die Führung des Verfahrens als kontinuierliches Fiießsystem, wird das ge- wünschte Produkt permanent dem Reaktionsgieichgewicht entzogen und erlaubt eine theoretische Ausbeute von nahezu 100 %. Dies ist in einem diskontinuierlichen (Batch) Verfahren oder durch klassische organische Umesterung unmöglich.
„In situ-Extraktion-Reaktion-Chromatographie" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, daß an Ort und Stelle die Fettsäureester aus der biologischen Quelle mittels ver- dichteter Gase durch eine Reaktion bereitgestellt, chromatographiert und extrahiert werden (kurz: SF-REC).
Hierzu bedarf es eines spezifischen Katalysators, der an Ort und Stelle mit der biologischen Quelle verrieben und/oder vermengt -also vermischt - wird, und die Spaltung der Lip(o)ide unter Reaktion (Umesterung) mit einem Alkohol zum Fettsäu- reester bewirkt. Zudem dient der erfindungsgemäße Katalysator als stationäre Phase in der die hergestellten Fettsäureester selektiv vom Katalysator desorbiert und in Gegenwart des verdichteten Gases eluiert werden. Daher muß der erfindungsge- mäße Katalysator eine chromatographische Retention aufweisen, bei welcher nicht das Produkt adsorbiert.
Die erfindungsgemäßen Parameter (Bedingungen) sind so gewählt, daß die Lip(o)ide auf dem Katalysator verbleiben und selektiv die Fettsäureester eluiert werden. Diese spezifischen Parameter werden in den Beispielen erläutert.
Das erfindungsgemäße Verfahren der in situ-Reaktion-Extraktion- Chromatographie wird als kontinuierliches Verfahren ausgeführt. Es kann ebenfalls synonym vom Begriff „(continious) Batch Flow Verfahren" Gebrauch gemacht werden. Im Sinne dieser Erfindung wird der Begriff kontinuierliches Verfahren als Durchflußsystem ver- standen, in dem unter fortwährender Reaktion im Gas/Modifierstrom die Reaktionsprodukte an der festen oder konsistenten biologischen Quelle in Kontakt mit dem inerten Katalysator chromatographiert und extrahiert werden. Eine flüssige biologische Quelle kann dem Gas/Ethanol Strom zugegeben werden und gewährleistet ein kontinuierliches Verfahren.
Der Begriff „verdichtete Gase" im Sinne dieser Erfindung umfaßt flüssige, überkritische sowie zweiphasige bzw. subkritische Gase oder Gasgemische. Es werden hier ausdrücklich die Gase einbezogen, die dem Fachmann auf dem Gebiet der SFE- und SFR-Technik bekannt sind. Insofern dient das verdichtete Gas zur Extraktion und wird als Reaktionsmedium verwendet. Im Sinne dieser Erfindung dient das Gas auch als mobile Phase und wird als Extraktionsmedium verwendet. Besonders bevorzugt ist verdichtetes Kohlendioxid.
Im Sinne dieser Erfindung bedeutet „Modifier" ein Zusatzstrom in Gegenwart des verdichteten Gases. Im Rahmen dieser Erfindung werden 0,5-5 Vol. % an niederen Alkoholen eingesetzt. Bevorzugt ist ein Ethanol-Modifier von 0,5-5 Vol. %. Beson- ders bevorzugt sind 1 Vol.% Ethanol, vorzugsweise technischer Ethanol. Im Sinne dieser Erfindung dient der Modifier als Reaktant zur Umesterung von Lip(o)iden am inerten Katalysator.
Im Sinne dieser Erfindung sind Fettsäureester erhältlich aus allen verzweigten und unverzweigten Fettsäuren sowie Fettsäurederivate, wie Hydroxifettsäuren, welche eine Kohlenstoffkette von mindestens 12 C-Atomen aufweisen. Bevorzugt sind Fettsäurester als Fettsäureethylester, da der zur Herstellung benötigte Alkohol von den niederen Alkoholen die geringste Toxizität aufweist. Die Erfindung ist ausführbar für unverzweigte oder verzweigte C1-C5 Alkohole.
Edukte sind vorzugsweise Lip(o)ide aus biologischen Quellen und andere gebundene Fettsäuren; Reaktionsprodukte sind Fettsäureester. Da vorzugsweise Ethanol als Reaktant und Modifier für die Reaktion (Umesterung) verwendet wird, werden vorzugsweise Fettsäureethylester erhalten. Selbstverständlich werden freie Fettsäuren und ihre Salze in den biologischen Quellen in ihre Fettsäureester überführt.
Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet vollständige Umsetzung die Überführung aller in den Edukten enthaltenen Fettsäuren in die entsprechenden Fettsäureethylester unter fortwährendem Verbleib (Adsorption) nicht abreagierter Edukte auf dem inerten Katalysator.
Inerter Katalysator im Sinne dieser Erfindung bedeutet, daß dieser Katalysator im vollständigen Kontakt mit der biologischen Quelle zum einen die Reaktion (Umesterung) in die Reaktionsprodukte beschleunigt und zum anderen als stationäre Phase dient. Hierzu muß der Katalysator chromatographische Retention aufweisen. Der Katalysator darf auf die biologische Quelle nicht toxisch wirken und steht daher der Reaktion inert zur Verfügung. Als vorteilhaft und kostengünstig hat sich handelsübli- eher Aluminiumoxid erwiesen, welcher zudem mit der biologischen Quelle leicht vermengt und / oder verrieben werden kann, ggf. mit weiteren Hilfs- und Zusatzstoffen (z.B. Seesand).
Im Prinzip kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren jede beliebige biologische Quelle verwendet und eingesetzt werden. Vorteilhaft sind selbstverständlich biologi- sehe Quellen, die reich sind an nativen Fettsäuren als solche oder in Form von Fettsäureestern, insbesondere als Lip(o)ide. Werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren gewünscht, so sind entsprechende biologische Quellen einzusetzen. Der Begriff biologische Quelle ist daher bevorzugt auf leicht kultivierbare Mikroorganismen anzuwenden. Hierbei sind bevorzugt Mikroorganismen mit einem hohen Gehalt an hochungesättigten Fettsäuren (PUFA), die leicht aufgeschlossen werden kön- nen. Sei es chemisch, enzymatisch, vorzugsweise jedoch mechanisch. Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen mit einem Fettsäurespektrum, welches überwiegend eine oder nur einige wenige gebundene oder native Fettsäuren enthalten. Hier kommen vorzugsweise Organismen, wie folgt, in Betracht:
(Als zugrundeliegende Systematik für die Gruppe 1 : Handbook of Protoctista, Margulis, Corliss, Melkonian, Chapman, Jones & Bartlett Publishers, Boston (1990) und für die Gruppe 2; Industrial Applications of Single Cell Oils, Kyle & Ratledge, American Oil Chemist' Society, Champaign, Illinois, 1992)
1. Gruppe: Microalgen und Protozoen (=Protisten)
- Phyium: Ciliophora
Gattung: Tetrahymena, Colpidium, Parauronema, Paramecium
- Phyium: Labyrinthulomycota
Gattung: Ulkenia, Thraustochytrium, Schizochytrium
- Phyium: Dinoflagellata
Gattung: Crypthecodinium, Gymnodinium, Gonyoaulax
- Phyium: Euglenida Gattung: Euglena
- Phyium: Bacillariophyta Gattung: Nitzschia, Navicula, Cyclotella
2. Gruppe: Pilze
Gattung: Mortierella, Cuπninghamella, Mucor, Phytium
3. Gruppe: Bakterien
Gattung: Butyrivibrio, Lactobacillus Figur 1 beschreibt den schematischen Aufbau und Anordnung der funktionelleπ Einheiten, wobei die Begriffe folgende angegebene Bedeutung haben:
„Katalysator": Stahlkammer gefüllt mit Aluminiumoxid. Ort der in situ-Extraktion- Reaktion-Chromatographie.
„Restriktor": Ventil oder enge Kapillare, die einem strömendem Medium einen Widerstand entgegensetzt und das Drucksystem reguliert in Gegenwart der „C02-", „Proben-", „Ethanol"-pumpe.
Weitere Parameter sind den Beispielen zu entnehmen.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung ohne dieselben auf die Erfindung zu beschränken und geben insbesondere die Bedingungen an, bei denen eine selektive Extraktion der hergestellten Fettsäureester erreicht werden kann.
Beispiele
Beispiel 1
Allgemeine Bedingungen:
Druck: 70 - 400 bar
Flußr 0,5 - 4 ml/min
Temperatur: 40 - 150°C
Alkohol: 0,5 vol% bis 5 vol% Ethanol
Katalysator Trennmedium: 7g Aluminiumoxid A zur Säuleπchromatographie (ICN, sauer, Aktivität I) (eventuell auch anderes, z.B. basisch, neutral, belegt mit Säuren, verschiedene Korngrößen oder auch auf Kieselgel-, Zirkonoxid- oder sonstiger Basis) Beispiel 2:
Im unteren Chromatogramm der Figur 2 ist die Analyse (an Aminopropylphase 4,6x500mm, 10 μm; 5% Ethanol als Modifier, 150 bar 40°C) der aus dem System während des Prozesses stammenden Substanzen zu erkennen. Es wird unter den gegebenen Bedingungen (1 % EtOH) nur der Ethylester dem System entnommen. Das obere Chromatogramm zeigt die dem System entnommenen Substanzen bei Zuspeisung von 10% EtOH. Unter diesen Bedingungen werden alle Substanzen (außer Glycerin) aus dem System eluiert. Dies kommt dem Abbruch der Reaktion gleich. Man erkennt Peaks für den Ethylester, das Triglycerid und die entsprecheπ- den Mono- und Diglyceride
Dieses Beispiel wurde unter folgenden Bedingungen ausgeführt:
Gerät : HEWLETT-PACKARD SFE Module 7680T
Probe: Triolein (97% TLC), Fluka
Extraktionskammer/Reaktor: ca. 0,2 g Probe
ca. 7 g Aluminiumoxid A zur Säulen- chromatographie(ICN, sauer, Aktivität I)
Bedingungen: Druck: 200 bar
Fluß: 4,0 ml/min (Fluid)
Modifier: 1 vol% EtOH
Temperatur: 80°C
Falle: Falle mit Glaskugeln (0,25 - 0,5 mm);
Extraktionsdauer: 2 Minuten statisch; 10 Minuten dynamisch; danach Spülung der Falle mit n-Heptan (etwa 1 ml), davon 8 Wiederholungen; anschließend Reaktionsabbruch durch Extraktion aller Substanzen (außer Glycerin) unter gleichen Bedin- gungen, jedoch mit 10% EtOH, 60 Minuten. Beispiel 3: Analytik mittels SFC und GC-MS:
Um den Reaktionsverlauf bei den weiteren Optimierungsschritten zu untersuchen werden zwei Techniken verwendet: Zur qualitativen Analyse und zur Identifizierung der Produkte wird die GC-MS eingesetzt. Zur Quantifizierung dient die SFC.
Ein qualitative Betrachtung der entstandenen Fettsäureethylester ist zur Bestimmung des Fettsäurespektrum besonders für die Realproben wichtig. Dies wird mittels GC-MS untersucht. Dazu wurden die in n-Heptan gelösten Ester an einer DB5 Säule getrennt und durch ihre Massenspektren identifiziert. Die genauen chromatographischen Bedingungen sind an entsprechender Stelle aufgeführt.
Beispiel 4: Quantitative Analyse mittels SFC:
Die quantitative Analyse der gebildeten Ethylester und der noch nicht umgesetzten Triglyceride dient zur Bestimmung der Ausbeute der SF-REC. Dabei stellt sich das Problem, alle Produkte (Ethylester, Mono- und Diglyceride; nicht Glycerin) und das Edukt (Triglycerid) mit einer chromatographischen Methode bestimmen zu können. Im allgemeinen können in der GC nur leichtflüchtige Ester (Methyl- oder Ethylester) aber nicht die schwerer flüchtigen Glyceride direkt bestimmt werden. Die Glyceride müssen daher erst in die Ester niederer Alkohole überführt werden. In der HPLC stellt sich das Problem der UV-Detektion. Die Glyceride und die Ethylester müssen z.B. in die Phenacylester umgewandelt werden. Mittels SFC an Aminophasen und Ethanol als Modifier lassen sich die Ethylester und die Glyceride trennen und auch underivatisiert bei 210 nm detektieren. Damit ist eine direkte Ermittlung der Umsatzrate auf schnelle Weise möglich.
Für die Quantifizierung der Umsetzung in der Modellreaktion (Umesterung von Triolein zu Ölsäureethylester) wurde mit folgender Methode gearbeitet:
System: HEWLETT-PACKARD SFC Chromatograph
Säule: BISCHOFF AMP Prontosil-120 3 μm 200 x 4,6 mm Flußrate: 3,0 ml/min
Enddruck: 150 bar
Temperatur: 35°C
Modifier: 3% Ethanol Injektion: 5 μl n-Heptan Lösung
Detektion: UV 210 nm (DAD)
Die Kalibriergeraden wurden für die beiden Standards mit
Ölsäureethylester 99% (GC) (FLUKA) Triolein 97% (DC) (FLUKA)
bestimmt.
Beispiel 5: Bestimmung der Reaktionskinetik:
Die SF-REC wurde am kommerzielle HEWLETT-PACKARD System SFE Module 7860T durchgeführt. Zur Bestimmung der Reaktionskinetik wurde nach bestimmten Zeitabständen die Umsatzrate überprüft: Nach dem Start der Reaktion, d.h. dem Einbringen der Probe in das Reaktionsgefäß mit Katalysator und Einstellung der Bedingungen (Druck, Temperatur, Fluß usw.) am Gerät, wurden kontinuierlich über einen gewissen Zeitraum die aus dem Reaktionsgefäß entnommenen Substanzen aufgefangen. Dieser Auffangprozeß mittels Falle mit festem Sorbens wird in zwei Schritten ausgeführt: Die Extraktion der Substanzen aus der Reaktionskammer ver- läuft in einem sog. dynamischen Schritt, d.h. das Extraktionsmedium fließt durch das System, löst die Probe und scheidet sie, nachdem das Fluid entspannt wurde, auf dem festen Träger der Falle ab. Diese wird in einem zweiten Schritt mit einem geeigneten Lösemittel (hier: n-Heptan) gespült und die extrahierten Substanzen in ein Auffanggefäß überführt. Dieser Spülschritt dauert etwa sechs Minuten. Während dieser Zeit ist der Fluß des Fluides angehalten, aber Druck und Temperatur in der Reaktionskammer bleiben erhalten. Die Reaktion läuft in dieser Zeit weiter. Diesen Schritt kann man daher als zusätzlichen sog. statischen Schritt bezeichnen. Zur Aufnahme der Kinetik wird nach bestimmten Zeiten die Falle gespült (s.o.), um festzustellen, wieviel Produkt sich nach dieser Zeit gebildet hat. Wenn im folgenden die Abszisse des Reaktionsverlaufes mit "Zeit [min]" beschriftet ist, so bedeutet dies, daß nur die dynamischen Schritte aufsummiert wurden. Zwei verschiedene Reaktionen, bei denen die gleiche zeitliche Abfolge der Schritte vorliegt, sind daher vergleichbar. Die Beschriftung der Zeit-Achse mit "Gesamtreaktionszeit [min]" bedeutet, daß zu jedem dynamischen Schritt die sechs Minuten des statischen Verlaufs der Reaktion während des Spülvorganges hinzuaddiert wurden. Dies ist beim Vergleich der aufgenommenen Kinetiken zu beachten!
Die Auffanggefäße (Vials) werden automatisch befüllt. Durch Wiegen der Vials vor und nach dem Schritt kann die Menge der n-Heptan-Lösung bestimmt werden. Aus den jeweiligen Vials für jeden Reaktionsschritt wird für die Quantifizierung dreimal injiziert. Zur Auswertung wird der Mittelwert der Peakflächen der drei Injektionen gebildet. Aus der Kalibriergeraden wird die Konzentration und mit der Menge der Lösung die Menge an Substanz berechnet. Für die Quantifizierung des mitextrahierten Trioleins wird auf die eingesetzte Menge Triolein bezogen. Aus dieser berechnet sich die theoretisch erreichbare Menge an Ölsäureethylester (EE), was 100% Reaktionsausbeute entspricht. Die ermittelte Menge 18:1-EE wird darauf bezogen.
Beispiel 6: Optimierung der Extraktions/Reaktions-Bedingungen:
Für die Umesterung mittels SF-REC können die Bedingungen in weiten Bereichen variiert werden. Neben technischen Details wie der Auffangtechnik und der "Probenvorbereitung" (z.B. wieviel Katalysator pro Menge Probe und an welcher Stelle die Probe sich im Reaktor befindet) können die Reaktions- bzw. Extraktions- bedingungeπ wie Druck, Flußrate, Modifiergehalt und Temperatur unabhängig von- einander variiert werden. Damit stehen eine Reihe von Parameter zur Optimierung der Ausbeute zur Verfügung. Betrachtet man den apparativen Aufbau (Figur 1 ), so ergeben sich daraus die einzelnen Punkte wie folgt: Tabelle 1 :
Beispiel 7: Auffangtechnik:
Die verwendete Auffangtechnik ist entscheidend dafür, ob eine möglichst quantitative Wiederfindung zu erreichen ist. Nach einer Extraktion mit sub- oder überkritisch Kohlendioxid muß dieses Medium entspannt werden. Der Druckabfall findet an einem sog. Restriktor statt. Dort wird das C02 gasförmig und verliert dabei die Fähigkeit Proben zu lösen. Diese scheiden sich nun als kleine Tröpfchen oder Partikel ab, die möglichst vollständig aufgefan- gen werden sollen. Prinzipiell stehen im analytischen Maßstab zwei Methoden zur Wahl: Auffangen an einem festen Sorbens oder in einem geeigneten Lösemittel. Im ersten Fall wird der Gasstrom durch eine sog. Falle, ein Rohr gefüllt mit dem festen Sorbens, geleitet. Die Probe wird dabei an dem Sorbens abgeschieden. Dies kann zum einen durch rein mechanischen Kontakt, z.B. an Glaskugeln (0,1-0,25 mm Durchmesser) geschehen. Die Falle kann gekühlt werden, um ein Verdampfen der Probe zu verhindern oder die Probe zu kondensieren, ihre Viskosität zu erhöhen bzw. sie auszufrieren. Zu beachten ist, daß ein "Abblasen" der Probe in Form von Tröpfchen vom Falleπmaterial durch den schnellen Gasstrom verhindert werden muß. Dieser Punkt stellt sich insbesondere dann als problematisch dar, wenn mit Modifier gearbeitet wird. Dieser scheidet sich ebenfalls als Flüssigkeit ab. Da die Flüssigkeitsmenge die Aufnahmekapazität der Falle übersteigt, kommt es zu Verlusten, weil die im Modifier gelöste Probe mit von der Falle "geblasen" wird. Daher muß bei Zusatz von Modifier die Falle über den Siedepunkt des Modifiers erhitzt werden, so daß dieser wie C02 gasförmig vorliegt und die Probe nicht mehr lösen kann. Bei dieser Temperatur kann es aber bedingt durch die Flüchtigkeit der Probe zu Verlusten durch Verdampfen kommen.
Die Probe wird nach dem sie auf der Falle aufgefangen wurde in einem Spülschritt (Rinse) mit einem geeigneten Lösemittel (Rinse-Solvent) vom festen Sorbens elu- iert.
Die zweite Möglichkeit stellt das Einleiten des entspannten Gases, in dem kleine Probentröpfchen bzw. -partikel mitgerissen werden, in ein geeignetes Lösemittel dar. Die Probe kann sich dabei im Lösemittel lösen, wenn sie genügend Zeit hat mit ihm in Kontakt zu treten. Diese Kontaktzeit hängt von der Strömungsgeschwindigkeit des C02 ab. Vorgelegt wird das Lösemittel in einem Kolben und der Gasstrom wird mittels einer Kapillare hindurchgeleitet. Bei dieser Methode ergeben sich prinzipiell zwei Probleme: Zum einen besteht die Möglichkeit, daß sich Teile der Probe auf dem Weg durch die Kapillare nach dem Restriktor abscheiden. Dies wird aber durch Modifierzusatz verhindert, da dieser als Flüssigkeitströpfchen die Kapillare hinter dem Restriktor spült. Eine Zuspeisung des Lösemittels direkt am Restriktor spült ebenso die Probe in die Vorlage. Das zweite Problem entsteht besonders beim Auffangen über einen längeren Zeitraum durch das Verdampfen des vorgelegten Lösemittels. Ein Zuspeisen des Lösemittels mit der Menge pro Zeit, die auch pro Zeit verdampft kann die Menge des Lösemittels in der Vorlage zwar konstant halten, verhindert aber nicht die Verluste durch Verdampfen der Probe selbst. Eine Verringerung der Vorlagetemperatur wirkt dem entgegen. Jedoch darf die Temperatur nicht soweit verringert werden, daß es zu Blockierungen der Kapillare durch Ausfrieren des C02 kommt (z.B. durch Aceton/Trockeneis).
Die Wiederfindungsrate von 18:1-EE (Ölsäureethylester, das Produkt der SF-REC mit der Modellsubstanz Triolein) wurde unter gleichen Bedingungen für die ver- schiedenen Auffangtechniken bestimmt.
Dazu wurde eine bestimmte Menge eines Standards von 18:1-EE in einer Extraktionskammer (Thimble) auf einem inerten Trägermaterial (Seesand) eingewogen. Die Extraktion wurde unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt, die auch später für die SF-REC benutzt werden:
System: HEWLETT-PACKARD SFE Module 7680T
Druck: 198 bar
Temperatur: 90°C
Dichte: 0,53 g/ml Modifier: 1 % EtOH
Fluß: 4,0 ml/min
Extraktionsdauer: 30 Minuten dynamisch Als Fallentechnik mit festen Sorbentieπ wurden zum einen Glaskugeln mit einen Durchmesser von 0,1-0,25 mm als inertes Material verwendet. Zum anderen wurde ein RP-C18-Material (Merck) mit einer mittleren Korngröße von 5μm in das Fallen- rohr gepackt. In beiden Fällen wurden folgende Temperaturen für den Restriktor (variabler Restriktor, Nozzle) und die Falle (Trap) am Gerät eingestellt:
Nozzle-Temperatur während der Extraktion: 90°C
Trap-Temperatur während der Extraktion: 85°C
Nozzle-Temperatur für den Spülschritt (Riπse): 70°C
Trap-Temperatur für den Spülschritt (Rinse): 60°C
Rinse-Solvent: 1 ml n-Heptan
Damit wird in der Falle der Siedepunkt des Modifiers Ethanol (78,3°C) überschritten, so daß keine Verluste durch Lösen des 18:1 -EE im kondensierten Ethanol auftreten. Die Probe wird nach der Extraktion mit einem Milliliter n-Heptan von der Falle gespült. Vergleicht man nun die beiden Wiederfindungsraten, so stellt man fest, daß auf den Glaskugeln lediglich 13% 18:1-EE zurückgehalten wurden. Der Rest ist entweder durch den hohen Gasstrom von der Kugeln "weggeblasen" worden oder auch schon teilweise verdampft. An dem RP-C18-Material wird der unpolare Ölsäureethylester physisorbiert. Das 5 μm Material hat eine wesentlich größere Oberfläche als die Glaskugeln, so daß die Fallenkapazität auch höher ist. Mit dieser Falle wird eine quantitative Wiederfinduπg von 98% erreicht.
Die Fallen mit Lösemittel (10 ml n-Heptan in der Vorlage) werden in einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Um Verluste durch Abdampfen des n-Heptans während des Durchleitens des Gasstromes zu verhindern, wird mit einer externen Pumpe n- Heptan zugesetzt. Dabei wird das n-Heptan direkt an dem Ausgang der Nozzle zugeleitet und fließt durch die Kapillare in die Vorlage. Die Flußrate wird so gewählt, daß in etwa die Menge n-Heptan, die pro Zeit verdampft, ausgeglichen wird. Bei der linken Falle in entweicht der Gasstrom, nachdem er die Vorlage passiert hat, durch kleine Kanäle am Stopfen des Kolbens (50 ml Meßkolben). Mit dieser Anordnung werden nur 35% des 18:1 -EE wiedergefunden. Dies kann zum einen durch das Verdampfen des Lösemittels erklärt werden, da zum Halten des Niveaus in der Vorlage, es einer Zuspeisung von etwa 0,5 ml/min n-Heptan bedarf. Zum anderen sind Verluste durch sehr feine Tröpfchen (Aerosol), die mit dem Gasstrom durch die Kanäle entweichen mit dieser Methode nicht zu verhindern. Aus diesen Gründen wurde diese Technik modifiziert, was aus dem rechten Schema in hervorgeht. Entscheidend ist hierbei die Kühlung des Gasstromes, nachdem er die Vorlage passiert hat, in einer langen Spirale. Dort können sich n-Heptan und Probetröpfchen niederschlagen und nach der Extraktion von oben mit Lösemittel in die Vorlage zurückgespult werden. Damit erreicht man eine Steigerung der Wieder- findungsrate auf 80%.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Fallentechnik mit RP-C18-Material besonders geeignet zu einer quantitativen Wiederfindung führt. Diese wird im folgenden für alle weiteren Optimierungsversuche angewendet. Sie läßt sich auch auf größeren Maßstab übertragen, wenn man die Menge an Sorbens erhöht. Nachteilig ist der separate Spülschritt. In präparativem, technischen Maßstab können Cyclon- Abscheider verwendet werden, die das reine Produkt auffangen, ohne mit Lösemittel zu arbeiten.
Beispiel 8: "Probenvorbereitung":
Unter "Probenvorbereitung" fallen in diesem Zusammenhang verschiedene Möglichkeiten, wie und wo die Probe dem System zugesetzt wird. Die Modellsubstanz Triolein ist bei Raumtemperatur flüssig. Der Reaktor wird etwa zu 4/5 mit Katalysator gefüllt. Danach wird Triolein direkt auf den Katalysator eingewogen. Dann füllt man den Reaktor mit Katalysator auf. Die Probe befindet sich somit in direktem Kontakt mit dem Katalysator und ist von ihm umgeben. Die Richtung des Fluidstroms wird so gewählt, daß 4/5 des Katalysators als "Reaktionsstrecke" zur Verfügung stehen, d.h. es wird vom Ende, wo die Probe aufgegeben wurde, weg durch den Reaktor extrahiert. Diese Technik wird für alle Optimierungen mit Triolein angewendet. Dahingegen werden feste Proben mit dem Katalysator zusammen eingewogen und im Mörser verrieben, um eine möglichst große Kontaktfläche herzustellen.
Der Einfluß der Katalysatormenge im Verhältnis zur Probe im Reaktionsraum; es gilt:
GesamtmengeKatalysator
KV = MengeTriolein
Dabei wurde saures Aluminiumoxid der Aktivitätsstufe Super I (Bezeichnung: Alox A Sl) mit folgenden Einwaagen verwendet:
Im Falle einer Füllung mit reinem Seesand wird bereits nach drei Minuten (1. Extraktionsschritt) der Ethylester nahezu quantitativ extrahiert. Für reines Aluminiu- moxid findet man erst nach neun Minuten etwas 18:1-EE und die maximal extrahierbare Menge beträgt nur 35% der eingesetzten. Verringert man die Menge Aluminiumoxid bezogen auf den Ethylester durch teilweise Füllung des Reaktors mit Seesand, auf den 18:1-EE aufgetragen wird, so findet man mit 63% deutlich mehr Ethylester wieder.
Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß ein Teil des 18:1-EE am Aluminiumoxid unter den gegebenen Extraktionsbedingungeπ irreversibel adsorbiert oder zersetzt wird. D.h. auf der Oberfläche des Aluminiumoxids gibt es besonders reaktive Zentren, die zuerst abgesättigt werden müssen, bevor der Ethylester passieren kann. Dies erklärt den Verlust und die verzögerte Extraktion. Um diese aktiven Zentren an der Oberfläche des Aluminiumoxides zu deaktivieren wurde der Katalysator (saures Aluminiumoxid, Aktivitätsstufe Super ICN) durch Zugabe von Ethanol zu 1 ,5 Gew.-% vorbelegt.
Beispiel 9: Modifiergehalt:
Der Modifiergehalt beeinflußt einerseits die Extraktion und andererseits die Reaktion. Für letzte gilt, je höher der Anteil des Reaktionspartners Ethanol, desto höhere Reaktionsausbeute kann erreicht werden. Andererseits ist zu beachten, daß mit steigendem Gehalt an Modifier, die Extraktionsausbeute nicht nur für 18:1 -EE, sondern auch für das Edukt Triolein zunimmt. Daher muß der Ethanolzusatz im Fluid zusätzlich zu der Vorbelegung des Katalysators mit Ethanol optimiert werden. In Figur 3 ist die SF-REC für Triolein unter gleichen Bedingungen ausgeführt, wobei im ersten Fall 1 % und im zweiten Fall 2% Ethanol als Modifier zugesetzt wurde. Für den höheren Gehalt an Ethanol findet man eine schnellere Reaktion und eine größere Ausbeute. Der Steigerung des Ethanolgehaltes sind jedoch durch die gleichzeitig erhöhte Extraktion des Trioleins Grenzen gesetzt. Es muß verhindert werden, daß das Edukt entfernt wird, bevor es sich umsetzen kann.
Beispiel 10: Druck/Temperatur - Dichte:
Über den Druck und die Temperatur des Fluids kann dessen Dichte und damit dessen Lösemittelstärke eingestellt werden. Diese ist entscheidend für die Extraktionsausbeute. Mit ihr kann die Selektivität der Extraktion zwischen dem Produkt Ethyle- ster und dem Edukt Triglycerid gesteuert werden. Wie im vorherigen Kapitel dargestellt, wirkt sich der Modifiergehalt ebenso auf diese Selektivität aus. Insgesamt muß daher die SF-REC-Bedingung so gewählt werden, daß bei möglichst hohem Modifiergehalt die Dichte so niedrig ist, daß selektiv nur der Ethylester aus dem Reaktionsraum extrahiert wird. Die Temperatur hat aber wie der Ethanolgehalt auch eine Wirkung auf die Reaktionsgeschwindigkeit. Erhöht man die Temperatur bei gleicher Dichte, so steigt die Ausbeute pro Zeit, wie in Figur 4 gezeigt ist: Eine Erhöhung der Temperatur ist im Prinzip am gegebenen System bis zu 150°C möglich. Damit steigt jedoch die Gefahr einer Isomerisierung oder Zersetzung der ungesättigten Fettsäuren. Bis zu einer Temperatur von 140°C konnten bisher für 18:1-EE, was die Ausbeute anbelangt, keine Verluste festgestellt werden. Insgesamt ergibt sich aus den durchgeführten Versuchen folgendes Bild der Einflußparameter.
Temperatur und Modifiergehalt haben direkten Einfluß auf die Reaktionsausbeute, d.h. die Umsatzrate der Umesterung. Sie sollten beide möglichst hoch sein, um eine schnelle Umsetzung zu erreichen. Auf der anderen Seite soll die Extraktion des Produktes aus dem Reaktionsraum möglichst selektiv gegenüber dem Edukt verlaufen, d.h. die Lösemittelstärke des Fluids muß ausreichen, um eine möglichst vollständige Extraktion des Ethylesters aber eine möglichst geringe Extraktion des Triglycerides zu erreichen. Dementsprechend wurde zur Optimierung folgende Strategie verwendet: Durch Erniedrigung des Drucks kann bei gleichzeitiger Erhöhung der Temperatur und des Modifiergehaltes die Extraktion ausreichend selektiv, die Umsatzrate aber entsprechend groß werden. Die optimierten Bedingungen sind im folgenden angeführt:
Beispiel 11 : Optimierte SF-REC:
Aus den vorherigen Beispielen ergeben sich die optimalen SF-REC-Bedingungen wie folgt:
System: HEWLETT-PACKARD SFE Module
Druck: 254 bar
Temperatur: 140°C
Dichte: 0,45 g/ml
Modifier: 5% EtOH
Fluß: 4,0 ml/min Katalysator: saures Aluminiumoxid Aktivitätsstufe Super I (ICN)
+ 15% Ethanol Reaktor: vollständig mit Katalysator gefüllt (7,1 g)
Probe: Triolein 54, 1 mg (FLUKA 97%)
Fallentechnik: Merck RP-C18-Material 5 μm
Spülschritt: jeweils 1 ,3 ml n-Heptan
Nozzle-Temperatur während der Extraktion: 90°C
Trap-Temperatur während der Extraktion: 85°C Nozzle-Temperatur für den Spülschritt (Rinse): 70°C
Trap-Temperatur für den Spülschritt (Rinse): 60°C
Damit ergibt sich folgende Kinetik für die Umsetzung des Trioleiπs zum 18:1-EE und die Extraktion des Eduktes (Figur 5).
Am Ende der Messung (730 Minuten Gesamtreaktionszeit) wurden insgesamt 93% Ethylester dem System entnommen, was einer nahezu quantitativen Umsetzung entspricht. Addiert man dazu die Menge an mitextrahiertem Triolein, so erhält man eine Gesamtwiederfindung von 96%, was in Anbetracht des langen Zeitraumes als quantitativ angesehen werden kann.
Betrachtet man den Verlauf der Kinetik, so fällt auf, daß die Reaktion am Anfang sehr schnell verläuft, gegen Ende hin immer langsamer wird. Dies läßt sich vereinfacht nach einem Zeitgesetz 1. Ordnung erklären. Da die Menge an noch nicht umgesetztem Triolein immer geringer wird, bildet sich auch absolut weniger Ethylester.
Beispiel 12: Anwendung der SF-REC auf Lecithin:
Als zweite Modellsubstanz wurde ein Lecithin mit zwei Ölsäuren Dioleylphosphati- dylcholin gewählt. Dieses wurde unter den für Triolein optimierten Bedingungen umgesetzt. Die Reaktionskinetik ist in Figur 5 zu sehen: Vergleicht man die Kinetik mit der für die Umesterung des Trioleins, so stellt man fest, daß die Umsetzung unter gleichen Bedingungen für das Phospholipid langsamer verläuft (Figur 5).
Beispielsweise wird nach der gleichen Zeit (130 Minuten, Summe der reinen Extraktionszeit) aus dem Lecithin knapp 49% und aus dem Triolein über 70% der in ihnen enthaltenen Ölsäure als Ethylester freigesetzt. Die Umesterung verläuft also mit einer geringeren Ausbeute pro Zeit für das Phosphatid. Für dieses Lipid läßt sich aber der Modifiergehalt weiter steigern, da hier das Edukt wesentlich polarer ist, als Triolein. Die Optimierung der Bedingungen für die Umesterung polarerer Lipide kann nach den selben Gesichtspunkten wie für die Triglyceride geschehen. Insgesamt ist eine bessere Selektivität der Extraktion/Chromatographie zu erwarten, da zu den Unterschieden in der Molekülmasse (Triolein: 885,46 g/mol - Dioleylphos- phatidylcholin: 786,1 g/mol - 18:1-EE: 310,5 g/mol) die Polaritätsunterschiede zwi- sehen Edukt und Produkt größer sind.
Die Verwendung eines RP-C18-Materials als Falle ermöglicht eine quantitative
Wiederfinduπg des aus dem Reaktionsraum extrahierten Produktes.
Durch das Zusammenspiel der Dichte des Reaktionsmediums, gesteuert über Tem- peratur und Druck, und des Modifiergehaltes kann die Lösemittelstärke des Fluids eingestellt werden. Damit kann die selektive Extraktion des Produktes Ethylester erreicht werden. Durch Steigerung der Reaktionstemperatur und des Ethanolgehal- tes wird die Umsetzungsrate erhöht, wobei gleichzeitig die Dichte so niedrig gehalten wird, daß die Selektivität der Extraktion/Chromatographie erhalten bleibt. Damit lassen sich die SF-REC-Bedingungen so optimieren, daß eine quantitativen Umesterung von Triolein zu Ölsäureethylester erfolgen kann.
Mit diesem Verfahren werden im folgenden verschiedene Proben biologischen Ursprunges umgeestert, um die Anwendbarkeit auf reale Biomatrices zu demonstrieren. Beispiel 13: Anwendung auf eine biologische Quelle/Matrix: Biotrockenmasse GLA- Stamm:
Im folgenden wird als Biotrockenmasse ein gefriergetrocknetes (lyophilisiertes) Pul- ver bezeichnet, das aus der Fermentation von Mikroorganismen gewonnen wird. Die erste Biotrockenmasse stammt von einem sog. GLA-Stamm. Diese enthält besonders viel γ-Linolensäure (GLA), die meist in Phosphatiden gebunden vorliegt. Die SF-REC wurde unter folgenden Bedingungen ausgeführt:
Fluß: 4,0 ml/min
Druck: 198 bar
Temperatur: 90°C
Modifier: 1% EtOH
Schritte: 2 min statisch 10 min dynamisch
Die aus dem zweiten Schritt erhaltene n-Heptanlösung wurde mittels GC-MS zur Identifizierung der vorhandenen Fettsäureethylester analysiert. Das Chromatogramm und eine Ausschnitt sind in Figur 6 gezeigt.
Neben dem GLA-EE findet man in Figur 6 noch eine Reihe weiterer Fettsäureethylester, besonders Öl- und Linolsäureethylester (18:1-EE und 18:2-EE), aber auch C14, C16 und C20 Fettsäuren.
Beispiel 14: Biofeuchtmasse GLA-Stamm:
Die wäßrige Suspension der Biomasse (ohne Lyophilisierung) wird als Biofeuchtmasse bezeichnet. Setzt man diese direkt in einer SF-REC um, so findet durch den Überschuß an Wasser keine Umesterung der Lipide in die Ethylester, sondern eine Hydrolyse zu den freien Säuren statt. Dies belegt die Analyse mittels GC-MS (Figur 7). Die SF-REC wurde unter folgenden Bedingungen ausgeführt: Fluß: 1,0 ml/min
Druck: 198 bar (0,72 g/ml)
Temperatur: 60°C Modifier: 10% EtOH Schritte: 2 min statisch
10 min dynamisch
Dabei wurden 1 ,56 g Biofeuchtmasse auf 13,3 g Seesand aufgenommen. Davon wurden 9,11 g (entspricht 0,96 g Biofeuchtmasse) mit 1 ,43 g saurem Aluminiumoxid Aktivitätsstufe I vermischt. Die SF-REC wurde mit 10% Ethanol und einer Dichte von 0,72 g/ml ausgeführt, da die freien Säuren stärkere Elutionsbedingungen benötigen als die Ethylester, um aus dem Reaktionsraum entfernt zu werden.
Vergleicht man dies mit den Ergebnissen für die Biotrockenmasse des gleichen GLA-Stamms (Figur 6), so findet man ein identisches Fettsäurespektrum.
Mit diesem Beispiel kann die prinzipielle Möglichkeit einer Hydrolyse anstelle einer Umesterung mittels SF-REC demonstriert werden. Interessant ist dies auch im Hinblick auf eine Kostenersparnis, wenn der aufwendige Schritt der Gefriertrocknung entfallen kann. Die Ethylester lassen sich jedoch chromatographisch einfacher in einem nachfolgenden SFC-Schritt trennen, als dies für die freien Säuren der Fall ist. Weitere Optimierungen der Bedingungen im Hinblick auf die Ausbeute der SF-REC sind noch auszuführen.
Beispiel 15: Biotrockenmasse DHA-Stamm:
Die lyophilisierte Biomasse des DHA-Stammes enthält neben der Docosahexaen- säure (DHA 22:6) vor allem die Docosapentaensäure (DPA 22:5). Der Gesamtlipi- danteii der Biotrockenmasse beträgt etwa 40 Gew.%. Darin sind wiederum 40% der Fettsäuren DHA. Die Lipidanteil liegt fast ausschließlich in Form von Triglyceriden vor. Die Biotrockenmasse wurde mit der zehnfachen Menge saures Aluminiumoxid Aktivität Super I, welches mit 15% Ethanol belegt wurde, im Mörser verrieben und in den Reaktor gefüllt. Unter folgenden Bedingungen wurde die SF-REC durchgeführt:
Fluß: 4,0 ml/min
Druck: 263 bar
Temperatur: 120°C
Modifier: 3% EtOH
Die Kinetik der Reaktion ist in Figur 8 dargestellt:
Die Menge an DHA-EE wurde mit Hilfe eines DHA Standards (90%, KD-PHARMA, Bexbach) ermittelt.
Geht man davon aus, daß 40 Gew.% Lipide in der Biomasse enthalten sind und davon wiederum 40% auf die DHA entfallen, so ergibt sich aus 782 mg Biomasse theo- retisch etwa 125 mg DHA. Dies entspricht 135 mg DHA-EE. Nach 670 Minuten reiner Extraktionszeit wurden ca. 95 mg DHA-EE gefunden. Daraus ergibt sich eine Umsetzung von 70% für diese Realprobe. Unter ähnlichen Bedingungen (2% Ethanol und Alox 10%: Figur 5), wurde für die Modellsubstanz Triolein nach der gleichen Zeit eine Ausbeute von 77% erreicht. Somit ergibt sich kaum eine Beeinträchtigung der Umsetzung durch die Matrix der Probe.
Die Anwendbarkeit der SF-REC auf Realproben konnte demonstriert werden. Für den sog. GLA-Stamm, der vorwiegend γ-Linolensäure enthält, konnte sowohl die lyophilisierte als auch eine wäßrige Suspension der Biomasse umgesetzt werden. Im ersten Fall entstehen in einer Umesterungsreaktion mit Ethanol die Ethylester, im zweiten Fall durch Hydrolyse die freien Säuren.
Auch aus der Biotrockenmasse des DHA-Stamms, die vor allem Docosahexaen- und Docosapentaensäure enthält, konnten mittels SF-REC die Fettsäuren als Ethylester gewonnen werden.
Beispiel 16: Anwendung der SF-REC - Gewinnung wertvoller biogener Stoffe aus Algen: Ziel der hier durchgeführten Versuche ist die Überprüfung der Möglichkeit, mittels verschiedener Extraktionsmethoden wertvolle Substanzen aus Algen zu gewinnen. Dabei stehen insbesondere mehrfach ungesättigte Fettsäuren im Vordergrund, die in Algen in recht hohen Konzentrationen vorkommen. Hier sind insbesondere Ara- chidonsäure (5,8,11 ,14-Eicosatetraensäure; ÄRA) und Eicosapentaensäure (EPA) zu nennen. Daneben besitzen auch ungesättigte Fettsäuren mit 18 Kohlenstoffato- men wie die gamma-Linolensäure (GLA) besondere Bedeutung. Neben diesen Stoffen findet man in Algen je nach Stamm auch eine Reihe von Farbstoffen, wie Chlorophyll, Xanthophyllen (Carotinoide), aber auch einige spezi- eile, wie die Klasse der Phycobiliproteine. In Rotalgen (Rhodophytha) finden sich insbesondere die Phycoerythrine.
Im folgenden soll gezeigt werden, wie diese verschiedenen Stoffklassen in reiner Form aus dem Algenmaterial gewonnen werden können. Insbesondere ist dabei die Tatsache zu beachten, daß die genannten Stoffklassen sich in ihrer Polarität unter- scheiden. Somit bietet sich eine schrittweise Extraktion mit unterschiedlich polaren Medien an, um eine Vorreinigung und Trennung zu erzielen.
Beispiel 17: Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE)
Die SFE mit reinem C02 stellt den ersten Schritt zur Gewinnung der Fettsäuren aus Algen dar. Polarere Verbindungen können dann im zweiten Schritt durch Einsatz von Ethanol als Modifier extrahiert werden. Eine Extraktion polarer Verbindungen, insbesondere solcher, die eine gute Wasserlöslichkeit zeigen, kann mit C02 nicht erfolgen, so daß diese dann in einem dritten Schritt mit Wasser extrahiert werden können.
Beispiel 18: Extraktion mit reinem Kohlendioxid
Etwa 2 Gramm der getrockneten Algen werden im Mörser mit etwa 5 Gramm See- sand zerrieben und in eine Extraktionskammer gefüllt. Unter verschiedenen Bedin- gungen wird jeweils 60 Minuten lang mit 4,0 ml/min Fluß extrahiert und dabei die extrahierten Substanzen an einer Falle (Glaskugeln) nach dem Entspannen des C02 auf Normaldruck abgeschieden. Von dieser werden sie anschließend nach jedem Extraktionsschritt mit n-Heptan eluiert. Die erste Extraktion wurde mit relativ geringer C02-Dichte durchgeführt: 204 bar, 60°C (Dichte: 0,73 g/ml). Dabei erhält man eine dunkelgelb bis grüne Lösung, die eine rote Fluoreszenz (Anregungswellenlänge: 366 nm) zeigt, so daß man davon ausgehen kann, daß unter diesen Bedingungen schon Chlorophyll extrahiert wird. Dieses stört nicht nur die Bestimmung der Fettsäuren, sondern stellt auch eine un- erwünschte Verunreinigung dar.
Beispiel 19: Extraktion mit Modifier:
Mit zunehmendem Druck und auch durch Verwendung von 10% Ethanol als Modifier kann nach mehreren Stunden Extraktion das Chlorophyll nahezu restlos aus dem Algenmaterial entfernt werden.
Beispiel 20: Extraktion in Gegenwart eines Adsorbens / in-situ Umesterung durch SF-REC:
Um die unerwünschte Extraktion des Chlorophylls in der ersten Fraktion zu vermeiden, wurden die Algen nun mit einem Adsorbens (Aluminiumoxid) anstelle von Seesand zerrieben und unter den gleichen Bedingungen wie oben extrahiert. Dabei stellt man fest, daß die Fraktionen, die ohne Modifier gewonnen wurden keine grü- ne, sondern nur eine schwach gelbe Färbung aufweisen.
Die Extraktion unter 204 bar, 60°C, 1 % Ethanol in Gegenwart von saurem Aluminiumoxid liefert eine gelbe Lösung, die eine bläuliche Fluoreszenz (366 nm) zeigt. Dabei ist die Ursache der Färbung wahrscheinlich in Xanthophyllen zu suchen, wel- ehe gelbe, unpolare Pflanzenfarbstoffe darstellen. Eine genauere Untersuchung ist für eine exakte Bestimmung noch erforderlich.
In Gegenwart von saurem Aluminiumoxid findet die in situ Umesterung der Lipide statt, die zum einen das Fettsäurespektrum der Algen zugänglich macht, zum ande- ren auch die Anwendung zur präparativen Gewinnung der Fettsäureethylester aus biologischer Matrix modelhaft demonstriert. Im folgenden ist die Analyse des gewonnenen Produkts mittels GC-MS zu sehen (Figur 8).
Das UV-Spektrum bis 600 nm Chlorophyll konnte mittels Dioden-Array-Detektor aufgezeichnet werden. Die gelbe Fraktion enthält demnach kein Chlorophyll. Die Identifizierung des Peaks bei 3,1 min als gelben Farbstoffe konnte dadurch erfolgen, daß eine Dünnschichtplatte mit definierter Geschwindigkeit am Auslaß der SFC vorbeibewegt wurde. Auf ihr konnte man unter UV-Licht einen bläulich fluoreszierenden Fleck bei 3,1 min entdecken. Es ist somit möglich die wertvollen Fettsäuren aus den Algen in situ umzuestern und als Ethylester zu isolieren, ohne daß Chlorophyll mitextrahiert wird.
Beispiel 21 : Extraktion mit Ethanol
Die direkte Extraktion der Algen mit Ethanol liefert grüne Lösungen. Das Chlorophyll kann demnach mit Ethanol aus den Algen entfernt werden.
Nach mehrstündiger SFE mit 10% Ethanol als Modifier konnten die Algen vom Chlorophyll weitgehend befreit werden. Eine anschließende direkte Extraktion mit Ethanol zeigt nur mehr schwach grün gefärbte Lösungen. Der rote Farbstoff der Algen löst sich nicht in Ethanol, so daß eine Trennung vom Chlorophyll entweder mit SFE und Ethanol als auch direkt mit Ethanol möglich ist.
Beispiel 22: Extraktion mit Wasser Sowohl aus den bereits mit SFE "vorgereinigten" Algen, als auch aus den unbehan- delten Algen kann mit Wasser eine purpurfarbene Lösung erhalten werden. Diese Lösung zeigt bei Anregung mit UV-Licht (366 nm) orangene Fluoreszenz. Damit kann der Purpur-Farbstoff in einem wäßrigen Schritt abgetrennt von den Fetten und von Chlorophyll dargestellt werden.
Das anfangs eingesetzte Aluminiumoxid kann in Wasser durch Sedimentation von den Algenresten abgetrennt werden. Es zeigt eine mintgrüne Färbung, was auf adsorbiertes Chlorophyll schließen läßt.
Beispiel 23: UV/Vis-Spektren der erhaltenen Lösungen
Zur Charakterisierung der drei Fraktion:
(1 ) Gelbe Lösung in n-Heptan - blaue bis grüne Fluoreszenz : SFE/SFR 204 bar, 60°C, 1 % Ethanol in Gegenwart von saurem Aluminiumoxid
(2) Tiefgrüne Lösung in n-Heptan - rote Fluoreszenz :
SFE 204 bar, 60°C, 10% Ethanol in Gegenwart von Aluminiumoxid
(3) Purpurne Lösung in Wasser - orangene Fluoreszenz : wäßrige Extraktion des SFE-Rückstandes, zentrifugieren.
Die Farbe der gelben Lösung ist im Spektrum durch die Flanke, die sich vom UV- Bereich bis hin zu 500 nm erstreckt, zu erklären. Ein Absorptionsmaximum ist im UV-Bereich bei 282,4 nm zu erkennen. Die Ursache für die grüne Färbung der Chlo- rophyll-Lösung ist das Absorptionsmaximum bei 662,6 nm. Zahlreiche Maxima geringerer Höhe sind im Bereich des sichtbaren Lichtes zu finden. Das höchste Maximum liegt bei 410 nm. Die purpurne Lösung absorbiert im sichtbaren Bereich am stärksten bei 545,5 nm (Der Algenfarbstoff B-Phycoerythrin besitzt nach Literaturangaben ein Absorptionsmaximum bei 546 nm). Im UV-Bereich findet man ein Ma- ximum bei 272,2 nm, das evtl. auf Lichtstreuung der leicht trüben Lösung zurückzuführen ist. Die Beispiele zeigen, daß eine Extraktion und Trennung der gewünschten Substanzen z.B. aus den gegebenen Algen möglich ist.
Mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren mit 1 % Ethanol als Modifier in Gegenwart von saurem Aluminiumoxid als Adsorbens und als Katalysator können die wertvollen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren als Ethylester erhalten werden. Sie werden zusammen mit gelben Farbstoffen extrahiert, wobei es sich wahrscheinlich um Xanthophylle handelt. Diese können in einem weiteren Aufarbeitungsschritt z.B. mittels präparativer SFC abgetrennt werden. In einem zweiten Schritt kann das störende Chlorophyll entweder mittels SFE bei mehr als 10% Ethanol als Modifier und höherem Druck (höhere Dichte) oder durch direkte Extraktion mit Ethanol aus der Matrix entfernt werden. Dabei wird der purpurne Farbstoff der Algen nicht extrahiert.
Dieser kann entweder direkt aus den Algen oder nach den beiden ersten Schritten mit Wasser extrahiert werden. Die Vorteile der angewendeten Verfahren liegen darin begründet, daß sich jeglicher Kontakt mit toxischen Lösemitteln vermeiden läßt, so daß die gewonnenen Substanzen für eine pharmazeutische oder lebensmitteltechnische Anwendung zur Verfügung stehen. Die Umsetzung des Triglycerides Triolein zu Ölsäureethylester diente als Modell- beispiel für die Umesterung mittels Ethanol an saurem Aluminiumoxid. Die SF-REC wurde für dieses Beispiel in bezug auf apparative Bedingungen und Prozeßführung optimiert. Es konnte eine nahezu quantitative Umesterung mit 93% Ausbeute erreicht werden. Auch für die Modellsubstanz des Phosphatides Dioleylphosphatidylchoiiπ konnte die SF-REC ausgeführt werden.
Als Realproben standen mehrere gefriergetrocknete Fermentationsprodukte (Biotrockenmassen) zur Verfügung, die einen hohen Anteil an PUFAs enthalten. Diese konnten direkt in einer SF-REC umgesetzt werden. Die Anwendung der Methode auf ein noch nicht getrocknetes Fermentationsprodukt (Biofeuchtmasse) führte durch den Überschuß an Wasser zu einer Hydrolyse, so daß in diesem Falle die freien Fettsäuren gewonnen wurden. Die Anwendung auf getrocknete Rotalgen demonstriert ebenfalls die Anwendbarkeit der SF-REC auf diese Art von Proben.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung und selektive Isolierung von Fettsäureestern und/oder Fettsäuren aus biologischen Quellen mittels einer kontinuierlichen in situ-Extraktion-Reaktion-Chromatographie, in welcher in Gegenwart eines verdichteten Gasstromes und 0,5 bis 5 vol% C1-C5 Alkoholmodifiers
(a) die Reaktion an einem inerten Katalysator in vollständigen Kontakt mit der biologischen Quelle erfolgt;
(b) die Chromatographie der Reaktionsprodukte am inerten Katalysator aus (a), welcher chromatographische Retention aufweist, erfolgt und ausschließlich die Reaktionsprodukte desorbiert und eluiert;
(c) die Extraktion der desorbierten und eluierten Reaktionsprodukte aus (b) erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Katalysator mit der biologischen Quelle vermischt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der inerte Katalysator aus Aliuminiumoxid und/oder Kieselgel hergestellt und ggf. weiteren Zusatz- und Hilfsstoffen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Modifier Ethanol ist, vorzugsweise 1 vol% im verdichteten Gas.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das verdichtete Gas Kohlendioxid ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Edukte zu den Reaktionsprodukten vollständig umgesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsprodukte aus biologischen Quellen, wie Mikroalgen und / oder Protozoen und / oder Pilzen und / oder Bakterien erhältlich sind.
8.' Verwendung der erhaltenen Fettsäurester nach Anspruch 1 bis 6, als Lebensmittel und / oder Lebensmittelzusatzstoff.
9. Verwendung der erhaltenen Fettsäureester nach Anspruch 1 bis 7 zur pharmazeutischen Anwendung
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19903095C2 (de) * 1999-01-27 2003-05-22 Nutrinova Gmbh Gewinnung von gamma-Linolensäure aus Protozoen der Gattung Colpidium
AU782699B2 (en) * 2000-12-15 2005-08-18 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for preparing fatty acid esters from seeds or fruits
US7192731B2 (en) * 2001-05-24 2007-03-20 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization, (A.R.O.), Volcani Center Methods for efficient extraction of carotenoids using an esterase
US20020177181A1 (en) * 2001-05-24 2002-11-28 Agricultural Research Organization, The Volcani Center Increasing bioavailability of carotenoids
DE10159987A1 (de) * 2001-12-06 2003-06-26 Nutrinova Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von Glycerolether enthaltenden Mischungen
US7091366B2 (en) * 2003-09-25 2006-08-15 Thar Technologies, Inc. Recovery of residual specialty oil
US20060252949A1 (en) * 2003-09-25 2006-11-09 Lalit Chordia Recovery of residual specialty oil
CN101018867A (zh) * 2003-10-02 2007-08-15 密西西比州立大学 从废水处理厂的污泥中生产生物柴油和其它有价值的化学物质
DE102004019472A1 (de) * 2004-04-22 2005-11-17 Bayer Healthcare Ag Phenylacetamide
ES2909600T3 (es) 2005-06-07 2022-05-09 Dsm Nutritional Products Ag Microorganismos eucarióticos para producir lípidos y antioxidantes
US9023616B2 (en) * 2006-08-01 2015-05-05 Dsm Nutritional Products Ag Oil producing microbes and method of modification thereof
UA97127C2 (uk) * 2006-12-06 2012-01-10 Бандж Ойлз, Инк. Спосіб безперервної ферментативної обробки композиції, що містить ліпід, та система для його здійснення
WO2009018230A1 (en) * 2007-07-27 2009-02-05 Solix Biofuels, Inc. Continuous algal biodiesel production facility
US8450370B2 (en) * 2007-12-21 2013-05-28 Old Dominion University Research Foundation Production of glycerol-related products from a high temperature reaction
AU2008343290A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Old Dominion University Research Foundation Direct conversion of biomass to biodiesel fuel
US20100077654A1 (en) * 2008-09-23 2010-04-01 LiveFuels, Inc. Systems and methods for producing biofuels from algae
US20100236137A1 (en) * 2008-09-23 2010-09-23 LiveFuels, Inc. Systems and methods for producing eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid from algae
EP2342347A1 (de) * 2008-09-23 2011-07-13 Livefuels, Inc Systeme und verfahren zur herstellung von biokraftstoffen aus algen
US20110239318A1 (en) * 2008-11-18 2011-09-29 LiveFuels, Inc. Methods for producing fish with high lipid content
US8753851B2 (en) 2009-04-17 2014-06-17 LiveFuels, Inc. Systems and methods for culturing algae with bivalves
CN104974030A (zh) 2009-12-30 2015-10-14 巴斯夫制药（卡兰尼什）公司 用于纯化多不饱和脂肪酸的模拟移动床色谱分离方法
US9040263B2 (en) 2010-07-28 2015-05-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of alcohol esters and in situ product removal during alcohol fermentation
BR112012032172A2 (pt) 2010-06-18 2015-11-24 Butamax Tm Advanced Biofuels método para produzir um álcool e composição
JP2012036337A (ja) * 2010-08-10 2012-02-23 Institute Of National Colleges Of Technology Japan 多段燃料合成装置および燃料合成方法
US8563759B2 (en) 2010-10-02 2013-10-22 Cal Poly Corporation Process for extracting lipids from microalgae
WO2012103513A2 (en) 2011-01-28 2012-08-02 Mccutchen Co. Radial counterflow reactor with applied radiant energy
US9487716B2 (en) 2011-05-06 2016-11-08 LiveFuels, Inc. Sourcing phosphorus and other nutrients from the ocean via ocean thermal energy conversion systems
GB201111591D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd Further new process
GB201111589D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd New modified process
GB201111594D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd New improved process
GB201111595D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd Improved process
GB201111601D0 (en) 2011-07-06 2011-08-24 Equateq Ltd New process
JP2014529607A (ja) 2011-08-26 2014-11-13 ピーティーティー グローバル ケミカル パブリック カンパニー リミテッド 天然物質からルテイン／キサントフィルを抽出する方法、並びにこの方法により得られる高度精製ルテイン／キサントフィル
GB201300354D0 (en) 2013-01-09 2013-02-20 Basf Pharma Callanish Ltd Multi-step separation process
DK2970926T3 (en) 2013-03-13 2018-04-16 Dsm Nutritional Products Ag GENMANIPULATION OF MICROorganisms
US9428711B2 (en) 2013-05-07 2016-08-30 Groupe Novasep Chromatographic process for the production of highly purified polyunsaturated fatty acids
US8802880B1 (en) 2013-05-07 2014-08-12 Group Novasep Chromatographic process for the production of highly purified polyunsaturated fatty acids
EP3118186B1 (de) 2013-12-11 2022-02-09 Novasep Process Chromatografische anlage zur herstellung von mehrfach ungesättigten fettsäuren
BR112016015718B1 (pt) 2014-01-07 2021-12-07 Novasep Process Solutions Processo de purificação de aminoácidos aromáticos
AR104042A1 (es) 2015-03-26 2017-06-21 Mara Renewables Corp Producción de alta densidad de biomasa y aceite utilizando glicerol en bruto
CA2991707C (en) 2015-07-13 2023-08-01 MARA Renewables Corporation Enhancing microbial metabolism of c5 organic carbon
CN105296555A (zh) * 2015-12-03 2016-02-03 福建师范大学 一种采用两步脂肪酶催化法制备结构甘油酯的方法
US10851395B2 (en) 2016-06-10 2020-12-01 MARA Renewables Corporation Method of making lipids with improved cold flow properties
US10537840B2 (en) 2017-07-31 2020-01-21 Vorsana Inc. Radial counterflow separation filter with focused exhaust

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61261398A (ja) * 1985-05-15 1986-11-19 株式会社日立製作所 魚油精製方法
US4898673A (en) * 1987-07-11 1990-02-06 Vitamins, Inc. Dynamic supercritical fluid extraction system

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0005395A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
US6350890B1 (en) 2002-02-26
WO2000005395A1 (de) 2000-02-03
NO20010276D0 (no) 2001-01-17
JP2002521030A (ja) 2002-07-16
NO20010276L (no) 2001-03-20

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