DE60002952T2

DE60002952T2 - Verfahren zur selektiven Abtrennung und Reinigung von Eicosapentaensäure und Decosohexaensäure und deren Estern

Info

Publication number: DE60002952T2
Application number: DE60002952T
Authority: DE
Inventors: Satoshi Ohimachi Kiyohara; Shiro Ohimachi Fujita
Original assignee: Nisshin Pharma Inc
Current assignee: Nisshin Pharma Inc
Priority date: 1999-06-28
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2020-06-22
Also published as: US6313330B1; DE60002952D1; ATE241584T1; NO321273B1; DK1065196T3; CA2311974A1; NO20003335D0; EP1065196B1; NO20003335L; EP1065196A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Trennung und Reinigung von Eicosapentaen- und Docosahexaen-Säuren oder Estern davon aus einer Mischung, die eine hoch-ungesättigte Fettsäure oder deren Derivate umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Derivate wie Ester davon, die aus Fischölen wie Ölen von Sardinen, Makrelen, Thunfischen oder ähnlichem stammen, sind bekannt. Insbesondere Eicosapentaen-Säure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) und Ester davon werden auf dem Gebiet der Reformkost und der Arzneimittel aufgrund ihrer pharmakologischen Wirkungen verwendet.
Die bekannten Verfahren für die Reinigung dieser ungesättigten Fettsäuren oder deren Derivate sind ein Harnstoff-Additionsverfahren, ein Präzisions-Destillationsverfahren, ein Chromatographieverfahren, ein superkritisches Fluidextraktionsverfahren und ähnliches. Diese bekannten Verfahren sind jedoch im einzelnen schwierig, um eine Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Derivate, die aus Fischölen stammen, in hohen Reinheiten, ohne Modifizierung in hohen Mengen und bei niedrigen Kosten zu reinigen. Bei dem Harnstoff-Additionsverfahren ist die resultierende Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Ester umfasst, von einem geringen Reinheitsgrad. In dem Präzisions-Destillationsverfahren treten Polymerisationen und Isomerisationen mit leichter Modifizierung des Produktes auf, und es ist schwierig, Eicosatetraen-Säure (ETA) oder deren Ester, die bei der Verwendung als Arzneimittel und in Nahrungsmitteln unerwünscht sind, zu entfernen. Außerdem ist der chromatographische und der superkritische Fluidextraktionsprozeß für die Trennung und Reinigung in industriellem Maßstab ungeeignet.
Das japanische Patent Kokai 9-151390 offenbart ein Verfahren für die Reinigung einer hoch-ungesättigten Fettsäure und Derivaten davon, das umfasst: das Inkontaktbringen einer Mischung von hoch- ungesättigten Fettsäuren oder deren Derivaten mit einem Träger, auf dem ein Silbersalz aufgezogen ist, und die nachfolgende Abtrennung und Extraktion durch Inkontaktbringen des Trägers mit einem Lösungsmittel. Es ist dort beschrieben, das Silikagel, Zeolith, Kaolin, aktiver Chinaton, Perlit und eine Kombination davon als Träger verwendet werden. Diese Veröffentlichung gibt jedoch keinen Hinweis auf die Verwendung von Diatomeenerde und die dadurch erzielte Wirkung. Weiterhin führt dieses bekannte Verfahren zu Einschränkungen, indem die Menge des Trägers für das Silbersalz 19 Gewichtsteile, ausgedrückt als Silber, bezogen auf 45–55 Gewichtsteile des Trägers sein sollte, und weiterhin, dass die Menge der Mischung der hoch-ungesättigten Fettsäuren oder deren Derivate, die mit dem Träger, auf den das Silbersalz aufgezogen ist, in Kontakt gebracht wird, 15 Gewichtsteile betragen sollte. Das Verlassen dieser Einschränkungen führt zu einer Verringerung des Reinigungsgrades. Obwohl das bekannte Verfahren eine hoch-ungesättigte Fettsäure-Komponente trennen und zu hoher Reinheit reinigen kann, gibt es verschiedene Probleme, indem das Verfahren für die Herstellung des Silber-geträgerten Trägers kompliziert ist, und eine Extraktionsoperation, die das wiederholte Rühren und Filtrieren einschließt, mühselig ist.
Es besteht der Wunsch nach einem praktischen Verfahren für die selektive Abtrennung und Reinigung der gewünschten EPA und DHA aus Fischölen, die verschiedene hoch-ungesättigte Fettsäuren und deren Derivate enthalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens für die Abtrennung und Reinigung von EPA und DHA in hoher Reinheit, das ein höheres Gewichtsverhältnis des Silbersalzes zu dem Träger aufweist, als das Verfahren des Stands der Technik, und somit eine hohe Verarbeitungsleistung zeigt, und dass das Einfügen einer Silber-Verbindung eliminiert.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann gelöst werden unter Verwendung von Diatomeenerde als Träger für das Aufziehen eines Silbersalzes, das Einfüllen des Trägers in eine Säule, das Durchströmen der Säule mit einem wässrigen Medium, das ein Silbersalz enthält, um den Silber-geträgerten Träger leicht herzustellen und wiederum Durchströmen der Säule mit einem spezifischen Entwicklungslösungsmittel.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die selektive Abtrennung und Reinigung von Eicosapentaen- und Docosahexaen-Säuren oder Estern davon aus einer Mischung, die eine hoch-ungesättigte Fettsäure oder deren Derivate umfasst, bereit, welches Verfahren die Schritte umfasst:
Durchströmen einer mit einem Träger gefüllten Kolonne mit einem wässrigen Medium, das ein Silbersalz umfasst, um das Silbersalz auf den Träger aufzuziehen;
Durchströmen des mit dem Silbersalz beladenen Trägers in der Kolonne mit einer Lösungsmittellösung einer Mischung, die die hoch-ungesättigte Fettsäure oder das Derivat davon umfasst; und Durchströmen der Kolonne mit einem Entwicklungslösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger Diatomeenerde ist.
Die vorliegende Erfindung des zuvor beschriebenen Aufbaus kann EPA und DHA effektiv abtrennen und reinigen aus einer Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder Derivate davon enthält, die aus Fischölen stammen und weiterhin kann sie ein Ausströmen des Silbers verhindern, wodurch eine Verringerung der Trennfähigkeit und das Einführen des Silbers in das abgetrennte und gereinigte Produkt verhindert wird. Außerdem kann das vorliegende Verfahren den Gehalt von Eicosatetraen-Säure (ω6 ETA), die in Reformkost und Arzneimitteln unerwünscht ist, so klein wie möglich machen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Ausgangsmaterialien, eine Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Derivate umfasst, die für die Reinigung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein: diejenigen, die aus Fischölen wie Ölen von Sardinen, Makrelen, Thunfischen oder ähnlichem stammen, die hoch-ungesättigte Fettsäuren, z. B. ETA, EPA oder DHA, Ester-Derivate dieser ungesättigten Fettsäuren oder Mischungen davon enthalten. Die Zusammensetzung der Ausgangsmaterialien kann, wenn sie aus Fischölen stammen, variabel sein. Der Grad der Trennung oder der Reinigung von EPA und DHA oder deren Ester kann abhängig von der Zusammensetzung des Ausgangsmaterials variieren. Selbst wenn mehrere Prozent oder mehr ETA in dem Ausgangsmaterial enthalten ist, kann das vorliegende Verfahren selektiv EPA und DHA trennen und reinigen und weiterhin den Gehalt des ETA auf spezifische niedrige Niveaus reduzieren.
Die vorliegende Erfindung ist gekennzeichnet durch die Verwendung von Diatomeenerde als Träger für das Aufziehen des Silbersalzes. Die Diatomeenerde ist eine Versteinerung einer Einzellen-Pflanze, die eine Art von Wasser-Seegras ist, das sowohl in Frischwasser als auch in Vexationswasser verbreitet ist. Einer der Gründe für die selektive Verwendung von Diatomeenerde besteht darin, dass die Fähigkeit Wasser in der Diatomeenerde zu halten, ungefähr zweimal höher ist als die anderer Materialien, wenn das Silbersalz auf die Diatomeenerde in Form einer in einem wässrigen Medium gelösten Lösung mit dem Silbersalz aufgezogen wird. Als Referenz wird die Fähigkeit, Wasser aufzunehmen, unten verglichen unter Verwendung eines Porenvolumens pro Gewicht (Ölabsorption, ml/g).
Die Diatomeenerde kann gewöhnlich in uncalcinierter oder calcinierter Form verwendet werden, aber die calcinierte Erde ist bevorzugt. Die calcinierte Diatomeenerde kann hergestellt werden durch Zerkleinern einer Roh-Diatomeenerde, Trocknen des zerkleinerten Produktes, Unterwerfen davon wiederholten Mahl- und Klassierungsoperationen, um Verunreinigungen zu entfernen, Calcinieren des klassierten Produktes bei hoher Temperatur und weiter Unterwerfen davon wiederholten Mahl- und Klassieroperationen, um die Partikelgröße einzustellen. Es ist bevorzugt, dass die Diatomeenerde eine Porengröße von 0,1–10 μm, eine spezifische Oberfläche von 0,5–50 m²/g und ein Porenvolumen von 1–10 ml/g aufweist, um die Fähigkeit eine wässrige Silbersalzlösung zu halten, zu verbessern und einen guten Kontakt mit den zu behandelnden hoch-ungesättigten Fettsäuren oder deren Derivaten sicherzustellen. Es ist noch bevorzugter, dass die Diatomeenerde eine Schüttdichte von 0,1–0,3 g/ml aufweist, zieht man die Größe der Säule in Betracht. Die Diatomeenerde, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist kommerziell erhältlich, aber nicht beschränkt auf spezifische, wovon ein typisches Beispiel „Extrelut^® 13076", erhältlich von Merck Co., Ltd., ist.
Als Silbersalze, die auf die Diatomeenerde aufgezogen werden, können beliebige Silbersalze verwendet werden, wenn sie einen Komplex auf der Diatomeenerde mit der Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Derivate umfasst, bilden kann. Silbernitrat wird am meisten bevorzugt verwendet, zieht man die Leichtigkeit seiner Handhabung und die Verfügbarkeit ebenso wie die leichte Isolierung und Wiederverwendung in Betracht.
Es ist bevorzugt, dass die Menge der Silbersalze, die auf die Diatomeenerde aufgezogen werden, nicht mehr als 65 Gewichtsteile, bezogen auf das Silber, bevorzugt nicht mehr als 55 Gew.-% bis nicht mehr als 65 Gew.-%, basierend auf dem Gewicht der Diatomeenerde beträgt, zieht man eine Verkleinerung der Säule und eine hohe Betriebsfähigkeit in Betracht.
Im allgemeinen kann, wenn die Menge der Silbersalze, die auf eine vorgegebene Menge der Diatomeenerde aufgetragen wird, ansteigt, die Menge des behandelten Rohmaterials, d. h. die Menge der behandelten Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Derivate umfasst, erhöht werden. Unter diesem Gesichtspunkt kann die Menge des Silbersalzes, die in der vorliegenden Erfindung aufgezogen wird, auf 65 Gew.-% maximal erhöht werden, was zu dem Vorteil führt, dass die Menge der behandelten Ausgangsmaterialien stark erhöht werden kann.
Als Verfahren zum Aufziehen eines Silbersalzes auf einen Träger offenbart das japanische Patent Kokai 9-151390 ein Verfahren des Eintauchens des Trägers in eine wässrige Lösung des Silbersalzes, gefolgt durch Trocknen. Dieses Verfahren ist jedoch schwierig bei der Steuerung des Wassergehaltes. Im Gegensatz dazu besitzt die vorliegende Erfindung den Vorteil, dass das Aufziehen des Silbersalzes auf die Diatomeenerde leicht durch einfaches Durchströmen mit dem wässrigen Mediums, das das Silbersalz enthält (z. B, eine 50%ige wässrige Lösung des Silbersalzes) durch die Diatomeenerde, die trocken in die Säule eingefüllt wird, z. B. in im wesentlichen der gleichen Menge wie das Silbersalz eingefüllt ist, durchgeführt werden. Das wässrige Medium für das verwendete Silbersalz ist Wasser, Methanol, Aceton oder ähnliches, aber Wasser ist bevorzugt.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Säule gefüllt mit Silber-beladener Diatomeenerde hergestellt werden durch Einfüllen der Diatomeenerde in die Säule und Durchströmen der Säule mit dem wässrigen Medium, das das Silbersalz enthält, um das Silbersalz auf die Diatomeenerde aufzuziehen. Anschließend wird eine Lösungsmittelösung der Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Derivate umfasst, die abzutrennen und zu reinigen sind, mit der Diatomeenerde in Kontakt gebracht, um einen Komplex mit dem Silbersalz (Silberion) zu bilden. Anschließend wird die Säule mit einer kleinen Menge eines spezifischen Lösungsmittels entwickelt, um EPA, DHA oder deren Ester selektiv abzutrennen und zu reinigen. Ein repräsentatives Beispiel einer Lösemittellösung der genannten Mischung ist eine Hexanlösung, ohne dass jedoch eine Einschränkung darauf besteht. Das für die Herstellung der genannten Lösung verwendete Lösungsmittel kann identisch mit dem Entwicklungslösungsmittel sein.
In der vorliegenden Erfindung kann eine Säule mehrere Male verwendet werden, und die Lösungsmittellösung der aufzutrennenden und zu reinigenden Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Derivate umfasst, kann mit der Diatomeenerde in Kontakt gebracht werden, nachdem die Säule, gefüllt mit der mit Silber beladenen Diatomeenerde zuvor mit Hexan ausgetauscht wurde.
Als Entwicklungslösungsmittel, die in der vorliegenden Erfindung für die Abtrennung und die Reinigung des gewünschten Produktes verwendet werden können, können beliebige Lösungsmittel verwendet werden, wenn sie eine hohe Selektivität und eine hohes Extraktionsvermögen mit einer kleinen Menge des Lösungsmittels zeigen und ein Ausströmen des Silbersalzes verhindern können, aber Pentan, Hexan, Heptan, Toluol, Xylol, Methanol, Isopropylalkohol, Ethylacetat oder eine Mischung davon sind besonders bevorzugt. Typ und Menge der verwendeten Lösungsmittel können geeignet ausgewählt werden, um optimale Bedingungen bereitzustellen.
Im Hinblick auf die Selektivität der Extraktion können Extrakte verschiedener Zusammensetzung erhalten werden durch Steuerung der Polarität des Entwicklungslösungsmittels. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann eine Elution durchgeführt werden unter anfänglicher Verwendung von Hexan und anschließend Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthält, als Entwicklungslösungsmittel.
In der vorliegenden Erfindung wird die Extraktion bei Umgebungstemperatur durchgeführt, bevorzugt bei einer Temperatur von 0°C bis 30°C. Dies kann einen stabilen Extrakt bereitstellen mit geringerer Wahrscheinlichkeit einer Veränderung durch thermische Isomerisierung oder ähnliches. Die Atmosphäre nach der Extraktion wird bevorzugt mit einem Inertgas wie Stickstoff, Argon oder ähnlichem ausgetauscht, um zu verhindern, dass die Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Ester umfasst, Einflüssen wie der Oxidation oder ähnlichem unterliegt.
In der vorliegenden Erfindung beträgt das Porenvolumen der Diatomeenerde 1–10 ml/g, was angibt, dass die Menge des wässrigen Mediums, die pro Gramm der Diatomeenerde gehalten wird, 1–10 ml beträgt. Z. B. bildet Silbernitrat seine gesättigte Lösung mit Wasser von ungefähr der halben Menge bezogen auf das Gewicht des Silbernitrates, wenn Silber in der Form einer wässrigen Silbernitratlösung aufgezogen wird. Folglich werden lediglich 50% des Porenvolumens der Diatomeenerde verwendet, selbst wenn Silbernitrat desselben Gewichtes wie Diatomeenerde in der Form einer wässrigen Lösung gehalten wird. Dies kann ein Ausströmen von Silber verhindern. D. h., die zweifache Menge von Diatomeenerde, bezogen auf das wässrige Medium der wässrigen Silbernitratlösung kann verwendet werden, was nicht zu einem Ausströmen von Silbersalz aus der Säule resultiert, wenn die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Hexan oder ähnlichem durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele weiter veranschaulicht.
Beispiel 1
Eine Glassäule (20 mm Innendurchmesser × 300 mm Länge) wurde trocken befüllt mit 20 g Diatomeenerde („Extrelut® 13076", erhältlich von Merck Co., Ltd.) mit einer Porengröße von 4000 nm, einer spezifischen Oberfläche von 1,01 m²/g, einem Porenvolumen von 1,2 ml/g und einer Schüttdichte von 0,24 g/ml. Eine wässrige Lösung von 20 g Silbernitrat in 10 ml Wasser wurde durch die Säule, die mit Diatomeenerde befüllt war, durchströmen gelassen. Die Säule wurde für 30 Minuten stehen gelassen, um das Silbersalz auf die Diatomeenerde aufzuziehen. Anschließend wurde Hexan durch die Säule strömen gelassen, um die Säule mit Hexan auszutauschen.
10 g eines Rohmaterials, einer Ethylestermischung von hoch-ungesättigten Fettsäuren mit der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung wurden in 10 ml Hexan gelöst, um eine Hexanlösung herzustellen. Diese Lösung wurde durch die Säule strömen gelassen. Anfänglich wurde die Säule mit 90 ml Hexan mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, ein Eluat von der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, was 5,76 g (Ausbeute 57,6%) einer ersten Effluent-Franktion ergab. Als nächstes wurde die Säule mit 290 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. eluiert, ein Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, was 3,62 g (Ausbeute 36,2%) einer zweiten Effluent-Fraktion ergab.
Weiter wurde die Säule durch 100 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, ein Eluat aus der Säule isoliert, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, wodurch 0,65 g (Ausbeute 6,5%) einer dritten Effluent-Fraktion erhalten wurden. Die resultierenden gereinigten Ethylester der Fettsäuren wurden durch Gaschromatographie analysiert mit den folgenden in Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen.
Der Gaschromatograph, der in der Analyse verwendet würde, war das Modell 263-560, hergestellt durch Hitachi Co., Ltd. Die Säulenbedingungen sind unten gezeigt.
Gepackte Säule: Silar-10C Uniport, HP 80/100, 3 mm I.D. × 2 m
Detektor: FID
Säulen-Temperatur: 200°C
Einlass-Temperatur: 250°C
Detektor-Temperatur: 250°C
Trägergas: Stickstoff
Fließgeschwindigkeit: eingestellt, um eine Retentionszeit für EPA von ungefähr 20 Minuten einzustellen.
Tabelle 1
Die obigen Ergebnisse zeigen deutlich, dass ETA (ω6, ω3), das in dem Ausgangsmaterial vor der Reinigung enthalten war, deutlich reduziert wurde. Weiterhin ist es deutlich, dass die Ethylester von EPA und DHA selektiv gereinigt werden.
Beispiel 2
Eine Glassäule (20 mm Innendurchmesser × 300 mm in der Länge) wurde trocken mit 20 g Diatomeenerde („Extrelut® 13076", erhältlich von Merck Co., Ltd.) mit einer Porengröße von 4000 nm, einer spezifischen Oberfläche von 1,01 m²/g, einem Porenvolumen von 1,2 ml/g und einer Schüttdichte von 0,24 g/ml befüllt. Eine wässrige Lösung von 20 g Silbernitrat in 10 ml Wasser wurde durch die Säule, die mit der Diatomeenerde befüllt war, strömen gelassen. Die Säule wurde für 30 Minuten stehen gelassen, um das Silbersalz auf Diatomeenerde aufzuziehen. Anschließend wurde Hexan durch die Säule strömen gelassen, um die Säule mit Hexan auszutauschen.
10 g eines Rohmaterials, einer Ethyestermischung einer hoch-ungesättigten Fettsäure mit der in Tabelle 2 gezeigten Zusammensetzung, wurde in 10 ml Hexan gelöst, um eine Hexanlösung herzustellen. Diese Lösung wurde durch die Säule strömen gelassen. Anfangs wurde die Säule mit 90 ml Hexan bei einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, ein Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, was 6,76 g (Ausbeute 67,6%) einer ersten Effluentfraktion zu ergeben. Als nächstes wurde die Säule mit 290 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, wodurch 2,96 g (Ausbeute 29,6%) einer zweiten Effluentfraktion zu ergeben.
Die resultierenden gereinigten Ethylester der Fettsäuren wurde durch Gaschromatographie mit den folgenden in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen analysiert.
Tabelle 2
Das obige Resultat zeigt deutlich, dass selbst wenn das Rohmaterial EPA von hoher Reinheit enthielt, ETA (ω6, ω3), das darin vor der Reinigung enthalten ist, stark reduziert wurde. Weiterhin ist ersichtlich, dass der Ethylester von EPA selektiv gereinigt wurde bis zu einem Grad von 98% oder mehr, was das Niveau für Arzneimittel erfüllte.
Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 1

i) Für Beispiel 3 wurden drei Glassäulen (20 mm im Innendurchmesser × 300 mm in der Länge) jeweils trocken befällt mit 20 g Diatomeenerde („Extrelut® 13076", erhältlich von Merck Co., Ltd.) mit einer Porengröße von 400 nm, einer spezifischen Oberfläche von 1,01 m²/g, einem Porenvolumen von 1,2 ml/g und einer Schüttdichte von 0,24 g/ml. Anschließend wurden 14,20 g, 17,31 g und 20,42 g Silbernitrat gelöst in 7,1 ml, 8,7 ml und 10,2 ml Wasser, um wässrige Lösungen von Silbernitrat herzustellen. Jede wässrige Lösung des Silbernitrates wurde durch jede Säule gefüllt mit Diatomeenerde strömen gelassen. Die Säulen wurden für 30 Minuten stehen gelassen, um das Silbersalz auf die Diatomeenerde aufzuziehen. In diesem Fall betrug das auf die Diatomeenerde aufgezogene Silbernitrat in jeder Säule 45%, 55% bzw. 65%, ausgedrückt als Silber, bezogen auf das Gewicht der Diatomeenerde. Anschließend wurde Hexan über die Säule gegeben, um die Säule mit Hexan auszutauschen.
ii) Für das Vergleichsbeispiel 1 wurden drei Glassäulen (20 mm im Innendurchmesser × 300 mm in der Länge) jeweils trocken gefüllt mit 20 g Silikagel („Silikagel® 60 107734", erhältlich von Merck Co., Ltd.) mit einem Partikeldurchmesser von 0,063–0,2 mm. Anschließend wurden 14,20 g, 17,31 g bzw. 20,42 g Silbernitrat in 7,1 ml, 8,7 ml bzw. 10,2 ml Wasser gelöst, um wässrige Lösungen von Silbernitrat herzustellen. Jede wässrige Lösung des Silbernitrats wurde durch jede Säule gefüllt mit Silikagel strömen gelassen. Die Säulen wurden für 30 Minuten stehen gelassen, um das Silbersalz auf das Silikagel aufzuziehen. In diesem Fall betrug das auf das Silikagel aufgezogene Silbernitrat in jeder Kolonne 45%, 55% bzw. 65%, ausgedrückt als Silber, bezogen auf das Gewicht des Silikagels. Anschließend wurde Hexan über die Säule gegeben, um die Säule mit Hexan auszutauschen.
iii) 7,1 g, 8,7 g bzw. 10,2 g eines Rohmaterials, einer Ethylestermischung hoch-ungesättigter Fettsäuren mit einer in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung wurden in 7,1 ml, 8,7 ml bzw. 10,2 ml Hexan gelöst, um Hexanlösungen herzustellen. Jede Hexanlösung wurde über jede Säule gegeben. Anfangs wurden die Säulen mit 63,9 ml, 78,3 ml bzw. 91,8 ml Hexan mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, das Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, wodurch die ersten Effluentfraktionen erhalten wurden. Anschließend wurden die Säulen mit 206 ml, 252 ml bzw. 296 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, bei einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, ein Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingeengt, um das Eluat einzuengen, wodurch die zweiten Effluentfraktionen erhalten wurden.

Weiter wurden die Säulen mit 71 ml, 87 ml bzw. 102 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Gew.-% Methanol enthielt, mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, bei einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min., ein Eluat aus der Säule isoliert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, wodurch eine dritte Effluentfraktion erhalten wurde.
Die gereinigten Ethylester der Fettsäuren, die in den zweiten Effluentfraktionen erhalten worden waren, wurden durch Gaschromatographie mit den in Tabelle 3 gezeigten Ergebnissen analysiert.
Wie in Tabelle 3 gezeigt, zeigte Diatomeenerde als Träger, selbst wenn die aufgezogene Silbermenge variiert wurde, eine geringfügig höhere Fähigkeit der Trennung von ETA (ω6, ω3) als Silikagel. Wenn eine gesättigte Natriumchloridlösung zu dem Ausströmenden gegeben wurde, wurde das Ausströmende aus der mit Silikagel gefüllten Säule trübe, was bestätigte, dass sich Silberchlorid bildete. Keine Änderung wurde jedoch beobachtet in dem Effluent aus der mit Diatomeenerde gefüllten Säule. Im Falle des Silikagels war die Menge des aufgezogenen Silbersalzes oberhalb von 45% ausgedrückt als Silber bezogen auf dem Gewicht des Trägers, was jenseits der Grenzen der Fähigkeit des Silikagels lag, Silbersalze darauf zu halten, was dadurch bestätigt wurde, dass Silbersalz aus der Säule austrat. Aus diesem Ergebnis war zu schließen, dass die Verfahren aus dem Stand der Technik, die Silikagel als Träger verwenden, einen zusätzlichen Schritt für die Abtrennung des Silbers erfordern, da Silberionen in dem Ausströmenden enthalten sein würden nach der Reinigung der Säule, und dass die Trennfähigkeit der Säule reduziert sein würde infolge der reduzierten Menge der in der Säule enthaltenen Silberionen.
Beispiel 4
Eine Glassäule (90 mm Innendurchmesser × 300 mm in der Länge) wurde trocken mit 500 g Diatomeenerde („Extrelut® 13076", erhältlich von Merck Co., Ltd.) mit einer Porengröße von 4000 nm, einer spezifischen Oberfläche von 1,01 m²/g, einem Porenvolumen von 1,2 ml/g und einer Schüttdichte von 0,24 g/ml gefüllt. Eine wässrige Lösung von 500 g Silbernitrat in 250 ml Wasser wurde durch die Säule, die mit Diatomeenerde gefüllt war, strömen gelassen. Die Säule wurde für 30 Minuten stehen gelassen, um das Silbersalz auf die Diatomeenerde aufzuziehen. Anschließend wurde Hexan über die Säule gegeben, um die Säule mit Hexan auszutauschen.
250 g eines Ausgangsmaterials, einer Ethylestermischung von hoch-ungesättigten Fettsäuren mit der in Tabelle 4 gezeigten Zusammensetzung, wurden in 250 ml Hexan gelöst, um eine Hexanlösung herzustellen. Diese Lösung wurde über die Säule gegeben. Anfänglich wurde die Säule mit 2250 ml Hexan mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, das Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat zu extrudieren, wodurch 157,18 g (Ausbeute 62,87%) einer ersten Effluentfraktion zu ergeben. Als nächstes wurde die Säule mit 7250 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, ein Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, wodurch 84,93 g (Ausbeute 33,97%) einer zweiten Effluentfraktion erhalten wurden.
Weiter wurde die Säule mit 2500 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, ein Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, wodurch 2,59 g (Ausbeute 1,04%) einer dritten Effluentfraktion zu ergeben. Die resultierenden gereinigten Ethylester der Fettsäuren wurden analysiert durch Gaschromatographie mit den folgenden in Tabelle 4 gezeigten Ergebnissen.
Tabelle 4
Selbst wenn die Größe der Säule erhöht wurde, zeigte das vorliegende Verfahren eine hohe Selektivität von EPA und DHA wie in Beispiel 1 und stellte reproduzierbare Ergebnisse von Beispiel 1 im Hinblick auf die Beladung der Säule, die Menge der Entwicklungslösungsmittel und der Ausbeute der resultierenden gereinigten Fettsäuren bereit.
Beispiel 5
Eine Glassäule (60 mm Innendurchmesser × 495 mm in der Länge) wurde trocken mit 400 g Diatomeenerde („Extrelut® 13076", erhältlich von Merck Co., Ltd.) mit einer Porengröße von 4000 nm, einer spezifischen Oberfläche von 1,01 m²/g, einem Porenvolumen von 1,2 ml/g und einer Schüttdichte von 0,24 g/ml befüllt. Eine wässrige Lösung von 400 g Silbernitrat in 200 ml Wasser wurde durch die Säule, die mit Diatomeenerde gefüllt war, strömen gelassen. Die Säule wurde für 30 Minuten stehen gelassen, um das Silbersalz auf die Diatomeenerde aufzuziehen. Anschließend wurde Hexan über die Säule gegeben, um die Säule mit Hexan auszutauschen.
200 g eines Rohmaterials, einer Ethylestermischung von hoch-ungesättigten Fettsäuren mit der in Tabelle 5 gezeigten Zusammensetzung, wurden in 200 ml Hexan gelöst, um eine Hexanlösung herzustellen. Diese Lösung wurde über die Säule gegeben. Anfänglich wurde die Säule mit 2000 ml Hexan mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, das Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat zu extrudieren, wodurch 114,5 g (Ausbeute 57,25%) einer ersten Effluentfraktion zu ergeben. Als nächstes wurde die Säule mit 2000 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, ein Eluat aus der Säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, wodurch 29,3 g (Ausbeute 14,65%) einer zweiten Effluentfraktion erhalten wurden.
Weiter wurde die Säule mit 2500 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, mit einer linearen Geschwindigkeit von 0,5 bis 5,0 cm/min. entwickelt, ein Eluat aus der säule isoliert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, um das Eluat einzuengen, wodurch 36,19 g (Ausbeute 18,10%) einer dritten Effluentfraktion erhalten wurden. Die resultierenden gereinigten Ethylester der Fettsäuren wurden analysiert durch Gaschromatographie mit den folgenden in Tabelle 5 gezeigten Ergebnissen.
Tabelle 5
Wie in Tabelle 5 gezeigt, zeigte das vorliegende Verfahren eine hohe Selektivität für DHA, wenn hoch-ungesättigte Fettsäuren mit hohem DHA-Gehalt als Ausgangsmaterial verwendet wurden, und es konnten Fettsäuren, die DHA enthielten, in hoher Reinheit von 99% oder höher hergestellt werden.
Beispiel 6
Die Abtrennung und Reinigung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch die Lösungsmittel, die in Tabelle 6 gezeigt sind, das gemischte Lösungsmittel aus Toluol, das 0,5 Vol.-% Methanol enthielt, ersetzt wurden.
Die gereinigten Ethylester der Fettsäuren, erhalten in der zweiten Effluentfraktion, wurden durch Gaschromatographie analysiert mit den in der folgenden Tabelle 6 gezeigten Ergebnissen.
Das obige Ergebnis zeigt deutlich, dass ETA (ω6, ω3), das in dem Ausgangsmaterial vor der Reinigung enthalten ist, stark verringert wurde und auch die Zusammensetzung der ausströmenden Fettsäuren abhängig von der Art der Entwicklungslösungsmittel variierte, da die Polarität der Lösungsmittel verschieden war. Am meisten geeignete Lösungsmittelspezies und eine Kombination davon können aus der resultierenden Zusammensetzung und der Ausbeute der Fettsäuren oder ähnlichem entsprechend der Aufgabenstellung bestimmt werden.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Das Verfahren für die Trennung und Reinigung hoch-ungesättigter Fettsäuren oder deren Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung ist gekennzeichnet durch die Verwendung von Diatomeenerde als Träger mit einem hohen Porenvolumen, bevorzugt einer Porengröße von 0,1–10 μm, einer spezifischen Oberfläche von 0,5–50 m²/g, einem Porenvolumen von 1–10 ml/g und einer Schüttdichte von 0,1–0,3 g/ml, die eine spezifische Menge Silber (oder Silbersalz) in den Poren der Diatomeenerde trägt, worin ein Komplex mit dem zu behandelnden Ausgangsmateria, d. h. einer Mischung, die hoch-ungesättigte Fettsäuren oder deren Ester umfasst, mit dem Silberion gebildet wird, weiterhin durch die Verwendung der mit Silber beladenen Diatomeenerde innerhalb einer Kolonne, aber nicht chargenweise, und Durchströmen kleiner Mengen von Lösungsmittel nacheinander durch die Säule, wodurch selektiv EPA und DHA oder deren Ester abgetrennt und gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung des obigen Aufbaus kann mit Silber beladene Diatomeenerde leicht herstellen, kann EPA und DHA oder deren Ester in hoher Reinheit trennen und reinigen. Weiterhin kann die Menge der bei der Trennoperation verwendeten Lösungsmittel reduziert werden und die Dauer für die Trennung, die erforderlich ist, kann ebenfalls reduziert werden. Dies führt zu stark verringerten Betriebskosten, wenn die Trennung in industriellem Maßstab durchgeführt wird. Weiterhin kann ein Ausströmen von Silber verhindert werden und die Verunreinigung mit Silber der abgetrennten und gereinigten Produkte kann verhindert werden.

Claims

Verfahren zur selektiven Abtrennung und Reinigung von Eicosapentaen- und Docosahexaensäuren oder deren Ester aus einer Mischung, die eine hoch ungesättigte Fettsäure oder ein Derivat davon umfasst, welches Verfahren die Schritte umfasst: Durchströmen einer mit einem Träger gefüllten Kolonne mit einem wässrigen Medium, das ein Silbersalz umfasst, um das Silbersalz auf den Träger aufzuziehen; Durchströmen des mit dem Silbersalz beladenen Trägers in der Kolonne mit einer Lösungsmittellösung einer Mischung, die die hoch ungesättigte Fettsäure oder das Derivat davon umfasst; und Durchströmen der Kolonne mit einem Entwicklungslösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger Diatomeenerde ist,
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Diatomeenerde eine Porengröße von 0,1–10 μm, eine spezifische Oberfläche von 0,5–50 m²/g und ein Porenvolumen von 1–10 ml/g aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das aufgezogene Silbersalz nicht mehr als 65 Gew.-%, ausgedrückt als Silber, bezogen auf das Gewicht der Diatomeenerde, beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Entwicklungslösungsmittel Pentan, Hexan, Heptan, Toluol, Xylol, Methanol, Isopropylalkohol, Ethylacetat oder eine Mischung davon ist.
Verfahren nach Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, worin die hoch ungesättigte Fettsäure oder das Derivat davon aus einem Fischöl stammt.