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Verfahren zur Herstellung eines neuen anti-perniziosa-anämischen
Faktors
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen anti-perniziosa-anämischen
Faktors.
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Es wurden in letzter Zeit verschiedene anti-perniziosa-anämische
Faktoren in reiner oder im wesentlichen reiner Form isoliert, von denen Vitamin
B12 der hauptsächlichste ist [vgl. J. A. C. S., 7I, I854 (I949)].
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Andere solche Faktoren wurden als Vitamin Bl2a und Bl2b bezeichnet
und beschrieben [vgl. J. A. C. S., 7I, I5I4 (I949) und JA. C. S., 7I, 2952 (I949)].
Es wurde kürzlich festgestellt, daß Vitamin B12 a und Vitamin Bi2b identisch sind
[vgl. J. A. C. S., 72, 1042 (I950)].
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Vitamin B12 a wurde durch Reduktion von Vitamin B12 Verhalten. Vitamin
Bl2b wurde aus einem Kulturmedium isoliert, in dem der Organismus Streptomyces griseus
gezüchtet worden war. Der Ausdruck Vitamin Bl2b, wie er hierin benutzt wird, soll
das Reduktionsprodukt von Vitamin B12 und die Substanz bezeichnen, welche aus Fermentationen
von Streptomyces griseus isoliert wurde und die Eigenschaften von Vitamin BI2b besitzt,
wie sie in J.A.C.S., 7I, I5I4 (I949) beschrieben sind.
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Im Patent 876 443 ist ein Verfahren zur Reinigung von anti-perniziosa-anämisch
wirksamen Präparaten beschrieben, wobei diese Präparate mit salpetriger Säure behandelt
werden. Es wurde nun gefunden, daß in gewissen Fällen die Behandlung eines anti-perniziosa-anämisch
wirksamen Materials mit salpetriger Säure zur Bildung eines neuen Vitamin-Bl2-Faktors
Anlaß gibt. Ursprünglich wurde dieser neue Faktor mit Vitamin Bl2x bezeichnet. Um
jedoch die Terminologie der internationalen Gepflogenheit mehr anzupassen, wurde
der genannte neue Faktor als Vitamin B12c bezeichnet (vgl. Chemistry and Industry,
I950, S. 574)
Es wurde gefunden, daß dieser neue Faktor durch die
Behandlung von anti-perniziosa-anämisch wirksamen Materialien anderer Art als Vitamin
B12 selbst oder eines Additionsproduktes desselben erzeugt wird, und insbesondere
entsteht dieser bei der Behandlung der Vitamine B12b mit salpetriger Säure.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
eines neuen anti-perniziosa-anämischen Faktors, wobei ein anti-perniziosa-anämisch
wirksames Material, ausgenommen Vitamin B12 selbst und dessen Additionsverbindungen,
mit salpetriger Säure behandelt wird.
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Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die
neue Verbindung durch Behandlung von Vitamin Bl2b mit salpetriger Säure hergestellt.
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Es wurde gefunden, daß die Kultur von Streptomyces griseus auf oder
in einem flüssigen Medium antiperniziosa-anämisch wirksame Materialien erzeugt,
welche in manchen Fällen vorwiegend aus Vitamin B12 selbst und in anderen Fällen
aus Vitamin Bl2b bestehen.
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Deshalb ist es bei Verfahren, wo die Fermentation Vitamin Bl2b erzeugt
und die nachfolgende Reinigungsbehandlung einen Behandlungsschritt des aktiven Materials
mit salpetriger Säure umfaßt, in vielen Fällen möglich, die neue Verbindung Vitamin
B12 G ZU zu isolieren.
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Es sollen nun die Eigenschaften von Vitamin B12 beschrieben werden,
so daß es für den Fachmann verständlich ist, wie diese Verbindung von anderen Vitamin-Bl2-Faktoren
unterschieden werden kann.
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Vitamin B12 ist eine rote, kristalline, feste Substanz, welche im
wesentlichen dieselbe anti-perniziosaanämische Wirksamkeit wie Vitamin B12 und im
wesentlichen dieselbe Vitamin-B,2-Wirksamkeit, wie sie hierin definiert wird, besitzt.
Es hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften, wobei eine Kombination
von gewissen derselben es ermöglichen, es von bisher bekannten Gliedern der Vitamin-Bl2-Gruppe
zu unterscheiden.
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Ob eine gegebene Verbindung anti-perniziosaanämische Wirksamkeit
besitzt oder nicht, kann nur durch klinische Prüfungen endgültig bestimmt werden.
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Jedoch ergibt eine Prüfung seiner mikrobiologischen Wirksamkeit durch
den sogenannten Becher-Platten-Versuch (vgl. englisch: cup-plate assay), wobei Lactobacillus
lactis Dorner oder Lactobacillus Leichmanii und reines, wasserfreies Vitamin B12
als Standardpräparat verwendet werden (vgl. z. B. Cuthbertson, Biochem. J. I949
Proc. V), einen Hinweis auf die antiperniziosa-anämische Wirksamkeit, welcher in
den meisten Fällen zuverlässig ist.
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Die mikrobiologische Wirksamkeit, welche auf diesem Wege bestimmt
wird, soll hier als Vitamin-Bl2-Wirksamkeit bezeichnet werden. Materialien, welche
Vitamin-Bl2-Wirksamkeit besitzen, sollen hier als aktive Materialien bezeichnet
werden, unabhängig davon, aus welcher Quelle diese Materialien stammen.
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1. Ultraviolettlichtabsorptions - Charakteristica.
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Wasserfreies, reines, kristallines Vitamin B12@ (getrocknet bei 1000
und 5 mm Druck während 4112 Stunden) in Lösung von destilliertem Wasser zeigt charakteristische
Absorptionsmaxima bei 352 und 527,5 mµ, E ilcm = 153,2 bzw. 59,5; die Bande mit
dem Maximum bei 352 m hat eine Halbbandenbreite (half-band width) von 44 bis 45
m,u. Diese Eigenschaften ermöglichen es, im wesentlichen reines Vitamin B12c von
allen anderen bisher bekannten Gliedern der Vitamin-Bl2-Gruppe zu unterscheiden.
Es sei erwähnt, daß Vitamin Bl2b Maxima bei 351 und 525 my besitzt, jedoch beträgt
für diese Verbindung die Halbbandenbreite der Bande mit einem Maximum bei 352 m,u
3I mu. Die Ultraviolettlichtabsorptionskurven der Vitamine B12, Bl2b und B12 csind
in Fig. I der Zeichnung verglichen.
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Diese Kurven wurden alle unter Verwendung von Lösungen der reinen,
wasserfreien Materialien in des tilliertem Wasser bestimmt.
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2. Wenn reines, wasserfreies, kristallines Vitamin B12c in n/100-Natriumhydroxyd
gelöst wird, so wechseln seine Ultraviolettlichtabsorptionseigenschaften von den
oben angegebenen Werten zu den folgenden: Max. 357 und 535 my, E 1csm = I39 bzw.
62,5.
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In saurer Lösung bei einem pg-Wert von 4 ist keine Anderung im Absorptionsspektrum
bemerkbar.
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Eine ähnliche Verschiebung wird in dem Spektrum von Vitamin Bl2b
in alkalischer Lösung beobachtet.
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In Fig. 2 der Zeichnung werden die Ultraviolettlichtabsorptionsspektren
von Vitamin Bl2b undVitamin Bl2 e in wäßriger Lösung und in Lösung in n/100-NaOH
verglichen, wobei die voll ausgezogene Linie das Spektrum in Wasser und die punktierte
Linie das Spektrum in Alkali bedeuten.
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Vitamin B120und Vitamin Bl2b können weiter durch die Rf-Werte und
durch ihre Verteilungswerte in Lösungsmitteln unterschieden werden. Der Rf-Wert
(bestimmt, wie weiter unten beschrieben) von im wesentlichen reinem, kristallinem
Vitamin B12c ist größer als der Rf-Wert von Vitamin B12b, der unter identischen
Bedingungen bestimmt wurde. Wie experimentell bestimmt wurde, war unter identischen
Bedingungen der Ausdruck Rs-Wert von Vitamin B,2 Rf-Wert von Vitamin Bl2b in der
Größenordnung von 2,60 bis 3,0 (spezifische Beispiele hierfür sind 2,63 und 2,78),
während unter denselben Bedingungen der Ausdruck Rf-Wert von Vitamin Bl2b Ry-Wert
von Vitamin B12 in der Größenordnung von o,4I bis 0,45 lag (spezifische Beispiele
sind 0,42 und 0,44). Es sei erwähnt, daß diese Werte an den reinsten erhältlichen
Materialien nach mehrmaligem Umkristallisieren bestimmt wurden.
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Die Rf-Werte der aktiven Materialien können durch Papierstreifenchromatographie
folgendermaßen bestimmt werden: Eine starke wäßrige Lösung von reinem, kristallinem,
aktivem Material, welche 4 bis omg aktives Material/Milliliter enthält, wird als
Fleck, der von einem Tropfen der wäßrigen Lösung herrührt und nicht größer als etwa
5 Mikroliter im Volumen ist, auf einen Streifen von unbehandeltem Whatmann-Nr.-4-Filtrierpapier
aufgebracht. Der Streifen wird entwickelt, indem man bei 27° mit Wasser gesättigtes
sekundäres Butanol niederfließen läßt, wobei die Entwicklung in einem Raum unter
Temperaturkontrolle bei 27° durchgeführt wird. Ein Band, welches das aktive Material
enthält, wandert dann den Papier-
streifen abwärts. Der Ry-XU rt
eines aktiven Materials ist das Verhältnis des Abstandes der Front des dieses Material
enthaltenden Bandes vom Ausgangspunkt seiner Bewegung zur Länge des Abwärtswanderns
(vom Ursprung) der Lösungsmittelfront und wird so durch folgende Gleichung wiedergegeben:
Abstand der Front des Bandes vom Ursprung des Abwärtswanderns Länge des Abwärtswanderns
der Lösungsmittelfront
Der hier benutzte Ausdruck Rf-Wert bezieht sich also auf den
durch die obige Gleichung erhaltenen Wert aus den Resultaten der Papierstreifenchromatographie,
die, wie oben beschrieben, durchgeführt wurde.
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Es sei erwähnt, daß kein absoluter Rt-Wert für Vitamin B12 @ aufgestellt
wurde, da dieser mit einerAnzahl von Faktoren variieren kann. Es sei jedoch darauf
hingewiesen, daß die Verhältnisse der Rf-Werte der aktiven Materialien zuverlässiger
sind, vorausgesetzt, daß die Werte nebeneinander unter identischen Bedingungen verglichen
werden, wobei man derartige Vorsichtsmaßnahmen trifft, wie z. B. die Verwendung
von Papierstreifen, welche von denselben Bogen abgeschnitten sind. Auf diese Weise
ist es zweckmäßig, den Rf-Wert von Vitamin B12 c mit demjenigen von Vitamin B12b
zu vergleichen. DerRpWert der letzteren Verbindung kann dann gewünschtenfalls mit
dem Rf-Wert von reinem Vitamin B,2 verglichen werden.
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Es sei besonders betont, daß die Rf-Werte an den reinst möglichen
Materialien bestimmt werden sollen.
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Es sei weiter erwähnt, daß bei Bestimmung unter identischen Bedingungen
der Rf-Wert von Vitamin B12 c größer ist als derjenige von allen anderen Gliedern
der Vitamin-B,2-Gruppe.
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3. Vitamin B12 @ ist eine neutrale oder sehr schwach saure Substanz,
während Vitamin Bl2b basisch ist. Es ist deshalb möglich, zwischen diesen zwei Verbindungen
durch Verteilungsuntersuchungen, wie z. B. zwischen Wasser und einem Lösungsmittelgemisch,
das 2 Volumteile Butanol und I Volumteil Phenol enthält, zu unterscheiden. So wird
bei 20° ein gegebenes Volumen des erwähnten Lösungsmittelgemisches wenigstens etwa
80 % Vitamin B12 c aus einem gleichen Volumen einer wäßrigen Lösung extrahieren,
welche im wesentlichen reines, kristallines Vitamin B12 c bei einem PH-Wert von
4 bis 4,5 enthält. Bei derselben Temperatur wird das genannte Lösungsmittelgemisch
aus einem gleichen Volumen einer wäßrigen Lösung von reinem, kristallinem Vitamin
B12b bei demselben PH-Wert nicht mehr als etwa 10 % Vitamin Bl2b extrahieren.
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4. Wenn eine wäßrige Lösung von Vitamin B12 bei einem p-Wert von
4 der Destillation, vorzugsweise unter leicht vermindertem Druck, unterworfen wird,
so findet eine Wiederumwandlung zu Vitamin Bl2b statt, und es wurde gefunden, daß
das Destillat salpetrige Säure enthält. Diese Wiederumwandlung wurde beobachtet,
selbst wenn die Destillation bei so niedrigen Temperaturen wie von 40° durchgeführt
wird.
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Jedoch wird keine solche Umwandlung beobachtet, wenn eine neutrale
Lösung von Vitamin B,2 der Destilkation unterworfen wird. Während es nicht wünschenswert
erscheint, sich durch theoretische Betrachtungen zu beschränken, so sieht es aus,
als ob Vitamin B,2 @ ein Komplex wäre, der ein Oxyd des Stickstoffs enthält, das
z. B. Stickstoffoxyd sein kann.
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Es wurde nun festgestellt, daß Vitamin B12 im wesentlichen dieselbe
anti-perniziosa-anämische Wirksamkeit besitzt wie Vitamin B12. gemäß der Bestimmung
durch klinischen Test. Es hat auch im wesentlichen dieselbe mikrobiologische Wirksamkeit
wie Vitamin B,2, gemäß Bestimmung z. B. mit Lactobazillus lactis Dorner.
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Es werden nun Ergebnisse wiedergegeben, welche bezüglich der Wiederumwandlung
von Vitamin B12 in Vitamin B12b gemacht wurden.
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Beim Erhitzen im Autoklav bei einem pu-Wert von 4 in einer verschlossenen
Ampulle während 15 Minuten bleibt Vitamin B12c im wesentlichen unverändert.
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Beim Erhitzen in einem Autoklav in Flaschen mit Stopfen bei einem
p-Wert von 4 wird eine Lösung erhalten, welche Vitamin B12 und Vitamin Bl2b enthält.
Diese beiden Vitamine können durch Extraktion der Mischung mit einem Gemisch aus
einem Teil Phenol zu 3 Teilen n-Butanol getrennt werden, wobei der größte Teil von
Vitamin B12 in die Phenol-Butanol-Schicht extrahiert wird, während der größere Teil
von Vitamin Bl2b in der wäßrigen Phase verbleibt.
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Bei der Destillation einer Lösung von Vitamin B12 bei einem pn-Wert
von 4 enthält das Destillat salpetrige Säure, wie durch folgende Prüfung angezeigt
wird: a) Es ergibt mit Stärke-Jodid eine blaue Färbung; b) mit m-Phenylendiamin
wird eine braune Farbe erhalten, und c) mit Sulfanilsäure und a-Naphthylamin resultiert
eine rosa Färbung.
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Die Behandlung einer wäßrigen Lösung von Vitamin B12 mit Sulfaminsäure
(sulphamic acid) ergibt Vitamin Blab Eine ähnliche Behandlung der angesäuerten Lösungen
von Vitamin B,2, mit Harnstoff ergibt ebenfalls Vitamin Bi2b.
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Daraus ist zu schließen, daß in saurer Lösung bei etwa einem pEI-Wert
von 4 das folgende Gleichgewicht existiert: Vitamin Bl2e = Vitamin B12b + HNO2.
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Wenn die salpetrige Säure aus einer solchen Lösung entfernt wird,
so resultiert eine vollständige Wiederumwandlung von Vitamin B12c zu Vitamin B12b.
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Die Verwandtschaft zwischen den verschiedenen Vitaminen B12 kann
demgemäß schematisch folgendermaßen veranschaulicht werden: Streptomyces-griseus-Fermentationsflüssigkeit
| Reduktion |
| Vitamin B12 -> Vitamin Bl2b |
| 2 |
| 2 |
| 2 o |
| 2 |
| Y |
| Vitamin Bl2e |
Eine grobe Unterscheidung zwischen den drei obenerwähnten Vitaminen
B12 kann mittels Verteilungschromatographie durchgeführt werden, wobei Kieselgur
als Adsorbens und wassergesättigtes n-Butanol als Lösungsmittel verwendet werden.
Hierbei wird beobachtet, daß die Banden, welche jedes Vitamin enthalten, sich mit
folgenden relativen Geschwindigkeiten bewegen: Die schnellste Fortbewegung besitzt
Vitamin Bl2eX dann folgt Vitamin Bla und Vitamin B,2b als langsamstes.
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Bezüglich der Verfahren, durch welche die neue Verbindung Vitamin
B12 e hergestellt werden kann, wurde gefunden, daß die Behandlung mit salpetriger
Säure vorzugsweise in wäßriger Lösung durchgeführt wird, z. B. durch Zugabe eines
anorganischen Nitrits, wie Natriumnitrit, zu einer angesäuerten Lösung von Vitamin
Bl2b.
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Diese Behandlung wird vorzugsweise bei einem pg-Wert in dem Bereich
von I bis 5 durchgeführt. Es sei betont, daß die Reinheit des Materials, das mit
der salpetrigen Säure behandelt wird, nicht von Bedeutung ist, vorausgesetzt, daß
das Material einen Vitamin-Bl2-artigen Faktor besitzt, welcher zu Vitamin B12 umwandelbar
ist, z. B. Vitamin Bl2b.
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Im allgemeinen kann gesagt werden, daß die Bedingungen der Behandlung
mit salpetriger Säure so sein können, wie es in dem Patent 876 443 beschrieben ist.
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Bei der Erzeugung von Vitamin B12 ist es vorteilhaft, den Organismus
Streptomyces griseus unter solchen Bedingungen zu züchten, daß vorwiegend VitaminBl2b
entsteht, das aktive Material daraus zu isolieren und bei den nachfolgenden Reinigungsschritten
eine Behandlung mit salpetriger Säure einzuschließen, z. B. durch Anwendung des
Reinigungsverfahrens des Patents 876 443.
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Gegenwärtig ist es nicht möglich, exakte Züchtungsbedingungen für
den Organismus Streptomyces griseus aufzustellen, um durch Fermentation vorwiegend
Vitamin Bl2b zu erzielen. Demgemäß ist es notwendig, orientierende und versuchsweise
Fermentationen durchzuführen und jene Bedingungen auszuwählen, bei denen gefunden
wird, daß relativ große Mengen dieses Produktes gebildet werden.
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Bei der Isolierung und Reinigung des aktiven Fermentationsmaterials
können verschiedene Verfahren angewendet werden, wie Lösungsmittelextraktionen,
Adsorption an Adsorbentien, wie Aktivkohle und Silikagel, Ausfällung und ähnliche
Verfahren, vorausgesetzt, daß ein Arbeitsgang benutzt wird, bei dem das aktive Material
mit salpetriger Säure behandelt wird.
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Es seijedochnochmals darauf hingewiesen,daß bei der Handhabung mit
Lösungen von Vitamin B,20bei anderen p-Werten als bei etwa 7 größte Sorgfalt geübt
werden muß infolge der Gefahr der Wiederumwandlung in Vitamin Bl2b. So tritt, z.
B. wenn eine angesäuerte Lösung von Vitamin B120 unter vermindertem Druck verdampft
wird, ein Verlust an Stickstoffoxyd (nitrid oxide) ein, und es wurde gefunden, daß
die Lösung Vitamin B12b enthält.
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Die Durchführung der Erfindung soll durch folgende Beispiele näher
erläutert werden: Beispiel I Das Ausgangsmaterial für diesen Versuch war irgendein
kristallines Material, welches aus einer Streptomyces-griseus-Fermentation erhalten
wurde und von dem durch chromatographische Prüfung bekannt war, daß es eine Mischung
der Vitamin-Bl2-Faktoren enthält. 23 mg dieses Materials wurden in 10 ccm Wasser
gelöst und auf einen pu-Wert von 3,5 eingestellt. Die Lösung wurde zweimal mit jeweils
10 ccm einer Mischung von Phenol und Äther im Verhältnis 3: 2 extrahiert. Diese
Extrakte wurden ihrerseits wiederum mit zwei Portionen von je 10 ccm Wasser, das
auf ein pu von 3,5 eingestellt war, gewaschen. Die wäßrige Schicht und die Waschwässer
wurden vereinigt, mit Äther zur Entfernung des Phenols extrahiert und die Lösung
auf ein kleines Volumen konzentriert und aus Aceton kristallisiert. Diese Fraktion
A betrug 8,5 mg.
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Es zeigte sich durch Verteilungschromatographie, daß diese Fraktion
aus Vitamin Bl2b bestand. Der Phenol-Äther-Extrakt wurde mit mehreren Volumen Äther
verdünnt und mit kleinen Portionen Wasser geschüttelt, bis alle Farbe extrahiert
war. Da das Produkt noch einige basische Faktoren enthielt, wurde die Lösung auf
ein Volumen von 10 ccm konzentriert, auf ein PH von 3,5 eingestellt und zweimal
mit je 10 ccm einer Mischung von Phenol und Butanol im Verhältnis I: 3 extrahiert.
Die Extrakte wurden ihrerseits mit je zwei Portionen von 10 ccm Wasser, das auf
ein pn von 3,5 eingestellt war, gewaschen. Die wäßrige Schicht und die Waschwässer
wurden vereinigt, mit Äther extrahiert und konzentriert. Es zeigte sich durch koloritmetrischen
Test, daß diese Fraktion B 6,3 mg B,2-Faktoren enthielt, und es zeigte sich weiter,
daß sie hauptsächlich aus Vitamin B12b bestand. Die Phenol-Butanol-Schicht wurde
mit mehreren Volumen Äther vermischt und mit mehreren kleinen Portionen Wasser extrahiert,
bis alle.
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Farbe entfernt war. Diese Fraktion C enthielt nur neutrale Faktoren,
Vitamin B12 selbst und Vitamin B12 Diese Fraktion (3,7 mg) in einem Volumen von
20 ccm Wasser wurde mit 5 ccm 5°/Oiger wäßriger Sulfaminsäure behandelt. Nach 5
Minuten langem Stehen bei 200 wurde die Lösung mit I ccm Methyldioctylamin, das
in 10 ccm Chloroform gelöst war, extrahiert. Dies diente zur Entfernung der Sulfaminsäure.
Die Lösung wurde dann mit einer Mischung von Phenol und Butanol, wie oben beschrieben,
fraktioniert. Es zeigte sich, daß das aus der Phenol-Butanol-Schicht gewonnene Material
(Fraktion E) o,6 mgVitamin B12 enthielt.
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Die wäßrige Schicht (Fraktion F) enthielt 2,4 mg Vitamin Bl2b, das
von der Einwirkung der Sulfaminsäure auf das Vitamin B12 e, das in der Fraktion
C enthalten war, herrührte. Die Fraktionen B und F, welche hauptsächlich aus Vitamin
B1,b bestehen, wurden vereinigt, und die Lösung wurde mit 0,25 g Natriumnitrit und
Salzsäure (zur Einstellung des pn-Wertes auf etwa 3,5) behandelt. Die Lösung wurde
5 Minuten auf 65° erhitzt. Das resultierende Vitamin B12c wurde an 6o mg Adsorptionskohle
adsorbiert, welche mit Wasser gewaschen und mit 5o0i0igem wäßrigem Isopropylalkohol
eluiert wurde. Die entstehende 2 ccm tiefrote Lösung wurde unter vermindertem Druck
konzentriert und aus Aceton kristallisiert. Diese Fraktion H enthielt 5,omg
Vitamin
B, 2 e, das durch seine neutralen oder schwach sauren Eigenschaften und seine Absorptionsspektren
charakterisiert wurde.
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Beispiel 2 5 mg Vitamin B12 e wurden in 20 ccm Wasser gelöst, das
mit Salzsäure auf pH 3 eingestellt war. Die Lösung wurde unter leicht vermindertem
Druck auf etwa 0,5 ccm konzentriert, wobei die Temperatur der Flüssigkeit zwischen
40 und 50° gehalten wurde.
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Der Rückstand wurde durch Zugabe eines großen Überschusses Aceton
ausgefällt. Die Ausfällung wurde dann in wenigen Tropfen Wasser gelöst und Aceton
zugegeben, bis die Lösung leicht trüb wurde. Sie wurde zur Kristallisation gestellt
und ergab 3,5 mg kristallines Material. Das Produkt war Vitamin Bi2b, das durch
seine Basizität, das Absorptionsspektrum und das chromatographische Verhalten charakterisiert
wurde.
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Beispiel 3 100 g Kieselgur wurden in 800 ccm n-Butanol, das mit einer
20/0eigen wäßrigen Lösung von primärem Kaliumphosphat gesättigt war, suspendiert.
Unter heftigem mechanischem Rühren wurden langsam 50 ccm einer 20i0igen wäßrigen
Lösung von primärem Kaliumphosphat zugegeben. Die Suspension wurde einige Minuten
zwecks Entfernung von gelöster Luft unter vermindertem Druck gehalten. Die Suspension
wurde in eine Reihe von senkrechten Glasröhren gegossen, welche 1 cm Durchmesser
hatten und am Boden mit Baumwolle verstopft waren. Man ließ den Kieselgur absetzen
und das Lösungsmittel auf den Boden durchtropfen, dann wurde noch mehr Butanol,
das mit einer 2%igen wäßrigen Lösung von primärem Kaliumphosphat gesättigt war,
am oberen Ende der Säule zugegeben und durchsickern gelassen, bis die Säule aus
dem feuchten Kieselgur möglichst weit zusammengeschrumpft war. Zu einer dieser Säulen
wurde eine Lösung von 0,5 mg Vitamin Bl2b in I ccm n-Butanol, das mit einer 20/0eigen
wäßrigen Lösung von primärem Kaliumphosphat gesättigt war, gegeben. Man ließ die
Lösung in die Kieselgursäule eindringen, und dann wurde Butanol, das mit einer 2°/Oigen
wäßrigen Lösung von primärem Kaliumphosphat gesättigt war, sorgfältig am oberen
Ende zugegeben, bis es in einer Höhe von etwa 60 cm (2 ft.) über dem oberen Ende
des Kieselgurs stand, so daß eine hinreichende Flüssigkeitsschicht zur Verfügung
stand, um die Flüssigkeit mit hinreichender Geschwindigkeit durch die Säule durchzutreiben.
Es wurde beobachtet, daß das an der Säule durch das Vitamin B,2b gebildete blaßrote
Band sich sehr langsam mit einem R-Wert von o,o8 abwärts bewegte.
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Der R-Wert wird definiert als der Abstand vom oberen Ende der Kieselgursäule
bis zum unteren Ende des Bandes, geteilt durch den Abstand, in dem das Lösungsmittel
in dem Rohr oberhalb des Kieselgurs gefallen ist (einschließlich der Höhe, welche
durch die zuerst aufgebrachte Vitamin-B12 Lösung ursprünglich eingenommen wurde).
Eine zweite Säule wurde in derselben Weise mit Vitamin B12 beschickt, das einen
R-Wert von 0,83 ergab. Eine dritte Säule wurde mit Vitamin Bl2b beschickt, das einen
R-Wert von 0,9I ergab.
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Beispiel 4 Eine Jonophorese-Apparatur wurde beschickt mit einem Boratpuffer
vom ps 9 mit I,5 o/o Agar, wie sie von Gordon, Kiel und Sowesta beschrieben wurde
(vgl. Nature, 164, 499 [1949]). Eine Probe von reinem Vitamin B12 ß wurde zu dem
Agar in der Mittelkammer gegeben. Nachdem man einen Strom von 8o mA während 5 Stunden
durchgeschickt hat, hatte sich ein hellrotes Band 4,1 cm auf die Kathode hin bewegt,wobei
dessen Beweglichkeit 3,8 X IO-S cm2/Voltsekunde war. Unkorrigiert für Endosmose
(endosmosis). Das Material in diesem Band wurde mit Wasser ausgelaugt, die Lösung
neutralisiert und spektroskopisch geprüft. Die Lage des Maximums im Ultraviolett
(35I m,) und die Halbbandenbreite (33 m,u) erwiesen, daß eine Umwandlung in Vitamin
B12b stattgefunden hatte.
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Beispiel 5 2 mg Vitamin Bi2b, das durch Reduktion von Vitamin B12
hergestellt wurde, wurden in 9 ccm Wasser gelöst und 50 mg Natriumnitrit zugegeben.
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Der p-Wert wurde mit Salzsäure auf 3,5 bis 4 eingestellt und die Lösung
5 Minuten bei 60 bis 70° erhitzt und abkühlen gelassen. Der aktive Bestandteil wurde
an 25 mg Adsorptionskohle adsorbiert.
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Das Adsorbat wurde mit Wasser gewaschen, mit wenigen Kubikzentimetern
Isopropylalkohol eluiert und diese Lösung unter vermindertem Druck bis auf wenige
Tropfen konzentriert. Bei Zugabe von Aceton fand rasche Kristallisation statt. Das
erhaltene Produkt war Vitamin B12 , was sich durch Messung des Absorptionsspektrums,
durch das chromatographische Verhalten und durch die Beobachtung ergab, daß es durch
Phenol-Butanol aus einer Lösung beim PH 4,0 extrahiert wurde.
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Beispiel 6 Ein hochgereinigtes Konzentrat von Vitamin B12 b wurde
aus Streptomyces-griseus-Fermentationsflüssigkeit hergestellt und auf chromatographischem
Wege von anderen Faktoren der Vitamin-Bl2-Gruppe getrennt. Ein Teil dieses Materials
wurde auf ein Kieselgurverteilungschromatogramm aufgebracht und bewegte sich als
einzelnes, sehr langsames Band. Ein anderer Teil dieses Materials wurde bei einem
pH von 4,0 5 Minuten lang bei 70" mit Natriumnitrit behandelt. Dieses Produkt wurde
auf eine ähnliche Kieselgursäule aufgebracht und wanderte in einem einzelnen, schnellen
Band abwärts. Das rote Band wurde ausgeschnitten und mit 50°/Oigem Alkohol extrahiert.
Dieser Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen konzentriert
und Aceton zugegeben, worauf sich rasch Kristalle von
Vitamin B,56
bildeten. Dieses wurde durch die in dem vorhergehenden Beispiel erwähnten Methoden
charakterisiert.