DE1014711B - Verfahren zur Abtrennung und gegebenenfalls Reinigung von Cephalosporin C aus Cephalosporin N und C enthaltenden Mischungen - Google Patents

Description

DEUTSCHES

Es ist bekannt, daß man bei Fermentierung eines Nährmediums mit Schimmelpilzen der Gruppe, zu der Cephalosporium I. M. I. 49,137 (Amerikanische Kulturtypensammlung 11 550) gehört, ein Medium mit antibiotischer Wirksamkeit erhält. Die Isolierung der beiden verschiedenen Antibiotika aus dem Medium wurde bereits im einzelnen beschrieben. Eines dieser beiden Antibiotika wirkt im wesentlichen aktiv gegen grampositive Bakterien und wird mit Cephalosporin P bezeichnet. Das andere wird mit Cephalosporin N bezeichnet und stellt ein penicillinaseempfindliches Material dar, das sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Bakterien aktiv ist.

Es wurde nun festgestellt, daß bei rohen Herstellungsverfahren von Cephalosporin N, bei denen bei einem solchen p_H-Wert gearbeitet wird, daß Cephalosporin N in Cephalosporin-N-Penicillinsäure umgewandelt wird, beispielsweise bei einem p_H von 2,5 bis 5,5, eine Mischung von Cephalosporin-N-Penicillinsäure mit einem bisher ■ unbekannten antibiotischen Material erhalten wird. Dieses dritte antibiotische Material wird nachfolgend mit Cephalosporin C bezeichnet. Es ist wie Cephalosporin N sowohl gegen grampositive als auch gramnegative Bakterien aktiv, jedoch im Gegensatz zu Cephalosporin N unempfindlich gegen aus Bacillus subtilis hergestellte Penicillinase. Es ist in Wasser löslich und in Äthanol und Äther fast unlöslich. Man erkennt es an dem Ultraviolett-Absorptionsspektrum, das bei Vorliegen des Antibiotikums in Form einer wäßrigen Lösung des Natriumsalzes eine spezifische Drehung von [α] % + 103° und ein Ultraviolett - Absorptionsmaximum bei 260 ταμ mit E?*_m=200hat.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung und gegebenenfalls Reinigung von Cephalosporin C, das in Mischung mit Cephalosporin-N-Penicillinsäure erhalten wird, wenn man roh Cephalosporin N bei einem solchen p_H-Wert herstellt, daß es sich zu Cephalosporin-N-Penicillinsäure umsetzt. Das Cephalosporin C ist sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Bakterien aktiv und bei p_H-Werten von 2,5 bis 5 stabil.

Es wurde bereits vorgeschlagen, Cephalosporin N dadurch zu reinigen, daß man das Mycel aus der Fermentationsflüssigkeit entfernt, die Flüssigkeit mit Aktivkohle behandelt, das von der Kohle adsorbierte Material abschlämmt und mit Aluminiumoxyd in Berührung bringt. Das adsorbierte antibiotische Material wird dann von dem Aluminiumoxyd abgeschlämmt. Dabei erhält man Cephalosporin C zusammen mit Cephalosporin N in der Aufschlämmung von dem Aluminiumoxyd, so daß dieses Material eine wichtige Quelle für Cephalosporin C darstellt. Andere Quellen für Cephalosporin C sind die Fermentationsflüssigkeit selbst und roh hergestelltes Cephalosporin N, das in anderen Reinigungsstufen des Verfahrens oder in entsprechenden Stufen anderer Reini- _:

Verfahren zur Abtrennung
und gegebenenfalls Reinigung

von Cephalosporin C

aus Cephalosporin N und C enthaltenden

Mischungen

Anmelder:

National Research Development
Corporation, London

Vertreter:
Dr.-Ing. A. von Kreisler, Dr.-Ing. K. Schönwald,

Dipl.-Chem. Dr. phil. H. Siebeneicher

und Dr.-Ing. Th. Meyer, Patentanwälte,

Köln 1, Deichmannhaus

Beanspruchte Priorität:
Großbritannien vom 2. Februar und 16. Juni 1955

Edward Penley Abraham, Oxford,
und Guy Geoffrey Frederick Newton,
Headington, Oxford (Großbritannien),

sind als Erfinder genannt worden

gungsverfahren erhalten wird. Es ist für einen Fachmann keine Schwierigkeit, zu bestimmen, in welcher Reinigungsstufe eines jeden gegebenen Verfahrens Cephalosporin N entfernt werden kann, ohne daß gleichzeitig auch Cephalosporin C ausgeschieden wird. Roh hergestelltes Cephalosporin N kann beispielsweise der Wirkung geeignet hergestellter Penicillinase unterworfen werden oder bei einem p_H-Wert von 2,5 bis 5 gehalten und dann auf die gegen entsprechende Bakterien, z. B. B. coli, verbliebene Aktivität geprüft werden.

Cephalosporin C enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel und kein Halogen und/oder Phosphor. Die Elementaranalyse des Natriumsalzes und der freien Säure ergaben jeweils folgende Ergebnisse:

. Natriumsalz, gefunden C 39,5 und 40,0%, H 4,8 und 5,2 ⁰I₀, N 8,9 ⁰/₀, S 6,2 % und Na 4,9 %. Gemäß röntgeno-

709 65Ä394

graphischer Kristallanalyse betrug das Molekulargewicht 470 ±15. Titration 480 ± 15. Ci₆H₂₀O₈N₃SNa · 2 H₂O enthält theoretisch C 40,5 °/₀, H 5,1 °/₀, N 8,9%, S 6,7%, Na 4,9% und hat ein Molekulargewicht von 473. Freie Säure, gefunden C 44,4%, H 5,6%, N 9,8%,

S 7,3%.

C₁₆H,

,OoN,S · Η,Ο enthält theoretisch

C 44,5%, H 5,3%, N 9,7%, S 7,4%.

Die Analysenwerte zeigen, daß Cephalosporin C der Formel C₁₆H₂₁O₈N₃S entsprechen kann.

Cephalosporin C gibt eine Reaktion mit Ninhydrin. Die elektrometrische Titration zeigt, daß es sich um eine Monoaminodicarbonsäure handelt, die zwei Säuregruppen mit p_H-Werten von weniger als 2,6 und 3,1 und eine basische Gruppe mit einem pK-Wert von 9,8 besitzt. Bei der Ionophorese auf Papier in einem Kollidin-Acetat-Puffer bei einem p_H-Wert 7 wandert es zur Anode mit fast der gleichen Geschwindigkeit wie Cephalosporin N.

Das Infrarotspektrum des Natriumsalzes von Cephalosporin C (in Paraffinpaste) zeigt Bande bei folgenden Wellenlängen: 2,94 μ, 3,06 μ, 5,77 μ (Ester- oder Lactongruppen), 6,05 μ und 6,57 μ (C = O-Gruppe von monosubstituierten Amiden), 6,29 μ (-COO-), 7,17 μ und 7,36 μ (Isopropylgruppe). Die in Klammern angeführten Gruppen werden nur angenommen. Das Natriumsalz des Die Giftigkeit wurde nicht in durchgehenden biologischen Versuchen geprüft; es wird jedoch angenommen, daß sie nur gering ist, da Mäusen mindestens 10 mg des gereinigten Materials intravenös eingeführt werden können, ohne daß tödliche Wirkungen eintreten.

Gemäß der Erfindung wird Cephalosporin C aus einer Mischung mit Cephalosporin N abgetrennt, indem man die Mischung durch zwei Lösungsmittel teilt, die jedes sowohl Cephalosporin N als auch Cephalosporin C lösen. Man kann jedes geeignete Lösungsmittelsystem verwenden, dessen Teilungskoeffizient bei p_H-Werten günstig liegt, bei denen die beiden Antibiotika stabil sind. Cephalosporin N ist bei p_H-Werten unter 5 instabil, während Cephalosporin C sogar bei dem niederen p_H-Wert von 2,5 noch stabil ist. Wenn daher die Aktivität von Cephalosporin N vernachlässigt werden kann, teilt man bei p_H-Werten, bei denen das Cephalosporin C allein stabil ist. Ein geeignetes Lösungsmittelsystem ist ein Phenol-Wasser-System, dessen eine Phase aus einer phenol· reichen Schicht besteht, während die andere Phase aus einer wasserreichen Schicht besteht. Bei einem p_H-Wert 2,5 beträgt das Konzentrationsverhältnis in der wasserreichen Phase zur Konzentration in der phenolreichen Phase (K) für Cephalosporin N etwa 0,35 und für Cepha-

Cephalosporins C hat des weiteren ein Band bei 5,61 μ, 25 losporin C etwa 0,2. Bei einem p_H-Wert 6 liegen beide wie es auch Cephalosporin N und Natriumbenzylpeni- Antibiotika fast vollständig in der wasserreichen Phase cülin haben und das in der zuletztgenannten Verbindung vor. Es wurde jedoch festgestellt, daß der Teilurigsder C = O-Gruppe des geschlossenen /3-Lactamthia- koeffizient eines Phenol-Wasser-Systems in der Praxis zolidinring-Systems zugeschrieben wird. (Thompson, ausreichend verschieden bei p_H-Werten eingestellt werden Brattain, Randall und Rasmussen, The Chemistry 30 kann, bei denen beide Antibiotika stabil sind, beispiels-

35

of Penicillin, Kapitel 13, Princeton-University-Press, 1949.)

Im Gegensatz zu Cephalosporin N und Benzylpenicillin ist jedoch Cephalosporin C in wäßriger Lösung bei einem p_n-Wert von 2,5 stabil. Bei einem p_H-Wert von 12 wird es aber sehr schnell inaktiviert. Nach 2 Stunden bei einem p_H von 12 zeigt eine Gegentitration, daß sich zwei saure Gruppen je Mol gebildet haben. Unter gleichen Bedingungen wird aus Cephalosporin N und Benzylpenicillin nur eine Säuregruppe je Mol freigemacht. In Gegenwart von bestimmten Schwermetallionen, wie Cu ++, Pb ++ und Zn ^{+ +} , ist Cephalosporin C stabiler als Cephalosporin N oder Benzylpenicillin.

Bei der Hydrolyse mit Säure (n-HCl, 8 Stunden bei 110°) ergibt Cephalosporine wie CephalosporinN Kohlendioxyd und eine saure Aminosäure, die bei papierchromatographischer Behandlung wie a-Amino adipinsäure reagiert. Das bei der Umsetzung von Cephalosporin C mit 1, 2, 4-Fluordinitrobenzol erhaltene Produkt ergibt bei der Hydrolyse ein Produkt, das wie das Dinitrophenylderivat von a-Aminoadipinsäure reagiert. Es scheint demzufolge so, als ob die a-Aminogrupps der a-Aminoadipinsäure im Cephalosporin C frei ist, und auch (da diese Aminogruppe einen pK-Wert von 9,8 hat), als ob die a-Carboxylgruppe frei ist.

Die Bildung einer wesentlichen Menge Penicillamin (ß-Thiolvalin) bei der Hydrolyse von Cephalosporin C konnte nicht bewiesen werden, jedoch ergab die Hydrolyse des daraus bei der Hydrogenolyse mit Ranay-Nickel erhaltenen Produktes Aminosäuren, die wie a-Aminoadipinsäure bzw. wie Valin reagieren, wenn sie papierchromatographisch behandelt werden.

Cephalosporin C hat die gleiche Aktivität gegen grampositive und gramnegative Bakterien. Gegen Staph. aureus und Salm, typhi ist es in vitro weniger wirksam als Cephalosporin N und hat eine Aktivität von 8 bis Einheiten (die Einheit ist die von Abraham, Newton und Haie 1954, Biochem j. 58.94, angeführte). Gegen Bact. coli hat es die gleiche Aktivität wie Cephalosporin N.

weise auf Werte größer als 5, wenn man eine geringe Menge, z. B. von 1 bis 10%, einer organischen tertiären Base, wie Dimethylanilin, Pyridin, Lutidin oder Kollidän, zusetzt.

Ähnliche Wirkungen werden nicht nur mit Phenol selbst, sondern auch mit einfachen alkylsubstituierten Phenolen, wie Kresolen und Xylenolen, erhalten.

Die Trennung der beiden Antibiotika durch Lösungsmittelfraktionierung stellt ein langwieriges Verfahren dar, das eine beträchtliche Anzahl von Verfahrensstufen umfaßt. Wenn es nicht erforderlich ist, das Cephalosporin N in aktiver Form zurückzubehalten, kann die Abtrennung des Cephalosporins C in ganz einfacher Weise dadurch erfolgen, daß man das Cephalosporin N in eine Mischung von Cephalosporin-N-Penicillinsäure umwandelt und die entstehende Mischung zur Abtrennung des Cephalosporins C beispielsweise einer Lösungsmittelfraktionieniög durch fraktionierte Adsorption auf einem festen Adsorbenten, wie Aluminiumoxyd, oder einem anionenaustauschenden Material unterwirft und dabei die Penicillinsäure in ein unlösliches Derivat umwandelt oder indem man diese Verfahren verbindet. Das geeigneteste Verfahren zur Umwandlung des Cephalosporin N in die, entsprechende Penicillinsäure besteht darin, daß man die Mischung bei einem p_H-Wert, bei dem CephalosporinN instabil ist, hält. Die Umwandlung kann dann einfach bewirkt werden, wenn man die Mischung 2 Stunden bei einem p_H von 3 und einer Temperatur von 37° hält.

Folgende Verfahren zur Trennung von Cephalosporin C von Cephalosporin-N-Penicillinsäure ergaben gute Ergebnisse :

1. Eine wäßrige Lösung der Mischung wurde in eine Kolonne mit einem anionenaustauschenden Harz, wie es unter der handelsüblichen Bezeichnung »Amberlite IR4B .-verkauft wird, gegeben und mit einer verdünnten Säure und einer geeigneten Pufferlösung, wie wäßrigem Ammoniumformiat oder Ammoniumacetat mit einem ρ_Η zwischen 3,2 und 5,0, oder mit einer wäßrigen Lösang einer tertiären Base, wie Pyridin, die teilweise mit Schwefelsäure oder Oxalsäure neutralisiert ist, die :Tien-

60

nung bewirkt. Von der Kolonne wird zunächst ein Band aus Cephalosporin-N-Penicillinsäure vor einem Cephalosporin-C-Band ausgesandt.

2. Eine wäßrige Lösung der Mischung wurde in einer Verteilervorrichtung im Gegenstrom unter schwach sauren Bedingungen in ein zweiphasiges Lösungsmittelsystem aus Wasser und Phenol eingeführt (oder einem geeigneten substituierten Phenol, wie Kresol, oder einem Xylenol). Gewünschtenfalls können die Teilungskoeffizienten des Systems auf einen p_H-Wert von 2 bis 5 durch Zusatz von Essigsäure oder eines Ammoniumacetats oder Ammoniumformiatpuffers eingestellt werden. Es wurde so lange behandelt, bis Cephalosporin C und Cephalosporin-N-Penicillinsäure getrennte Bänder zeigten. Die Bedingungen wurden vorzugsweise derart eingestellt, daß Cephalosporin C aus der Vorrichtung in wäßriger Phase abgezogen wird.

3. Eine wäßrige Lösung der Mischung wurde in eine Kolonne mit mit Säure gewaschenem Aluminiumoxyd eingegeben und die Aufschlämmung mit einer verdünnten wäßrigen Alkalilösung, wie 0,01 n-Natriumhydroxyd bewirkt. Aus der Kolonne gewinnt man Cephalosporin C als Lösung des Natriumsalzes vor der Cephalosporin-N-Penicillinsäure.

4. Eine wäßrige Lösung eines Quecksilberchlorids wurde zu einer Lösung zugegeben, die eine rohe Mischung von Cephalosporin C und Cephalosporin-N-Penicillinsäure enthält, wobei die letztere Verbindung in ein Penicillamin umgewandelt wird, das als Merkaptid ausgefüllt wird. Die obenstehende Lösung enthielt das rohe Cephalosporin C.

Gemäß der Erfindung kann man auch Cephalosporin N und Cephalosporin C in aktivem Zustand nach einem Verfahren erhalten, das weniger langwierig ist als das Lösungsmittel-Fraktionier-Verfahren. Dieses Verfahren beruht auf zwei Beobachtungen:

a) Bei der Abschlämmung einer Mischung der beiden Antibiotika von einem Anionen austauschenden Material mit einer Pufferlösung mit einem p_H-Wert 4,5 bis 5,5 werden beide Antibiotika in aktivem Zustand aufgeschlämmt und dabei das Cephalosporin N zuerst.

b) Besteht die Pufferlösung aus einer wäßrigen Lösung einer schwachen tertiären Base mit Schwefelsäure oder Oxalsäure, dann lassen sich die beiden Antibiotika leicht aus dem abgeschlämmten Material unter Bedingungen gewinnen, bei denen im wesentlichen kein Aktivitätsverlust erfolgt.

Gemäß einem weiteren wesentlichen Merkmal der Erfindung wird eine wäßrige Lösung behandelt, die sowohl Cephalosporin C als auch Cephalosporin N enthält, um eine Fraktion zu erhalten, in der das Verhältnis von Cephalosporin C zu Cephalosporin N größer ist als in der wäßrigen Lösung, sowie eine Fraktion, in der das Verhältnis von Cephalosporin C zu Cephalosporin N kleiner ist als in der wäßrigen Lösung. Bei diesem Verfahren wird die wäßrige Lösung mit einem Anionen austauschenden Material bei einem p_H-Wert von mindestens 4,9 in Berührung gebracht und nach und nach das Anionen austauschende Material mit einem wäßrigen Puffer mit dem gleichen p_H-Wert, z. B. zwischen 4,9 und 8,0, vorzugsweise mit einer wäßrigen Lösung von Schwefelsäure oder Oxalsäure, die eine ausreichende Menge einer tertiären Base enthält, die darin löslich ist und dadurch ein p_H-Wert von 4,9 bis 5,5 eingestellt wird, abgeschlämmt. Man fängt dann getrennt einen Anteil des Abgeschlämmten auf, in dem das Verhältnis von Cephalosporin C zu Cephalosporin N kleiner ist als in der wäßrigen Lösung, und einen anderen Anteil, in dem das Verhältnis von Cephalosporin C zu Cephalosporin N größer ist als in der wäßrigen Lösung. Es wird darauf hingewiesen, daß bei p_H-Werten unter 4,9 die Deaktivierung des Cephalosporins N wahrscheinlich auf Grund der Instabilität gegen Säuren ansteigt, während bei p_H-Werten über 8 Cephalosporin C deaktiviert wird und bei einem p_H 11 vollständig deaktiviert ist. In dem niederen p_H-Bereich kann man die Deaktivierung von Cephalosporin N durch Arbeiten bei tiefen Temperaturen verzögern, so daß man bei p_H-Werten unter 4,9 arbeiten kann, wenn man die Temperatur unter etwa 7 oder 8° hält. Es tritt jedoch

ίο ein nicht zu vermeidender geringer Verlust an Cephalosporin N ein.

Das zur Abschlämmung der Anionenaustauscherkolonne verwendete Schlämmittel ist vorzugsweise eine Lösung von Schwefelsäure oder Oxalsäure, die eine ausreichende Menge einer schwachen tertiären Base enthält, die in der Lösung löslich ist und einen p_H-Wert von 4,9 bis 5,5 einstellt. Die genaue Art der tertiären Base ist unwichtig. Da die Lösung abgepuffert werden muß, ist es nur erforderlich, eine Base zu verwenden, die bei An-

ao wendung in dem erforderlichen p_H-Bereich ausreichend schwach ist. Man muß bei der Auswahl der Base darauf achten, daß die Base leicht von den Antibiotika entfernt werden kann, wenn man diese in reinerer Form in den letzten Verfahrensstufen erhalten will.

Geeigneterweise wird die Base durch Abdampfen entfernt. Da die Antibiotika im allgemeinen thermolabil sind, ist es vorteilhaft, eine Base zu verwenden, die bei relativ niederen Temperaturen bei solchen Vakuumgraden, die handelsüblich zur Anwendung gelangen, flüchtig ist. In der Praxis hat sich Pyridin als eine geeignete Verbindung gezeigt. Man hat auch Collidin und Lutidin als Basen verwendet, jedoch werden diese geeigneter durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Benzol, entfernt.

Die nach der beschriebenen Verfahrensweise erhaltenen Produkte, d. h. eine vorwiegend Cephalosporin N und eine vorwiegend Cephalosporin C enthaltende Mischung, enthalten beide Oxalsäure oder Schwefelsäure. Da die Gegenwart dieser Säuren in den späteren Verfahrensstufen nicht erforderlich ist, kann man sie auf verhältnismäßig einfache Weise entfernen. Beide Säuren bilden mit Erdalkalimetallen unlösliche Salze und werden daher gemäß einem Merkmal der Erfindung aus der Mischung in Gegenwart eines Erdalkalihydroxyds, vorzugsweise Bariumhydroxyd, ausgefüllt.

Durch die Behandlung mit überschüssigem Erdalkalihydroxyd zur Entfernung von Oxal- oder Schwefelsäure wird das Antibiotikum in sein Erdalkalisalz umgewandelt. Üblicherweise werden die Antibiotika in Form ihrer Natriumsalze verwendet, und daher fällt man die Erdalkaliionen durch Zugabe einer äquivalenten Menge eines Alkalisulfates aus oder bringt vorzugsweise die überstehende Flüssigkeit mit einem kationenaustauschenden Harz oder einem natürlichen Zeolith in der Natriumform in Berührung, um in das Natriumsalz umzuwandeln. Etwa in der Cephalosporin-C-reichen Fraktion verbliebenes Cephalosporin N kann entfernt werden, indem man es durch Säurehydrolyse in seine Penicillinsäure umwandelt oder durch eine Penicillinasemasse, für die Cephalosporin C unempfindlich ist, behandelt und dann die Penicillinsäure von dem Cephalosporin C abtrennt.

Nach Abtrennung des Cephalosporins N oder der

Penicillinsäure kann man das Cephalosporin C nach irgendeinem der Reinigungsverfahren für Cephalosporin N reinigen. Im allgemeinen sind diese Verfahren sehr einfach durchzuführen, da Cephalosporin C in sauren Lösungen stabil ist.

Wenn bei dem Reinigungsverfahren Ammoniumacetat- oder Ammoniumformiatpuffer angewendet werden, können die Puffer aus der gebildeten Lösung von Cepha-

losporin C durch Abdampfen oder Sublimieren im Hochvakuum oder durch Elektrophorese entfernt werden (beispielsweise unter Verwendung einer Zelle mit vier Abteilungen nach Synge, Biochem. J., 1951, 49, S. 642) oder durch Verwendung eines geeigneten Ionen austauschenden Harzes.

Lösungen von freiem Cephalosporin C, die entweder durch Verwendung einer Anionen austauschenden Kolonne oder durch Trennung im Gegenstrom erhalten worden sind, können im Vakuum zur Trockne eingedampft werden und das Cephalosporin C dann durch eine andere Anionen austauschende Kolonne zur weiteren Reinigung hindurchgeleitet werden. Das gereinigte Cephalosporin C kann gewtinschtenfalls durch Auflösen in Wasser und Einstellen des p_H-Wertes auf 6,0 mit Natriumhydroxyd in das Natriumsalz umgewandelt Werden.

Lösungen des Natriumsalzes von Cephalosporin C, die nach einem dieser Verfahren erhalten wurden, können, einen p_H-Wert zwischen 2,7 und 3,0 aufwies. Die Lösung wurde dann auf 37° erhitzt und in halbstündigen Abständen Proben entnommen. Die Proben wurden: mit Wasser verdünnt, um Lösungen von 0,075 mg/ccm zuierhalten. Die optische Dichte dieser Lösungen bei 240 ΐήμ wurde mit einer Lösung der Blindprobe verglichen, die «in gleicher Weise verdünnt worden war. Die Umsetzung ist vollständig, wenn kein weiterer Anstieg der optischen Dichte bei 240 ΐημ festgestellt werden kann (120 bis 180

ίο Minuten). Der Anstieg der Dichte bei 240 πιμ betrug im allgemeinen 0,3 Dichteeinheiten bei Verwendung einer 1-cm-Zelle und einer Konzentration von 0,075 mg/ccm. Nach vollständiger Wiederanlagerung des Cephalosporin N an die Penicillinsäure wurde die Lösung zur Trockne erstarren gelassen, und man erhielt 7,0 g der Mischung, Nach dem Verfahren von Hirs, Moore und Stein (1952, J. Biol. Chem., 195, S. 699) wurde ein Anionen austauschendes Harz (Amberlite XE 59) abgepuffert mit 0,2 Mol Ammoniumformiat mit einem p_H-Wert von._; 3,0

wenn erforderlich, unter Verwendung von Aktivkohle ao bis 3,2 hergestellt. Eine Kolonne von 59 χ 4 cm wurde entfärbt und im Vakuum konzentriert werden. Das mit dem gepufferten Harz gefüllt und dann 500 ecm Natriumsalz von Cephalosporin C bildet monokline 0,2 M Ammoniumformiat mit einem Gehalt von 0,5 %

~ " Thiadiglykol durch die Kolonne durchsickern gelassen.

3,5 g der Mischung von Cephalosporin C und Cephalosporin-N-Penicillinsäure wurden in 30 ecm 0,2 M Puffer gelöst und die Lösung auf einen p_H von 0,2 Einheiten tiber dem des Puffers in der Kolonne eingestellt. Die Lösung wurde in 3 χ 10 ecm Anteilen durch die Kolonne geschickt. Die Fließgeschwindigkeit in der Kolonne wurde derart eingestellt, daß jeder 10-ccm-Anteil 10 bis 15 Minuten zum Sinken durch die Kolonne brauchte. Die Lösung wurde dann in der Kolonne mit 2 χ 10 ecm 0,2 M Puffer mit einem Gehalt von 0,5% Thiodiglykol gewaschen. Die Kolonne wurde dann mit der gleichen Pufferlösung gefüllt und mit einem konstanten Druckreservoir verbunden. Die Fließgeschwindigkeit in der Kolonne wurde so eingestellt, daß man in jeweils 30 Minuten 20 ecm Fraktionen gewann.

Von jeder vierten Fraktion wurden Proben entnommen und mit Wasser auf das Zehnfache verdünnt. Die,optischen Dichten der verdünnten Lösungen wurden. bei 240 und 260 πιμ, entsprechend einer in gleicher Weise verdünnten Probe der Pufferlösung, gemessen. Cephalosporin C befand sich hauptsächlich in den Fraktionen 96 bis 118. ;

Die Fraktionen 96 bis 118 wurden vereint und in einem rotierenden Vakuumverdampfer auf etwa 60 ecm bei einer Temperatur unter 25° konzentriert. Das Konzentrat wurde dann in einer Erstarrungs-Trockenvorrichtung zu einem dicken Sirup eingedampft. Der Sirup wurde zur Entfernung des Thiodiglykols zweimal mit Aceton gewaschen. Es verblieb eine Mischung von Ammoniumformiat mit dem Ammoniumsalz des Cephalosporin C. Das Ammoniumformiat kann entweder durch A. Sublimation im Hochvakuum oder B. durch Elektrophorese entfernt werden. i:

A. Die nach dem Waschen mit Aceton verbleibende feste Masse wurde in einigen ecm Wasser gelöst und in eine Sublimiervorrichtung übergeführt. Die Sublimation wurde in der von Hirs, Moore und Stein (1952, J. Biol. Chem., 195, 699) beschriebenen W^reise durchgeführt. Der Rückstand der Sublimation bestand im wesentlichen aus dem Ammoniumsalz von Cephalosporin C. Das Sefc wurde in 2 bis 3 ecm Wasser gelöst und die Lösung duüeh eine kleine Kolonne (0,5 X 0,5 cm) geleitet, die jniit, Aktivkohle zur Entfernung von Pigment gefüllt: wer., Beim langsamen Verdampfen des Durchlaufes kristallisiert das Produkt. ... ■ ._{:

B. Die nach dem Waschen mit Aceton verbleibende i^Site

monokline

Kristalle, die Kristallwasser enthalten. Es kann aus wäßrigem Äthanol oder wäßrigem Propanol umkristallisiert werden. Beim Trocknen bei Zimmertemperatur im Vakuum verliert es das Kristallwasser, das beim Stehenlassen an der Laboratoriumsluft schnell wieder aufgenommen wird.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Lösungsmittelsystem: Wasser, gesättigt mit Phenol (3,5 1), Phenol, gesättigt mit Wasser (0,41) Tetrachlorkohlenstoff (0,4 1), 2, 4, 6-Trimethylpyridin (71 ecm) und 1On-H₂SO₄ (10 ecm) wurden gemischt und bei 3° ein Gleichgewicht sich einstellen gelassen. Die wäßrige Phase hat einen p_H-Wert von 6,1, gemessen mit einer Glaselektrode.

Trennung: Das 2, 4, 6-Trimethylpyridinsalz des rohen Cephalosporin N (4,4 g) wurde m 60 ecm der oberen Phase und 40 ecm der unteren Phase des Lösungsmittelsystems gelöst und einer ganz aus Glas bestehenden Gegenstrom-Trennvorrichtung bei 3° in der von Abraham, Newton und Haie (1954, Biochem. J., 58, 94) beschriebenen Weise gelöst. Bei Versuchsende hatten 95 Übertragungen stattgefunden, wobei 77 obere Schichten (30 ecm) und 17 untere Schichten (0 bis 16) abgezogen waren, bis eine neue Ausbeute an oberer Schicht nach der 78. Übertragung nicht mehr in das Rohr vO« gegeben wurde. Cephalosporin C wurde in den Fraktionen 6 bis 16 der abgezogenen unteren Schichten festgestellt. Der Teilungskoeffizient

Konzentration in wäßriger Phase \

h. = I

Konzentration in der Phenol-Phase /

von Cephalosporin C betrug 0,12 und der von Cephalosporin N 0,29. Cephalosporin C wurde in Form des Bariumsalzes nach dem von Abraham und anderen (1954) mit dem Titel »Bestimmung des Trockengewichtes« System 1, Zweite abgezogene Reihen (Phenoalphase)«· beschriebenen Verfahren gewonnen.

Beispiel 2

6,9 g rohes Cephalosporin N, gewonnen durch Abschlämmen von Aluminiumox3'd, wurden in 110 ecm Wasser gelöst. Eine Probe wurde entnommen, um als Blindprobe bei den nachfolgenden spektroskopischen

Messungen zu dienen. Es wurde dann 10 n-Salzsäure

(üblicherweise etwa 1 ecm) zugegeben, bis die Lösung 70 Masse wurde in 25 ecm Wasser gelöst und in

9 10

Kammer einer vierabteiligen Zelle (Synge, 1951, Eisessig wurden gemischt und bei 20° ein Gleichgewicht

Biochem. J., 49, 642) eingebracht. Die Zelle war mit sich einstellen gelassen. Im Gleichgewichtszustand zeigte

einer Kühlschlange versehen, durch die Alkohol mit die obere Schicht an der Glaselektrode einen p_H-Wert

einer Temperatur von 5° gepumpt wurde. Die Essigsäure- von 2,6.

und die Ammoniakabteilungen wurden alle 3 Stunden 5 Trennung: 7,3 g einer Mischung von Cephalosporin-N-gewechselt. Nach 12 bis 16 Stunden bei Spannungen bis Penicillinsäure und Cephalosporin C, die, wie im Beispiel 1 zu 500 Volt war das Entsalzen üblicherweise beendet. beschrieben, erhalten worden war, wurden in 80 ecm der Die Lösungen aus den Essigsäureabteilungen wurden oberen Phase und 40 ecm der unteren Phase des Lösungsvereint und unter Erstarren getrocknet. Das Produkt, mittelsystems gelöst. 20 ecm der unteren Phase und das aus der freien Säure von Cephalosporin C, verun- io 40 ecm der oberen Phase dieser Lösung wurden in reinigt durch Spuren von Essigsäure, bestand, wurde Rohre »0,. und »1« einer aus Glas bestehenden Gegendurch Auflösen in einer geringen Menge Wasser von strom-Trennvorrichtung (Craig und Craig, 1950, Tech-Essigsäure frei gemacht und mit 2n-NaOH (0,3 bis nik und Organic Chemistry, Bd. 3, Kapitel 4) einge-0,2 ecm) neutralisiert. Beim langsamen Abdampfen bracht. 100 Übertragungen der oberen Schicht (40 ecm) kristallisierte das Natriumsalz. Die Kristalle wurden von 15 wurden unter Anwendung des Grundverfahrens durchetwa vorliegendem, nicht kristallinem Gum durch Waschen geführt und anschließend 300mal die obere Schicht mit 70°/₀igem Äthanol befreit und dann aus wäßrigem (40 ecm) aus dem Rohr »100.< abgezogen.
Alkohol umkristallisiert. Die Ausbeute an umkristalli- Analyse der Fraktionen: Von jeder zehnten Fraktion

siertem Material betrug 100 mg, bei 260 ma, E .¹^ =200. ^der abgezogenen Reihen wurden 0,2 ecm Probe ent-

^{1 i cm} 20 nommen und die sich beim Erwärmen mit 0,5 ecm

Beispiel 3 Ninhydrin entwickelnde Farbtiefe photometrisch nach

dem Verfahren von Moore and Stein (1948, J. Biol.

400 mg rohes Cephalosporin N wurden in 30 ecm Wasser Chem., 176, 367) gemessen. Beim Auftragen der auf diese gelöst und der p_H-Wert der Lösung mit 2 n-HCl auf 3,0 Weise erhaltenen optischen Dichten gegen die Fraktionseingestellt. Die Lösung wurde 2,5 Stunden bei 37° ge- 25 zahl, zeigte sich bei den Fraktionen 51 bis 120 ein Cephahalten und dann durch eine 14 cm lange Kolonne mit losporin-N-Penicillinsäure enthaltendes Band und bei den einem Gehalt von 10 g Aluminiumoxyd (Savory & Fraktionen 190 bis 300 ein Cephalosporin C enthaltendes Moore Ltd., London, Zur chromatographischen Analyse) Band. Der Wert für den Teilungskoeffizienten für Cephahindurchgeleitet. Das Aluminiumoxyd war vorher mit losporin C, errechnet aus der Lage der Spitze des Bandes, einer ausreichenden Menge verdünnter HCl gerührt 30 betrug 0,2 und für Cephalosporin - N - Penicillinworden, um den p_H-Wert der überstehenden Flüssigkeit säure 0,63.
auf ein Gleichgewicht bei 4,8 einzustellen. Die abgezogenen Fraktionen 200 bis 300 wurden vereint

Nach Zugabe der gesamten Lösung zu dem Aluminium- und in einem rotierenden Vakuumverdampfer auf etwa oxyd zeigte sich ein dünnes braunes Band im oberen Teil 500 ecm konzentriert (400 ecm wäßrige und 100 ecm der Kolonne, und ein schwaches gelbes Band erstreckte 35 phenolische Schicht). Das Konzentrat wurde dann in sich darunter bis zu zwei Dritteln der Kolonnenlänge. Der einen Scheidetrichter eingebracht und mit 400 ecm Durchlauf enthielt nur eine Spur ninhydrinpositives Tetrachlorkohlenstoff geschüttelt. Nach Trennung der Material. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen Schichten wurde die Tetrachlorkohlenstoffphase ver-(20 ecm) und dann mit 0,01 n-NaOH abgeschlämmt und worfen und die wäßrige Phase dreimal mit dem gleichen 5-ccm-Fraktionen aufgefangen. Die Fließgeschwindig- 40 Volumen Benzol extrahiert. Der wäßrige Rückstand keit betrug 1 ecm je Minute. Die Extinktion dieser wurde in dem rotierenden Verdampfer auf 100 ecm kon-Fraktionen wurde bei 240 und 260 ητ,μ in einem Beck- zentriert und dann zur Trockene erstarren gelassen. mann-Spektrophotometer gemessen. Spuren von Essigsäure wurden aus dem Produkt durch

Von Fraktion 13 an begann die Absorption bei beiden Auflösen in einem geringen Volumen Wasser und AusWellenlängen scharf zu steigen. Bei den Cephalosporin C 45 fällen des Cephalosporins C (freie Säure) mit einem Überenthaltenden Fraktionen 13 bis 17 war die Absorption schuß Aceton entfernt. Der Niederschlag wurde mit bei 260 τημ größer als bei 240 ΐημ. Fraktion 18 zeigte trockenem Aceton gewaschen.

einen plötzlichen Anstieg der relativen Absorption bei Die freie Säure wurde in einem geringen Volumen

240 τημ auf Grund der Gegenwart von Cephalosporin-N- Wasser gelöst und dann mit 2 n-NaOH (0,5 bis 0,5 ecm) Peniciilinsäure in dem Abgeschlämmten. Fraktion 21 50 neutralisiert. Beim langsamen Abdampfen der neutralienthielt ein gelbes Pigment in der Schlämmasse. Die sierten Lösung kristallisierte das Natriumsalz von Cepha-Fraktionen 13 bis 17 (p_H 5,0) wurden vereint und im losporin C aus. Die Kristalle wurden mit 70 °/_oigem Ätha-Vakuum auf 2 ecm konzentriert. Aus der gebildeten nol gewaschen und nicht kristallines Material dadurch Lösung wurde das Pigment entfernt, indem man durch entfernt. Ausbeute 168 mg, die aus wäßrigem Propanol eine kleine, mit Aktivkohle gefüllte. Kolonne (0,5 cm 55 umkristallisiert wurden.
Durchmesser χ 3 cm Höhe) hindurchleitete, die vorher

mit Wasser gewaschen worden war. Beim Konzentrieren Beispiel 5

des Durchlaufs im Vakuum erhielt man eine kristalline

Masse von Cephalosporin C. Das Produkt wog 33 mg. Als Ausgangsmaterial wurde Cephalosporin N ver-

Es enthielt geringe Mengen nicht kristalliner Bestand- 60 wendet, das durch Abschlämmen von Aluminiumoxyd teile. Durch Messen des Absorption bei 260 ΐημ wurde (vgl. britische Patentanmeldung 31 589/52) erhalten das Vorliegen von 25 mg Cephalosporin C festgestellt. Die worden war und eine Aktivität von 41 Einheiten je mg Kristalle wurden von der nicht kristallinen Masse durch besaß. Durch Zusatz von etwa 450 ecm n-Pyridin zu Rühren mit geringen Mengen von 70%igem Äthanol ab- 150 ecm 2 η-Schwefelsäure wurde eine Pufferlösung mit getrennt und abfiltriert. Das kristalline Produkt wurde 65 einem p_H-Wert von 5,0 hergestellt und die Lösung mit aus wäßrigem Propanol umkristallisiert. Wasser auf 1800 ecm verdünnt.

. . 280 mg des Cephalosporin N wurden in 2 ecm des

.Beispiel 4 Puffers gelöst und oben in eine Kolonne von 0,9 cm

Lösungsmittelsystem: 5 1 mit Phenol gesättigtes Durchmesser und 120 cm Höhe eingebracht, die mit dem Wasser, 4,5 1 mit Wasser gesättigtes Phenol und 0,45 1 70 unter der handelsüblichen Bezeichnung »Amberlite

IR 4 Β« vertriebenen Harz gefüllt war und die vor der Anwendung mit dem Puffer auf ein Gleichgewicht eingestellt war. Die Kolonne war von einem Mantel mit Umlaufwasser von 5° umgeben. Es wurde dann mit dem Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ecm je Stunde abgeschlämmt. Die abgeschlämmte Masse wurde durch Anwendung automatischer Fraktionsabscheider in Fraktionen von 1 ecm geteilt. Jede Fraktion wurde auf einen p_H-Wert 6 neutralisiert, indem sie in einem Rohr aufgefangen wurde, das 2 Tropfen Pyridin enthielt. Fraktion 48 der abgeschlämmten Masse zeigte antibacterieide Aktivität. Die Aktivität stieg bei Fraktion 58 auf ein Maximum an und fiel dann wieder ab, um bei Frak-

Produkt wog 70 mg. Das noch in diesem Produkt vorliegende Cephalosporin N wurde inaktiviert, indem man es 3 Stunden bei 37° in einer wäßrigen Lösung mit einem p_H-Wert 2,5 hielt. Die Aktivität des verbleibenden Materials, das vollständig aus Cephalosporin C bestattd, betrug 0,5 Einheiten je mg. Nach dem im Beispiel? beschriebenen Verfahren kann man aus diesem Material das kristalline Natriumsalz des Cephalosporin C aaskristallisieren.

Beispiel 7

Eine wäßrige Lösung von rohem Cephalosporin C, die von einer Anionen austauschenden Kolonne abgeschlämmt

tion 90 einen O-Wert zu erreichen.

Die im wesentlichen Cephalosporin N enthaltenden 15 worden war und noch geringe Mengen Cephalosporin N

Fraktionen 52 bis 65 wurden vereint und 0,3 η-Barium- enthielt, wurde auf einen p_H-Wert von 2,5 angesäuert und

hydroxydlösung zugegeben, bis der p_H-Wert auf 7,6 ange- 2 Stunden bei 37° gehalten. Die Inaktivierung von

stiegen war. Das ausgefällte Bariumsulfat wurde durch Cephalosporin N war dann vollständig. Die Lösung

Zentrifugieren entfernt und die obenstehende Lösung wurde zur Trockene erstarren gelassen, nachdem der

durch Erstarren getrocknet. Man erhielt 100 mg eines ao p_H-Wert auf 5,0 eingestellt worden war. Das Produkt

weißen Pulvers, das zur Entfernung von Pyridinspuren (600 mg, 0,45 Einheiten je mg) wurde zu 3 ecm Pyridin-

in 1 ecm Wasser gelöst und durch Zugabe von 20 ecm Aceton wieder ausgefällt wurde. Das gebildete Bariumsalz von Cephalosporin N hatte eine Aktivität von 58 Einheiten je mg.

Cephalosporin C wurde in den Fraktionen 70 bis 90 konzentriert. Diese Fraktionen wurden vereint und in der für die Fraktionen 52 bis 65 vorstehend beschriebenen Weise vom Puffer befreit. Das gebildete Bariumsalz

acetatpuff er mit einem p_H von 5,0, 150 ecm, 2 M-Essigsäure, (250 ecm) n-Pyridin und 600 ecm Wasser zugegeben und durch Zentrifugieren etwa vorliegendes unlösliches Material entfernt. Die erhaltene klare Lösung (p_H 5,0) wurde langsam in zwei Teilen in eine Kolonne (1,9 χ 20 cm) gegeben, die mit Amberlite IR4B gefüllt war. Das Harz war mit Pyridinacetat auf ein p_H 5,0 abgepuffert worden, indem die Acetatform des Harzes ■ auf

wurde in Wasser gelöst und die Lösung durch eine mit 30 einem Filter so lange mit Pyridinacetatpuffer gewaschen einem Kationen austauschenden Harz in Natriumzu- worden war, bis der ein- und der ausfließende Puffer den stand gefüllte Kolonne mit einem Durchmesser von gleichen p_H-Wert von 5,0 zeigten.

1,2 cm und 1,5 cm Höhe hindurchgeleitet. Der Durch- Nachdem man die Lösung von rohem Cephalosporin C

lauf wurde im Vakuum zu einem Syrup konzentriert. in die Kolonne hatte einfließen lassen, wurden zweimal je Dabei kristallisierte das Natriumsalz von Cephalosporine 35 2 ecm Pyridinacetatpuffer zugesetzt und der Kolonnenaus. Nach dem Waschen mit 70°/₀igem wäßrigem kopf dann mit einem konstanten Druckreservoir verbunden. Die Höhe des Reservoirs war derart eingestellt, daß die gewünschte Fließgeschwindigkeit von 9 ccm/Std. erhalten wurde. Diese Fließgeschwindigkeit erhielt man, 40 wenn die Höhe des Puffers in dem Reservoir nur einige cm über der Bodenplatte der Kolonne lag. Alle 20 Minuten wurden 3 ecm Fraktionen abgezogen.

Verschiedene Fraktionen wurden analysiert, indem die antibacterid.de Aktivität gegen S. typhi von Proben

Äthanol zur Entfernung nicht kristalliner Verunreinigungen erhielt man 5,5 mg Produkt, (10 Einheiten je mg), das das charakteristische Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Cephalosporin C zeigte.

Beispiel 6

Als Ausgangsmaterial wurde rohes Cephalosporin N
(2,3 Einheiten je mg) verwendet, das durch Verdampfen 45 bestimmt wurde, die mit Natriumhydroxydlösung neu

tralisiert worden waren und auch in einem photometrischen Ninhydrinverfahren.

In den Fraktionen 72 bis 108 wurde Cephalosporin C abgeschlämmt. Diese Fraktionen wurden vereint und bei 30° Badtemperatur im Vakuum in einem rotierenden Verdampfer konzentriert. Der Rückstand wurde in einer geringen Wassermenge gelöst, auf eine Unterlage aufgebracht und über Nacht unter Vakuum über KOH und P₂O₅ getrocknet. Danach war kein Geruch von Pyridin

einer von Aktivkohle abgeschlämmten Masse erhalten worden war. Durch Zusatz von n-Pyridin zu 150 ecm 2 η-Schwefelsäure wurde ein Puffer mit einem p_H-Wert von 5,0 hergestellt und die erhaltene Lösung mit Wasser auf 3,61 verdünnt.

2 g des rohen Cephalosporin N wurden in 8 ecm Puffer
gelöst und in den oberen Teil einer mit Amberlite IR4B-Harz 79 % 342 bis 845 Maschen je cm²; 21 °/₀ 845 bis 2000
Maschen je cm² gefüllten Kolonne von 1,95 cm Durchmesser und 41 cm Höhe eingegeben, die von einem mit 55 oder Essigsäure mehr festzustellen. Das Produkt wurde Umlaufwasser von 7° gefüllten Mantel umgeben war. in 0,3 ecm Wasser gelöst und 10 ecm Aceton zugesetzt. Es wurde dann mit dem Puffer mit einer Fließgeschwin- Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit einigen ecm digkeit von 9 ecm je Stunde behandelt. Die abge- Aceton gerührt, nochmals zentrifugiert und im Vakuum schlämmte Masse wurde in 3-ccm-Fraktionen geteilt und getrocknet. Man erhielt ein vollständig weißes Pulver der jede Fraktion durch Eintropfen in ein 6 Tropfen Pyridin 60 freien Säure von Cephalosporin in C. Diese wurde in 2 ecm enthaltendes Rohr auf einen p_H-Wert 6 neutralisiert. Wasser zu einer Lösung mit einem p_H 3,0 gelöst und aus Fraktion 19 zeigte antibacterieide Aktivität, die bei einer Bürette vorsichtig 0,49 ecm 0,1 n-NaO H zugegeben, Fraktion 21 scharf auf einen Maximalwert anstieg und bis das p_H auf 6,5 angestiegen war. Die entstehende dann allmählich bis Fraktion 100 auf 0 abfiel. Die Frak- Lösung des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurde tionen20 bis 40, die im wesentlichen Cephalosporin-C- 65 durch Erstarren getrocknet. Das getrocknete Material freies Cephalosporin N enthielten, wurden vereint und in wurde durch Auflösen in einem geringen Wasservolumem der in dem vorhergehenden Beispiel beschriebenen Weise und langsamen Abdampfen der Lösung kristallisiert. Das j| vom Puffer befreit. Cephalosporin C wurde in den Frak- trockene kristalline Material (39 mg) wurde durchWaschen |j| tionen 40 bis 100 konzentriert. Diese Fraktionen wurden mit einem geringen Volumen von 7O^o/oigem Äthanol von j vereint und in üblicher Weise vom Puffer befreit. Das 70 nicht kristallinen Verunreinigungen befreit.

Beispiel 8

Eine Lösung von rohem Cephalosporin C, die von einer Anionen austauschenden Kolonne abgeschlämmt war und noch geringe Mengen Cephalosporin N enthielt, wurde auf einen p_H-Wert von 2,5 angesäuert. Sie wurde dann 2 Stunden bei 37° gehalten und in dieser Zeit die gesamte Aktivität des Cephalosporin N zerstört. Die Lösung wurde zur Trockene erstarren gelassen, nachdem ein p_H-Wert von 5,0 eingestellt war. Das Produkt (4 g 0,08 Einheiten je mg) wurde mit 8 ecm Pyridinacetat (p_H 5,0, vgl. Beispiel 7) geschüttelt. Um das p_H der Lösung bei 5,0 zu halten, wurden einige Tropfen Pyridin zugesetzt. Die Lösung wurde nach etwa 20 Minuten zentrifugiert und die klare oben aufstehende Flüssigkeit dekantiert. Der Niederschlag wurde mit weiteren 4 ecm Puffer geschüttelt, nochmals zentrifugiert, und die zweite Menge der oben aufstehenden Flüssigkeit (12 ecm) wurde in viermal 3-ccm-Anteilen durch eine zweimal-42-cm-Kolonne hindurchgeschickt (Amberlite IR4B). Das Harz war mit Pyridinacetatpuffer (5,0), wie im Beispiel 7 beschrieben, abgepuffert worden. Der Lösung des rohen Cephalosporin C wurden zweimal 3 ecm Anteile von Pyridinacetatpuffer nachgeschickt und die Kolonne dann, wie im Beispiel 7 beschrieben, bearbeitet.

Die Volumenanteile von 280 bis 500 ecm, die abgeschlämmt wurden, enthielten Cephalosporin C. Die Volumenanteile von 387 bis 443 ecm wurden von P5>ridinacetatpuffer befreit und mit Aceton ausgefällt, wie im Beispiel 7 beschrieben. Man erhielt 18 mg unreines Cephalosporine (freie Säure). Die freie Säure wurde in 2,0 ecm Wasser gelöst und 0,14 ecm 0,1 n-NaOH bis zu einem p_H-Wert von 6,5 zugegeben. Beim langsamen Verdampfen dieser Lösung schied sich ein Teil des Materials in kristallinem Zustand ab. Die Mischung aus kristallinem und nicht kristallinem Material wurde mit 70%igem Äthanol auf einem Filter gewaschen, und man erhielt 2 mg des kristallinen Natriumsalzes von Cephalosporin C. Nach der Äthanolwäsche erhielt man 14 mg von Material mit einer Aktivität von 2,5 Einheiten je mg. Die restliche Lösung des zwischen 280 und 500 ecm abfließenden Volumens enthielt 23 mg Material mit einer Aktivität von 2,5 Einheiten je mg.

Gemäß der Erfindung können auch für die chromotographische Behandlung zur Trennung von Cephalosporine von Cephalosporin N oder Cephalosporin-N-Penicillinsäure durch Verteilung im Gegenstrom andere Lösungsmittelsysteme verwendet werden. Auch kann eine der Phasen beispielsweise von Trägern, wie Kieselgur, absorbiert werden oder aber kontinuierlich arbeitende Lösungsmittelextraktionskolonnen verwendet werden, wie sie von Scheibel und Karr (Ind. Eng. Chem., 42, S. 1048[195O]) beschrieben werden.

Cephalosporin C ist gegen Penicillinase unempfindlich, d. h., es bleibt im wesentlichen unbeeinflußt. Dies stellt einen der wichtigsten Vorteile des neuen Antibiotikums dar, da es gegen solche Mikroorganismen angewandt werden kann, die Penicillinase erzeugen und daher mehr oder weniger penicillinresistent sind. Cephalosporin C kann demzufolge als Schutzmittel für Penicillin gegen dessen Inaktivierung durch solche Mikroorganismen wirken.

Versuche haben gezeigt, daß Cephalosporin C im wesentlichen von reiner Penicillinase nicht beeinflußt wird, die aus Kulturen von B.subtilis und B.cereus hergestellt war. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Mengen verschieden hergestellter Penicillinase, die erforderlich sind, um eine 50°/₀ige Inaktivierung zu bewirken, ausgedrückt in Anteilen, die an Cephalosporin C erforderlich sind, dividiert durch die Menge, die für einen gleichen Anteil Cephalosporin N erforderlich ist.

	Penici	14 Tabelle 1	Relativer Anteil C/N
Quelle		linase Reinheit	100 5 30 10,000
B subtilis ..		roh roh gereinigt kristallin
B.cereus ...
B.cereus ...
B.cereus ...

Die relativ niederen Mengen, die für die weniger reinen Penicillinasekulturen erforderlich sind, lassen sich voraussichtlich auf die Gegenwart von Verunreinigungen zurückführen, die eine schädliche Wirkung auf das Cephalosporin C ausüben.

Die Wirksamkeit von Cephalosporin C gegen verschiedene Mikroorganismen wird in der nachfolgenden Tabelle erläutert, die jedoch nicht das ganze Bakterienspektrum umfaßt, sondern nur die antibiotische Aktivität erläutert, die zur Zeit genau bekannt ist.

Tabelle II

Organismus	Niedrigste Konzen tration, bei der nach. 24 Std. ug/ml das Wachstum verhindert wird
Staph.aureus, Heatley-Probe Penicillinempfindlich Staph.aureus, Penicillin-wider standsfest Str.pyogenes B.anthracis N.meningitidis N.gonorrhoeae H.pertussis H.infmenzae S.typhi S.paratyphi B S.typhimurium V.cholerae Bact.friedländeri Bact.coli	50 bis 100 25 25 25 1,6 1,6 1,6 12,5 25 25 50 50 50 200

Die Eigenschaften von Cephalosporin C sind in den Zeichnungen erläutert, in denen Fig. 1 eine Ultraviolett-Absorptionskurve und Fig. 2 das Infrarotspektrum darstellt.

Claims (12)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Abtrennung und gegebenenfalls Reinigung von Cephalosporin C aus Cephalosporin N und Cephalosporin C enthaltenden Mischungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Cephalosporin N und C enthaltenden Mischungen durch Lösungsmittelfraktionierung oder durch Adsorption auf einem Anionen austauschenden Material und anschließendem Abschlämmen mit einer wäßrigen Schlämmlösung trennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsmittelfraktionierung durch Teilung zwischen wenigstens zwei Lösungsmittelphasen, vorzugsweise zwischen Wasser und Phenol, bzw. alkylsubstituierten Phenolen erfolgt.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsmittelfraktionierung

κ ι pn

in Gegenwart geringer Anteile einer tertiären organischen Base vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsmittelfraktionierung bei p_H-Werten, bei denen Cephalosporin N wenigstens teilweise in seine Penicillinsäure übergeführt wird, insbesondere zwischen 2,5 und 5,0 erfolgt.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem p_H-Wert über 5 fraktioniert.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionen austauschendes Material ein synthetisches Harz verwendet wird und gegebenenfalls dieses Material auf p_H-Werte zwischen 4,9 und 8,0 eingestellt wird.

7. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Schlämmittel eine wäßrige Pufferlösung mit einem p_H zwischen 2,5 und 8,0, vorzugsweise 4,9 und 8,0, hergestellt vorzugsweise aus einer tertiären Base, die auf den erforderlichen p_H-Wert neutralisiert wird, insbesondere eine Pyridinsulfatlösung, verwendet wird.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Anionen austauschende Material während der Behandlung gekühlt wird.

9. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das abgetrennte Cephalosporin C anschließend gereinigt wird.

10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial Cephalosporin N und C enthaltende, durch Fermentation eines Nährmediums mit einer Kultur von Cephalosporiumarten erhaltene Mischungen in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch Adsorption an Aktivkohle mit anschließendem Abschlämmen, Adsorption des abgeschlämmten Materials auf Aluminiumoxyd und neuerlichem Abschlämmen, reinigt und aus der gereinigten Flüssigkeit mit einem Lösungsmittelelutionsverfahren durch Adsorption auf einem Anionen austauschenden Harz und anschließendem Abschlämmen mit einer wäßrigen Pufferlösung mit einem p_H von 2,5 bis 8,0 das Cephalosporin C abscheidet.

11. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die abgeschlämmte Lösung von Cephalosporin C mit ErdalkalisalzlösiMl·- gen behandelt, um die Säure aus der Pufferlösung aus*- zufallen, worauf das gegebenenfalls gebildete Erdalkalisalz des Cephalosporins C durch Lberieiten über ein Kationen austauschendes Material im Natriumzustand in das Natriumsalz umgewandelt wird.

12. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Cephalosporin N und C enthaltenden Mischungen vor der Abtrennung des Cephalosporin C in wäßriger Lösung bei p_H-Werten zwischen 2,5 und 4,5 erwärmt werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen