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Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Vitamin-B,2-Konzentraten
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von . Konzentraten,
die Vitamine der B12 Gruppe enthalten.
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Nach dem Verfahren des Hauptpatents g22126 werden Konzentrate, die
die Vitamine der B12 Gruppe enthalten, aus Ausgangsstoffen wie Faulschlamm oder
anderen durch Methangärung erzeugten Produkten gewonnen. Der Faulschlamm enthält
0,25 bis 1 Gamma Vitamin B12 je ccm, wobei fast die gesamte Vitaminmenge
an die Schwebstoffe gebunden ist. Die Überführung der Vitamine der B12 Gruppe in
die wäBrige Phase und die Abtrennung der letzteren von den Schwebstoffen des Faulschlammes
ist bereits im Hauptpatent g22126 beschrieben worden. Die auf diese Weise gewonnenen
Extrakte, die praktisch die gesamten Vitamine der B12 Gruppe des Ausgangsmaterials
enthalten, sind noch mit verschiedenen, vor allem braungefärbten löslichen organischen
Stoffen verunreinigt, die anscheinend mikrobiologisch nur sehr langsam abgebaut
werden können und die die Vitamine der B12 Gruppe während des Reinigungsprozesses
hartnäckig begleiten, falls nicht besondere Reinigungsverfahren angewandt werden.
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Es wurde nun gefunden, daB eine glatte Abtrennung der braunen Begleitfarbstoffe
möglich wird, wenn die üblicherweise angewandtenAdsorptions-, Elutions-ünd Extraktionsverfahren
bei ganz bestimmten pH-Werten durchgeführt werden.
". So wird das
aus dem Faulschlamm auf die im Hauptpatent g22 126 beschriebene Weise gewonnene,
die Vitamine der Bit Gruppe enthaltende Filtrat erfindungsgemäß auf einen pH-Wert
von 6 bis 9, vorzugsweise jedoch auf PR 7,5 eingestellt, wonach die übliche Adsorption
der Vitamine der Bl2-Gruppe an Kohle oder an ein anderes Adsorptionsmittel durchgeführt
wird.
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Es wurde nämlich gefunden, daß hei schwach sauren, neutralen bzw.
schwach alkalischen pH-Werten die bräunen Begleitfarbstoffe von den üblichen Adsorptionsmitteln
nur sehr wenig adsorbiert werden. Die Adsorbierbarkeit der Vitamine der B12 Gruppe
ist dagegen vom pH-Wert weitgehend unabhängig, Das so gewonnene Kohleadsorbat, in
dem praktisch die gesamte Ausgangsmenge der .Vitamine der B12 Gruppe enthalten ist
und das infolge der Durchführung der Adsorption bei den genannten p11-Werten nur
noch sehr wenig braune Begleitfarbstoffe enthält, wird mit einer Pufferlösung mit
einem pH-Wert zwischen 6 und g, vorzugsweise pH etwa 7,5 gewaschen.
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Die Elution der Vitamine der B12 Gruppe aus dem Adsorbat wird erfindungsgemäß
in einem sauren Milieu z. B. bei p$ 3 bis 5 bei erhöhter Temperatur durchgeführt,
da die braunen Begleitfarbstoffe im. sauren pH-Gebiet, vor allem bei pH-Werten,
die niedriger als 5 liegen, bevorzugt adsorbiert bleiben. Die Elution kann so durchgeführt
werden, daß z. B. das gewaschene Adsorbat mit wenig Wasser zu einem Brei verrührt
und durch Zusatz von Säure oder einer Pufferlösung auf den gewünschten pH-Wert angesäuert
wird. Es wird dann ein entsprechendes Elutionsmittel, wie z. B. ein Alkohol, zugesetzt,
erhitzt, die Kohle abgetrennt und in bekannter Weise aufgearbeitet. Die vereinigten
Eluate werden anschließend auf einen pH-Wert von 5 bis 6 gebracht und im Vakuum
auf etwa 1/a0 des Volumens eingeengt.
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Eine praktisch quantitative Abtrennung der im Eluatkonzentrat noch
vorhandenen bräunen Begleitfarbstoffe kann nun z. B. mit Hilfe einer Flüssigflüssig-Extraktion
erfolgen. Eine solche Extraktion der Vitamine der B12 Gruppe aus der wäßrigen Phase
kann bekanntlich mit Hilfe von höheren Alkoholen oder phenolhaltigen Flüssigkeiten
durchgeführt werden.
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Es wurde dargelegt, daß die in Frage kommenden Begleitfarbstoffe von
organischen Lösungsmitteln nur bei p11-Werten, die unterhalb 5 liegen, extrahierbar
sind; die Extrahierbarkeit der Vitamine der B12 Gruppe ist hingegen vom p11-Wert
weitgehend unabhängig.
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Wenn nun die Flüssig-flüssig-Extraktion, die eine Überführung der
Vitamine der B12 Gruppe in die organische Phase zum Zweck hat, bei einem pH-Wert,
der über 6 liegt, am besten jedoch bei PH 7 durchgeführt wird, so bleiben die in
Frage kommenden Begleitfarbstoffe in der wäßrigen Phase zurück, und die organische
Phase hat die reine Farbe der Vitamine der B12 Gruppe. Die abgetrennte organische
Phase wird nun zur weiteren Reinigung einmal, z. B. mit 5°/@ger gatriumbicarbonatlösung
oder einer Pufferlösung, einmal mit auf p$ 2 bis 5 angesäuertem Wasser und einige
Male mit reinem Wasser gewaschen und auf die übliche Weise weiterverarbeitet. .
Eine weitere Möglichkeit, die im Eluatkonzentrat noch vorhandenen braunen Verunreinigungen
zu entfernen; bietet sich bei der Flüssig-fest-Extraktion, also z. B. beim Perkolieren
fester, die Vitamine der Bit Gruppe enthaltenden Stoffe mit wasserfreien Extraktionsmitteln,
wie z. B. mit Alkoholen oder mit phenolhaltigen Flüssigkeiten. Zwecks erfolgreicher
Trennung der Vitamine der B12 Gruppe von den fraglichen Begleitstoffen, d. h. um
zu erreichen, daß im Perkolator bzw. im Extrakt praktisch keine Farbstoffe erscheinen,
muß das Trockengut, das die Vitamine der B12 Gruppe enthält, erfindungsgemäß auf
die Weise hergestellt werden, daß es in seiner Natur neutral oder leicht basisch
ist. Diese Bedingung ist erfüllt, wenn z. B. das zu perkolierende Trockengut, das
die Vitamine der B12 Gruppe enthält, auf folgende Weise hergestellt wird: Einstellen
des Vitamin-B12 Konzentrates, z. B. des Eluatkonzentrates, auf pH über 6, Zusatz
von 1 °/o Kieselgur und 58 °/o Ammoniumsulfat - 58 g auf ioo ccm Flüssigkeit -,
Verrühren bis zum Auflösen des Ammoniumsulfates und Korrektur des pH-Wertes auf
pff größer als 6, wobei die pH-Messung nach Verdünnen einer kleinen Probe mit destilliertem,
kohlensäurefreiem Wasser erfolgt. Nach Abtrennen des rötlichgefärbten Niederschlages
durch Filtration wird der Filterkuchen mit kristallwasserfreiem Natriumsulfat zu
einem Trockengut verrieben. Das so hergestellte Trockenpulver, das die Vitamine
der B12 Gruppe enthält, enthält die braunen Verunreinigungen in im wesentlichen
nicht perkolierbarer Form, so daß die daraus erhaltenen Perkolate reinrot gefärbt
sind.
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Im folgenden wird die Erfindung an Hand von einigen Beispielen erläutert.
Beispiel i Too 1 Faulschlamm werden mit ioo g Natriumbisulfit, in etwas Wasser gelöst,
versetzt und bei pH 6 1 Stunde lang auf 70° erhitzt. Nach dem Abzentrifugieren der
festen Bestandteile wird das Filtrat auf p$ 3 angesäuert und nochmals zentrifugiert.
Das geklärte Filtrat, das nach dem mikrobiologischen Test mit der E. coli-Mutante
1i3-3 0,3 Gamma Vitamine der B12 Gruppe je ccm enthält, wird auf Pu 7,5 gebracht
und mit i kg Aktivkohle in der Kälte 30 Minuten lang gerührt, wonach die
Kohle durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 2o 1 2°/jger Natriumbicarbonatlösung
gewaschen wird. Die von der Flüssigkeit abgetrennte Kohle wird nun mit 2 1 Wasser
verrührt . und mit verdünnter Schwefelsäure auf PH 4 angesäuert. Anschließend werden
32o ccm n-Butanol zugegeben. Das Ganie wird anschließend unter Rühren auf 85° erhitzt
und die Kohle abgetrennt. Das mit den Vitaminen der Bl$-Gruppe angereicherte Filtrat
wird gekühlt und zur Weiterverarbeitung bereitgestellt. Der bereits geschilderte
Elutionsprozeß wird noch fünfmal wiederholt. Die vereinten Eluate werden im Vakuum
bei 3o bis 4o° auf %. des Volumens eingeengt, das Eltiatkonzentrat, das nach
dem mikrobiglogischen Test mit der E. coli-Mutante 5o Gamma Vitamine der B12 Gruppe
je ccm enthält, wird auf pH 7 gebracht und mit ioo ccm, dann zweimal mit je 5o ccm
einer
20%igen Lösung von p-Chlorphenol in Trichloräthyleri - 2o
g auf ioo ccm verdünnt - extrahiert. Die organische Phase, insgesamt Zoo ccm, wird
zunächst einmal mit 50 ccm einer 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, dann einmal
mit 5o ccm verdünnter wäßriger Phosphorsäurelösung und anschließend dreimal mit
je 50 ccm Wasser gewaschen. Sie enthält keine braunen Verunreinigungen mehr,
ist von sonstigen Begleitstoffen weitgehend befreit und besitzt eine reinrote, für
die Vitamine der B12 Gruppe enthaltenden Lösungen charakteristische Farbe. Sie enthält
nach dem mikrobiologischen Test sowie nach spektrophotometrischer Messung mit dem
Beckmann-Spektrophotometer insgesamt 2o mg Vitamine der B12 Gruppe. Beispiel 2
50 ccm eines in der gleichen Weise wie im Beispiel i aus Faulschlamm hergestellten
Eluatkonzentrates, enthaltend 4o Gamma Vitamine der B12 Gruppe je ccm, werden mit
Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und dann mit 0,5 g Kieselgur
und 29 g Ammoniumsulfat versetzt. . Nach dem Auflösen des Ammoniumsulfats wird der
pH-Wert auf 7,5 korrigiert. Der ausgefallene rosarote flockige Niederschlag wird
mit Hilfe einer Saugnutsche abgetrennt, und der feuchte Filterkuchen, der 95 bis
98 % des Gehaltes an Vitaminen der B12 Gruppe des Eluatkonzentrates enthält und
3 g wiegt, wird mit 3 g wasserfreiem Natriumsulfat innig verrieben. Das anfallende
rosagefärbte Pulver wird mit io ccm einer 5%igen Lösung von p-Chlorphenol in Trichloräthylen
verrührt und der Brei in einen Perkolator, bestehend aus einem unten verengten und
mit etwas Watte verschlossenen Glasrohr, gefüllt, so daß die Schichtdicke der festen
Substanz in der Säule 12 cm beträgt. Das nun langsam abtropfende Perkolat ist leichtgelb
gefärbt und enthält nur geringe Spuren an Vitaminen der Blz-Gruppe. Sobald der Flüssigkeitsspiegel
im Perkolator das Niveau der festen Schicht erreicht hat, wird mit einer io%igen
Lösung von p-Chlorphenol in Trichloräthylen perkoliert, wobei ein tiefrotgefärbtes
Perkolat erhalten wird. Das Perkolat, etwa 1ä ccm, enthält nach dem mikrobiologischen
Test mit der E. coli-Mutante sowie nach spektrophotometrischer Bestimmung mit Hilfe
des Beckmann-DU-Spektrophotometers insgesamt 1,8 mg Vitamine der B, Gruppe und besitzt
die für die Vitamine der B12 Gruppe charakteristische rote Farbe. Das Perkolat wird
nun mit i,2 ccm Methyläthylketon versetzt und der ausgeflockte karminrote Niederschlag
mit Hilfe einer Glassinternutsche abfiltriert. Der Rückstand wird mit wenig Trichloräthylen
gewaschen und anschließend in 5--ccm einer 2o%igen Lösung von p-Chlorphenol in Trichloräthylen
gelöst. Die rote Lösung wird zunächst einmal mit i ccm einer 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung,
dann einmal mit i ccm Wasser, schließlich einmal mit einer verdünnten wäßrigen Phosphorsäurelösung,
pH-Wert etwa i bis 2, und endlich dreimal mit je i ccm Wasser gewaschen. Aus dieser
weitgehend von Begleitstoffen befreiten Lösung, die die Vitamine der B12 Gruppe
enthält, können nach Ausfällung und einmaliger Chromatographie die Vitamine der
B12 Gruppe zur Kristallisation gebracht werden.