DE876443C

DE876443C - Verfahren zur Reinigung von Praeparaten, die den antiperniciosa-anaemischen Faktor enthalten

Info

Publication number: DE876443C
Application number: DEG1587A
Authority: DE
Inventors: Stanley Ball; Ernest Lester Dr Smith
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1949-07-13
Filing date: 1950-04-07
Publication date: 1953-05-11

Description

Verfahren zur Reinigung von Präparaten, die den antiperniciosa-anämischen Faktor enthalten Die vorliegende Erfindung -hetrifft ein Verfahren zur Herstellung von Präpa.raten, welche Substanzen mit antiperniciosa-anämischer Wirksamkeit enthalten.
Von dem antiperniciosa-anämischen Faktor wird angenommen, daß er zwei oder möglicherweise mehr getrennte und unterschiedliche wirksame Bestandteile. von denn einer kürzlich unter dem Samen Vitamin B12 bekanntgeworden ist, enthält.
I)er hier benutzte Ausdruck aktives Material bedeutet irgendeine Substanz oder ein Gemisch von zwei oder mehr getrennten und unterschiedlichen Substanzen mit antiperniciosa-anämischer Wirksainkeit, wie sie durch klinische Prüfungen bestimmt wird, unabhängig von der Zahl der Substanzen und von der Herkunft des Materials.
Das aktive Material kann aus Leber erhalten werden, und es sind verschiedene Methoden zur Erzielung von an aktivem Material reichen Extrakten aus Leber bekannt. Neuerdings wurde ermittelt, daß das aktive Material in einem geeigneten Kulturmedium von gewissen Mikroorganismen, wie z. B. Streptomyces Griseus, erzeugt wird, Wenn die antiperniciosa-anämischen Faktoren auf mikrobiologischem Wege erzeugt werden, so sind sie in dem Kulturmedium nicht immer in einer Form vorbanden, die antipeniiciosa-anämische Wirksamkeit zeigt und die für die weitere Reinigung geeignet ist.
In solchen Fällen kann es notwendig sein, eines oder mehrere Verfahren, wie sie in der britischen Patentschrift 665 485 beschrieben sind, anzuwenden, um aktives Material zu erhalten. Die letztgenannte Patentschrift beschreibt åuch,'wier die Mikroorganismen, welche die antiperniciosa-anämischen Faktoren erzeugen,'erkannt werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entfernung von Verunreinigungen aus den Extrakten, welche das obengenannte aktive Material enthalten.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung soll erwähnt werden, daß die Frage, ob ein gegebenes Material antiperniciosa-anämische Eigenschaften besitzt oder nicht, nur durch klinische Prüfungen bestimmt werden kann. A:ndererseits gibt eine Prüfung seiner mikrobiologischen Wirksamkeit durch den sogenannten Becher-Plattenver- -such, wobei Lactobacillus' laXtis jDorner' oder Lactokacillus Leichmanii und reines kVitamin -B12 als Standardpräparat verwendet werden (vgl.
Cuthbertson, Biochem. J. I949, Proc. V.), einen Hinweis auf die antiperniåosa-anäomische Wirksamkeit, welcher im allgemeinen. zuverlässig ist. Der im nachfolgenden benutzte Ausdruck VitamineBl2-Wirksamkeit bedeutet die Wirksamkeit eines gegebenen Materials, die mikrohiologisch wie beschrieben gemessen wird und von der durch klinische $r'üfungen - bestimmten Wirksamkeit verschieden ist.
Das aus Leber oder Mikroorganismen stammende aktive Material ist gewöhnlich von Ver'unreiniguu= gen begleitet - wie Aminosäuren -oder Peptiden, welche, da sie amphoter sind, schwer abzutrennen sind. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren,' wobei die rohen Extrakte des aktiven Ma.terials von diesen Verunreinigungen befreit werden, ohne daß sie ihre antiperniciosa-anämische Wirksamkeit verlieren.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das -aktive Material seine antiperniciosa-anämische Wirksamkeit nicht verliert, wenn man es mit salpetriger Säure behandelt. Es wurde weiter gefunden, daß, wenn man einen- Extrakt, der das aktive Material und Verunreinigungen, bestehend aus Aminosäuren und Peptiden, enthält, mit salpetriger Säure behandelt, die genannten Verunreinigungen in Oxysäuren umgewandelt werden, die wesentlich - leichter aus dem aktiven Material abgetrennt werden können. Dies erfolgt entweder durch Entfernen der Säuren aus den Mischungen oder durch - Anwendung eines Lösungsmittels, welches - das aktive Material selbst' extrahiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird also ein Verfahren zur Entfernung von Verunreinigungen aus einem Extrakt, der das oben- beschriebene Material enthält, vorgesehen, wobei derggenannte Extrakt mit salpetriger Säure behandek wird. Die entstehende Lösung kann- dann weiterhin so behandelt werden, daß eine Trennung des aktiven Materials und der in der Lösung vorhandenen sauren Verunreinigungen erzielt wird.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung werden die sauren Verunreinigungen nach dem BeW handeln mit salpetriger Säure von -der Lösung abgetrennt.
Schließlich wird gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung die Lösung nach der Behandlung mit salpetriger Säure neutral oder alkalisch gemacht und das darin enthaltene aktive Material aus der :Lösung mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie es. unten beschrieben wird, extrahiert.
Die wäßrigen Extrakte, welche als Ausgangsmaterial des erfindungsgemäßen Verfahrens benutzt werden, können jeden beliebigen Grad von Reinheit oder Konzentration besitzen, vorausgesetzt, daß sie antiperniciosa-anämische Wirksamkeit zeigen. So kann man z. B. einen rohen wäßrigen Leberextrakt oder einen rohen Extrakt aus Mikro Organismen benutzen, der z. B. nach der in der britischen Patentschrift 665 485 beschriebenen Metb,ode berges, teilt wurde, oder man kann alternativ eine oder mehrere Reinigungsbehandlungen anwenden. Beispielsweise kann man eine Adsorption an Alüivkohle, Lösungsmittelextraktion u. dgl. annvenden) bevor man von dem erfindungsgemäßen Verfahren Gebrauch macht.
Die Behandlung mit salpetriger Säure kann nach einer geeigneten Methode erfolgen; so kann man vz. B. den wäßrigen Extrakt des aktiven Materials ansäuern und ein Nitrit, wie z. B. Natriumnitrit, zufügen. Alternativ kann der Extrakt beispielsweise mit nitrosen Dämpfen oder salpetriger Säure behandelt werden, welche man aus Alkylnitrit wie -Ainy-lnitrft hergestellt hat.
Da-das aktive Material unter stark sauren B dingungen zerstört werden kann, so muB man be; achten, daß die Behandlung mit salpetriger Säure unter solchen Bedingungen vor sich geht, daß das aktive Material nicht zerstört wird. Es wurde gefunden, daß eine Behandlung in einem pH-Bereich -von-I bis 5 im allgemeinen befriedigende Ergebnisse zeigt.
In der Praxis wird der wäßrige Extrakt vorzugsweise bis zu einem pH von 4 mit einer organischein Säure, wie z. B. Essigsäure, oder einer Mineralsäure, wie z. B. Salzsäure, angesäuert und die erhaltene Lösung mit Natrium- oder Kaliumnitrit behandelt, wobei nötigenfalls weitere Anteile an Säure zugefügt werden können, um einen pH-Wert von ungefähr 4 aufrechtzuerhalten. Indessen kann man auch eine andere Methode zur Behandlung mit salpetriger Säure anwenden, vorausgesetzt, daß stark saure Bedingungen, welche das aktive Matenal zerstören könnten, vermieden werden.
Die salpetrige Säure wird vorzugsweise im Uberschuß angewendet, und damit dies geschehen kann, müssen die Aminogruppen in dem Ausgangsmaterial bestimmt werden, z. B. nach der bekannten Methode von van Sly k e. Wenn die Menge der für die Reaktion benötigten salpetrigen Säure bekannt ist, so werden die Mengen der Reagenzien so stimmt, daß man einen Überschuß an salpetriger Säure erhält, z. B. wenn Natriumnitrit angewendet wird, durch Verwendung eines Überschusses an Natriumnitrit. Wenn die Reaktion beendet ist, kann -der Überschuß an salpetriger Säure gewünschten- falls zerstört werden, z. B. durch Zugabe von Harnstoff.
Die J3elandlung mit salpetriger Säure kann bei ltaumtemperatur erfolgen, jedoch wird im allgemeinden ein gelindes Erwärmen der Reaktionsmischung bevorzugt. Es ist indessen zu beachten, daß eine zu holäe Reaktionstemperatur eine Zerstörung des aktiven Materials verursachen kann.
Wie bereits oben erwähnt wurde, können die behandelte Verunreinigungen von dem aktiven Material auf zwei Arten abgetrennt werden; so können die Verunreinigungen aus der nach dem Behandeln mit salpetriger Säure erhaltenen Lösung extrahiert werden, oder alternativ kann das aktive Material selbst aus dieser Lösung extrahiert werden. Selbstverständlich können beide Methoden in Kombination angewandt werden.
Wenn man die sauren Verunreinigungen aus der Lösung extrahieren will, so verwendet man die Mehoden zur Extraktion von Oxysäuren aus den sie enthaltenden wäßrigen Lösungen. So kann die nach der Behandlung mit salpetriger Säure erhaltene Lösung unter sauren Bedingungen mit einem organischen Lösungsmittel, das Oxysäuren zu lösen vermag, extrahiert werden. Für diesen Zweck können viele organische Lösungsmittel verwendet werden, es wurde jedoch gefunden, daß die folgenden Lösungsmittel besonders geeignet sind: Ather, Chloroform, niedrigermolekulare aliphatische Ester, Butyl- und Amylalkohole. Gewisse Lösungsmittel, besonders Butyl- und Amylalkohole, können auch einen Teil des aktiven Materials extrahieren, und es ist daher zweckmäßig, daß man den Losungsniittelextrakt anschließend mit Wasser extrahiert, um jede Spur von aktivem Material, das mit dem Lösungsmittel extrahiert worden sein könnte, zurückzugewinnen.
Die Extraktion wird vorzugsweise in einem pll-Bereich von I bis 5 durchgeführt. Die Lösungsmittelextraktiou der Säuren soll nicht unter zu stark sauren Bedingungen erfolgen, wodurch das aktive Material zerstört werden könnte.
Andere Extraktionsmethoden für Säuren, die angewendet werden können, schließen die Verwendung ron anionaustauscheuden Harzen, die z. B. hunter der Beæeichnung Deacidit- oder Amberlitharze IRA 400 und IR-B B im Handel sind, ferner die Ausfällung mit Metallsalzen u. dgl. ein.
Wenn man das aktive Material aus der nach der Behandlung mit salpetriger Säure erhaltenen Lösung extrahieren will, so muß diese neutral oder alkalisch gemacht werden und die erhaltene Lösung mit einem geeigneten, wie oben definierten Lösungsmittel extrahiert werden.
Der Ausdruck geeignetes Lösungsmittel bedeutet hierbei einen bei gewöhnlicher Temperatur im Ausmaß von 3 bis 25 Volumprozent in Wasser löslichen Alkohol oder ein Gemisch solcher Alkohole oder NIischungen von Phenol undXoder einem oder mehreren Kresolen mit einem dieser Alkohole oder Mischungen voll Phenol und/oder einem oder mehreren Kresolen mit nicht mehr als der dreifachen Menge ihres Gewichts an in Wasser bei gewöhnlicher Temperatur bis zum Ausmaß von 3 bis 25 Volumprozent löslichem Keton oder Ester oder Misellullgen von Phenol und/oder einem oder mehreren Kresolen mit nicht mehr als der dreifachen Menge ihres Gewichts an Diäthyläther, DiisGpropyläther, Benzol, Toluol undloder Xylol oder Alischungen von Phenol und/oder einem oder mehreren Kresole, welche mit so viel Wasser vermischt sind, daß sie verflüssigt werden, mit Propyl-oder Iscpropylalkohol, der 5 bis 25 Voluinprozent Wasser enthält.
Wenn wäßrige Propyl- und Isopropylalkohole als Lösungsmittel verwendet werden, so soll die wäß rige Lösung genügend Aussalzmittel enthalten. um eine vollständige Mischbarkeit zu verhindern.
Vorzugsweise wird als das geeignete Lösungsmittel Phenol oder eine Mischung aus Phenol und Butanol angewendet. Das Reaktionsgemisch kann durch Verwendung eines geeigneten Reagens neutral oder alkalisch gemacht werden. Vorzugsweise wird Natrium- oder Raliumhydroxyd oder -carbonat verwendet. Es sei indessen erwähnt, daß stark alkalische Bedingungen leicht die Zersetzung des aktiven Materials verursachen können und daß demzufolge vorzugsweise der p-Wert der Lösung während dieser Extraktion den Wert g nicht überschreiten soll.
Anschließend an die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können gewünschtenfalls geeignet, an sich bchanute Reinigungsmaßnahmen e-rgriffen werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Beispiel I 50 ml einer teilweise gereinigten wäßrigen Lösung von aktivem Material, hergestellt aus dem bei der Züchtung vcn Streptomyces Griseus erhaltenen Nährboden nach der in der britischen Patentschrift 665 485 beschriebenen Methode, an die eine teilweise Reinigung durch Adsorption an Aktivkohle, eine Elution mit I0°/o Wasser enthaltendem Phenol und eine Entfernung des Phenols durch Behandlung mit Äther und Wasser angeschlossen war, wurden mit Eisessig auf einen pE-Wert von 4 angesäuert und 5 inl einer gesättigten Lösung von Natriumnitrit zugegeben. -Die Mischung wurde 5 Minuten lang auf ungefähr 800 erwärmt und dann 20 Minuten lang gekühlt.
Die gekühlte Lösung wurde dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform und dann zweimal mit dem gleichen Volumen Butanol extrahiert. Die Butanollösungen wurden mit wenig Wasser nachgewaschen und die Waschwässer zu der wäßrigen Hauptlösung gegeben. Dieser wäßrige Extrakt wurde nun mit festem~Natriumbicarbonat auf ein PH von 7,5 eingestellt und dreimal mit einem Butanol-Phenol-Gemisch (Volumenverhältnis 3 : t) extrahiert.
Das in dem Butanol-Phenol-Extrakt enthaltene aktive Material wurde in eine wäßrige Lösung durch Zugabe von 5 Volumina Diäthyläther und Waschen der Phenol-Ather-Schicht mit Wasser übergeführt. Durch weiteres Waschen mit Äther wurde das ganze Phenol aus der wäßrigen Lösung entfernt, und die das aktive Material enthaltende Endlösung hatte eine leicht braune Farbe. Der größte Teil der gefärbten Verunreinigungen war durch die vorhergehenden Extraktionen. entfernt worden.
Vor der Behandlung mit salpetriger Säure enthielt der Extrakt 665 y an wirksamem Vitamin B12 und 2,43 g feste Stoffe; nach der Behandlung enthielt er 650y wirksames Vitamin B12 und 0,35 g feste Stoffe. Die Vitamin-Bl2-Wirksamkeit wurde mit Lactobacillus lactis Dorn;er bestimmt.
Beispiel 2 25 ml einer Lösung des aktiven Materials, welches man durch teilweise Reinigung des durch Züchtung von Streptomyces Griseus gewonnenen Nährbodens erhalten hatte, wurden mit Eisessig auf ein pE von 4 angesäuert und 3 ml gesättigte Natriumnitritlösung zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei gewöhnlicher Temperatur stehengelassen und dann dreimal mit den gleichen Volumen Butanol extrahiert, wobei das Butanol wieder mit etwas Wasser nachgewaschen wurde, um einen Verlust an aktivem Material zu vermeiden. Die wäßrige Lösung wurde dann mittels festem Natriumcarbonat auf ein pH von 7,3 gebracht und dreimal mit B«utanol-Phenol (Volumenveshältnis 3 :I) extrahiert. Die phenolische Schicht wurde mit 5 Volumen Diäthyläther verdünnt und die -Mischung mit kleinen Mengen von Wasser extrahiert. - Schließlich wurde die vereinigte wäßrige Schicht mit Diäthyläther extrahiert, um die letzten Spuren von Phenol zu entfernen.
Vor der Extraktion enthielt die Lösung 48q y wirksames Vitamin B12 und 1,22 g feste Stoffe; nach der Behandlung mit salpetriger Säure und Extraktion mit Butanol-Phenol enthielt die Lösung 450 y wirksames Vitamin B,2 und o,76 g feste Stoffe. Die Vitamin-Bk,-Wirksamkeit wurde mit Lactobacillus lactis Dornes bestimmt.
Beispiel 3 IOO ml eines wäßrigen Leberextrakts, welcher 20,3 g feste Stoffe und Sooo;' wirksames Vitamin B12 enthielt, wurde mit 4 g Natriumnitrit und konzentrierter Salzsäure bei einem PE von 4 behandelt und I Stunde lang gelinde erwärmt. Die Lösung wurde weiter bis zu einem pE von 3 angesäuert und mit vier gleichen Volumen n-Butanol extrahiert.
Die Extrakte wurden mit kleinen Mengen Wasser nachgewaschen, die zu der Hauptmenge der wäßrigen Lösung zugegeben wurden, Es wurde nun - neutralisiert und dreimal mit 11/2 Volumen Phenol-ButanelÄ,fischung (i :) extrahiert. Die Extrakte wurden mit mehreren Volumen Ather verdünnt und das aktive Material durch Extraktion mit kleinen Mengen Wasser wieder zurückgewonnen.
Das Produkt enthielt nur I,77 g feste Stoffe und 4000;' wirksames Vitamin B12.
Beispiel 4 25 ml einer Lösung von aktivem Material, welche durch teilweise Reinigung des durch Züchtung von Streptomyces Griseus gewonnenen Nährbodens erhalten wurde, wurde mit Eisessig auf ein pH von 4 angesäuert und 3 ml gesättigte Natriumnitritlösung zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten lang hei gewöhnlicher Temperatur stehengelassen und der pH-Wert dann mit festem Natriumbicarbonat auf 7,3 eingestellt. Diese Lösung wurde hierauf dreimal mit Butanol-Phenol (Volumenverhältnis 3: I) extrahiert und die phenolische Schicht mit 5 Volumen Diäthyläther verdünnt, wobei diese Mischung mit kleinen Mengen von Wasser extrahiert wurde.
Schließlich wurde die vereinigte wäßrige Schicht mit Diäthyläther extrahiert, um die letzten Spuren von Phenol zu entfernen.
Vor der Extraktion enthielt die Lösung 487 r wirksames Vitamin B12 und I,22 g feste Stoffe; nach dem Behandeln mit salpetriger Säure und der Extraktion mit Butanol-Phenol enthielt die Lösung 437 y wirksames Vitamin B12 und o,8g g feste Stoffe. Die Vitamin-B12-Wirksamkeit wurde mit Lactobacillus lactis Dorner bestimmt.
Beispiel 5 so ml einer Lösung von aktivem Material, welche durch teilweise Reinigung eines durch Züchtung von Streptomyces Griseus gewonnenen Nährbodens erhalten wurde, wurden mit Eisessig auf ein pB von 4 angesäuert und I,S g Natriumnitrit in Form einer gesättigten Lösung zugegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang auf 8d° erwärmt und dann 20 Minuten lang gekühlt. Der p-Wert wurde mit festem Natriumbicarbonat auf 7,3 eingestellt und die Lösung dreimal mit Butanol-Phenol (Volumenverhältnis 3 : 1) extrahiert. Die phenolische Schicht wurde mit 5 Volumen Diäthyläther verdünnt und die Mischung mehrmals mit kleinen Mengen von Wasser extrahiert. Schließlich wurde die vereinigte wäßrige Schicht mit Diäthyläther extrahiert, um die letzten Spuren von Phenol zu entfernen.
Die ursprüngliche Lösung enthielt vor der Behandlung mit salpetriger Säure und Butanol-Phenol 500;' wirksames Vitamin B12 und 5,6 g feste Stoffe.
Nach der Reinigung enthielt die Lösung 450 r wirksames Vitamin B12 und 1,47 g feste Stoffe. Die Vitamin-Bj2-Wirksamkeit wurde mit Lactobacillus lactis Dorner bestimmt.
Beispiel 6 300 ccm Rohflüssigkeit aus der Kultur von Streptomyces Griseus, die 23,5 g feste Stoffe und ungefähr 24 r wirksames Vitamin Bt2 enthielt, wurden auf 700 bei einem Po von 4 in Gegenwart von 1-2 g Natriumnitrit erwärmt, 5 Minuten lang bei 7a0 belassen und dann gekühlt. Die Lösung wurde auf ein PE von 7,5 eingestellt und mit drei gleichen Volumen einer Mischung von Phenol und Benzol (I :3) extrahiert. Zu den vereinigten organi- schen Schichten wurden 2 Volumen Benzol gegeben und die Mischung erschöpfend mit mehreren Portionen Wasser extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte enthielten insgesamt 5,I5 g feste Stoffe, das ist ungefähr 220/o des Ursprünglichen, und 20,1 y wirksames Vitamin B1-, das ist ungefähr Sg O/o des Ursprünglichen.
Be!ispiel 7 300 ccm Rohflüssigkeit aus einer Kultur von Streptomyces Griseus, die 23,5 g feste Stoffe und ungefähr 24 y wirksames Vitamin B12 enthielt. wurden mit 2.4 g Natriumnitrit bei einem pH von 4 20 Minuten lang bei gewöhnlicher Temperatur stehengelassen. Die Lösung wurde dann, wie in Beispiel 6 angegeben, behandelt. Die Gesamtmenge an festen Stoffen der wäßrigen Endextrakte war g, g, das ist I4,4°/o der ursprünglichen festen Stoffe; die Gesamtmenge an wirksamem Vitamin B12 in den Extrakten entsprach 83 0/o der ursprünglichen Gesamtmenge.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: I. Verfahren zur Entfernung von Verunreinigungen, wie Aminosäuren, Peptiden, aus antianmischen Wirkstoffen, insbesondere das Vitamin Br2 enthaltenden Extrakten, wie Organextrakten, Extrakten von Kulturen von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die Extrakte mit salpetriger Säure behandelt werden.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Behandlung der Extrakte mit salpetriger Säure eine Trennung der Wirkstoffe von den entstandenen Reaktionsprodukten der Verunreinigungen mit der salpetrigen Säure, insbesondere den Oxysäuren, durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet. daß die Tennung durch Entfernen der Oxysäuren aus den Extrakten durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung durch Entfernen der Wirkstoffe aus den Extrakten durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffe durch Neutralisieren oder Alkalischmachen der Lösung und deren Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie einem bei gewöhnlicher Temperatur im Ausmaß von 3 bis 25 Volumprozent in Wasser löslichem Alkohol oder einem Gemisch solcher Alkohole untereinander oder mit Phenolen und/oder Kresolen entfernt werden.
6. Verfahren nach Anspruch I und 3, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Behandlung mit salpetriger Säure die wäßrige Lösung durch Extraktion von den Oxysäuren befreit und anschließend neutral oder alkalisch gemacht wird und die Wirkstoffe daraus mittels eines geeigneten Lösungsmittels, wie einem bei gewöhnlicher Temperatur im Ausmaß von 3 bis 25 Volumprozent in Wasser löslichem Alkohol oder einem Gemisch solcher Alkohole untereinander oder mit Phenolen und/oderKresolen, extrahiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die sauren Verunreinigungen, insbesondere Oxysäuren, durch Ansäuern der wäßrigen Lösung und Extrahieren mit Äther, Chloroform, einem niedrigermolekularen aliphatischen Ester, Butyl- oder Amylalkohol oder 3Sischungen dieser Lösungsmittel entfernt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffe aus der wäßrigen Lösung auf einen pH-Welt, der in dem Bereich von I bis 5 liegt, angesäuert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung mit Phenol oder einer Mischung von Phenol und Butanol extrahiert wird.

IO. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffe vor der Behandlung mit salpetriger Säure teilweise, z. B. mittels Adsorption an Aktivkohle, Lösungsmittel extraktion oder ähnliche Behandlungen, gereinigt werden.

II. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Be; handlung mit salpetriger Säure durch Ansäuern des wäßrigen Extrakts auf ein pH von ungefähr 4 und Behandeln mit einem Nitrit durchgeführt wird, wobei nötigenfalls weitere Säuremengen zugegeben werden können, um einen pH-Wert von ungefähr 4 während der Behandlungsdauer aufrechtzuerhalten.

I2. Verfahren nach Anspruch II, dadurch gekennzeichnet, daß als Nitrit Natrium- oder Kaliumnitrit verwendt wird.