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Verfahren zum Anreichern Zellvermehrung bewirkender Wachstumsstoffe
Es ist bekannt, daß in tierischen und pflanzlichen Materialien Wachstumsstoffe vorkommen,
deren Wirkung z. B. durch die Zellvermehrung bei Hefekulturen mengenmäßig bestimmt
werden kann. Der hierbei wirksame Stoff bzw. das wirksame Stoffgemisch ist im Schrifttum
gewöhnlich als Bios bezeichnet worden. Der Wirkstoff ist löslich in Wasser und wasserhaltigen
Lösungsmitteln, unlöslich in Lipoidlösemitteln. Die im Schrifttum angegebenen Verfahren
haben günstigstenfalls zu einer etwa zehnfachen Anreicherung geführt.
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Es wurde gefunden, daß der Wirkstoff viel weitgehender angereichert
werden kann, wenn man aus einem wäßrigen Auszug aus Hefe oder anderen Kleinlebewesen,
Samen, Keimlingen oder Eigelb nach vorheriger Entfernung von Ballaststoffen durch
Adsorption z. B. an Fullererde oder durch gegebenenfalls wiederholtes Fällen mit
einem wassermischbaren Lösemittel oder mit Schwermetallsalzen unwirksame Stoffe
durch Fällen mit Reineckesalz, Pikrolonsäure oder Oxalsäure entfernt und den Wirkstoff
mit Phosphorwolframsäure oder Merkurichlorid ausfällt.
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Als wassermischbare Lösemittel kommen z. B. Alkohol und Aceton, als
Schwermetallsalze neutrales Bleiacetat und Quecksilberchlorid in Frage. Als Acyliermittel
wird vorteilhaft Essigsäureanhydrid, gegebenenfalls in Gegenwart von etwas Schwefelsäure,
angewendet. Beim Acylieren werden die wirksamen Stoffe nicht angegriffen. Die acylierten
Begleitstoffe können durch Ausziehen mit organischen Lösemitteln, z. B. Chloroform,
entfernt werden.
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An vorerwähntes Verfahren kann sich noch ein aufeinanderfolgendesBehandeln
mit Fällmitteln, wie Sublimat, Reineckesäure, Pikrolonsäure und Oxalsäure, anschließen.
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So gereinigte Zubereitungen zeigen bereits in sehr großen Verdünnungen
eine starke zellvermehrende Wirkung. Als Maß für die Wirksamkeit kann, wie in den
folgenden Beispielen, die Saccharomyces-Einheit (SE) gewählt werden: Hierunter wird
diejenige Menge des Wirkstoffs verstanden, die einen Zellenzuwachs von =oo °/o hervorruft,
wenn folgende Bedingungen eingehalten werden: Einwirkung auf 0,240 mg Hefe, 5 Stunden
Wachstumszeit bei 30' ± 0,5' C, Nährboden Glucose und übliche anorganische
Salze.
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Die in den neuen Reinigungsverfahren angewandten Arbeitsweisen sind
an sich bekannt. Man hat auch bereits eingeengten Hefeextrakt zur Anreicherung von
Bios mit Alkohol gefällt, das Filtrat anschließend mit Aceton behandelt und den
entstandenen Niederschlag nach Auflösen in Wasser durch eine Bleiacetatfällung weitergereinigt.
In der so gewonnenen Lösung sollte der Wirkstoff durch Phosphorwolframsäure nicht
fällbar sein. Es war daher erstaunlich, daß durch vorliegendes Verfahren, in dem
die Phosphorwolframsäurefällung eine wichtige Reinigungsstufe darstellt, der die
Zellvermehrung bewirkende Stoff in so hoher Konzentration gewonnen werden konnte.
Beispiel
r Der Autolysesaft von 7 kg Preßhefe wird mit Fullererde behandelt. Die Fullererderestlösung
wird durch Einengen auf einen Gehalt von 50°/ä Trockensubstanz gebracht und mit
q. 1 absolutem: Alkohol entmischt. Der alkoholische Anteil wird in 2 1 Wasser gelöst
und erst mit neutraler Bleiacetat-, dann mit Sublimätlösung erschöpfend gefällt.
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Das Filtrat des Sublimatniederschlägs wird mit Schwefelwasserstoff
vom Quecksilber befreit und zur Sirupkonsistenz eingeengt. Nun wird mit 60o ccm
Essigsäureänhydrid und einem Tropfen konzentrierter Schwefelsäure auf 6o' erwärmt.
Dabei geht der Sirup in Lösung. Nach dem Entfernen des Essigsäureanhydrids wird
der Rückstand in Chloroform gelöst und die Lösung mit Wässer und verdünnter Salzsäure
ausgezogen. Der Rückstand des wäBrigen und des salzsauren Auszugs wird noch einmal
der Acetylierung unterworfen. Nach Abtrennung eines Kristallisats wird das acetylierte
Produkt in Wasser gelöst und zur Entfernung von Begleitstoffen erst mit Äther und
dann mit Chloroform ausgezogen.
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Nach dem Ausziehen wird der wäßrige Anteil in 10 ccm 5 °/oiger Schwefelsäure
gelöst und mit 5 ccm einer 50 °/oigen Lösung von Phosphorwolframsäure in 5 °/oiger
Schwefelsäure gefällt. Der Niederschlag wird mit Barytlauge zerlegt, mit Schwefelsäure
vorn Barium befreit und zur Trockne eingedampft.
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Der Rückstand wird in 15 ccm Wasser gelöst und mit 7 ccm gesättigter
alkoholischer Sublimatlösung gefällt. Der Niederschlag wird mit Schwefelwasserstoff
zerlegt.
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Die Lösung (q. ccm) wird alsdann mit einer alkoholischen Lösung von
Pikrolonsäure versetzt. Das Filtrat dieser Fällung wird auf 1 ccm eingedampft und
i ccm Reineckesälzlösung hinzugefügt.
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Das Filtrat des entstehenden Niederschlags wird nach Eindampfen in
1o °/oiger wäßriger Oxalsäurelösunggelöst. NächkurzerZeitkriställisiert ein schwer
lösliches Salz aus, das biologisch unwirksam ist. Das Filtrat wird durch Ausäthern
von überschüssiger Oxalsäure befreit. Der Rückstand der wäßrigen Lösung wird mit
absolutem Alkohol ausgezogen, die Auszüge in verdünnter Schwefelsäure gelöst und
durch Ausäthern von den Resten der Oxalsäure befreit.
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Der alkoholunlösliche Anteil ergibt nach Eindampfen zur Trockne 84
mg, _ die etwa 37o ooo SE/g enthalten; Gesamtmenge 31000 SE.
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Der alkohollösliche Anteil ergibt nach Eindampfen 15 mg, die 26oooo
SE/g enthalten; Gesamtmenge 3 90o SE. Beispiel 2 Zur Verwendung kommt die Dottersubstanz
von (gekochten) Hühnereiern. In diesem Beispiel wird die Aufarbeitung von 25 Eidottern
beschrieben,; Trockengewicht 147 g, Gehalt etwa .3 400 SE/g.
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Das Eigelb wird mit der fünffachen Menge Wässer heiß ausgezogen. Der
Auszug wird mit einem Drittel seines Rauminhalts Aceton gefällt. Das Filtrat wird
zur Trockne eingedampft, in 25 ccm Wasser gelöst und mit 165 ccm 95 °/öigem Alkohol
gefällt.
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Das Filtrat der Fällung wird zur Trockne gedampft, in 35 ccm Wasser
gelöst und erschöpfend mit Bleiacetat- und Sublimatlösung gefällt. Nach Zerlegen
der Sublimatfällung mit Schwefelwasserstoff und Eindampfen der erhaltenen Lösung
zur Trockne wird in 2 ccm 5 %iger Schwefelsäure gelöst und mit 2 ccm 5o°/oiger Phosphorwolframsäurelösung
in. 5 °/oiger Schwefelsäure gefällt.
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Nach Zerlegen des Niederschlags mit Baryt und Ausfällen des Bariums
mit Schwefelsäure wird nach Eindampfen der erhaltenen Lösung der Rückstand in 3,5
ccm Wasser gelöst und mit 2 ccm gesättigter alkoholischer Sublimatlösung gefällt.
Der Niederschlag und das Filtrat werden mit Schwefelwasserstoff zerlegt.
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Die Fällung ergibt nach Zerlegen und Eindampfen 75 mg, die etwa 2
350 000 SE/g enthalten; Gesamtmenge 18oooo SE.
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Das Filtrat ergibt nach Zerlegen und Eindampfen 36o mg, die etwa q.=0000
SE/g enthalten; Gesamtmenge 150 000 SE.
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In der Fällung ist das Biotin auf das 7oofache in bezug auf das Ausgangsmaterial
angereichert.