DE923739C

DE923739C - Verfahren zur Anreicherung antibiotisch, insbesondere tuberkulostatisch wirksamer Stoffe

Info

Publication number: DE923739C
Application number: DEI1379A
Authority: DE
Inventors: Erich Dr Med Hesse; Karl-Heinz Dr Rer Nat Imhausen; Gustav Dr Rer Nat Renckhoff; Walter Dr Rer Nat Rudolph
Original assignee: Imhausen & Co GmbH; KARL HEINZ INHAUSEN DR RER NAT
Current assignee: Imhausen & Co GmbH; KARL HEINZ INHAUSEN DR RER NAT
Priority date: 1950-06-27
Filing date: 1950-06-27
Publication date: 1955-02-21

Description

Verfahren zur Anreicherung antibiotis dl, insbesondere tuberkulostatisch wirksamer Stoffe In Escherichia coli sind antibiotisch, insbesondere tuberkulostatisch wirksame Stoffe enthalten, zu deren Gewinnung die Bakterienleiber, wie sie sich z. B. in den Fäces finden, als Ausgangsmaterial dienen können. Man kann eine geeignete Bakterienmasse auch durch Abschleudern von auf Kulturlösungen gewachsenen Colibakterien erhalten, wobei es gegebenenfalls vorteilhaft ist, besonders ausgelesene Varianten zu kultivieren, die eine hohe Wirkstoffproduktion liefern.
Es wurde nun gefunden, daß solche Wirkstoffe in angesäuertem Wasser unlöslich sind, aber aus der Bakterienmasse mit Hilfe von Lipoide, insbesondere höhere Fettsäuren lösenden organischen Lösungsmitteln extrahiert werden können. Durch Entfernung der in schwachem Alkali (p, = 9) un. löslichen Bestandteile aus den Extrakten lassen sich die Wirkstoffe weiter anreichern.
Als Lösungsmittel können z. B. Äther, Petroläther und andere Kohlenwasserstoffe, Ester u. dgl. benutzt werden. Besonders zweckmäßig ist die Benutzung solcher Lösungsmittel, die auch Wasser zu lösen vermögen bzw. damit mischbar sind, wie Aceton, Alkohol, Butanol, Methylenchlorid, Pyridin od. dgl. Derartige Lösungsmittel gestatten, die Bakterienmasse ohne vorherige Trocknung zu extrahieren, doch müssen in diesem Falle die angewendeten Lösungsmittelmengen so groß sein, daß das Lösevermögen der wasserhaltigen Lösungsmittel für höhere Fettsäuren erhalten bleibt. Der Wassergehalt des Extraktionsmittels soll im Falle von Athylalkohol etwa 40 0/o, im Falle von Pyridin 25 O/o, bei Aceton 30 bis 350/0, bei einer Pyridin-Butanol-Mischung (3 : 2 bis 5 Gewichtsteile) etwa 25 bis 35 O/o nicht übersteigen.
Die z. B. durch Abschleudern aus der Kulturlösung isolierte Bakterienmasse kann entweder so wie sie anfällt verarbeitet werden oder nach einer Vorbehandlung, durch die die Zellwände mehr, oder weniger weitgehend zerstört werden. Zum Beispiel kann man sie mit Kochsalz verreiben oder auch mit Natriumsulfat, wobei gleichzeitig ein Wasserentzug stattfindet, so daß sich eine besondere Trocknung erübrigt. Man kann auch mit Kohlensäureschnee verreiben und nach dem Auftauen im Vakuum trocknen.
Bei der Extraktion fallen nach Entfernung des Extraktionsmittels Öle, die zur teilweisen Kristallisation neigen, an, deren in schwacher Lauge löslichen Bestandteile eine hohe Wirksamkeit gegen Tuberkelbazillen und auch einige andere .Bazillen aufweisen.
Beispiel I Iooo g durch Zentrifugieren aus einer Nährlösung isolierte Paste von Escherichia coli mit einer Keimzahl von rund 5 . 1011 Keimen pro Gramm, die einen Trockengehalt von etwa 260/0 und einen Aschegehalt von etwa g bis IOO/o in der Trockensubstanz besitzt, wird durch Verreiben mit Kohlensäureschnee rasch gefroren und 4 Tage, in Thermosflaschen verpackt, im Eisschrank bei einer Temperatur von etwa + 40 dem Auftauungsprozeß überlassen. Die im wiederaufgetauten Zustand etwas dünnflüssigere Paste wird alsdann auf Glasplatten ausgestrichen und bei 400 im Vakuum getrocknet, bis der Dampfdruck praktisch 0 ist. Die Paste geht dabei in eine blättrige, durchscheinende Masse über, die ähnlich wie Schellack aussieht und fast geruchlos ist. Der Trocknungsvorgang dauert ungefähr 4 Tage. Der leichten, blättrigen Masse wird nach dem Verreiben Gelegenheit gegeben, sich wieder mit Wasserdampf zu sättigen. Sie wird dann in einem Soxhlet mit Äther extrahiert. Die erschöpfende Extraktion dauert etwa 4 bis 6 Stunden.
Zunächst läuft der Äther intensiv gelb gefärbt ab, um später farblos zu werden. Der gelbe ätherische Auszug wird durchAbdampfen, zuletzt im Vakuum bei maximal 400 von allen flüchtigen Anteilen befreit. Danach riecht der ätherfreie Rückstand (7 g) etwas nach Essigsäure. Er neigt zur Kristallisation.
In Ho O mit n Kalilauge gelöst, erweist sich dieser Extrakt im Sauton-Test in hoher Verdünnung als wirksam gegen Tuberkelbazillen vom Typ humanus.
Beispiel 2 IOOO g Colipaste mit den im Beispiel 1 beschriebenen Eigenschaften werden mit 600 g Kochsalz intensiv verrieben. Die Mischung, die dabei dünnflüssig wird, bleibt 4 Tage im Eisschrank bei + 40 stehen und wird dann mit so viel Wasser vermischt, daß alles Kochsalz in gesättigte Kochsalzlösung übergehen kann. Sie wird mit Salzsäure auf PH 2 Z eingestellt. Die Aufschwemmung der Bakterien in dieser sauren, gesättigten Kochsalzlösung läßt sich ohne besondere Maßnahmen gut absaugen, wobei ein klares, gelbes Filtrat und ein ziemlich trockener Absaugrückstand erhalten wird. Dieser Absaugrückstand kann in gleicher Weise noch ein-oder mehrmals von bei saurer Reaktion in Wasser löslichen Bestandteilen befreit werden. Dabei ist es unter; Umständen erforderlich, mit abnehmendem Kochsalzgehalt im Absaugrückstand zwecks Erreichung einer besseren Absaugbarkeit in der Bakteriensuspension in saurem Wasser eine Fällung von Gips zu erzeugen, dessen Menge etwa 0,5 bis 10/0 des jeweils auszuwaschenden Absaugrückstandes betragen soll.
Die so von wasserlöslichen Bestandteilen befreite Bakterienmasse wird alsdann mehrmals mit 7o0/oigem Alkohol durch intensives Verrühren und Absaugen ausgezogen. Die vereinigten Auszüge, die klar sind und eine leicht bräunliche Farbe haben, werden durch Abdampfen im Vakuum bei höchstens 400, wobei von Zeit zu Zeit etwas Wasser zugesetzt wird, vom Alkohol befreit. Dabei fällt ein brauner, fester Niederschlag aus, Er wird durch Abfiltrieren isoliert, mit Wasser ausgewaschen und nach nach dem Suspendieren in Wasser mit n Kalilauge behandelt, wobei die Hauptmenge in einen seidig glänzenden, in Wasser unlöslichen Stoff übergeht; ein geringer Teil geht indessen in Lösung. Der unlösliche Stoff wird durch Zentrifugieren abgetrennt.
Die nahezu klare, überstehende, wäßrige, schwach alkalische Lösung erweist sich als im Sauton-Test außerordentlich wirksam.
Beispiel 3 IOOO g Colipaste mit den im Beispiel 1 beschriebenen Eigenschaften werden mit 500 g Pyridin und 400 g n-Butanol gut verrührt und I8 bis 24 Stunden im Eisschrank bei + 40 belassen. Diese Suspension läßt sich sehr leicht absaugen, wobei ein klares, grün fluoreszierendes Filtrat gewonnen wird, das sehr zum Schäumen neigt. Durch Zusatz von etwas Chlorbenzol od. dgl. wird indessen das Abdampfen des Pyridins und Butanols im Vakuum bei etwa 400 ermöglicht. Butanol wird dabei restlos entfernt. Reste von Pyridin werden dadurch beseitigt, daß der Abdampfrückstand nach Aufnehmen in Äther mit etwa 10/obiger wäßriger Salzsäure mehrmals gut durchgeschüttelt wird. Nach Trocknen der ätherischen Lösung mit Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum hinterbleiben etwa 7 bis 8 g eines rotgefärbten Öls, das n in Wasser mit n Kalilauge bei PH = 8 bis 9 gelöst werden kann. Das Öl erweist sich in verschiedenen Testverfahren nicht nur gegen Tuberkelbazillen vom Typ humanus als wirksam, sondern auch gegen eine ganze Reihe anderer Bazillen, wie z. B. die von Typhus, Bang und Diphtherie, sowie gegen Staphylokokken und Streptokokken.
PATENTANSPRCCHE: I. Verfahren zur Anreicherung antibiotisch, insbesondere tuberkulostatisch wirksamer Stoffe dadurch gekennzeichnet, daß aus Kulturlösungen z. B. durch Abschleudern, isolierte Colibakterien mit Hilfe von Lipoide, insbesondere höhere Fettsäuren lösenden organischen Lösungsmitteln, wie Äther, Petroläther od. dgl., Ester, oder auch mit Wasser mischbaren Mitteln, wie Alkohole, Aceton, Pyridin od. dgl. mit einem Wassergehalt nicht über 25 bis 45 °/o, extrahiert und die Extrakte vom Lösungsmittel sowie gegebenenfalls von in schwachem Alkali (PH = 8 bis 9) unlöslichen Stoffen befreit werden.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß in der Bakterienmasse vor der Extraktion durch Zerreiben mit festen Stoffen, vorzugsweise Kochsalz oder Natriumsulfat oder durch Gefrierenlassen, die Zellen zerstört werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienmasse vor der Extraktion getrocknet wird.

Angezogene Druckschriften: Lembke und Krüger-Thiemer, Jena, I952, Literaturstudien zum Tuberkuloseproblem; Hoppe-Seyler, I950, S. I72; Aun. Inst. Pasteur, I947, 5. 904.