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Verfahren zur Gewinnung organspezifischer Wirkstoffe fermentartiger Aktivität
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung neuer wasserlöslicher Fermente. Man erhält diese in Form eines Fermentkomplexee organspezifischer Fermente, indem man von einem Stück Gewebe, das einem lebenden Tier entnommen wird, ausgeht und dieses der Mazeration mit Wasser unterwirft. Diese
Fermente, ihrer Natur nach eiweiss-spaltend, besitzen interessante therapeutische Eigenschaften.
Bei der Herstellung dieser neuen wasserlöslichen Fermente wurde gefunden, dass ihre Wirksamkeit im Laufe der Mazeration bedeutenden Schwankungen unterliegt. Es empfiehlt sich also, die Mazerations- flüssigkeiten zu kontrollieren, um zu versuchen, die Zeit der höchsten Wirksamkeit zu bestimmen. Zu diesem Zweck nimmt man in regelmässigen Zeitabständen Laboratoriumsreaktionen vor, wie z. B. die
Mikroreaktion von Abderhalden.
Die Abderhalden'sche Mikroreaktion dient dem Nachweis der Anwesenheit von organspezifischen Abwehrfermenten im Harn oder im Blutserum.
Im Prinzip wird die fermenthaltige Flüssigkeit in Kontakt gebracht mit verschiedenen reinen Organsubstraten.
Falls organspezifische Fermente vorhanden sind, tritt eine Verdauung des korrespondierenden Organsubstrates ein, Verdauung, die unter andern Stoffen hauptsächlich Aminosäuren hervorbringt.
Diese Aminosäuren gehen mit Ninhydrin eine Blaufärbung ein.
Im einzelnen wird folgendermassen vorgegangen : In eine Reihe Probiergläser gibt man in das erste Glas etwas Hypothalamus - substrat das zweite Glas etwas Hypophysen - substrat das dritte Glas etwas Schilddrüsen - substrat das vierte Glas etwas Leber - substrat usw.
In das letzte Glas jedoch gibt man kein Substratum (dient als Kontrolle).
Nun wird zu jedem Glas 1 ml des auf organspezifische Fermente zu untersuchenden Blutserums (in diesem Falle : filtrierter Mazerationsflüssigkeit) gegeben.
Sämtliche Gläschen werden nun mit einem Wattebausch verschlossen und in einen Brutschrank bei 37 C während 16-20 h aufbewahrt.
Am nächsten Tag wird zu jedem Gläschen 10 ml absoluter Äthylalkohol gegeben (zur Präzipitierung).
Nach erfolgter Präzipitation wird der Inhalt jedes Gläschens separat gefiltert (Papierfilter).
Zwischendurch werden in sogenannte Abderhalden'sche Mikroröhrchen 0, 2 ml einer 1% Ninhydrinlösung gegeben.
Von den inzwischen erhaltenen Filtraten wird genau 0, 5 ml abgemessen und zu einem der eben mit Ninhydrinlösung beschickten Mikroröhrchen gegeben.
Im einzelnen geht das folgendermassen vor sich :
Von dem als"Kontrolle"bezeichneten Probierglas wird 0,5 ml des Filtrats zu einem als Kontrolle bezeichneten Mikroröhrchen gegeben.
Von dem als "Hypothalamus" bezeichneten Probierglas wird 0, 5 ml des Filtrats zu einem als'Hypo- thalamus'bezeichneten Mikroröhrchen gegeben.
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Von dem als "Hypophyse" bezeichneten Probierglas wird 0 ; 5 ml des Filtrats zu einem als'Hypo- physe'bezeichneten Mikroröhrchen gegeben ; usw.
Daraufhin wird jedes Mikroröhrchen mit seinem Glaspfropfen verschlossen und das Röhrchen gut durchgeschüttelt. Schliesslich werden alle Mikroröhrchen in das Wasserbad bei zirka 70-80 C gehängt.
DasWasserbad wird unterbrochen, sobald das als Kontrolle bezeichnete Röhrchen Farbe annimmt.
Die aufgetretenen Blaufärbungen werden mit dem Blau der Kontrolle verglichen : Jedes Mikroröhr- chen, das eine stärkere Blaufärbung zeigt als die Kontrolle, wird als positiv erachtet, alle übrigen werden als negativ angesprochen.
Diese Methode ist eine qualitative Methode, die, wie die Erfahrung gezeigt hat, den Anforderungen zur Gewinnung der beschriebenen organspezifischen Fermenten Genüge leistet.
Die Substrate werden aus tierischen oder menschlichen Organen gewonnen : Die Organe werden fein zerkleinert, daraufhin wird unter wiederholtem Waschen unter fliessendem Wasser alles Organbindegewebe mechanisch entfernt, so dass schliesslich nur mehr reines Organgewebe übrigbleibt.
Das so erhaltene Organgewebe wird während 3 Tagen in Aceton im Überschuss aufbewahrt. Falls das
Aceton eine gelbe Farbe annimmt, muss es abgegossen und erneuert werden.
Am vierten Tage wird das letzte Aceton durch ein Aceton-Äthergemisch (ana partes) ersetzt und bleibt in Berührung mit den Organzellen, bis zum sechsten Tag. (Häufiges Umschütteln zwischendurch erforderlich.)
Am siebenten Tag wird das Aceton-Äthergemisch durch reinen Äther ersetzt und stehen gelassen bis zum zehnten Tag. Am zehnten Tag wird das ganze auf einen grossen Papierfilter gekippt, der Filter wird ausgebreitet und das so erhaltene auf dem Filter liegende Substrat wird an der Luft getrocknet und schliess- lich in einer hermetisch schliessenden Flasche aufbewahrt.
Vor Gebrauch wird eine kleine Menge entnommen, 10 ml destilliertes Wasser zugesetzt und aufge- kocht. Das Wasser wird abgegossen und durch neues ersetzt. Wieder aufkochen, Wasser wegwerfen, und so voran. Im ganzen achtmal. Schliesslich wird alles auf hartes Papierfilter gekippt. Von dem an dem
Filter hängenden Substrat wird eine kleine Menge genommen, um zum Ansetzen der Reaktion zu dienen.
Da das Substrat frei von ninhydrinpositiven Substanzen sein muss, wird folgende Probe angestellt :
Etwas Substrat wird mit 0, 9 ml physiologischer Kochsalzlösung vermischt und in den Brutschrank bei 37 C gestellt. Nach 24 h darf die überstehende Flüssigkeit keine Färbung geben nach Zusatz einer 10/D
Ninhydrinlösung.
Bei der Durchführung dieser Laboratoriumsreaktionen an den verschiedenen Organen wurde festge- stellt, dass die therapeutische Wirksamkeit dieser neuen wasserlöslichen Fermente mehr oder weniger proportional der Zahl der Organe ist, mit welchen man die digestive Wirkung der Fermente prüft. Von den Organen, die für diese Bestimmungen verwendet wurden, seien die folgenden genannt : Leber, Milz, Hypothalamus, Hypophyse, Nebenniere, Schilddrüse, Quadriceps, Ovarien, Testikel und Bindegewebe. Durch diese Liste soll nur eine beispielsweise Nennung, nicht aber eine Beschränkung auf die genannten Organe vorgenommen werden, die sowohl vom Menschen als auch von Tieren herstammen können.
Die Dauer der Mazeration, die notwendig ist, um ein Maximum an Wirksamkeit, oder wenigstens eine genügend grosse Wirksamkeit zu erreichen, hängt von den Verfahrensbedingungen und besonders von der Art der Organe ab, die der Mazeration unterworfen werden, und weiters von der Temperatur und der Zusammensetzung der Mazerationsflüssigkeit. Die Dauer beträgt im allgemeinen zwischen 2 und 30 Tage, doch wird diese Zahl manchmal auch überschritten. In der Mehrzahl der Fälle liegt das Maximum jedoch zwischen dem zehnten und dem zwanzigsten Tag. Man kann annehmen, dass das Optimum der Wirksamkeit erreicht oder sehr nahe bevorsteht, wenn das Mazerationswasser mindestens 7 Substrate auf 10 auflöst.
Das Mazerationswasser erleidet, ob es von dem ursprünglichen tierischen Gewebe abgetrennt ist oder nicht, eine degressive Fortentwicklung, die manchmal durch zeitweiliges Wiederansteigen der Aktivität unterbrochen ist. So z. B. ist die Mazerationsflüssigkeit, die vom Quadriceps einer Ziege herrührt und am neunten Tag abgetrennt wurde, fähig, 3 oder 4 Substrate zu verdauen. Diese Aktivität erreicht 7 Substrate am achten Tag nach der Trennung und verschwindet ganz am Ende von 22 Tagen. Bei gleichbleibenden Versuchsbedingungen erfolgt der Aktivitätsverlust in Anwesenheit des ursprünglichen animalischen Gewebes weniger rasch.
Jedenfalls verlieren die neuen, wasserlöslichen Fermente mit der Zeit ihre organspezifische Wirksamkeit in der Mazerationslösung, ob das ursprüngliche animalische Gewebe gegenwärtig ist oder nicht.
Es wurde nun gefunden, dass diese Wirksamkeit durch eine einfache Massnahme überraschenderweise über eine lange Zeit hinweg erhalten wird. Es genügt, die neuen wasserlöslichen Fermente einfach abzutren'1en.
Diese Abtrennung kann auf folgende Art durchgeführt werden.
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Laboratoriumsversuche haben gezeigt, dass die organspezifische Wirksamkeit der neuen wasserlöslichen Fermente deutlich erhöht werden kann, wenn man die Mazerationsflüssigkeit einer Erhitzung Im Autoklaven bei 120 C während 1 h unterwirft. Die so behandelte Mazerationsflüssigkeit wird anschlie- ssend durch steriles Papier filtriert. Das Filtrat, welches bei 37 C getrocknet wird, gibt einen Rückstand, der in einer mit Stöpsel versehenen Flasche und vor Licht geschützt, aufbewahrt werden kann. Man hat feststellen können, dass das so erhaltene Pulver seine organspezifische Aktivität sogar bei Temperaturen von ungefähr 30 C, während mehrerer Monate aufrecht erhielt. Man findet tatsächlich, wenn man das Pulver in sterilem Wasser auflöst, die ursprüngliche enzymatische Wirksamkeit wieder.
Diese bleibt während einiger Tage konstant und erleidet dann eine progressive Verminderung, die aber viel langsamer verläuft als die, welche bei der Mazerationsflüssigkeit zu beobachten ist.
Gemäss einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens kann die Abtrennung der neuen wasserlöslichen Fermente dadurch erfolgen, dass die von animalischem Gewebe befreite Mazerationsflüssigkeit mit einem organischen Lösungsmittel behandelt wird, welches mit Wasser mischbar ist.
Als Beispiele seien unter anderem erwähnt Aceton, die Alkohole oder Mischungen derselben. Es bildet sich ein Niederschlag, den man so schnell als möglich abtrennt und anschliessend einer Extraktion unterwirft. Die Extraktionslösung wird unter den gleichen Bedingungen eingedampft wie die Flüssigkeit, die im Autoklaven erhitzt worden war. Die so erhaltenen Pulver lassen sich sehr gut aufbewahren und besitzen therapeutische Eigenschaften, die von den aus Flüssigkeiten, die im Autoklaven erhitzt worden sind, erhaltenen teilweise verschieden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft also zusammenfassend ein Verfahren zur Gewinnung organspezifischer Wirkstoffe fermentartiger Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass man zerkleinerte Gewebe von tierischen Muskeln oder Organen unter sterilen Bedingungen und bei einer Temperatur von ungefähr 5 C in einem annähernd neutralen wässerigen Medium mindestens 2 Tage, jedoch so lange mazeriert, bis eine Reaktion auf organspezifische Fermente wie die Abderhalden'sche Mikroreaktion optimal positiv ist, dann entweder die erhaltene Mazerationsflüssigkeit nach Filtration mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Aceton, fällt, den Niederschlag abtrennt und aus dem Niederschlag die Wirkstoffe mit physiologischer NaCl-Lösung eluiert oder das Mazerat im Autoklav zirka 1 h auf 120 C erhitzt, filtriert und die Lösung gegebenenfalls schonend trocknet.
Die Wirksamkeit der neuen wasserlöslichen Fermente nach der Erfindung hängt von der Azidität der Lösung ab. Im sauren Gebiet (PH = 3) ist fast keine Wirkung feststellbar, diese wird jedoch bei einem PH = 6 ansehnlich und erreicht ihr Maximum im neutralen Wasser (PH = 7) ; sie verringert sich in der Folge rasch und ist in leicht alkalischen Lösungen (Pli = 8, 5) nur mehr ganz schwach.
Die organspezifische Wirkung kann durch entsprechende Behandlung oder Zusätze verbessert werden.
Zu den Lösungen der neuen wasserlöslichen Fermente, die aus einem trockenen Pulver hergestellt sind, setzt man z. B. Vitamin C (15 mg/ml) Penicillin-Kalium (16 000 Einheiten/ml) oder biologische Stimulantien, wie sie von Filatov beschrieben sind, zu. (Filatov, La Therpeutique tissulaire, Edit. franco.
Mascou [1955]). Es wird auch die Behandlung mit X-Strahlen (Röntgenstrahlen) (Entfernung 7 cm, 60 kV, 20 mA, 6 sec) oder mit ultravioletten Strahlen (Entfernung 10 cm, 500 W, 90 sec) empfohlen. Es braucht nicht besonders hervorgehoben zu werden, dass diese genannten Zahlen nur als ungefähre Angaben zu werten sind, welche in bestimmten weiteren Grenzen abgeändert werden können. Eine Lösung der wasserlöslichen Fermente, die durch langes Stehen ihre Wirkung verloren hat, erlangt wieder eine deutliche Aktivität nach Zugabe von 15 mg/ml Vitamin C.
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Was die Abwehrfermente von Abderhalden betrifft (diese treten nur im lebenden Organismus, der nicht cachexigiert und von seinem Pankreas versorgt ist, in Erscheinung : R. Abderhalden und R. W. Martin, Fermentforschung 16 [1940], S. 245), so halten diese keine Wärmebehandlung aus (R. Abderhalden und S. Buadze, Fermentforschung 11 [1931], S. 361). Diese Unterschiede zeigen in klarer, jede Diskussion ausschliessender Weise, dass die neuen, wasserlöslichen Fermente nach der Erfindung nicht zu den Abwehrfermenten gerechnet werden können. Übrigens haben diese letzteren, wenn der pH-Wert der Lösung unter 6 liegt, überhaupt keine Wirkung, und in leicht alkalischen Lösungen eine deutliche Aktivität, und das bei dem gleichen PH, bei dem die neuen Fermente nach der Erfindung ihre gesamte eiweissspaltende Wirkung verloren haben.
Es muss hervorgehoben werden, dass die Mikroreaktion nach Abderhalden, die zur Untersuchung der Wirksamkeitsänderungen während der Mazeration verwendet wurde, nicht unentbehrlich ist ; im Prinzip werden andere Testmethoden ebenso gut verwendbar sein.
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die pH-Werte ihrer Aktivitätsmaxima ganz verschieden.
In den folgenden Beispielen werden die wasserlöslichen Wirkstoffe aus Muskeln, Lunge, Kubitalnerv oder der Niere einer Ziege gewonnen. Diese Aufzählung von Geweben oder Organen soll keineswegs be- grenzend sein. Vergleichbare Resultate wurden erhalten, wenn man die Mazeration der Nebenniere vom
Schwein oder Rind, von Rindermuskel, Gehirn der Ziege, menschliche Plazenta, Rückenmark der Ziege,
Schilddrüse der Ziege, Ziegenhaut, Testikel vom Ziegenbock, Leber von der Ziege oder vom Rind, Rin- ) derherz usw. durchführt.
Beispiel l : Unter Sterilätzung wird vom Quadriceps einer frisch geschlachteten Ziege eine Probe genommen. Der Muskel. wird in kleine Würfel geschnitten, die dann in einen sterilen Behälter gebracht werden. Dazu werden -dann 400 ml physiologische Kochsalzlösung und 50 000 Einheiten Penicillin-Kalium, gelöst in einem Milliliter, zugefügt. Die Flasche wird verstopft, geschüttelt und an einen Ort mit einer , Temperatur von ungefähr 50C gebracht und stehen gelassen.
Die notwendigen Mengen für die Aktivitätsversuche werden vorbereitet. Die Probenahme erfolgt je- weils am ersten, vierten, sechsten, neunten und zwölften Tag. Für die Reaktion nach Abderhalden wählt man folgende 10 Organe : Leber, Milz, Hypothalamus, Hypophyse, Nebenniere, Schilddrüse, Quadriceps von Rind oder Ziege, Ovarien, Testikel, Bindegewebe. Die positiven Reaktionen ergeben sich wechsel- seitig mit 2, 8, 3, 4 und 8 Organen. Nach Erhalt dieses letzten Resultates werden 200 ml der Mazera- tionsflüssigkeit und genau die Hälfte der Quadricepsstücke herausgezogen.
Die Mazeration wird unter den gleichen Bedingungen wie vorher fortgesetzt. Es werden Proben ge- nommen für Versuche am fünfzehnten, achtzehnten, vierundzwanzigsten, einunddreissigsten, achtund- vierzigsten und dreiundsiebzigsten Tag. Die Zahl der Organe, die nach der Mikroreaktion \on Abderhal- den aufgelöst wird, beträgt wechselweise 5,8, 0 (vierundzwanzigster Tag), 2,5, 0 (dreiundsiebzigster
Tag). Die vorstehenden Resultate zeigen klar die Aktivitätsänderungen während der Mazeration.
Wenn man ein bestimmtes Organ nimmt, z. B. die Leber, findet man, dass am ersten, neunten, vierundzwanzigsten, einunddreissigsten und dreiundsiebzigsten Tag die Wirksamkeit nicht festgestellt wer- den kann ; eine deutlich starke Wirksamkeit ist am vierten und achtzehnten Tag feststellbar und eine be- deutende Wirksamkeit ist schliesslich am zwölften und achtundvierzigsten Tag zu beobachten.
Die am zwölften Tag ausgeführte Probenahme hat zur Präparation von neuen wasserlöslichen Fer- menten gedient, wie sie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben werden.
Beispiel 2 : Zu 100 ml Flüssigkeit, die am zwölften Tag als Probe gezogen worden ist, wird die genau entsprechende Menge an Quadricepsstücken (d. i. ein Viertel der ursprünglichen Menge) zugesetzt.
Das Ganze wird in einem Autoklaven bei 120 C und einem Druck von 3 atm absolut 1 h erhitzt.
Man lässt abkühlen bis ungefähr 500C und filtriert bei dieser Temperatur durch ein steriles Papier.
Das Filtrat wird auf 5 Petrischalen aufgeteilt, die sodann in einen Trockenapparat mit. einer Temperatur von ungefähr 370C eingesetzt werden. Nach volIständigerTrocknung wird der Eindampfrückstand mit Hilfe von sterilen Instrumenten aufgelockert und in eine gut verschliessbare Flasche gebracht. Die Aufbewahrung erfolgt unter Lichtausschiuss und wenn möglich im Kühlen. Diese letzte Bedingung ist nicht unerlässlich.
Beispiel 3: 100 ml der Flüssigkeit, die am zwölften Tag als Probe gezogen wurde (Beispiel l), werden durch steriles Papier filtriert. Zu diesem Filtrat werden 150 ml einer aus gleichen Teilen Aceton und Äthylalkohol bestehenden Mischung zugesetzt. Der entstehende Niederschlag wird 12 h absetzen ge- lassen. Danach wird die überstehende Flüssigkeit sorgfältig abgegossen. Der Niederschlag wird sodann einer Auslaugung mit 20 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung unterworfen, wobei während einer
Zeit von 20 h von Zeit zu Zeit mit einem sterilen Glasstab umgerührt wird. Sodann wird durch steriles
Papier filtriert und das Filtrat in Petrischalen gegossen, die, wie jene im Beispiel 2, in einen Trocken- apparat mit ungefähr 370C eingesetzt werden.
Die Aufbewahrung des erhaltenen Pulvers erfolgt unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 2.
Wenn man die Mischungen Aceton-Äthanol durch Aceton allein ersetzt, erhält man das gleiche Ergebnis.
Beispiel 4 : Unter sterilen Bedingungen wird der Lungenlappen einer frisch geschlachteten Ziege entnommen. Die Lunge wird in kleine Würfel zerteilt und diese in einen sterilen Behälter eingebracht.
Dazu werden dann 300 ml physiologische Kochsalzlösung und 50 000 Einheiten Pencillin-Kalium. gelöst in einem Milliliter Wasser, zugefügt. Die Flasche wird verstopft, geschüttelt und an einen Ort mit einer Temperatur von etwa 50C gebracht und stehen gelassen.
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