DE212709C

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KAISERLICHES

PATENTAMT.

PATENTSCHRIFT

- JV! 212709 -KLASSE 30 h. GRUPPE

Dr. LUDWIG HEIM in ERLANGEN.

Patentiert im Deutschen Reiche vom 20. März 1908 ab.

Bisher hat man die Schutzstoffe aus dem immunisierten Körper fast ausnahmslos mit dem Serum gezogen; der Gedanke, sie aus den 'Gewebszellen einschließlich der Zellen des Blutes zu bekommen, ist nur selten aufgeworfen und verfolgt worden und hat zu nennenswerten Erfolgen bis jetzt nicht geführt. Der Grund dafür ist in der Meinung zu suchen, daß nur das Serum eine verwertbare Ausbeute an Antistoffen liefern könne, daß dagegen in den Organzellen entweder keine solchen zu erwarten oder daß sie nicht in lohnender Menge aus ihnen herauszuziehen seien.

Nur verhältnismäßig wenige Forscher haben nach Schutzstoffen in den Zellen gesucht und zu diesem Zweck die einzelnen Organe oder selbst ganze Tiere zerkleinert, wie z. B. Jez, der die fein zerschnittenen Organe gegen Typhus immunisierter Tiere in einem Mörser zu einer Masse mit einer Lösung, bestehend aus Kochsalz, Alkohol, Glyzerin, einer kleinen Menge Karbol, später auch unter Hinzunahme von etwas Pepsin, verrieb und, nachdem die Masse 24 Stunden auf Eis stehen gelassen worden war, sorgfältig filtrierte. Andere Autoren, so zuerst R. Emmerich und seine Mitarbeiter haben eine günstige Ausbeute aus Tieren, die gegen Pneumonie oder Schweinerotlauf immunisiert waren, dadurch zu erzielen gesucht, daß sie die Organe und die ganzen Tiere, nachdem sie enthäutet und gereinigt waren, mit der hydraulischen Presse auspreßten und den Saft durch Porzellan filtrierten.

Allein der nutzbaren Verwendung der so zerkleinerten und mit Verdauungsfermenten versetzten oder der ausgepreßten Organe stellte sich der Umstand hinderlich in den Weg, daß die Schutzstorfe durch die in zu großer Menge noch vorhandenen Zellbestandteile und Eiweißmoleküle verdeckt waren und in ihnen eingeschlossen blieben, so daß sie einerseits im Organismus des zu behandelnden Individuums nicht genügend zur Wirkung gelangen konnten, während anderseits schon vorher bei der Filtration der eiweißhaltigen Aufschwemmung oder des Preßsaftes zu viel wirksame Substanz auf dem Filter zurückbehalten und so verloren wurde.

Gemäß vorliegender Erfindung werden nun die Zellbestandteile so weitgehend als möglich beseitigt, so daß schließlich die Schutzstoffe möglichst frei in einer wäßrigen Flüssigkeit neben den löslichen Abbauprodukten der Zellen vorhanden sind und so in den Körper des zu behandelnden Individuums übergeführt, ungehindert ihre Wirkung zu entfalten vermögen, sobald sie auf passende Antigene treffen.

Ein Weg, dieses Ziel zu erreichen, ist folgender:

Ein genügend hoch immunisiertes Tier wird durch Entbluten oder auf andere Weise getötet, danach werden die Muskeln und die meisten inneren Organe entnommen und entweder vereinigt oder einzeln für sich in nachstehender Weise behandelt.

Die Gewebe werden mehrmals durch eine Hackmaschine geschickt, von Feuchtigkeit und Fett befreit und gepulvert. Die Beseitigung

der Feuchtigkeit geschieht entweder in einem Verdampfungsapparat bei niedriger Wärme oder durch Ausschütteln mit Acetonäther, der durch Abfiltrieren und Abdunsten entfernt wird. Dann werden die trockenen Fasern zerrieben und einigemal mit reinem Aceton ausgeschüttelt, um das Fett möglichst wegzuschaffen. Das nach Abfiltrierung dem Rückstand noch anhaftende Aceton wird verjagt

ίο und dieser zu einem feinen Pulver in einer Kugelmühle o. dgl. verrieben.

Diese wirksame, aber viele Tage dauernde Zerkleinerung kann durch folgendes Verfahren umgangen werden: Die in der Hackmaschine zerkleinerten Gewebe werden in frischem, feuchtem Zustande mit Sand und Kieselgur vermischt und in der hydraulischen Presse bei etwa 300 Atmosphären Druck ausgepreßt. Der erhaltene Preßsaft wird entweder im Verdampfungsapparat oder durch Eingießen in Acetotiäther wie oben angegeben getrocknet und der Rückstand einigemal mit reinem Aceton ausgeschüttelt. Durch kurze Veireibung nach Entfernung des Acetons erhält man dann ein Pulver, das für die nachher einzuleitende Fermentation bereits gut geeignet ist. Der klumpige Preßrückstand wird in der Hackmaschine zerwirkt und dann ebenso behandelt; infolge des vorhandenen Sandes und Kieseigurs läßt sich durch kurze Verreibung ein Pulver erzielen, das ebenfalls der folgenden Fermentation mit Erfolg unterworfen werden kann.

Das abgewogene Pulver wird mit ungefähr der zehnfachen Menge sterilen Wassers versetzt und der Einwirkung proteolytischer Fermente unterworfen, um das Eiweiß wegzu-

^; schaffen. Proteolytische Fermente können verschiedene genommen werden, entweder Pepsin in schwach saurer und Pankreatin in schwach alkalischer Lösung oder andere Verdauungsfermente, die man nacheinander Wochen oder Monate hindurch wirken läßt, während welcher Zeit die Flüssigkeit mit einem entwickelungshemmenden Mittel, z. B. Toluol, behufs Vermeidung von anderweitigen Zersetzungen versetzt^ in gut verschlossener Flasche bei Brutschrankwärme gehalten und zeitweise umgeschüttelt wird, oder nicht krankheiterregende, eiweißauflösende Bakterien; im letzteren Falle kann man zu dem sterilen Wasser etwas Nährbouillon oder 2 prozentiges Peptonwasser geben. Wenn die Fermente in genügender Weise gewirkt haben, wird die Flüssigkeit klar abfiltriert. Das Filtrat wird, wenn nicht von vornherein viel Pepton zugesetzt worden ist, die Biuretreaktion höchstens schwach geben. Man kann den Filterrückstand nochmal mit Wasser übergießen und von neuem der Fermentation aussetzen, bis keine Antikörper mehr im Filtrat erscheinen. Um die" Bakterien wegzubringen, wird durch ein bakterienzurückhaltendes Filter, z. B. das Heimsche Asbestfilter, filtriert.

In dem Filtrat finden sich die spezifischen Schutzstoffe so reichlich, daß schon geringe Mengen davon genügen, um Tiere passiv zu immunisieren.

Die Filtrate lassen sich durch Einengung bei nicht zu hoher Wärme konzentrieren. Sie werden dadurch nicht blos quantitativ wirksamer, sondern es entstehen dabei auch Niederschläge, die für den Organismus nicht indifferente Produkte der Fermentation, aber wenig Schutzstoffe enthalten; sie werden durch Abzentrifugieren oder Filtrieren entfernt. Zur haltbaren Aufbewahrung wird das Präparat mit einem Antiseptikum, z. B. Phenol, versetzt.

Als Beispiel für die Wirkung solcher Präparate sei ein gegen die Pneümonie-Infektion eingestelltes, mittels bakterieller Fermentation gewonnenes Extrakt aufgeführt.

Von dem aus Muskeln und inneren Organen eines immunisierten Kaninchens hergestellten Extrakt werden weißen Mäusen je 0,2 ecm unter die Haut des Rückens injiziert, wonach sie keine auffallenden Veränderungen zeigen. Einige Stunden nachher wird den vorbehandelten, sowie einem Kontrolltiere die mehrfach tödliche Gabe virulenter Pneumbniekokken injiziert, und zwar nicht mit einer Kultur, sondern mit dem weit wirksameren und virulenteren Herzblut einer kurz vorher der Infektion erlegenen Maus, in der Dosis von ¹Z₁₀₀ bis ¹Z₁₀₀₀ Öse. Danach stirbt die Kontrollmaus, die vorbehandelten Mäuse dagegen bleiben am Leben und gesund, sobald die Aufschließung der Schutzstoffe aus den' Geweben genügend durchgeführt war. Von der der Fermentation unterworfenen Pulveraufschwemmung wurde zu verschiedenen Zeiten je eine Probe entnommen und nitriert; von dem nicht weiter eingeengten Filtrat wurden in der angegebenen Weise Mäuse behandelt und dann infiziert:

Die mit 2 Tage fermentierter Aufschwemmung vorbehandelte Maus starb in 1¹Z₂ Tagen (9¹Z₂ Stunden später als die zugehörige Kontrollmaus).

Die mit 4 Tage fermentierter Aufschwemmung vorbehandelte Maus starb in 3^χ/₂ Tagen (2 Tage später als die zugehörige Kontrollmaus).

Die mit 9 Tage fermentierter Aufschwemmung vorbehandelte Maus starb nach 8 Tagen (6 Tage später als die zugehörige Kontrollmaus). .

Die mit einer anderen, 10 Tage- fermentierten Aufschwemmung vorbehandelte Maus blieb gesund und am Leben. In wieder anderen Fällen wurden lebensrettende Präpa-

rate durch kürzere, 4 bis 7 Tage währende, oder durch längere, etwa 3 Wochen dauernde bakterielle Fermentation erzielt oder aber unter Ausschluß bakterieller Wirkung durch monatelang durchgeführte Fermentation erst mit Pepsin in schwach saurer, dann mit Pankreatin in schwach alkalischer Lösung.

Claims

Pate nt-An Sprüche:

i. Verfahren, in den Geweben immunisierter Tiere enthaltene Schutzstoffe aufzuschließen und möglichst konzentriert in wäßrige Lösung zu bringen, dadurch gekennzeichnet, daß man Muskeln und innere Organe ' derartiger Tiere zerhackt, durch Trocknen bei niedrigen Wärmegraden oder durch Ausschütteln mit Acetonäther von ihrer Feuchtigkeit, mittels dieses Aceton- -äthergemisches und mittels reinen Acetons oder mittels reinen Acetons allein von ihrem Fettgehalt befreit und nach Verjagen des Acetons durch längeres Zermahlen in ein feines Pulver überführt, das mit der ungefähr zehnfachen Menge Wasser verrieben, im Brütschrank der Wirkung proteolytischer Fermente ausgesetzt und, wenn die Eiweißstoffe fast bis zur Biuretfreiheit der Lösung abgebaut sind, klar filtriert wird, worauf das FiI-trat eventuell bis zum wünschenswerten Gehalt an Schutzstoffen bei. Körperwärme oder darunter im Verdampfungsapparate eingeengt wird. ■ ,
2. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die zerhackten Muskeln und inneren Organe nach dem Vermischen mit Sand und Kieselgur in einer hydraulischen Presse auspreßt, den Preßsaft durch gelinde Wärme oder mittels Acetonäthers vom Wasser befreit, den dabei erhaltenen Rückstand wiederholt mit reinem Aceton schüttelt, um das Fett zu entfernen, und nach Beseitigung des Acetons in ein Pulver überführt, das gemäß Anspruch 1 fermentiert und weiter verarbeitet wird.
3. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß Verfahren nach Anspruch 2 im Preßsack zurückgebliebenen Rückstand durch gelindes Erwärmen oder mittels Acetonäthers von Feuchtigkeit befreit und hierauf gemäß Anspruch 2 bzw. 1 weiter verarbeitet.

Berlin, gedruckt in der reichsdruckerei.