DE1617605A1 - Antigenherstellung und Vakzine - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein 7-er fahren zur Extraktion von B»~
pertussis-Antigen und die Verwendung dieses Antigens zur Herstellung yon mono- oder polyvalenten Vakzinen? die von jeglichem wesentlichen G-ehalt an Zellmateria't. des B* pertussis frei sind.

Der Keuchhusten ist als sine akute, stark übertragbare, infektiöse Erkrankung definiert_t die von B, pertussis hervorgerufen wird und bei Kindern im Alter von unter vier Jahren gefährlich ist und wahrscheinlich unter den Ursachen der Kindersterblichkeit an.erstsr Stelle steht. Eine Immunisierung gegen diese
Störung int bisher durch Injektion abgetöteter Zellvakzine oder extrahierten Antigens bewirkt worden« Das häu/ige Auftreten von Nebenreaktionen, wie Fieber, Empfindlichkeit₈ Entzündungen und ». sowie die seltenen, aber entmutigenden Berichte über

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Enzephalitis haben rait starkem Nachdruck Forschungen nach einer besseren Vakzine notwendig gemacht.

Die vorliegende Erfindung macht e:.n B₀-pertussis-Antigen wesentlich verbesserter Form verfügbar, mit dem sich eine bleibende Immunität gegen Keuchhusten erreichen lässt und das nicht die unerwünschten Uebeneffekte heute bekannter Vakzinen ergibt. Sie stellt eina Vakzine zur Verfügung, die von Zellsubstanzen, die ssma 'Teil toxisch sind und für die bei Verabreichung im Handel verfügbarer Vakainen beobachteten Febenreaktionen verantwortlich sein können» frei ist.

Es wurde gefunden« dass sich eine wertvolle Vakzine für die Immunisierung gegen Keuchhusten durch eine Reihe von Arbeiteschrit~ ten erhalten lässt _s bai denen man Zellen des B, pertussis me=» chanisch zerlegt und das Antigen aus der Zellwand chemisch extrahiert.- Es hat sich gezeigt _t das9 das Schutzantigen einen einheitlichen Teil der Zollwanö. (manchmal auch als Zellmembran oder Zellhülle bezeichnet) bildet; das Protoplasma der Zelle, das den Hauptanteil des stickstoffhaltigen Materials enthält, besitzt nur eine geringe bis keine Schutzaktivität. Das Protoplasma enthält jedoch in honer Konzentration toxischen Protein, das bei Laboratorluastieren zum Tode und beim Vorliegen in den klinisch verabreichten Vakzinen au unerwünschten Nebeneffekten führen kann»

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Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt dementsprechend in der Zerlegung der intakten E.· pertussis-Zelle und Ißolierung der Zollwänds durch Schleudern odei: auf. anderem mechanischen Wege» Die isolierten Zellwände werden dann im wesentlichen vcn Zellmaterial ireigewe3cheu und mit einer Lösung von Natrium- oder Kaliumchlorid extrahiert, weicha das Schutzantigen löslich y.acht und seine iruchanisc'ie Abtrennung von der Zellwand erlaubt.

Pie bei dsm Verfahren gemäas der JSrCindung eingesetzten B₄-pertussis-Zellen Wonnen auf ,jede.·» der bekannten, zweckentsprechenden Medien gezüchtet werden, wie dem Holzkohle -Agar-Medium _t den flüssigen Medien oder dem Kulturmedium nach Cohen-Wheeler, Nach dem V/achsen werden die Zellen durch Schleudern geerntet; man kann die Zellen in der geernteten Form bei dem Verfahren geraäsa der Erfindung einsetzen oder die Zellpaste bie zum Bedarf gefrieren und bei -50 C aufbewahren, Wenn gewünscht, kann man die geernteten Zellen lyophilisieren und dann bis zum Bedarf aufbewahren oder die Zellen mit Merthio3ate (Thimer-osal) oder nach anderen Methoden abtöten, die vcn einer Zerstcrungswirkung auf das B.»pertusais-Schutzantigen frei sind«

Die Zellen werden in kaltem, destilliertem Wasser (2 bis 5° C) wiederauapendiert und in einer Fraktioniervorriohtung der Bevuart Ribi Cell Practionator bei 2110 at (30 000 psi) und einer Temperatur von 2C C oder darunter einer explosiven Dekompression unterworfen» Bei einem Druck von 2110 at erhält man gute

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nisse,. aber ea hat sich gezeigt, dass zufriedenstellende Ergebnisse allgemein bei Drücken im Bereich von etwa 1050 bia 3550 at (etwa 15 000 bis 50 000 psi) erhalten werden_e Auch andere Mittel sur Zerlegung oder Zerreissung von Zellen und Isolierung der Zellv/ände können Verwendung finden, wie Schallschwingungen, mechanisches "Mahlen usw., aber die Erfahrung zeigt, dass mit der explosiven Dekompression (in der Ribi Pressure Cell) die höchsten Ausbeuten an sauberem bandmaterial erhalten werden, Vor dem Einsatz wird die obengenannte Fraktioniervorrichtung vorteilhafterweise sterilisiert» indem man ihr gesamtes Leitungssystem 24 Std. der Einwirkung von Äthylanoxyd aussetzt und dann mit sterilen Stickstoffgas spült. Die "Druckeinheit wird 1 Std. steriliaert, vorzugsweise durch Zusammenbringen aller ihrer Teile mit ß-Pröpiolacton (0,5 ^) und dann Spülung mit sterilem, destilliertem Wasser. Zur Verbindung der "Deliompreaaionskaminer mit einem Stick-2¹Gofftank dient ein mehrphasigem, Bakterien zurückhaltendes Filter oder anderes zweckentsprechendes Filter.,

Die Suspension der B^-pertusais-Ze]len wird in die Kompresse onskammer der Fraktioniervorrichtung eingeführt und in dieser einem Druck von 1050 bis 3550 at ausgc3etst, wodurch die Zellen in die reltompressicnskam-ner getrieben werden, in der sie explosiv bersten. Die Dekomprensionskammer wircj mittels vorgekUhltem Stickstof f gas ,, das man durch das mehrphasige Filter und in die Kammer einleitet, auf 20° C oder darunter gehalten. Das von der DekomproflHionskammer abströmende, die Zellwände und Protoplasma fut-

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haltende Out wird in einem in ein Eisbad getauchten, sterilen .Behälter

las abströmende» das geborstene Ze3!material enthaltende GuC wird geschleudert und das überstehende, fliessfähige Material ve:rwor~ i'on; das verbleibende Zellwand-Material kann mit kaltem, destilliertem Wasser gewaschen werden,, ud. hochtoxische_f lösliche }?rotop.".asmabes1.andt>-"^jJJ.e zu beseitigen. He gewaschenen oder ungewaschenen Zf-lLvrändö werden in einem Tuffer auf eine Konzentration vun afcwa 100 bis ?QQO B/ml suspendiert» wobei in der Praxis im fcJlggmeintn eir.e Konzentration von 500 3/ml Anwendung finden v/ird. Der Sehutsantigen wird dann extrahiert, indem man die ZeiTvand'-ijuspennion mit Natrium- oder Kaliumchlorid .auf ein*; Endkonzentrat.Ion von 0,5- bis S,^molai versetzt; durch Zusatz ednes basischen Salzes,, wie Triaatri.uinortbophosphat« natrium·» oder Kaliumcarl, onat und Nat ciuiiherc&nieths phosphat oder Tris-Chydrcxy-mefchyl)«an Liiomethan, n-sber¹. dem Ha ti ium- oder Kai iuahy dr oxy d wird Q¹⁵U pH auf 8,5 bis 10 eingestellt, und dao Volumen wird mit de·- f»l:M..ierte,m V/asgqr 30 eingestill^,, dtiea man ein Z ellwand ^Äquivalent vor. 200 B/ml erhält,

hⁱ\η Zell'A.iad ijaJz-Gemi ?ch v/irö kontinuierlich 18 bis 48 StcU »uihfce bu^o£ f;,. vHhrend man die Tarne mitur zwischen etwa 2 urd 5° 0 hält. TMe iHiceriaL wird geojhl ai.dert und das überoteher.de C'i>; kann :ι/κοη lui'fer .0,Cm .r'hooprni-vuf fer) beii ^ in em pH Jni Bereich v;n 7 bio V»? fila'i.ysiert wavcen_t um übarschüasiges EaIz

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zu beseitigen. Der das Schutzantiger enthaltende Extrakt wire auf pH 7_tO eingsstellt und auf eine dan vorgeschriebenen Normen, wie den Normen der "TTational Inatitutes of Health", entsprechende; Konzentration verdünnt. Die Lösung cea Schutzantigena kann rojt siner Wirkraenge Konservierungsmittel» wie Merthiolate, Benzethonii chldridum, Benzylalkohol,γ-licoliniumchlorid oder anceren bekannten_? aweckentaprechenden Konservierungsmitteln, konserviert und auf jede gewünschte Konzentration verdünnt werden=

gemäss der Erfindung erhaltene Schutzantigen kann zur Herstellung einer wässrigen Vakzine veiwendet oder zunächst an Hlfs atoffen, wie AluBiiniumhydrcxyd oder -phosphat, adsorbiert, oc er mit AluminiuEikaliumsulfat gefällt urd dann zur Vakzine zuberedtet werden. Das Schutzantigen kann, da es mit anderen Antigerten und bzw« oder Toxoiden verträglich ist, mit diesen in herkömmlicher Weise unter Bildung einer polyvalenten Vakzine in Form einer Einzeldosis vereinigt werden*

Die vorliegende Erfindung bietet eir.e ganze Reihe ausgeprägter Vorteile. Das Produkt ist von allen Protoplasmabesfcandteilen frei, von denen einer, das wärn5el?~bi le Toxin, dafür bekannt ist, bei Laboratoriums tieren extrem toxisch zu sein, und für die3f: · oder ,jene Nebenreaktion beim Manschen verantwortlich sein karn_t Daa Produkt ist von ilährmeß-ium, 2 el Irrsten und chemischen Prtndstoffen freir Ea ist mit anderen Antigenstoffen, die heute mit Antigen der intakten Pertussis- Sells Irombiniert werden, vertrag-

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lieh. Das Verfahren ist'einfach and leicht durchführbar und unter Erzielung hoher Ausbeuten an aktivem Material reproduzierbar«

Das Verfahren ist in dem folgenden Beispiel im einzelnen erläu«= tert, aber im Rahmen der Erfindung liegen auch Abänderungen der verschiedenen, bei der Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung angewandten Techniken? die grundsätzliche Arbeitsweise besteht in der Extraktion des Sciutzantigens aus den B„-pertue~ sis~Zellwänden, die von Protoplasma wie auch anderen Fremdstoffen isoliert worden sind.

Beispiel

Die Zellen einer auf einem Cohen»Wheeler-Mediiah gewachsenen 48-Std.-Kultur von B. pertussis v/eräen geerntet, indem man das Medium mit konzentrierter Salzsäure auf pH 7,0 einstellt und auf einer Sharples-Zentrifuge' schleudert* Die erhaltene Zellpaste wird in destilliertem Wasser vieler suspendiert, durch, ein 200-Maschen-Nylonsieb passiert, um Grobteilchen zu entfernen, und das Filtrat auf eine Konzentration von 500 B/ml eingestellt. Die Zellkonzentration soll für die Zwecke der Erfindung vorzugsweise im Bereich von 100 bis 1000 B/ml liegen.

Das Zellkonzentrat ',1600 ml) wird in eine vorsterilisierte Fraktion! ervorrichtung der Bauart Ribi Cell Fractionator eingeführt

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und einem Druck von 2110 at unterworfen= Die Zellen werden unter Druck in die Dekompressionskammer ausgepresst, die mit gekühltem Stickstoff gas auf 20° C oder darunter gehalten wird,, und unterliegen in dieser einem explosiven Bersten. Das Zellmaterial läuft von der Dekompressionskammer in einen in ein Eisbad getauchten, sterilen Behälter ab, wo sei 1600 ml abströmendes Gut erhalten werden.

Das abströmende Gut wird 3 Sta. bei 16 000 U/Min, in dem Batch-Rotorkopf einer Zentrifuge der Bauart Spinco "!8 000 geschleudert, wobei aber auch andere Schleudervorrichtungen, wie z» B₀ dis Sharples-Zentrifuge, verwendbar sind. Man entfernt das überstehende Gut aus dem Rotorkopf durch Dekantieren und kann, Menu gewünscht, den Kopf ein- oder mehrnals wieder füllen und umlaufen lassen» ohne den Rückstand zu tintfernen. Das überstehende Gut, das entfernt und verworfen wi:.*d, enthält die hochtoxische Protoplasmafraktion des Zellkonaen~;rates,

Der Rückstand oder das sediment in dem Rotorkopf wird vorzugsweise entfernt, indem man den lQto3*kopf mit Stahlperlen versieht und den Kopf durch Aufbringen auf einen Rollmechaniamus sacht bewegt* Die lioalösung des Rückstandes von dem Rotorkopf kenn aber auch nach anderen, an sich bekannten Verfahren erfol«· gen.

üfan wäscht den Rückstand aus dem Ettorkopf mit kaltem, destil-

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liertem Wasser (2 bis 5° C, ungefähr 1600 ml) aus» gibt 1 1 sterile Natriumchloridlcsung (enthaltend 213»8 g) hinzu und stellt das pH durch Zusatz von Trinatriumphosphat (66,6 ml 0,6molare Lösung) und 2,0 ml 1Obiger Salzsäure auf 10,0 und das Volumen mit destilliertem Wasser auf 4000 ml ein» wodurch ein Gemisch erhalten wird, dessen Pertussis-Konzentration 200 B/ml entspricht und das Natriumchlorid und Trinatriuzsorthophosphat in 1,0-=- bzwc 0,01 molarer Konzentration enthält. Die Konzentration des Zellwandmaterials kann jedoch ebenso gut auf eine 100 bis 2000 B/ml entsprechende Fertussiskonzentration und diejenige des Natriumchlorides auf 0,5- bis 1,5molar eingestellt,werden· Die Suspension wird in einer mechanischen Schüttelvorrichtung 18 bis 24 Std, bei 2 bis 5° C sacht bewegt und dann in dem Batch-Rotorkopf einer Fraktioniervorrichtung der Bauart Spinoo 18 000 (oder einer anderen Zentrifuge) 1 Std. bei 16 000 TJ/ftin. (30100 χ Schwerkraft Durchschnitt) geschleudert« Das überstehende Gut wird durch Dekantieren entfernt und gewonnen; der Rotorkopf kann wiederholt eingesetzt werden, um weitere Anteile an SSellwend-Suspension zu behandeln, ohne dass man das Sediment am ©sifernen braucht*· .

Die erhaltenen Anteile an überstehendem, das Schutsantigen enthaltendem Gut werden vereinigt und können gegen 0,01m Phosphatpuffer, pH 7,0 bis 7,2, dialysiert werden» um überschüsaigee Salz zu entfernen. In der Regel ist eine Dialyse unnötig, und der Extrakt kann mit Salzsäure neutralisiert und auf jede ge-

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wünschte Konzentration verdünnt wenden.

Zur Bestimmung des WirkungsVermögens des auf das Äquivalent von 32 B/ml verdünnten Zellextraktes und von N.I.H.-Kontrollmaterial werden getrennten Gruppen, von Mäus«m Reihenverdünnungen des Extraktes und des Kontrollmaterials verabreicht und dann die Tiere intrakranial mit 0,03 ml einer Verdünnung von bekanntem, virulentem B. pertussis mit einem G-eha'.t von 10 Organismen/ml gereizt. Die Ergebnisse wiederholter Prüfungen und das Mittel sind in der folgenden Tabelle erfasst.

Test *) Schutzeinheiten/Gesamtdoaie beim ——«—_ Menschen **'.

1 9

2 9,2

3 '1,4

4 ■ 24,6
Mittel 13,55

*)■ Verglichen mit NIH Nr. 6 und ir.ternen Vergleichsmaterialien der Anmelderin

**) 1,5 ml

Der Schutzantigen-Sxtrakt gemäss dem Beispiel erweist sioh sprechend den N.I.H.-Normen als nichttoxisch; diese Normen fordern, dass, bei intraperitonaler Injektion der halben Einzeldoaie für den Menschen bei Mäusen in 3 Tsgen kein Gewichtsverlsut, in

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1 Tagen eine Hettozunahme von 3 g tnd. ein Todesfall bei nicht mehr ale 5 # der unter suchte» Tiere eintritt* Bei intraperitanaler Injektion von 0,25 ml des Scfautzantigen-Extraktes gernese Beispiel bei to Mäusen wurde im Durchschnitt, am Ende von 3 lagen eine durchschnittliche Gewichtszunahme von 2,5 g und am Ende von 7 Tagen eine durchschnittliche Zunahme von 6,5 g beobachtet, ohne dass am Ende der Prüfbit ein Todesfall vorgelegen hätte*

Der Extrakt geraäss dem Beispiel gefügte auch dem Tier-Sicherheitstest; bei Injizierung von awei 20~g-Mäusen mit jeweils der halben Einzeldosia für den Menschen lu'id drsimaliger Injizierung von zwei 35O-g-Meerschweinc!ien mit jeweils einer Einzeldosis für äen Menschen ergaben sich keine Todesfälle und keine Symptome.

Herkömmliche Sterilitätsprufungs-a haben g«s«igt_? dass der Extraktvon Schimmelpilzen und Bakterien frsi ist«

Die elektruphoretiache Analyse und lie Ouchterlony«=.Analyse haben ergeben, dass der Extrakt gemaas dem Beispiel von dem Hauptaateil der Protoplaamastoffe und Wandantigtmstoffe mit Ausnahme öes Schutzantigens frei war.- Die Endyakiiine enthielt ein Drittel oder weniger des GesamtStickstoffs, der bei herkömlieaen Vakainen ermittelt worden ist.

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Vakzi ne-Hers t ellung Wässrige Vakzine

Baa Sobtttzantigen^Bxtrafct^Konaenti'at gemäss dem Beispiel wird mit gepufferter Salzlauge (pH 7 »2 ■» die Merthiolate im Verhältnis 1 ϊ *iö OÖÖ enthält, auf eine JindkoasSent ration von 32 B/ml oder darunter eingestellt* Diese Vakzine bleibt bei Iiageruiig bei 2 Μ« 5° G beständig»

takgine, adt Hilfsstoff '

Matt versetzt 4000 nil des Söhutgantigen-Konzentratea gemäss dem' Beispiel fnit 444 tnl sterilem» 10^i gem Aluminiumkaliumsulfai; und stellt ir.s p-H mit kalter_K 10?Siger Natronlauge (2 bia 5° C) auf ?_f0 ·£&* Bas Material wird 24 Std< bei 2 bis 5° C aufbewahrt und dann etvie 15 liin» bei 2ÖÖ0 U/Hin, in einer auf 2 bis 5^Ö C gehaltenen Zentrifuge der Bauart International geschleudert. Dar. Überstellende Grut wifd verwörfön« Man suspendiert das Sediment vieder in gepufferter Sälsslauge > pH 7,2, auf ein End volumen von 3OÖO ml

einer &$7 B/al &<|ui^alenten Konzentration). Me -lt5Ä2iiiiitration käiin durefi fusatz von steriler Salzlauge, - eier &_t3m Ölyein-JHi£fer ä«f das X^uivalent von 32 Σ/ml ©der dariijster eingestallt wenden* fls Konservierungsfflittel wird

in eißsr genü|;eHd*n- K&5ge Kugeaetzt, um in verdünntöii eine lena&ntration von ^ ί 10 OÖÖ zu erhalten. Diese Vä&» bleibt lei Auibewaürung bei 2 biif |° 0 beständig*

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Multiyalente Vakzinen

Durch Zusatz von Toxoiden, wie Diphtherie- und Tetanustoxoiden, ' zu der obigen wässrigen Vakzine oder Hilfset of f.-Vakzine kann eine multivalente Vakzine erhalten werden, in welcher die Toxoide in den normalerweise empfohlenen Konzentrationen vorliegen«

Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Extraktion von Schutzantigen aus B.-pertussis-Zellwänden. unter Anwendung von Abän^ derungen der in dem Beispiel beschriebenen Arbeitsweisen· Insbesondere kann das Schutzantigen in für die Vakzinen-Herstellung geeigneten Konzentrationen extrahiert werden, indem man bei. alkalischen Bedingungen, vorzugswiese bei pH 8,5 bis 10, und bei einer Temperatur von etwa 2 bis 5° C eine Suspension von etwa 100 bis 200Ö B/ml_e Zeilwandmaterial des B.-pertussis und eine genügende Mange Natrium- oder Kaliumchlorid vermischt, damit eine. Salz-Endkonzentration von 0,5- bis 1,5molar erhalten Wird. Die Trennung des 'so erhaltenen Schutzaitigens von Wandrüekatänden kann durch Schleudern erfolgen, Das so erhaltene Konzentrat des Schutzantigens kann auf jede gewünschte Konzentration eingestellt und nach all den berkömialicierweise zur Vakzine-Herstellung, besondere zur Herstellung voi Vakzinen mit einem Gehalt an B,-pertussi3-Antigen, angewandten Methoden zu einer monoöder polyvalenten Vakzine zubereit 3t werden·

Claims (1)

1. ⁸

   l\l

   Pat e η t a η a ρ - r ü σ h e

   1, Verfahren zur Extraktion von Sohutzantigen aus isoliertem Zellwandmaterial des B. pertussis durch Vermischen einer Suspension von 100 bia 2000 B/ml des Zellwandmateriala und einer genügenden Lösung eines iialzee aus der Gruppe Natrium- und Kaliumchlorid, um eine End:conz ent ration von 0,5- bia 1,5molar zu erhalten, bei alkalischen Bedingungen und bei einer Temperatur von etwa 2 bin 5⁰O.

   2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» dass man Natriumchlorid verwendet und d:.e Extraktion bei einem pH-Wert von etwa 8_f-5 Ma 10 durch.führt. . .-»

   3c Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man nach der Extraktion das-Material schleudert, das überstehende Gut sammelt und gegen Phosphatpuffer, pH 7,0 bis 7,2, dialyaiert, um im wesentlichen das gesamte Salz zu entfernen.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einer Konzentration des ZeJ.lwandmateriala des B_a pertuasis von etwa 500 B/ml arbeitet,

   5. Verfahren zur Sxtraktion von Schutzantigen aus isoliertem

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   Zellwandmaterial dee B* pertussis, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension des "eHwandmaterials mit einer Konzentration von etwa 100 Mu 2000 B/al mit einer 0,5- bis 1_f5molaren lösung eines Salze,·! aus der Sruppe Natrium- und Kaliumchlorid bei einem pH von etwa 8,5 Ms 10 vermischt und dae Gemisch, mindestens eti/a 13 Stdi bei einer Tempera-* tür zwischen etwa 2 und 5^Ö G nacht bewegt, dann etwa 1 Std* bei etwa 16 000 U/Ein* schleuiiert und das überstehende, das ■ Schutaantigen enthaltend« Gut sammelt,

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« dass stan daß Zellwandmaterial des B* portusais durch mechanisches Zerreissen von Zeilen dea B. pertussis und Abtrennen des Zellwandmateriala von Protoplf-smamaterial gewinnt«

   7. Verfahren nacä Anspruch "^:, dat.urch gekeaöÄ©Iöisa:©t» dass man das Zellwandmateriäl des B, ptirtussis von allem anderen Zellmaterial durch Auspressen des B, pertussis bei einem Druck von tö5ö Ms 3550 at in eine gekohlte Uekoffipresöions** kammer und dann mechanisches (ewlnnen de& Zellwandmaterlala abtrennt«

   3c Verfahren nach Anspruch i, dacurch gekenn2eichnet_f dass man das Zellwandmaterial des B« pfirtussis von alless äadeiren Zellmaterial durch Ausgresseft des virulenten B« pertusöiii bei einen? Brück von 1050 Ms :55O at JLm. ei»« &&£

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   20° C gehaltene Dekompresaionakammer abtrennt, die erhaltene, zerlegte Zellmasse bei e-;wa 16 000 U/Min. (30 100 χ Schwerkraft, Durchschnitt) schleudert und das Zellwandmaterial selektiv gewinnt«

   9. Verfahren zur Herstellung einei? bei parenteraler Verabreichung für die Hervorrufung von Schutzantikörpern gegen 33. pertussis wirksamen Vakzine, dadurch gekennzeichnet,, daas man das nach dem Verfahren gemr.ss Anspruch 3 erhaltene Schutzantigen zusammen mit einem Hilfsetoff aus der Gruppe Aluminiumhydroxyd, Aluminiumphosphat und Aluminiumkaliunsulfat fällt, das Hilfsstoffadtorbat in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von mindestens 8 Schutzeinheiten des B„=»pertussIs-Antigens/ml wieder suspendiert und Merthiolate auf eine Endkonzentration von mindestens etwa 1 : 10 000 zusetzt.

   10. Verfahren nach Anspruch 9, dadvrch gekennzeichnet, dass man der Vakzine mindestens einen Stoff aus der Gruppe Bakterientoxoicl und verträgliches Antigen zusetzt.

   11. Bei parenteraler Verabreichung zur Hervorrufung von Schutzantikörpern gegen B. pertussis wirksame Vakzine mit einem Gehalt von mindestens 8 Schutzeinheiten/ml B.-pertussis-· Antigen, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

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   12. Bei parenteraler Verabreichung zur Hervorrufung von Sohutzantikörpem gegen B, pertuss:,s wirksame Vakzine mit einem Gehalt von mindestens 8 Sßhu;zeinheiten/ml Β,-pertugsis-Antigen, erhalten nach dem Vorfahren gemäss Anspruch ".5.

   13- Bei parenteraler Verabraichung zur Hervorrufung von Schutz« ' antikörpern gegen B. pertussi.s wirksame Vakzine mit einem Gehalt von mindestens 8 Schu~;zeinheiten/ml B.«pertussis-Antigen, erhalten nach dem Vorfahren gemäss Anspruch 5«

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