DE2719547A1

DE2719547A1 - Immunostimulin, verfahren zu dessen herstellung und seine verwendung zur krebsbekaempfung

Info

Publication number: DE2719547A1
Application number: DE19772719547
Authority: DE
Inventors: Velimir Djurovic
Original assignee: DJUROVIC
Current assignee: DJUROVIC
Priority date: 1976-05-03
Filing date: 1977-05-02
Publication date: 1977-11-24
Also published as: FR2350104B1; FR2350104A1; GB1537610A

Description

DH. ΙΝ(ί. F. AVUKSTIIO K I·¹

Ι)Π.Κ. ν. l'KCllMANN IHl. IN(J. I). IUiUHKNS Din,. ΐ\·<;. κ. <;οι·:τκ

PATENTANWÄLTE

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TELEfIRAM MK t ΡηοΤΕΟΤΙ'ΛΤ KWl

1Α-49 303

Patentanmeldung

Anmelder:

Velimir DJUROVIC

8, Cite de 1'Ameublement, Paris 11§me,

Guy Haurice DECROIX

9, rue du Boccador, Paris öSrne

Titel:

Immunostimulin, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Verwendung zur Krebsbekämpfung

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n. ING. K WUKSTIIOKF

I)H. IC. ν. 1·Κ(ΊΙΜΛΝΝ I)H. IN(J. I). HKIIHKNS

DIIM-. inc;, u. uokvk I¹AT E NTAN w Alt B NOOO M 0 N C TI K N^T »O

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TKlKOlUM M K t

1A-49 303

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Immunostimulin, oder anders ausgedrückt, ein die Immunität förderndes Antigen, welches bei seiner Verabreichung durch Injektion oder gegebenenfalls örtlich, insbesondere durch ein Aerosol oder intratumoral, bei zugänglichen Restkrebsen oder bei Leukämien, oder bei festen Krebsen gestattet, das immunologische Gesamtpotential des Individiums durch Aktivierung des retikulolymphohistozitären Zellensystems zu erhöhen und es auf einem wirksamen Niveau zu halten, sowie dessen Herstellung bzw. Erzeugung.

Das erfindungsgemäße Inmiunostiinulin stellt einen sehr reichen Antigen-Überträger dar, aufgrund des Hycobacterien verliehenen hybriden Charakters, welche dem Menschen ohne Gefahr selbst während langer Zeiträume von mehreren Jahren verabreicht werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in vivo die Membran von dem nicht virulenten Mycobacterium smegmatis ATCC 607 durchlässig macht, indem man ihm gestattet, Bruchstücke des ADH von virulentem Mycobacterium tuberculosis H 37Rv zu absorbieren, und auf chemischem oder physikalischem Wege das umgewandelte Mycobacterium behandelt, um es seiner erworbenen Virulenzeigenschaften zu berauben, wobei jedoch seine besondere antigene Struktur beibehalten wird.

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Die Erfindung betrifft außerdem das durch da-* c. bljG Verfahren hergestellte, die Immunität fördernde Antigen sowie seine Anwendung bei der unspezifischen aktiven Immunotherapie zur· Krebsbekämpfung und sogar auch bei der Krebsverhütung, wenn die immunologischen Kriterien eines Individuums diese Verhütung wünschenswert machen.

Weitere Einzelheiten der Erfindung gehen aus der nachstehenden eingehenden Beschreibung hervor, für welche ein Ausführungsbeispiel einer wichtigen Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens in der einzigen Figur der Zeichnung dargestellt ist.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man zunächst ein künstlich modifiziertes Mycobacterium durch Anwendung eines Umwandlungsverfahrens in vivo her. Hierfür benutzt man einerseits das nachstehend ATCC 607 genannte Hycobacterium smegmatis ATCC 607 und andererseits das nachstehend H 37Kv genannte Mycobacterium tuberculosis IJ 37Hv.

Bekanntlich ist das ATCC 607 ein nicht virulentes schnell wachsendes Mycobacterium, v/elches eine natürliche Widerstandsfähigkeit gegen das INH hat, welches eine im Handel mit Rimifon bezeichnete Isonikotinsäure ist, während H37Rv ein langsam wachsendes Hycobacterium ist, v/elches jedoch virulent und für das INH empfindlich ist.

Zur Durchführung des Umwandlungsverfahrens in vivo stellt man Inocula, ausgehend von einigen Kolonien von ATCC 607, her, welche von einer achttägigen Kultur auf einem Loewenstein-Jensen-Nährboden herrühren, indem man einen Dubos-Nährboden mit ihnen beimpft. Hierauf stellt man eine bazillen- (d.h. bakterien-)haltige Suspension mit 10 mg/rnl

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Bazillen (bzw. Bakterien) her, indem man die Schleudersätze von 20 bis 30 Reagensröhrchen einer viertägigen Kultur auf Dubos-Nährboden zusetzt. Der Bazillengehalt wird z.B. durch Trübungsmessung gemessen.

Gleichzeitig stellt man eine Bazillensuspension von 2 mg/ml H37Hv her, welche mit einer achttägigen Kultur auf Dubos-Hährboden erhalten wurde.

Die hergestellten Bazillensuspensionen werden dann zu gleichen Teilen gemischt, um eine Bazillensuspension von 5 mg ATCC 607 + 1 mg H37Rv je ml zu erhalten, v/orauf diese Bazillensuspension während 24 Stunden in einen Heizschrank mit 37°C gebracht wird.

Zur Vornahme der Umwandlung in vivo injiziert man Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 bis 25 g 0,5 ml der hergestellten Bazillensuspension, v/elche 2,5 mg ATCC 607 und 0,5 mg H37Hv enthält. Die Injektion erfolgt auf intraperitonealem Wege. Um einen größeren Zustrom von Hakrophagen in die Bauchhöhle der Mäuse zu erhalten, ist es zweckmäßig, diese mehrere Tage, z.B. vier Tage, vor der Injektion der obigen Bazillensuspension dadurch zu behandeln, daß man den Mäusen auf intraperitonealem Wege 1 bis 3 ml, vorzugsweise 2 ml, einer sterilen Thioglykollatbouillon von 3 Promille injiziert. Die Injektion der Bazillensuspension in die Mäuse hat dann die Wirkung, daß von den peritonealen Makrophagen der Maus gleichzeitig das Gemisch M. smegmatis ATCC 607 und M. tuberculosis H37Rv phagozytiert wird.

Wach einem Zeitraum von vier Tagen injiziert man in die Bauchhöhle der Mäuse eine Waschflüssigkeit, welche durch h ml hepariniertes physiologisches Serum (50 U/ml) gebildet

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wird, und nach etwa fünfzehn Minuten wird die peritoneale Waschflüssigkeit zurückgewonnen, welche einer Zentrifugierung (3000 UpM während 15 Minuten) ausgesetzt wird. Der Schleudersatz wird dann mit ,Schwefelsäure von 4 % behandelt, neutralisiert und auf dem Loewenstein-Jensen-Nährboden mit dem vor der Koagulation einverleibten INH titriert (von dem Institut Pasteur de Paris geliefertes Mittel). Nach einer Inkubationszeit von vier Tagen bei 37°C stellt man das Vorhandensein von einigen v/enigen Kolonien mit schnellem Wachstum fest, welche man entnimmt, und mit welchen man einen Nährboden beimpft, z.B. den Dubos-i Jährboden.

Die obigen Vorgänge werden vorzugsweise an zwei verschiedenen ^uruppcn von 25 Mäusen vorgenommen.

Parallel geht man in entsprechender V/eise für eine Gruppe von 25 Mäusen vor, welchen man 0,5 ml der Bazillensuspension (5 mg/ml) von auf einem Dubos-Nährboden gezüchtetem ATCC 607 allein injiziert hat.

Die Kulturen (5 entstandene Kolonien), welche von der peritonealen Flüssigkeit der Mäuse herkommen, welche einerseits mit dem Gemisch ATCC 607 + H37Rv und andererseits mit ATCC 607 allein geimpft wurden, v/erden getrennt auf einem Dubos-iJährboden gezüchtet, um vier Bazillensuspensionen I, II, III und IV und eine 10 mg/ml Bazillen enthaltende Vergleichsbazillensuspension T herzustellen.

5 mg der Bazillensuspensionen I, II, III, IV und T werden in einem Volumen von 0,5 ml/Maus auf intraperitonealem Wege den 25 Mäusen einer jeden Gruppe injiziert » was etwa 5 χ 10 Einheiten von lebensfähigen Bazillen je Injektion entspricht.

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Nach vier Tagen sind die Mäuse der Gruppen II, III und IV zu 100 % tot mit einem massiven Überleben der Bazillen in den Organen. Dagegen wird keine oterblichkeit in der Mäusegruppe ΐ nach 30 Tagen mit nur einigen seltenen überlebenden Bazillen beobachtet.

Die obigen Ausführungen zeigen zv/eifellos zum ersten Mal einen experimentellverwirklichten Virulenzwechsel eines saprophyten Mycobacteriuins. Man kann infolgedessen

eine. Umwandlung von Ilycobacterium smegmatis Λ'1'CC durch Absorption des ADN des Mycobacterium tuberculosis annehmen.

Durch intraperitoneale ]hjekticneines Gemischs von virulentem H37Rv und nicht virulentem ATCC 607 beginnen bei der Maus nach einer gemeinsamen Phagocytose die lysosomalen Enzyme die phagozytierten Bakterien zu lösen. Kulturen und mikroskopische Untersuchungen der Abstriche von peritonealen Exsudaten zeigen, dai3 diese Auflösung von den vier ersten auf die Einimpfung folgenden Tagen an mit ATCC 607 fast vollständig zu sein scheint, Wenn jedoch Dosis 2,5 mg erreicht, bleiben bei allen Mäusen einige in diesem Zeitraum durch die Makrophagen nicht oder langsamer gelöste Bazillen ATCC 607 übrig.

Gleichzeitig bleiben in den gleichen Makrophagen die meisten Bazillen H37Hv resistent und teilen sich. Man kann jedoch annehmen, daß einige Bazillen H57Hv an dem ersten auf die Phagozytose folgenden Tag gelöst werden.

In diesem günstigen Augenblick, in welchem einige Mycobacterium tuberculosis H37Rv durch die Zellenenzyme gelöst sind und die seltenen Bazillen ATCC 607 nicht oder unvollständig gelöst sind (wahrscheinlich in dem gleichen Lysosomalsack),können die Bruchstücke von ADN des Mycobacterium tuber-

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culosis H37RV vielleicht in die seltenen Bazillen ATCC 607 dank einer Vergrößerung der Durchlässigkeit ihrer Wand eintreten, wobei sie eine kodierte Eigenschaft, im vorliegenden Fall Virulenz, zuführen und sich in das genetische Material des ATCC 607 einfügen.

Aus den obigen Ausführungen geht hervor, daß der Vorgang der Umwandlung in vivo die Erzeugung eines künstlichen (modifizierten)Mycobacteriums zur Folge hat, welches Träger von genetischen Eigenschaften der beiden ursprünglichen Mycobacterien ist. Dieses neue künstlich(modifizierte) ßakterium Dj 607, welches nicht natürlich vorkommt, stellt die Grundlage der Erfindung dar, da es eine Verstärkerwirkung auf Immunitätsreaktionen ausübt.

Eine nächste Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, den toten Mäusen der Gruppen II, III und IV (siehe die Zeichnung) Organe (Lungen, Leber und Milz) zu entnehmen und zu zerkleinern, sie während fünf Minuten mit Schwefelsäure von 4 % zu behandeln, zu neutralisiaen, einen Loewenstein-Jensen-Nährboden zu beimpfen und das Ganze in einen Heizschrank von 37°C zu bringen. Nach einer Inkubationszeit von vier Tagen wird eine sehr bazillenreiche Kultur erhalten. Die aus den in der obigen Weise behandelten Organen erhaltene Kultur bildet den Stamm, aus welchem man anschließend das Immunostimulin DJD607 herstellt.

Dieser Stamm kann auf eine der nachstehenden Weisen konserviert v/erden:

1. Man nimmt seine Homogenisierung vor und beimpft dann mit ihm einen Dubos-Nährboden, worauf er in Ampullen gebracht wird. In dieser Form kann er bei einer Temperatur von -20°C aufbewahrt werden.

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2. Wie oben nimmt man die Homogenisierung und hierauf eine leichte Verdünnung mit destilliertem V/asser vor, worauf die Bazillensuspension in Ampullen gebracht und lyophilisiert wird.

S O

Der hergestellte Mycobacterienstamm enthält so ausschließlich umgewandelte Bazillen M. smeginatis ATCC 607, d.h. Bazillen Dj 607, und dieser Stamm bildet den Ausgangsstoff des Immunostimulins.

Zur Herstellung des eigentlichen Immunostimulins hat es sich als besonders wichtig erwiesen, die Struktur der Bazillen Dj 607 beizubehalten, wobei sie jedoch unschädlich gemacht werden, wofür Mittel angewandt werden, welche es gestatten, entweder die Bazillen zu töten, oder die Bazillen lebend oder mit verringerter Virulenz zu erhalten. Die Beibehaltung der Struktur des Bazillus ist nämlich sehr wichtig, da es die genetische Spezifität der Bazillen Dj 607 ist, welche dem antigenen Material eine immunologische Besonderheit verleiht, was das wesentliche Element der Wirksamkeit des Immunostimulins darstellt.

Im Augenblick der Herstellung einer jeden Gruppe von Iinmunostimulin nimmt man eine Prüfung des auf die obige Weise hergestellten Stamms Dj 607 vor, indem man Mäusen eine Bazillensuspension dieses Stamms ebenfalls auf intraperitonealem Wege mittels des gleichen Verfahrens einimpft, welches oben zur Herstellung des Bazillus Dj 607 beschrieben wurde.

Nachstehend sind zwei Ausführungsformen zur Herstellung des Iminunostimulins DjD 607 beschrieben, welche die Beibehaltung der genetischen Spezifität des Bazillus Dj 607 gestatten.

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I - irrste Ausführuiiftsform (Herstellung in kleinen Mengen)

Beispiel 1

a) Die Bazillen von Mycobacteriuin Dj 607 werden in Röhrchen 17 x 17 mm auf dem Loewenstein-Jensen-Nährboden gezüchtet.

Einige Tropfen der Bazillensuspension des Stamms Dj 607 (welche bei niedriger Temperatur konserviert oder lyophilisiert wurden) werden auf einige Röhrchen des Loewenstein-Jensen-Nährbodens geimpft und waagerecht in einen Heizschrank von 37 C gebracht, Nach der Inkubationszeit von 4 bis 8 Tagen wird eine sehr bazillenreiche Kultur (Kolonien) erhalten.

b) Wan entnimmt mit einem Platinspachtel eine möglichst große Zahl von Teilchen der Kolonien dieser Kultur ohne Mitnahme des Nährbodens. Die entnommene Hasse wird in einen sterilen Kolben von 5 bis 10 cm Durchmesser gebracht, welcher 20 bis 30 Glaskugeln von 3 mm Durchmesser enthält.

Der Kolben wird während 30 Sekunden bis 1 Piinute kräftig geschüttelt. Dann werden 10 ml sterilisiertes destilliertes Wasser zugesetzt und noch weiter 30 Sekunden langsam geschüttelt. Die so erhaltene Bazillensuspension wird in Röhrchen von 22 χ 22 cm Durchmesser gebracht. Die Trübung der Suspension wird mit Hilfe eines Standards, der eine Suspension von 1 mg/ml BCG enthält, durch Zusatz von destilliertem Wasser auf 1 mg/ml Bazillen gebracht. Aus dieser Muttersuspension wird eine Verdünnung von 10"" mg/ml hergestellt, indem man in dezimetrischen Stufen vorgeht. Mit dieser Verdünnung (10~ mg/ml) beimpft man mit 03 ml je Röhrchen eine Zahl von Röhrchen mit einem Loewenstein-Jensen-Nährboden, was der herzustellenden Menge an Immunostimulin DjD 607 entspricht.

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■ t -

c) Hach einer Inkubationszeit von 4 Tagen bei 37 C erhält man eine Vollreife und sehr bazillenreiche Kultur (Kolonien). Diese Kultur wird mit einem Platinspachtel entnommen, ohne Nährboden mitzunehmen. Die entnommenen Massen werden in einen sterilen Kolben von 15 bis 20 cm Durchmesser gebracht, welcher 150 bis 200 Glaskugeln von 5 mm Durchmesser enthält. Der Kolben wird kräftig 5 Minuten geschüttelt, worauf 100 ml Kochsalzlösung (mit einer Konzentration an HaCl von 8,5 g auf 1000) langsam zugesetzt werden. Es muß noch 1 bis 2 Hinuten leicht geschüttelt werden, worauf 10 ml der so erhaltenen Bazillensuspension in ein Röhrchen von 22 χ 22 min Durchmesser gebracht werden, um durch Trübungsmessung (mittels eines Standards von 1 mg/ml JJCG, der von dem Institut Pasteur de Paris geliefert wird) ihren Bazillengehalt zu ermitteln. Die Trübung der Suspension wird durch Zusatz von physiologischer Salzlösung auf 2 mg/ml eingesteU.t,wobei man sich vergewissert, daß eine gute Homogenität erhalten wurde. Die so erhaltene Suspension wird durch einen antibiotischen Zusatz von 20 bis 50 mcg/ml Myambuthol behandelt. Diese Konzentrationen sind ungiftig und rufen keine Allergien während der Dangen Behandlung hervor. Nach 15 Minuten langem Bewegen der Suspension bei der Laboratoriumstemperatur wird die Suspension in Ampullen gefüllt, von denen jede 2 ml enthält, und die Ampullen werden sofort abgeschmolzen.

II - Zweite Ausführun^sform (Industrielle Herstellung)

Beispiel 2

a) Man stellt in einem industriellen Gärgefäß einen flüssigen Währboden her, z.B. den Souton-, Youmans- oder Dubos-Währboden. I-lan beimpft den Nährboden je nach der Aufnahmefähigkeit des Gärgefäßes mit 10 bis 20 ml der Bazillensuspension, welche ausgehend von einer Kultur des Stamms Dj auf Dubos-Nährboden erhalten wurde, welcher bei niedriger Temperatur aufbewahrt oder lyophilisiert wurde und eine Bazillentrübung von 1 bis 10 mg/ml besitzt.

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- W-

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b) Das Gärgefäß wird vier bis acht Tage auf einer Temperatur von 37°C gehalten, wobei man eine an Bazillen Dj 607 sehr reiche Kultur erhält. Diese Kultur läßt man 24 Stunden bei 4 C absetzen. Nach Entfernung des in dem Gärgefäß oben schwimmenden Teils wird der Bazillensatz aufgenommen und mit 3000 UpH 30 Minuten zentrifugiert.

c) Nach dem Zentrifugieren wird der Bazillen-Bodensatz einer physikalischen Behandlung von ungefähr 10 Wechseln von Druck und Unterdruck zwischen 1 und 5 Atmosphären unterworfen.

Nach der Gewinnung des so behandelten Bazillensatzes geht man an die Herstellung der Mycobacteriensuspension. Die entnommenenilengen von Mycobacterium werden in einen sterilen Kolben von 15 bis 20 cm Durohmesser gebracht, welcher 150 bis 200 Glaskugeln von 5 nun Durchmesser enthält. Es wird kräftig 5 Minuten geschüttelt, worauf 100 ml physiologische Salzlösung langsam zugesetzt werden, und noch 1 bis 2 Minuten leicht geschüttelt wird. Zehn Milliliter der so erhaltenen Bazillensuspension v/erden in ein Röhrchen von 22 χ 22 mm Durchmesser gebracht, um durch Trübungsmessung (mit Hilfe eines Standards von 1 mg/ml BCG) seinen Bazillengehalt zu ermitteln. Die Trübung der Suspension wird durch Zusatz von physiologischer Salzlösung auf 2 mg/ml Bazillen eingestellt«Wachdem man sich von der guten Homogenität der Bazillensuspension überzeugt hat, füllt man je zwei ml derselben in Ampullen ab, welche sofort zügeschmolzen werden.

Als Ausführungsabwandlung kann die physikalische Behandlung durch aufeinanderfolgende Drucksteigerungen durch eine Behandlung durch Antibiotika ersetzt werden. In diesem Fall wird nach Gewinnung des Bazillenschleudersatzes die Suspension von Mycobacterium mit einer Trübung von 2mg/ml mit 20 bis 50 mcg/ml Myambuthol behandelt.

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Der Inhalt der gemäß den beiden obigen Herstellungsarten behandelten Ampullen bildet das zur Verabreichung fertige Immunostimulin DjD 607.

Es ist wichtig, nach der Herstellung eines jeden Ansatzes von Immunostimulin diese Charge einer Sterilitätsprobe zu unterv/eri'en. Hierfür beimpft man mit einem Schleudersatz aus einem Gemisch von 10 willkürlich entnommenen Ampullen einerseits einen Difco-Nährboden und andererseits einen Loewenstein-Jensen-Nährboden. Man prüft zweimal nach V< Tagen bei der Kultur auf Difco-Nährboden und nach yü Tagen bei der Kultur auf Loewenstein-Jensen-Nährboden, daß tatsächlich negative Ergebnisse erhalten wurden.

Die zu 2 ml dosierten Ampullen können bei 4°C 8 bis 12 Monate aufbewahrt werden. Wenn man dies wünscht und zur Errnöglichung einer längeren Aufbewahrung kann das Immunostimulin lyophilisiert werden, wobei dann das lyophilisierte Immunostimulin vor seiner Verabreichung in 2 ml physiologischer Salzlösung suspendiert werden muß.

Die an dem Immunostimulin DjD 607 vorgenommenen Giftigkeitsuntersuchungen umfassen die Untersuchung:

a) der akuten Giftigkeit

b) der chronischen Giftigkeit

bei einer 200 bis 250 g wiegenden Ratte.

Akute Giftigkeit
-Einspritzung in die Vene-Line Dosis von 2 ml Immunostimulin DjD 607 wurde zweimal wöchentlich h Wochen in die Vene eingespritzt.

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Λ2Τ -

Chronische Giftigkeit

-Einspritzung unter die Haut-

Eine Dosis von 1 ml Immunostimulin DjD 607 wurde an zv/ei Stelleu (hintere Glieder) einmal wöchentlich 8 Wochen unter die Haut gespritzt.

Ergebnisse

Keine Ratte ist gestorben, und es wurde keine merkliche Giftwirkung festgestellt.

Es wurde keine wesentliche histologische Veränderung in den Geweben der untersuchten Tiere beobachtet, obwohl eine leichte Vergrößerung der Leber und der HiIz festgestellt wurde, welche von einigen ganglionären Hyperplasien begleitet war.

Desondere Aufmerksamkeit wurde der histologischen Untersuchung der Gewebe an den Stellen der Einspritzung unter die Haut gewidmet. Die untersuchten Gewebe zeigten reichliches granulornatöses Material (Riesenzeilen Granuloin), welches sehr reich an Lymphozyten und an makrophagen Zellen war.

Das obige Irnmunostimulin DjD 607 findet eine besonders interessante medizinische Anwendung bei restlichen Krebsen, Leukämie oder festen Krebsen. Es findet auch eine sehr wichtige Anwendung in der krebsverhindernden Prophylaxe, wenn der immunologische Zustand des Individiums es erfordert, es kann jedoch auch Anwendung zur Behandlung von anderen nicht krebsartigen Leiden finden.

Die Behandlungstechnik besteht im wesentlichen in Injektionen unter die Haut von 0,10 bis 0,50 ml Immunostimulin DjD 607 an vier getrennten Stellen (die oberen und die unteren Glieder), d.h. im ganzen 0,4 bis 2 ml je Sitzung in den meisten ballen.

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Die Injektionen müssen alle Woche oder alle zwei Wochen wiederholt v/erden, und zwar nach folgenden therapeutischen Kriterien: genaue anatomopathologische Untersuchung und eine möglichst vollständige immunologische Untersuchung.

Die Injektion unter die Haut kann von einer örtlichen Behandlung (Aerosol, Einspritzung in den Tumor) mit 1 ml Immunostimulin DjD 607 je Sitzung begleitet werden, jedoch nur, wenn der Zustand der Kranken erfordert, gleichzeitig eine unspezifische örtliche und allgemeine Immunostimulation hervorzurufen.

Bei therapeutischen Untersuchungen

wurde eine aktive unspezifische Immunotherapie unter Ausschluß jeder anderen Behandlung bei 5^ Patienten vorgenommen, welche eine Ausschneidung für primitive bronchitische Krebse erfahren hatten. Die Behandlung v/urde bei diesen Patienten regelmäßig in der oben angegebenen Weise fortgesetzt, jedoch unter Anpassung an die Klassifizierung TMW (genaue Untersuchung des Tumors, der Ganglions und der Metastasen) und an den nach der Operation vorhandenen immunologischen Zustand eines jeden Patienten.

Das einjährige Überleben der behandelten Gruppe betrug 90 %, was ungewöhnlich hoch ist. üJine Vergleichsgruppe von 71 Kranken, welche von der gleichen chirurgischen Gruppe operiert wurde und hinsichtlich des Alters, des Geschlechts der histologischen Formen und der Klassifizierung THH vergleichbar v/ar, aber nicht der Immunotherapie unterworfen wurde, zeigte einen Überlebenssatz von 60 % während der gleichen Zeit nach der Operation. Dieser Satz von 60 % entspricht den in der Literatur veröffentlichten chirurgischen Statistiken.

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ίο

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

My Immuno stimulin, dadurch g ekennz e ichne t,

^- /(bzw. Bakterien)

daß es tote oder lebende Baziller/ mit abgeschwächter Virulenz enthält, welche die genetische Eigenschaft von umgewandeltem Mycobacterium smegmatis ATCC 607 besitzen.
2. Verfahren zur Herstellung eines bakteriellen Immunostimulins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in vivo die Membran von nicht virulentem Mycobacterium smegmatis ATCC 607 durchlässig macht, indem man ihm gestattet, Bruchteile des ADN von virulentem Mycobacterium tuberculosis H37RV zu absorbieren, und daß man auf chemischem oder physikalischem Wege das umgewandelte Mycobacterium so behandelt, daß es seine erworbenen Virulenzeigenschaften verliert, aber seine besondere antigene Struktur beibehält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man durch Züchten Kolonien von virulentem Mycobacterium tuberculosis H37Rv und Kolonien von nicht virulentem Mycobacterium smegmatis ATCC 607 herstellt ,je eine Bazillensuspension mit einer Konzentration von 2 mg/1 M.tuberculosis H37Rv bzw.10 mg/ml M.smegmatis ATCC 607 herstellt, diese Suspensionen zu gleichen Teilen mischt, auf intraperitonealem Wege eine Dosis dieses Gemisches einem Tier einimpft, diese Dosis vier Tage in der Bauchhöhle hält, auf intraperitonealem Wege eine heparinierte Waschflüssigkeit einspritzt, anschließend das Tier tötet, um die peritoneale Waschflüssigkeit zu gewinnen, diese Flüssigkeit auf Loewen-

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ORIGINAL INSPECTED

stein-Jensen-Nährboden züchtet und aus diesen Kulturen einige seltene schnellwachsende Mycobacterien isoliert, welche die genetischen Eigenschaften von M. smegmatis ATCC 607 haben aber virulent gemacht sind, worauf diese Bakterien unschädlich gemacht werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch von Mycobacterien durch die peritonealen Makrophagen der Maus gleichzeitig phagozytieren und lysieren läßt, die noch lebenden, aus der peritonealen Waschflüssigkeit der Mäuse stammenden Mycobacterien zur Züchtung ansetzt, von der Kultur diejenigen Mycobacterien isoliert, welche ein schnelles Wachstum haben, eine Suspension dieser Mycobacterien bildet, neuen Mäusen Dosen einer myco-

bacteriellen Suspension einspritzt, welche etwa 5 x 10 lebensfähige Bazilleneinheiten enthält,und daß die Mäuse in einem Zeitraum von 4 Tagen getötet werden, daß man wenigstens die Lungen, die Leber und die Milz dieser Mäuse entnimmt, diese Organe zerkleinert, um ein Bakterieninoculum für einen Nährboden zu bilden, welcher bei 37°C fruchtbar ist und einen Stamm von Mycobacterium züchtet, v/elcher durch Gefrieren oder Lyophilisieren aufbewahrt v/erden kann.
5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bildung einer injizierbaren Suspension von Immunostimulin Bruchteile des aufbewahrten Stamms zur Beimpfung eines bei 37 C fruchtbaren Nährbodens benutzt, diesem Nährboden Bazillenkolonien entnimmt, diese

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Kolonien in sterilisiertem destilliertem Wasser suspendiert, die Bazillenkonzentration der Suspension so einstellt, daß eine ein neues Inoculum bildende homogene Muttersuspension entsteht, einen neuen, bei 37°C fruchtbaren Nährboden beimpft, diesem neuen Nährboden Bazillenkolonien entnimmt, die gewonnenen Bazillen in physiologischer Salzlösung homogenisiert und bis zu einer Bazillenkonzentration zwischen 1 und 5 mg/ml verdünnt, und diese Bazillen der chemischen oder physikalischen Behandlung unterwirft, welche sie unschädlich macht, bevor man die Suspension in einzelnen Dosen in Ampullen einfüllt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bereitung des Stamms die Organe (Lungen, Lebern und Milze) zerkleinert, 5 Minuten mit Schwefelsäure von 4 % behandelt, neutralisiert und auf einen Loewenstein-Jensen-Nährboden aufimpft, welcher 4 Tage in einem Heizschrank von 37 C inkubiert wird, worauf die Kultur homogenisiert und auf einen Dubos-Nährboden aufgeimpft wird, und anschließend in Ampullen abgefüllt und bei -20°C konserviert oder leicht mit destilliertem Wasser verdünnt und hierauf in Ampullen gebracht und lyophilisiert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man zur Herstellung eines injizierbaren, den veränderten Bazillus enthaltenden Immunostimulins den von dem Stamm kommenden Bazillus in Röhrchen züchtet, welche einen P?ewenstein-Jensen-Nährboden enthalten und in einem Heizschrank bei 37 C 4 bis 8 Tage in waagerechter Stellung gehalten werden, daß man Kolonien der Zucht entnimmt, ohne Nährboden mitzunehmen, die Kolonie durch Schütteln in einem Glaskugeln enthaltenden Kolben 30 Sekunden bis 1 Minute homogenisiert, mit destilliertem Wasser verdünnt, wobei die Trübung der Suspension so eingestellt wird, daß ihre Konzentration 1 mg/ml Bazillen beträgt, von neuem ver-

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dünnt, bis man eine Muttersuspension von 10 mg/ml erhält, 0,3 ml der Muttersuspension in einen Loewenstein-Jensen-Nährboden enthaltende Zuchtröhrchen bringt, vier Tage bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, um eine neue Zucht zu erhalten, diese neue Zucht in einem neuen, Glaskugeln enthaltenen Kolben homogenisiert, und daß man sie in

lösung
physiologischer Salz- suspendiert, um eine zwischen 1 und 5 mg/ml liegende Bazillenkonzentration zu erhalten.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man zur Herstellung eines den künstlich modifizierten Bazillus enthaltenden injizierbaren Immunostimulins den aus dem Stamm kommenden modifizierten Bazillus in einem Gärgefäß in einem flüssigen Nährboden, z.B. Souton-, Youmans- oder Dubos-Nährboden, züchtet, welcher mit dem suspendierten Stamm so beimpft wird, daß ein Volumen von 10 bis 20 ml mit einer zwischen 1 bis 10 mg/ml Bazillen liegenden Trübung entsteht.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß man, um die Bazillensuspension unschädlich zu machen, diese mit einem ungiftigen und keine Allergie erzeugenden Antibiotikum behandelt, insbesondere mit Myambuthol im Verhältnis von 20 bis 50 yug/ml.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß man, um die Bazillensuspensxon unschädlich zu machen, diese einer physikalischen Behandlung unterwirft, welche in Druckänderungen besteht, und zwar vorzugsweise in zehn aufeinanderfolgenden Wechseln, welche den Druck zwischen 1 und 5 Atmosphären verändern.

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11. Anwendung des Immunostimulins nach Anspruch 1 zur aktiven unspezifischen Immunotherapie zur Krebsbekämpfung und bei der Vorbeugung gegen Krebs und andere nicht krebsige Leiden.

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