DE1492042C - Verfahren zur Herstellung eines Pertussi-Antigens - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Pertussi-AntigensInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von B.-pertussis-Antigen, das von jeglichem
wesentlichen Gehalt an' Zellmaterial des B. pertussis frei ist.
Der Keuchhusten ist als eine akute, stark übertragbare, infektiöse Erkrankung, die von B. pertussis
hervorgerufen wird und bei Kindern im Alter von unter 4 Jahren gefährlich ist. Eine Immunisierung
gegen diese Erkrankung ist bisher durch Injektion abgetöteter Bazillen oder extrahierten Antigens bewirkt
worden. Das häufige Auftreten von Nebenreaktionen, wie Fieber, Reizerscheinungen, Entzündungen
und Nekrosen, sowie die seltenen, aber beunruhigenden Berichte über Enzephalitis haben Forschungen
nach einer besseren Vaccine notwendig gemacht.
Die vorliegende Erfindung macht ein B.-pertussis-Antigen in wesentlich verbesserter Form verfügbar.
Mit dem Antigen läßt sich eine bleibende Immunität gegen Keuchhusten erreichen, ohne daß die unerwünschten
Nebeneffekte heute bekannter Vaccinen auftreten. Sie stellt ein Antigen zur Verfügung, das
von Zellsubstanzen frei ist, die zum Teil toxisch sind und die für die Nebenreaktionen verantwortlich sein
können, die bei Verabreichung im Handel verfügbarer Vaccinen beobachtet wurden.
Es wurde gefunden, daß sich ein wertvolles Antigen für die Immunisierung gegen Keuchhusten
durch eine Reihe von Arbeitsschritten erhalten läßt, bei denen man Zellen des B. pertussis mechanisch
zerlegt und das Antigen aus der Zellwand chemisch extrahiert. Es hat sich gezeigt, daß das Schutzantigen
ein Teil der Zellwand (manchmal auch als Zellmembran oder Zellhülle bezeichnet) ist; das Protoplasma
der Zelle, das den Hauptanteil des stickstoffhaltigen Materials enthält, besitzt nur eine geringe
■bis keine antigene Eigenschaft, die zur Immunisierung geeignet ist. Das Protoplasma enthält jedoch in
hoher Konzentration Protein, das bei Laboratoriumstieren toxisch ist und beim Vorliegen in Vaccinen zu
unerwünschten Nebeneffekten führen kann.
Die in dem Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzten B.-pertussis-Zellen können auf jedem der
bekannten, zweckentsprechenden Medien gezüchtet werden, wie dem von Powell u. a. beschriebenen
Holzkohle-Agar-Medium (Public Health Reports, 66, S. 346 [1951]), den von Verwey u. a. beschriebenen,
flüssigen Medien (J. Bact., 58, S. 127) oder dem Kulturmedium nach Cohen—-Wheeler(Amer. J.Pub.
Health, 36, S. 371 [1946]). Nach dem Wachsen werden die Zellen durch Schleudern geerntet. Man kann
dann die geernteten Zellen zertrümmern oder die Zellpaste bis zum Bedarf gefrieren und bei — 30 0C
aufbewahren. Wenn gewünscht, kann man die geernteten Zellen lyophilisieren und dann bis zum Bedarf
aufbewahren oder die Zellen mit Thiomersal oder nach anderen Methoden, durch die das Antigen
das B. pertussis nicht zerstört wird, abtöten. Die Zcllkonzentration soll für die Zwecke der Erfindung
vorzugsweise im Bereich von 100 bis 1000 B/ml (Bazillen/ml) liegen.
Die Zellen werden in kaltem, destilliertem Wasser (2 bis 5° C) resuspendiert und in einer Fraktioniervorrichtung
der Bauart Ribi Cell Fractionator (Ivan Sorvall, Inc., Norwald, Conn., V. St. A.) bei 2110 at
und einer Temperatur von 20 0C oder darunter einer explosiven Dekompression unterworfen. Bei einem
Druck von 2110 at erhiilt man gute Ergebnisse, aber es hat sich gezeigt, daß zufriedenstellende Ergebnisse
allgemein bei Drücken im Bereich von etwa 1050 bis 3550 at erhalten werden. Auch andere Mittel zur
Zerlegung oder Zerreißung von Zellen und Isolierung der Zellwände können Verwendung finden, wie
Schallschwingungen, . mechanisches Mahlen usw., aber die Erfahrung zeigt, daß mit der explosiven Dekompression
die höchsten Ausbeuten an sauberem Wandmaterial erhalten werden. Vor dem Einsatz
wird die obengenannte Fraktioniervorrichtung voro teilhafterweise sterilisiert, indem man ihr gesamtes
Leitungssystem 24 Stunden der Einwirkung von Äthylenoxid aussetzt und dann mit sterilem Stickstoffgas
spült. Die Druckvorrichtung wird 1 Stunde sterilisiert, vorzugsweise durch Zusammenbringen
is aller ihrer Teile mit /J-Propiolacton (0,5%) und dann
Spülung mit sterilem, destilliertem Wasser. Zur Verbindung der Dekompressionskammer mit einem
Stickstofftank dient ein mehrphasiges, Bakterien zurückhaltendes Filter oder anderes zweckentsprechendes
Filter.
Die Suspension der B.-pertussis-Zellen wird in die Kompressionskammer der Fraktioniervorrichtung
eingeführt und in dieser einem Druck von 1050 bis 3550 at ausgesetzt, wodurch die Zellen in die Dekompressionskammer
getrieben werden, in der sie explosiv bersten. Die Dekompressionskammer wird mit vorgekühltem Stickstoffgas, das man durch das
mehrphasige Filter in die Kammer einleitet, auf 20 0C oder darunter gehalten. Das von der Dekompressionskammer
abströmende, die Zellwände und Protoplasma enthaltende Gut wird in einem in ein
Eisbad getauchten, sterilen Behälter gesammelt.
Das abströmende, das geborstene Zellmaterial enthaltende Gut wird geschleudert und das überstehende,.
flüssige Material verworfen; das verbleibende Zellwandmaterial kann mit kaltem Wasser
gewaschen werden, um hochtoxische, lösliche Protoplasmabestandteile zu beseitigen. Die gewaschenen
oder ungewaschenen Zellwände werden in einem Puffer auf eine Konzentration von etwa 100 bis
2000 Bazillen/ml (B/ml) suspendiert, wobei in der Praxis im allgemeinen eine Konzentration von
200 B/ml bevorzugt wird. Das Antigen wird dann erfindungsgemäß extrahiert, indem man die ZeIlwandsuspension
mit einem Salz der Desoxycholsäure bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,1 bis 10 %>
Desoxycholat versetzt; zur Erzielung einer maximalen Extraktion jedoch wird eine Endkonzentration
von etwa 0,25 bis 1% bevorzugt. Ein pH-Bereich von etwa 8 bis 10 hat sich als für die Extraktion sehr
zufriedenstellend erwiesen.
Das Zellwand-Desoxycholat-Gemisch wird kontinuierlich 18 bis 48 Stunden sachte bewegt, während
man die Temperatur zwischen etwa 2 und 5 0C hält. Das Material wird geschleudert und das überstehende
Gut gegen einen 0,01molaren Phosphatpuffer bei einem pH im Bereich von 7 bis 7,7 dialysiert, um
das Desoxycholat zu beseitigen. Das nicht dialysierbare Material, welches das Antigen enthält, wird auf
pH 7,0 eingestellt und auf eine den vorgeschriebenen Normen, wie den Normen der »National Institutes of
Health«, entsprechende Konzentration verdünnt. Die Lösung des Antigens kann mit einem Konservierungsmittel,
wie Thiomerral, Benzethoniumchlorid, Benzylalkohol, y-Picoliniumchlorid oder anderen bekannten,
zweckentsprechenden Konservierungsmitteln, konserviert und auf jede gewünschte Konzentration
verdünnt werden.
Das gemäß der Erfindung erhaltene Antigen kann zur Herstellung einer wäßrigen Vaccine verwendet
oder zunächst an Hilfsstoffen, wie Aluminiumhydroxyd
oder -phosphat, adsorbiert, oder mit Aluminiumkaliumsulfat gefällt und dann zur Vaccine
zubereitet werden. Das Antigen kann, da es mit anderen Antigenen und bzw. oder Toxoiden verträglich
ist, mit diesen in herkömmlicher Weise unter Bildung einer polyvalenten Vaccine in Form einer
Einzeldosis vereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung bietet eine ganze Reihe ausgeprägter Vorteile. Das Produkt ist frei von allen
Protoplasmabestandteilen, von denen einer, das wärmelabile Toxin, dafür bekannt ist, bei Laboratoriumstieren
extrem toxisch zu sein, und der für diese oder jene Nebenreaktion beim Menschen verantwortlich
sein kann. Das Produkt ist frei von Nährmedium, Zellresten und chemischen Fremdstoffen.
Es ist mit anderen Antigenstoffen, die bekanntlich mit der intakten Pertussiszelle kombiniert
werden, verträglich. Das Verfahren ist einfach und leicht durchführbar und unter Erzielung hoher Ausbeuten
an aktivem Material reproduzierbar.
Das Verfahren ist in dem folgenden Beispiel im einzelnen erläutert. Die grundsätzliche Arbeitsweise
besteht darin, das Schutzantigen mit Desoxycholat aus B.-pertussis-Zellwänden zu isolieren, die von
Protoplasma wie auch anderen Fremdstoffen abgetrennt worden sind.
30
Die Zellen einer auf einem Cohen-Wheeler-Medium gewachsenen 48-Stunden-Kultur von B. pertussis
werden geerntet, indem man das Medium mit konzentrierter Salzsäure auf pH 7,0 einstellt und auf
einer Sharples-Zentrifuge schleudert. Die erhaltene Zellpaste wird in destilliertem Wasser suspendiert,
durch ein 200-Maschen-Nylonsieb passiert, um Grobteilchen zu entfernen, und das Filtrat auf eine Konzentration
von 500 B/ml eingestellt.
Das Zellkonzentrat (1600 ml) wird in eine vorsterilisierte Fraktiomervorrichtung der Bauart Ribi
Cell Fractionator eingeführt und einem Druck von 2110 at unterworfen. Die Zellen werden unter Druck
in die Dekompressionskammer ausgepreßt, die mit gekühltem Stickstoff gas auf 20 0C oder darunter gehalten
wird, und unterliegen in dieser einem explosiven Bersten. Das Zellmaterial läuft von der Dekompressionskammer
in einen in ein Eisbad getauchten, sterilen Behälter ab, wobei 1600 ml erhalten werden.
Die Suspension wird 3 Stunden bei 16000 Umdr./ Min. in einer Zentrifuge der Bauart Spinco 18000
geschleudert, wobei aber auch andere Schleudervorrichtungen, wie z.B. die Sharples-Zentrifuge, verwendbar
sind. Man entfernt das überstehende Gut aus der Zentrifuge durch Dekantieren und kann,
wenn gewünscht, die Zentrifuge ein oder mehrmals wieder füllen und umlaufen lassen, ohne den Rückstand
zu entfernen. Das überstehende Gut, das entfernt und verworfen wird, enthält die hochtoxische
Protoplasmafraktion des Zellkonzentrates.
Der Rückstand oder das Sediment in dem Rotor wird vorzugsweise entfernt, indem man an dem
Rotor Stahlkugeln anbringt und ihn durch Aufbringen auf einen Rollmechanismus sacht bewegt. Die
Loslösung des Rückstandes von dem Rotor kann aber auch nach anderen, an sich bekannten Verfahren
erfolgen.
Man wäscht den Rückstand aus dem Rotor mit kaltem, destilliertem Wasser (2 bis 5 0C, ungefähr
800 ml) aus, stellt das pH durch Zusatz lO°/oiger Natronlauge (ungefähr 1,0 ml) auf 8,5 ein und bringt
das Endvolumen der Zellwandsuspension mit kaltem, destilliertem Wasser (2 bis 5 0C) auf 1600 ml. Weiter
stellt man eine sterile, 2%ige Lösung des Natriumdesoxycholates bei pH 8,5 (Einstellung mit In Natronlauge
von der Hitzesterilisierung) her und vereinigt 1600 ml dieser Lösung der Wandmaterialsuspension.
Durch Zusatz von kaltem, sterilem, destilliertem Wasser (800 ml) erhält man 4000 ml Wandmaterialsuspension
mit einer Desoxycholatkonzentration von 1,0%, die in 1 ml das Wandmaterial von 200 B.-Pertussi enthält. Die Suspension wird in einer
mechanischen Schüttelvorrichtung 18 bis 24 Stunden bei 2 bis 5 0C sachte bewegt und dann in dem Rotor
einer Fraktiomervorrichtung der Bauart Spinco 18000 (oder einer anderen Zentrifuge) 1 Stunde bei
16000 Umdr./Min. (30100 X Schwerkraft Durchschnitt)
geschleudert. Das überstehende Gut wird durch Dekantieren gewonnen; der Rotor kann
wiederholt eingesetzt werden, um weitere Anteile an Zellwandsuspension zu behandeln, ohne daß man
das Sediment zu entfernen braucht.
Die erhaltenen Anteile an überstehendem, das. Schutzantigen und Natriumdesoxycholat enthaltendem
Gut werden vereinigt und gegen 0,01-molaren Phosphatpuffer, pH 7,4 bis 7,7, dialysiert, bis in dem
Dialysat bei Zusatz von konzentrierter Salzsäure kein Desoxycholat mehr festzustellen ist. Gewöhnlich
wird der Endpunkt der Desoxycholatbestimmung bei dem vierten Wechsel des Puffers erhalten, wobei man
bei jedem Wechsel etwa 135 1 Puffer 48 bis 72 Stunden einwirken läßt. Der nichtdialysierbare Extrakt,
der bei Verdünnung auf einen 32 B/ml entsprechenden Wert nunmehr ein Volumen von 4500 ml hat,
enthält 14,7 Schutzeinheiten/ml (das N.I.H. Nr. 6-Kontrollmaterial
zum Vergleich 8 Schutzeinheiten/ml) und kann zur Herstellung von wäßrigen, adjuvanten
oder multivalenten Vaccinen verwendet werden.
Zur Bestimmung des Wirkungsvermögens des Zellextraktes und des N.I.H.-Kontrollmaterials werden
getrennten Gruppen von Mäusen verschieden verdünnte Lösungen des Extraktes und des Kontrollmaterials
verabreicht und dann die Tiere intrakranial mit 0,03 ml einer Verdünnung von bekanntem, virulentem
B. pertussis mit einem Gehalt von 105 Organismen/ml infiziert. Ergebnisse:
Verdünnung überlebende/geprüfte A I B |
0,01 | Tiere C |
ED50 ·) |
Grenzwerte der Zuverlässigkeit °/o |
Schutzeinheiten/ml | |
Extrakt gemäß Beispiel N.I.H. Nr. 6 |
0,05 | 8/32 0,02 |
0,002 | 0,0165 0,0304 |
85 bis 118 85 bis 118 |
14,7 8 |
29/32 0,06 |
4/32 | 1/32 0,0024 |
||||
25/31 | 0/32 |
*) Wirksame Dosis zum Schutz von 50 °/o der getesteten Tiere.
Der Antigenextrakt gemäß dem Beispiel erweist sich entsprechend den N.I.H.-Normen als nichttoxisch; diese Normen fordern, daß bei intraperitonaler
Injektion der Hälfte der Einzeldosis für den Menschen bei Mäusen in 3 Tagen kein Gewichts- S
verlust, in 7 Tagen eine Nettozunahme von 3 g und bei nicht mehr als 5% der untersuchten Tiere ein
Todesfall eintritt. Bei intraperitonaler Injektion von 0,25 ml des Schutzantigen-Extraktes gemäß Beispiel
bei zehn Mäusen wurde im Durchschnitt am Ende von 3 Tagen eine Gewichtszunahme von 2,1 und am
Ende von 7 Tagen eine durchschnittliche Zunahme von 6,5 g beobachtet, ohne daß am Ende der Prüfzeit
ein Todesfall vorgelegen hätte.
Der Extrakt gemäß Beispiel genügte auch dem Tier-Sicherheitstest; bei Injizierung von 20-g-Mäusen
mit jeweils der halben Einzeldosis für den Menschen und dreimaliger Injizierung von zwei 350-g-Meerschweinchen
mit jeweils einer Einzeldosis für den Menschen ergaben sich keine Todesfälle und keine
Symptome.
Herkömmliche Sterilitätsprüfungen haben gezeigt, daß der Extrakt von Schimmelpilzen und Bakterien
frei ist.
Die elektrophoretische Analyse und die Ouchterlony-Analyse
haben ergeben, daß der Extrakt gemäß Beispiel von dem Hauptanteil der Protoplasmastoffe
und Wandantigenstoffe mit Ausnahme des Antigens frei war. Die Endvaccine enthielt ein Drittel oder
weniger des Gesamtstickstoffs, der bei herkömmlichen Vaccinen ermittelt worden ist.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zum Herstellen eines Pertussis-Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß man das vom Protoplasma befreite Zellwandmaterial in Wasser suspendiert, so daß die Suspension das Zellwandmaterial in einer Menge von 100 bis 200 Bazillen/ml enthält, diese Suspension dann durch Zugabe eines Alkalimetallsalzes der Desoxycholsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 10% und durch Zugabe von Alkali auf einen pH-Wert von 8 bis 10 einstellt, und bei 2 bis 5 0C bis zu 48 Stunden beläßt, von den Zellwänden abtrennt und das Desoxycholat aus der Lösung des Antigens entfernt.
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