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Verfahren zur Herstellung einer wundenheilenden Zubereitung aus Embryonalstoffen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung einer wundenheilenden
(ephitilisierenden) Zubereitung aus Embryonalstoffen, die sowohl haltbar wie auch
steril ist.
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Es 'ist bekannt, Embryonalextrakte dadurch in steriler Form zu erhalten,
daß das Embryo unter aseptischen Bedingungen herausgenommen und behandelt wird.
Die dadurch gewonnenen Extrakte sind nur wenige Tage haltbar.
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Es ist auch bekannt, Organextrakte der verschiedensten Art dadurch
haltbar zu machen, daß sie in getrocknetem Zustand übergeführt werden. So ist es
auch mehrfach versucht worden, Embryonalstoffe einzutrocknen, jedoch sind die Versuche,
dadurch ein Trockenprodukt zu erhalten, das sowohl steril als auch haltbar ist,
bisher nicht gelungen. Solche Erzeugnisse könnten übrigens nur aus Embryonen, die
in steriler Form gewonnen werden können, hergestellt werden, was die Verwendung
von Hühnerembryonen, die im Laboratorium aus dem Ei aseptisch herausgenommen werden,
bedingt. Von einer Sterilisierung soll nach den Angaben im Schrifttum unbedingt
abgesehen werden, weil dadurch der wachstumfördernde Wirkstoff nahezu ganz zerstört
wird.
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In den Fällen, wo Embryonalstoffe bei den bisherigen Versuchen eingetrocknet
worden sind, hat man stets möglichst schonende Bedingungen angewendet, und zwar
niedrige Temperatur und Vakuum. Bei den Versuchen ist es auch vorgekommen, daß man
die unter aseptischen Bedingungen erreichten Eindampfungsprodukte wieder aufgelöst
hat, wobei man immer eine bedeutende Herabsetzung der Aktivität feststellen mußte.
Die Sterilisierung
von frischen, also nicht vorher eingedampften
Embryonalextrakten ist durch Sterilfiltrierung versucht worden, wobei jedoch die
Ergebnisse wenig befriedigend waren, da die Aktivität durch Filtrieren durch ein
Berkefeldfilter vermindert und durch Filtrieren durch ein Chamberlandfilter ganz
aufgehoben wird. Aufbewahrung in Kälte setzt auch die Aktivität eines Embryonalextraktes
herab, Es wurde nun gefunden, daß Embryonalstoffe eine Sterilisierung, die nicht
als Hitzesterilisation ausgeführt werden darf, wider Erwarten gut aushalten, wenn
sie vorher einer Trocknung bei nicht wesentlich über 5o° C unterworfen werden, wobei
auch niedrige Temperaturen (unter o° C) zu vermeiden sind. -Die Trocknung soll zum
Vorbereiten des Embryonalstoffes für die Sterilisierung dienen und soll auch dann
ausgeführt werden, wenn für die Weiterbehandlung und/oder als Enderzeugnis eine
Lösung des Embryonalstoffes erwünscht ist.
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Auf dem getrockneten Produkt oder auf dessen Extrakten kann eine Fraktionierung
ausgeführt werden, wobei der Embryonalstoff in eine mehr und eine minder wirksame
Fraktion geteilt wird.
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Die Trocknung kann durch Verdampfen des Wassers bei einer Temperatur,
die So' nicht übersteigt und die nicht ' sehr niedrig (unter o°) ist, erfolgen,
oder sie kann durch Behandlung mit wasserentziehenden Mitteln durchgeführt werden.
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Die Sterilisation darf nicht als Hitzesterilisation ausgeführt werden,
weil die F_mbryonalstoffe eine Erhitzung auf über t oo- C auch nicht nach vorherigem
Eintrocknen vertragen. Sie kann auf das Produkt, während es in der wasserfreien
Form vorliegt, durch Behandlung mit sterilisierenden Mitteln, z. B. organischen
Lösungsmitteln, wie Benzol, Methylalkoliol, Äthylalkohol oder Aceton, vorzugsweise
in konzentriertem oder wasserfreiem Zustand ausgeführt werden, wobei die genannten
Lösungsmittel den Wirkstoff nicht lösen. Wenn man beabsichtigt, die Sterilisation,
während der Wirkstoff in der Form einer Lösung vorliegt, auszuführen, geschieht
sie vorzugsweise durch Filtrierung durch ein bakteriendichtes Filter, wobei es sich
als bedeutungslos gezeigt hat, ob man hierzu ein Chatnberlandfilter, ein Berkefeldfilter
oder ein Seitzfilter benutzt, da die Aktivität bei dieser Behandlung in keinem Fall
wesentlich abnimmt.
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Es hat sich gezeigt, daß die vorhergehende Trocknung des Embryonalstoffes
auch für eine nachfolgende Fraktionierung eine notwendige Bedingung ist, weil diese
unter Verwendung der für solche Stoffe üblichen Fraktionierungsmethoden eine weit
bessere Trennung der aktiven von den inaktiven Stoffen ermöglicht, als wenn solche
Maßnahmen auf Enibryonalstoffe, die nicht vorher zum Trocknen eingedampft worden
sind, angewendet werden. Für das Fraktionieren werden vorzugsweise verdünnte Säuren,
z. B. Salzsäure oder Essigsäure, oder auch Aceton oder Al-
kohol, verwendet,
worin sich das aktive Prinzip nicht oder verhältnismäßig wenig löst. Das Fraktionieren
kann durch Fällen eines Extraktes des getrockneten Embryonalstoffes in Wasser, Ringerlösung
o. dgl. ausgeführt werden.
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Wenn der Sterilisierung andere Behandlungen folgen, müssen diese unter
aseptischen Bedingungen ausgeführt werden, ebenso wie gegebenenfalls dem Präparat
zuzusetzende Stoffe steril sein müssen.
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Wenn man ein Trockenpräparat herstellen will, ist es empfehlenswert,
den Extrakt zunächst mit einem pulverförmigen Absorptionsmittel aufzunehmen, das
in einer solchen Menge hinzugesetzt wird, daß ein mehr oder minder trockener Brei
entsteht.
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Während des ganzen Verfahrens wird durch Entnahme geeigneter Proben
die biologische Aktivität des Produktes überwacht. und Chargen, die sich unwirksam
erweisen, werden aus dein Verfahren entfernt. Die Überwachung kann durch Prüfung
des Vermögens der Wachstumförderung künstlicher Gewebekonturen, z. B. unter dem
Mikroskop oder durch direkte Prüfung der wundenheilenden Wirkung an geeigneten Versuchstieren,
z. B. Hunden, ausgeführt werden. Im Einklang mit dem Ergebnis dieser Proben kann
das Präparat gegebenenfalls auf eine im voraus bestimmte Aktivität eingestellt werden,
z. B. durch Mischung von Chargen verschiedener Aktivität oder durch Verdünnung mit
Verdünnungsmitteln, wie z. B. Ringerlösung, wenn es sich um flüssige, oder bolus
alba, Talkum o. dgl., wenn es sich um feste Produkte handelt.
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Das als Rohmaterial benutzte Embr yonaigewebe braucht nicht aus Hühnerembryonen
oder anderen Embryonen, die im Laboratorium aseptisch herausgenommen werden können,
zu bestehen, sondern man kann auch Embryonen anderer warmblütiger Tiere auf einem
geeigneten Entwicklungsstadium benutzen, wobei es an sich bekannt ist, daP tierische
Gewebe den wachstumfördernden Stofft in um so wirksamerer Form enthalten. auf je
früherer Entwicklungsstufe sie sich befinden.
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Als Grundmaterial können ganze Embryonen oder Teile davon verwendet
werden. So kann man gegebenenfalls einzelne Organe von
den Embryonen
entfernen, z. B. Thymus oder Anlagen von Klauen und Zähnen, die entweder in anderer
Weise verwendet werden können oder nur in geringem Maße zur Gewinnung der proliferationsaktiven
Stoffe beitragen oder (wie die Leber oder andere Verdauungsdrüsen bei verhältnismäßig
stark entwickelten Embryonen) herabsetzend auf die Aktivität des hergestellten proliferationsaktiven
Stoffes wirken.
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Die Erfindung soll im folgenden noch durch einige Ausführungsbeispiele
erläutert werden.
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Beispiel i 25 Hühnerembryonen, die während 7 bis i i Tagen gebrütet
worden sind, werden aus den Eiern genommen und in physiologischer Kochsalzlösung
reingespült, wonach sie fein gehackt werden. Zu dem entstandenen Embryonalbrei werden.
4. Volumen Äthylalkohol hinzugesetzt. Nachdem der Brei einige Stunden lang mit dem
Alkohol gestanden hat, wird der Niederschlag durch Zentrifugieren oder Filtrieren
abgetrennt und dann weiter mit frischem Äthylalkohol 24 Stunden lang behandelt.
Diese Behandlung wird noch einmal wiederholt, wonach der Niederschlag noch auf dieselbe
Weise mit Äther extrahiert wird. Die Suspension wird dann filtriert und in der Luft
getrocknet. Das Trockenpulver wird in einer Kugelmühle zu feinem Pulver vermahlen,
gesiebt und mit reichlichen Mengen von Aceton 24 Stunden lang hingestellt. Dadurch
wird eine Sterilisierung bewirkt, und das Aceton wird unter sterilen Bedingungen
entfernt, wonach das Pulver getrocknet wird, und zwar ebenfalls unter sterilen Bedingungen.
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Dieses Trockenpulver kann als solches als wundenheilendes Mittel verwendet
werden, oder es kann ein steriler wäßriger Extrakt daraus als wundenheilendes Mittel
Verwendung finden, jedoch ist das Präparat nicht so aktiv wie die nach Beispiel
2 und 3 hergestellten Präparate.
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Beispiel 2 io g des nach Beispiel i hergestellten Trockenproduktes,
das jedoch noch nicht durch Acetonbehandlung sterilisiert worden ist, werden mit
75 cm' o,o6 n-Salzsäure versetzt und 24 Stunden bei o° stehengelassen. Die Suspension
wird zentrifugiert und der Niederschlag in So cm' Wasser aufgeschlemmt. Unter Abkühlung
mit Eis wird dann o,o6 n-Natriumhydroxyd bis zu schwach basischer Reaktion hinzugesetzt.
Die Aufschlemmung wird zentrifugiert und das Zentrifugat mit Salzsäure versetzt.
Der hierdurch entstandene Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und
durch Behandlung mit Aceton getrocknet. Es werden o,2 g des aktiven Stoffes gewonnen
und dieser durch Stehenlassen während 24 Stunden mit Aceton oder absolutem Alkohol
sterilisiert. Das unlösliche Pulver wird von der Flüssigkeit getrennt und unter
sterilen Bedingungen getrocknet. Es kann als solches als wundenheilendes Mittel
verwendet werden, oder man kann daraus sterile Lösungen durch Lösung des Pulvers
in steriler Salz-oder Pufferlösungen herstellen, wobei gegebenenfalls steriles Alkali
hinzugesetzt werden muß.
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Beispiel 3 o,2 g eines nach Beispiel?- hergestellten Produkts, das
jedoch nicht sterilisiert zu sein braucht, wird unter Zusatz von o,25 n-Natriumhydroxyd
zu neutraler Reaktion in So cm3 physiologischem Kochsalz gelöst. Die Lösung wird
nach kräftiger Zentrifugierung auf dem Seitzfilter oder Berkefeldfilter steril filtriert.
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Beispiel 4 Gereinigte Kralbsembryonen werden fein zerteilt und durch
Zerstäubungstrocknen in warmer Luft getrocknet, wobei die Temperatur des nassen
Produktes 45° nicht übersteigen darf. Das Trockenprodukt wird gesiebt und mit reichlichem
Aceton während 24 Stunden stehengelassen, wodurch völlige Sterilisierung erreicht
werden kann. Das Pulver wird isoliert und unter sterilen Bedingungen getrocknet.
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Beispiel 5 Fein zerteilte Kalbsembryonen werden im Vakuum bei einer
40° nicht übersteigenden Temperatur getrocknet. Das erhaltene Produkt wird auf der
Kugelmühle vermahlen, gesiebt und mit Aceton 24 Stunden stehengelassen. Das Pulver
wird isoliert und unter sterilen Bedingungen getrocknet. Es kann als solches für
die Beschleunigung der Wundenheilung benutzt werden, ist aber nicht so aktiv wie
die nach den folgenden Beispielen 7 bis 9 erzielten Produkte.
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Beispiel 6.
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5 g eines im Vakuum getrockneten Produktes nach Beispiel 5 werden
mit ioo cm3 physiologischer Kochsalzlösung extrahiert und der Extrakt zentrifugiert.
Die klare Flüssigkeit wird durch Filtrierung durch ein Seitzfilter sterilisiert.
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Beispiel 7 ioo g eines Produktes, das, wie in Beispiel 5 angegeben,
im Vakuum. getrocknet ist, werden 24 Stunden bei o° C mit 750 cm3 o,o6 n-Salzsäure
hingestellt. Der Niederschlag wird abgeschleudert und mit Soo cm3 Wasser unter
Neutralisierung
mit verdünntem Natriumhydroxyd extrahiert. Der Extrakt wird zentrifugiert, und die
klare Flüssigkeit wird durch Versetzung mit verdünnter Salzsäure gefällt. Der Niederschlag
wird abgeschleudert und mit Aceton getrocknet. Gewicht :2 g. Zum Sterilisieren wird
das Produkt mit reichlichem Aceton während 24. Stunden behandelt und danach unter
sterilen Bedingungen isoliert und getrocknet. Das Produkt ist io- bis 2omal aktiver
als das nach Beispiel s erzielte Produkt. .
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Beispiel o,5 g eines nach Beispiel 7 hergestellten, jedoch noch nicht
sterilisierten Produktes wird unter Neutralisation mit Natriumhydroxyd in ioo cml
physiologischem Kochsalz gelöst. Die Lösung wird zentrifugiert und die dadurch gewonnene
klare Lösung auf einem Seitzfilter filtriert.
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Beispiel Ein nach Beispie17 hergestellter neutraler Extrakt wird mit
2 Volumen Aceton oder Alkohol versetzt. Es entsteht ein Niederschlag, der abzentrifugiert,
gründlich mit Aceton behandelt und getrocknet wird. Gewicht des trocknen Pulvers
3 g. Das Pulver wird 2.4 Stunden mit Aceton behandelt und unter sterilen Bedingungen
isoliert und getrocknet.
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Die zur Verwendung kommenden Embryonen können auch im voraus gepreßt
werden, um den Zellsaft abzutreiben, oder mit näßrigen Lösungen extrahiert werden
und die Lösung und .zurückbleibende Genehe jedes für sich aufgearbeitet werden.
Es ist jedoch am praktischsten, die Embryonen im ganzen aufzuarbeiten, weil sowohl
in der Lösung und dem ausgepreßten Saft als auch im abgepreßten Gewebe große Mengen
von aktivem Stoff enthalten sind, so daß hierdurch keine wesentliche Fraktionierung
erreicht «-orden ist.