DE1642662A1 - Verfahren zur Gewinnung von Urokinase - Google Patents

Description

Dr. F. Zumsfein - Dr. E. Assmann

Dipl. Fhy·;. R. Hdxb

Mönchen 2, Bräuhaussfrafce 4/BI

70/Haok
A 86 259

Starling Drug Inc. Rev York, 1T,Y./USA

Verfahren zur Gewinnung von Urokinase

P 14 42 162. 6% Ausscheidung III aus Patent (Patentanmeldung '

Die vorliegend© Erfindung betrifft die Gewinnung, von Urokinaae aua dem Urin von Säugetieren und die Reinigung der so gewonnenen Urokinase.

Urokinase, ein Enzya, das im Urin von Säugetieren vorlcoaat, katalysiert die Umwandlung von Plasminogen (Profibrino lysin) zu Plasmin (Fibrinolysin), einem Enaya₉ das zum Auflösen von Fibringerinnseln fällig ist* Urokinase -enthaltende Präparate haben sich als therapeutische Motel als wertvoll erwiesen, insbesondere bei der fibrinolytisehen Behandlung von thromboesibolisohen Krankheiten des Menschen»

Ks ist bekannt, Urokinaae-enthaiteDfaPräparate aua dem Urin τοη Säugetieren dvirch verachiedene Verfahren su gewinnen, die im allgemeinen dio folgenden Verfahrensatufen Bahaadlung von Sclugetiaruirin mit einem Reagens, fias

die Bildung eines Urokinase-haltigen Hiedörachlags bewirkt; Sammeln des Urokinase-heltigen Niederschlags; und Elution dea Niederschlags, um eine Urokiitaae-enthalt er d?.· Lösung hersustsllen. In einigen Fällen wurde das so erhaltene Bluat als solche β wegen seiner fibrinolytischen Aktivität verwendet, in anderen Fällen vrarde das Eluat weiter verarbeitet, um die Re inheit der Urokinase su verbessern. ETach den bekannten Verfahren gelang es nicht, ein kristallines Präparat von Urokinase herzustellen.

Es sind verschiedene Beagentien bekannt, die beim Kontaktieren mit Säugetierurin eine Abtrennung eines leicht zu sammelnden Siiedersehlags bewirken, der im wesentlichen die gesamten, oder einen Großteil der Urinproteine, einschließlich der Urokinase, enthält, zusammen rait anderem protoinartige» Material· Andererseits briagen 5yrogene, Inhibitoren, thromboplastieche Substanzen rmß. dergleichen beim Aufarbeiten des erhaltenen Urokinase-haltigen Siederachlaga zur Abtrermung der Urokinase in guter Ausbeute und hoher Qualität von dein Ausfällungsmittel und von den verunreinigenden Proteinen viele schwierige Probleme mit sich. Als Folge davon litten alle diese Verfahren an schwerwiegenden Nachteilen, obwohl die bekannten Methoden mahr oder weniger konzentrierte Präparate von Urokinase herzustellen gestatteten,und keines dieser Verfahren führte su einem kristallinen Urokinase-Präparat.

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BAD OntQtiNAL

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Ea ist ein 2iel der vorliegenden Erfindung, neuartige Verbesserungen in bestimmten Verfahrensschritten der oben ernannten allgemeinen Methoden zur Isolierung und Reinigung von Urokinaae aua Säugatiorurin zn schaffen, ma damit' ein neues Verfahren zur Gewinnung von Urokinase au liefern, das diese verbesserten Verfahrensaehritte beinhaltet, aodaß Urokinase in guter Ausbeute und von einem hohen Heinheitagrad gewonnen wird, und um Urokinaae in kristalliner Pora herzustellen.

I. Blution von Urokinaae aus Urokinaee-haltigen, aus Urin gewonnenen niederschlagen

In meiner Hinsioht betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbesserung der Elutionsstufe der oben gezeigten, allgemeinen Methode zur Gewinnung von Urokinase, wonach Urin von Säugetieren mit einem Reagenz behandelt wird, das die Bildung eines Urokinase-haltigen Niederschlags bewirkt, der entstandene Niederschlag gesammelt wird und die Urokinase dann aua dem Siederschlag eluiert wird, wobei die Verbesserung die Elution der Urokinase aus dem Urokinase-enthaltenden Niederschlag mit einer verdünnten -wäßrigen Lösung von 6,9-Mamino-2-äthoxyacridin umfaßt. Die Konzentration des 6,9-Diamino-2-äthoxyacrldins in der Elutionslösung beträgt 0,1 bis 2 oder mehr Gewichtsprozent und vorzugsweise etwa 0,4 Gewicfc&sproaent. Der pH der Lösung wird auf einen Woi't im ungefährer- Bereich von 1,5-7 eingestellt; vorzugsweise ißt die Lösung cauer im

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pH-Bereich von 2-5- Sewünschtenfalls kann das 6,9-Diamino-2-äthoxyacrielin aus dem Eluat durch Aussalzen mit natriumchlorid oder oiaem äquivalenten wasaerlöalichen anorganischen SaIs leicht entfernt werden. Wahlweise und vorteilhafterweise wird die Entfernung dea 6,9~Biamino-2-äthoxyacridins in Zusammenhang mit dem im Folgenden im Abschnitt II beschriebenen Verfahren sur Entfernung von lyrogenen aua Urokinase-Lösungen bewirkt·

Die Ausfällung des Urokinase-haltigen Niederschlags nach der oben beschriebenen Methode ist leicht durchzuführen, sum Beispiel durch Anwendung der vielen gut Vekaunten Methoden sur Ausfällung von Urokinase aus Säugetierurin. In den fällen, vro die Blutionsatufe nicht eof ort auf die Auefällungsstufe folgt* z.B» dann« \19wa. eine Ansah! von Chargen an Niederschlag Über eine Anzahl von Tagen gesammelt und dann zusaiaisiengegeben wird, xxn eine zufriedenstellende Auobeute an Urokinase sicherjsus.tellon, sollte der naone Urokinase-haltige Niederschlag oof ort nach dem Sammeln eingefroren und in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden. Die gefrorenen ÜTiederechläge werden aufgetaut, wenn sie für den Slutionoechritt gebraucht werden.

Es iet insbesondere vorzuziehen, den Urokinase-haltigen iiiederßchlag in der Weise au gewinnen» daß der Säugetierurin mit Beirfconit oder einer äquivalenten Aluminiuinsilikatzusaininen~ ootfsuu^ koritaktiert und danach der Bentonit mit der daran adsorbierten urokinase* bsispiel^iöisö durch Zöirtrifugieron,

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SAD

gesaiamelt wird. Im allgemeinen <s?ird bevorzugt, etwa 0_s1 - 0,5 g Bentonit pro Eiter Urin au verwenden, um schnelle und ausreichende Adsorption von Urokinase sicherzustellen. Obwohl nach de» Stand der Technik bekannt mr, daß Bentonit wirkungsvoll die. gesamte Urokinase aus urin adsorbiert, mirde nach den "bekannten Verfahren keine praktische Methode zur Rückgewinnung der adsorbierten Urokinase von dem Bentonit beschrieben. Es wurde nun gefunden, daß eine v/äßrige lösung von 6,S-Diaaino-2-äthoxyacrldin, vorzugsweise bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 1,5 - 7» ein hochwirksames Elutionsinittel sur Wiedergewinnung von Urokinase v<m Bentonit, an dem die Urokinase adsorbiert 1st, darstellt.

Bine weitere bequeme und einfache Methode zur Gewinnung eines Urokinase enthaltenden Niederschlage aus Säugetierurin, die im Zusammenhang mit dem oben beschriebenen Verfahren verwendet werden kann, umfaßt das Einstellen des pi !-Werts des Urins auf einen Wert im ungefähren Bereich von 4 - 5,5* z»B, durch Zugabe von Essigsäure oder einer anderen geeigneten Säure, Abkühlen des in der Weise angesäuerten Urins und Sammeln des gebildeten Urokinase-haltigen ITiederschlaga.

Bs wurde noch eine weitere Methode gefunden, wonach Urokinase In guter Ausbeute aus dem Urokinase-haltigen niederschlag, der durch Ansäuern des Urins gebildet mirde, elulort werden kann. Die neue Methode umfaßt das ausgiebige Waschen : des [irokfnasQ~haltigeii liiedorochlags mit angesäuertem Wasoer I

SAD ORiQlNAL

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oai einea ρΐϊ-tferi; im ungefähren Bereich von 3_S2 Ms 5,5 und dä&ach die Slution der Urokinase aus clem so ge^aaclieneii^ schlag jait angesäuerter* Waasez» bei einem pH-T/eri im aägsirüliron Eoreioh von 1,5 Ms 3, tfobai ein ρ3«-?.'_β^* von 2 "bavörsugt

II. Entfernung von gyrogenen von

Ia aaderöj? Hinaiont betrifft die vorliegende Erfindung üeuea Verfahren zur Entfernung von £yrogenen aua v/äSrigan

Es ist bekennt, Pyro&ena aus wäßrigen Lösungen von

aktiven Materialien, einschließlich von verschiede* non ßur Injektion vorgesehenen I&zyatypexi, durch Zugabe eines vraaffGrunlöaJLichen Eröallralipboophate trie OaXoiumphoaphat au entferum die Pyrogene, nicht jedoch dos gotrUnachte biologisch aktive Material zu adeorbieren, wobei äae Shoephat mit den darauf adeorbierten Pyrogenon dann entfernt und verworfen i?ird. Dieaa "bekannte Methode bewirkt jjedooh nicht die Abtrennung von iyrogenen von Urokinase, da Urokinase ebenfalls durch daa wasserunlösliche Phosphat adsorbiert raird und darüber hinaus konventionelle Blutionamittel sowohl die adsorbierten Pyrogena ala auoh die adsorbierte Urokinase von dem unlöslichen Phosphat entformen.

£3 vnirde nun gefunden, daß, -nenn eine pyrogenhaltige lösung von Urokinase miii Caloiuaphosphatgal oder einem

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äquivalenten amorphen wAaaesnralÖsliclien Ifc das 6_f9-Siamiuo"2~ätlioxyi.cridisi adsorbiert enthält, kontaktiort T?irü, cie Urokinaee und ein Großteil der Pyrcgene auf das GgX • ado or liiert «ird und üureli EIuMon nit oinan Vixfge? aua ilai;ri\«a- -RIiOSpIIa-G odor oisiem äq,uivalen'i;ea wasoorlöslicheii Biospiial;. dio

adsorMoitea

edsoroiarte Urokinase πηά au? ein geringer Soil aes76₅S~Eia?ßino-2-äihoxyacridins entfernt v/ß-rdea, während fast die geaesrfcen Pyrogene auf dem GgI verbleiben. Der Slutionsschritt verläuft sehr' viel wirksamer, wenn das GeX eingefroren und danach auf~ gQtaut wird. Die relativ geringe Menge an 6,9-33i£uaino»2~äthoxy~ acriöin, die in dem entstandenen Bluat Torhanden sind, können aus dem Urokinase-haltigen EXuat durch Behandlung sit natriumchlorid _ odor einem äquivalonten waaserlösliclien anorganischen SaIs auagesalsen oder durcü Adßoiption an Carboxymethylcellulose entfernt werden. Wahlweise wird dio Urokinase aucgefällt und auo dem Eluat durch Zugabe eines niederen Alkanols isoliert, xfobei das δ, 9-Diaiaino-2-ätliQsyaci*idi,n in lösung bleibt.

Kach einer bevorsugten Auoführuagsfom unfaßt die neue Methode zur Pyrogonontfermmg die folgenden Verfahrenoechritts ϊ Kontaktieren einer Pyrogen-haltigen wäßrigen Urokinaaelöauag bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6,0 - 7,0 aiit CaXciiunphcüphatgQl, daa 6,9-Dieißino-2-äthoXyaoriäin adsorbiert enthält, wobei die ürokinaae und ein Großteil der £yroß©ne an daa Caiciurajf-iiocpliatgel adsorbiert τ/erdoii; SorBieln. öeo Calciumphoophatgola mit döii darauf aduorbifirten

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I^yrogeno und 6,9-3)iaiaino--2-ötho3cyacridin, Waschen dee Gels ait Waaeer unter Verwerfen der Waschflüssigkeit; Suspendieren dea Gele in einem ITatriiuaphoophatpuffer bei einem pH-Werk im ungefähren Bereich von 6,0 - 7,0, wobei die molare Koneentration von Efatriumphoaphat mindestens 0,25 betrügt und vorsugsweiee ±nungefähren Bereich von 0,25 - 0,50 liegt, wobei wiederum eine molare Konzentration von 0,36 besonders bevorsugt wird} H.n~ frieren dee entstandenen Gemisches und danach Auftauen desselben, vrobei die Urokinase und eine geringe Menge von 6,9-IHLa»ino-2-

äthoxyaoridin von dem Gel in den Ihoephatpuffer «luiert werden und der gröBt« Teil der fyroge&e mm Gel cdaorbiert bleibt! und Abtrennen dee r*etlichen 6_t9-I}iftÄino-2-Ätho3cyacridine von der urokinase.

Das obige Verfahren 1st insbesondere vorteilhaft, trenn ea αυτ Entfernung von Pyrogenen aue dem 6,9"Bia»ino-2oäthoxy<- aoridin-enthaltenden wäßrigan Urokinaoeluoungeu, die in obigen

angewandt wird, Abaohnitt I alo Slutionezsittel beachrieben sind ,/da in dieaom Falle dad zur Adaorption auf das Calciusphosphat benötigte 6,9-Diamino-2~ätlTioxyecridjLn bereite vorhanden ist und damit keine Vorbehandlung des Calciumpho&phata erforderlioh ietj und gleichzeitig dient natürlich dae Verfahren eur Entfernung dea Pyrogöne auch daeu, den größten Teil des 6_v9*'I2innino-2->ttthox7^>-aoridin-Blutionsmittela von der Urokinase abzutrennen·

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III. Adsorption von Urokinase auf Carbogymethyloelluloae und Elution von diesem Material

In weiterer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Methode zur Reinigung und Konzentrierung von Urokinase in wäßrigen Lösungen, die mindestens 500 CTA-Einheiten Urokinase pro ml Lösung enthalten, also in Lösungen, in denen die Urokinasekonzentration etwa das hundert- oder mehrfache der Konzentration an Urokinase, die üblicherweise im Urin vorhanden 1st und 4-6 CTA-Einheiten pro ml ausmacht, beträgt. Die neue Methode umfaßt die folgenden Verfahrensschritte: Kontaktieren einer wäßrigen Lösung, die mindestens 500 CIA-Einheiten Urokinase pro ml enthält, bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 5,0 bis 6,5 mit Carboxymethylcellulose, welche die Urokinase adsorbiert; und anschließend Elution der Urokinase von dor Carboxymethylcellulose« Die Elution wird leicht bewirkt durch Vorwendung wäßriger Lösungen hoher lonenatärke, z.B. einer JJatriuraphosphatpufferlösung; oder wahlweise können statt des Salzes oder der Pufferlösung auch stark saure Medien von einem pH-Wert bis hinab zu 1,5» oder stark basische Medien von einem pH-Wert bis hinauf zu 11,5 verwendet werden. Diese neue Methode kann entweder in einem ohargemTOiaen Verfahren durchgeführt werden, bei dem die wäßrige Lösung und die Carboxymethylcellulose vermischt worden und zwischen den festen und flüssigen Blasen Gleichgewichte eingestellt werden, oder in einer kontinuierlichen Waschprozedur, wie in einer Elution durch oine Säule. In einem ohargernieioen Verfahren Tiird die

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Carboxymethylcellulose mit <ier darauf adsorbierten Uroiiinaco gesarasielt und die Urokinase -wird von der Carboxymethylcelluloce eXuiert, vorzugsYieise mit Katriuiüphosphatpuffer bei einem pH-Wert Ih ungef Öhren Bereich von 6,0 - 7,0, TJObei die lsoXaro Konzentration an Katriuraphoaphat aindestens 0<25 beträgt und vorzugsweise im ungefähren Bereich, von 0,25 - 0,50 liegt, ttobei eine solare Konsentration von 0,29 beoondere bovoraugt '/?ird. In einer koatinuierXiclien AuaiührimgsiTona liegt der pH-\/ert dos ITatriumpiiospaatpuffers vorsugs^eise im ungefähren Bereich, von 1-11 und. die molare Konzentration an liatriumphoophat liegt im ungefähren Bereich von 0,005 - 0,5, wobei eine Konzentration von etwa 0,05 iia pH-Bereich von 2-5 und 7-11 bevorzugt \7ird_e und eine Konzentration von aindastena 0,05 und I7ünocii8as»?ertor-weiae von etwa 0,2 iia pH-Bereich von 5-7 bevorzugt v/ird.

Die meisten Pyrogene werden durch diese Carboxyiaethylcellulosetahandlung von der Urolcinaoe abgetrennt. Darüber hinaus "wird eine wesentliche Konaentrierung der Urokinase bs~ wirltt. Wenn daher die Methode sur Reinigung von Urokinase rait einer relativ niedrigen durchschnittlichen spöjsifischen Urokinaaeaktivität, a,B. iia ungefähren Bereich von 1000 bis 20.000 CIA-Einheiten pro rag Protein, verwendet wird, °i7eiot die Urokinase in dem resultierenden Eluat eine wesentlich gesteigerte Aktivität auf, im allgemeinen das 5- bis 10-fache oder mehr.

Das urokinasehaltige Eluat, das nach dein im obigen Abschnitt II beschriebenen Verfahren gewonnen v/ird, ist inabe-

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sondere sur Verwendung als Ausgangsmaterial bei diesem Carboxymethyleellulose-Verfahren geeignet. In dieoem PaIXe sollte die raolare Konzentration des Hatriumphosphatt? im Eluat durch Verdünnen auf einen Wort unter 0,15 vermindert werden, ura liiaxiinalo Adsorption von Urokinase auf Carboxymethylcellulose zu gewährleisten.

Durch Anwendung beider Methoden, nämlich sowohl der Adsorption auf Carboxymethylcellulose ala auch der Adoorption auf 6₉8-Diaffiino-2~äthoxyacridiii-bGh&ntiolt<33 Calciuzapho3pbat_t τ/ird Urokinase erhalten, die im \7ßDeutlichen pyrogenfrei ist.

IV. GotYinntmg von TTrokinase in hqchkonzentrierter;.

. S_-HuSQtierurin

In weiterer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Methode sur Gewinnung von urokinase im Hinblick auf ein neues Verfahren aur Gewinnung von Urokinase in hochkonzentrierter¹ Form aus Säugetierarin, in dsm die verschiedenen anderen oben beschriebenen orfindungageinüßen Merkmale kombiniert sind. Dieses neue Verfahren umfaßt die folgenden Verfahrensschritte: Behandlung von Sängetierurin mit einem Reagens, das die Bildung eines urokinaaehaltigen ITioderachlags bewirkt, Elution der Urokinase von dem urokinasehaltigen Niederschlag mit einer verdünnten ^7üßrigen Lösung von 6,9-Dianino~2-äthoxyacridin; Kontaktieren des entotandenen Eluats, vorzugev/eise bei einem pH-Wort im ungefähren Bereicn von 6,0-7,0, mit Calcium-

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phoaphatgei, Y?obei die Urokinase_t Pyrogene und ein geringer Soil des 6,9~Diaßino~2~äthoxyaoridiii3 auf dem Gel adsorbiert v/eräen., und Einschließend Sammeln des GeIa₁ Suspendieren dea GeIa In einen liatriuraphosphcttpuffor (vorzugsweise bei einem pH-V.^Tert ir. ungefähren Bereich von 6,0-7_fO, v?obei die molare Konzentration des Uatriumphosphats im ungefähren Bereich von 0,25 bis 0,50 liegt) und Einfrieren dos Gemisches und anschließendes Auftauen desselben, wobei die Urokinase und ein geringer Teil des 65,9-Diamino-2~ätho3cyaeridin3 von dem Gel in den Phosphatpuffer eluiert werden und die Hauptmenge der Pyrogene an Gel adsorbiort bleibt; Kontaktieren des urokinasehaltigen Eluats mit Gcruoxylnethylcellulose, die das restliche 6,9-Diamino-2-äthoxyaoriöin adsorbiert; Abtrennen der CarboxynethylcQlluioae mit adsorbierton 6_f9-3>lamino~2-äthoxyacridin von der urol haltigen Lösung; Einstellen dor molaren Konzentration äea Natriumphosphatß in der urokinaoelialtigen Lösung auf oinen V/ert, der nicht größer ist als ungefähr O_t15 tmd Kontaktieron der entstandenen Lösung bei einen pH-Wert ita ungefähren Beraich von 5_t0 bia 6,5 rait CarboxyrAStliylcollulose, die die Urokinass adsorbiert; und Elution der Urokinase von der Carboxyciothylmethylcellulose, voz'zugsweiae mit einen liatriunphonipbatpuffer bei einem pH-Wort im ungefäliren Seroich von 6,0 bis 7,0, wobei die molare Konzentration des Hatriumphosphats 0,25 beträgt.

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V. Höret ellung von Icg3.atalli.ner )nsiischllohey_Urok:baag9

In weiterer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung menschliche Urokinase in kristalliner, im wesentlichen homogener Fora und Mittel sur Gewinnung derselben·

Seit der Entdeckung der Urokinase vor mehr aia einera Jahrcehnt mirde eine Reihe von Vorfahren sur partielle* Reinigung des Enzyme beschrieben« Viele der mehr grundaatzlichen chemischen und biologischen Untersuchungen der Urokinaso litten jedoch an dem Mangel an im wesentlichen homogenen Präparaten, liuniaehr ist es gelungen, menschliche Urokinase in kristalliner, ia wesentlichen houiogener Poria dadurch au gewinnen, daß aia Äusgangsmaterial wäßrige Lösungen hoehgoreinigter naenschlicher Urokinasepräparate ciit einer Aktivität von 40.000 oder mehr CTA-Einheiten pro rag Protein verwendet werden. Die erföräe2*lieheii Atisgaagspräparate für dieses Verfahren vnirden durch Anwendung der verschiedenen v/eiteren Merkmale dieser Erfindung, wie sie vorstehend beschrieben sind, verfügbar. GoraäQ der vorliegenden Erfindung wird menschliche Urokinase in kristalliner Porm folgendermaßen gewonnen: lösen eines Urokinooepräparats mit einer Urokinaaeaktivität von mindestens 40.000 CTA-Einheiten pro mg Protein mit Efatriumphoophatpuffer bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich vcm 6 bis 7 »ur Herstellung einer lösung mit einer Urokina3eaktivität von mindestens 100.000 CTA-Einheiten pro ml; Dialyoieren der erhaltenen üösung bei 0-4°0 gegen Wasser, bis der spezifische Widerstand auf mindestens

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2500 Ohm ansteigt? Entfernen und Verwerfen dea gebildeten LTiedorschlags» Aussalzen der Urokinaae aus der Lösung durch Behandeln mit ilatriumehlorid, Sasmeln der auf diese Weise ausgefällten Urokinase und Lösen derselben in wäßriger Hatriumchloriälösung; und Aussalzen der Urokinase aus der üb*sung mit Natriumchlorid, wobei die Urokinase in kristalliner Pona erhalten wird« Duroh weitere Urakristallisation dieses Produktes \7ie in Beispiel 3 beschrieben, wird Urokinase in kristalliner, im wesentlichen homogener Poria erhalten. Das so erhaltene Produkt hat ein Molekulargewicht von etwa 53.300 und eine speaifische Aktivität von 652.000 £ 29.800 (s.d.) COIA-Sinheiten pro ing Stickstoff (ICjeldahl), oder 104.000 * 4.800 (s.d.) CTA-Einhoiten pro rag geschätates Protein.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Die engon Bereiche für pH, Temperatur, Konzentrationen und - dergleichen werden in diesen Beispielen nur deshalb angegeben, um in einer Serie von Ansätsea ausreichend gut reproduzierbare Resultate au ersielen und dies8 Angaben stellen keine kritischen Bedingungen dar, die in einem bestimmten Falle für eine zufriedenstellende ifaeharbeitbarkelt notwendig aind.

Ssispigl _m\

(A) Sammeln dea^ürlna

Menschlicher Urin von Männern wird direkt über Bors&urapulver (U.S.P.) in reinen 19 lüter (5-gallon) Polyäthylen-

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balXongefäßen, die mit reinen lO-Zoll-Polyäthylantrichtern auogestattet oind, gesammelt. Me Henge an Borsäure, die in 3eäöia Ballon vorhanden iet, sollte so bemeaaoa sein, daß nach aera Sanuaeln dea beabsichtigten Voluicens Urin die BndkoziKentration an Borsäure annähernd 0,25 $ (G/V) beträgt; "$?emn a.B. beabsichtigt ist, daß dor Inhalt der Ballons durchschnittlich 11,5 Liter (3 gallons) Urin aufnehmen soll, sollten 30 g Borsäure in jedem Ballon vor Gebrauch eingeführt werden« Die Trichter enthalten die üblicherweise verwendeten Deaodoransbioelca aus p-Dichlorbenzol. Vorteilhafterweioe sollten die SaTMiielperioden 12 Stunden nicht überschreiten_s da sur Ersieluiig der besten Resultate Bakterien»mehstuia und Bildung von Pyroganen im Urin auf ein Miniiauia beschränkt werden oolite. Die vollen Grof&ßo werden alao sofort nach der relativ volusozireiehen iaorgendlicheii Harnabgabe gesajisaelt. Eine derartige Zeiteinteilung erlaubt das Aufarbeiten öeo Urins ©it der geringe»ton Verzögerung. Wenn Urin während der folgenden 12 Stimden-Periode gesammelt v/ird, wird er unter Kühlung aufbewahrt, bis er am nächsten Morgen aufgearbeitet

(B) Adsorption von. Urokinase aus Urin

Zu 160 Liter auaaminengoscliüttGtem menschlichen Urin werden bei 15 - 25⁰C 24 g Bentonitpulver (U.S.P.) unter Rühren zugegeben. Um eine gleichmäßige Dispersion den Bentonita aichor zuotellen, wird er vorzugsweise als oine frisch bereitete 3

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1 b 4 ^ b B 2

Suspension in Urin gugeoetzt· IiacMem das Gemisch 20 Minuten oder länger gerührt wurde, wird der gebildete Niederschlag isoliert durch Zentrifugiersn, s.B. in einer eiev/aDCorgGlcülilton Zentrifuge mit einer ein Viertel Zoll Zu/.aufröhrö und einer Durchlauf rate von 473 Itr./Std. (125 gal/hr). Der Niederschlag wird aus der Zentrifuge unversiiglich entnommen und sofort in einem Polyäthylenbeutel odor oisrier Polyäthyloiiflasche eingefroren; daa Durcllsc^^llittagG^7lcht des so erhaltenen nasaGn liiedorachlaga beträgt 0,8 g pro Liter Urin (In einer röpräoentativon Serie von Versuchsanaätsen bewegt sich die Menge arischen 0.G5 und 1,4 g). Der Urintiberstaiid wird nsch Probeentnahme verworfen« während der Hiedersclilag_f dor über 98 "p der im Urin uraprüngj.icii vorhandenen Urokinaoe enthält, im göfrorsnen Zustand aufbewahrt wird, bia eine ausreichende Zahl von Chargen beiaammen eind» um mit der weiteren Reinigung fortzufahren.

(C) Elution jrpn adsorbierter Ugpkinaop_ypji. Böiitonit

Die erhaltenen, wie in Abschnitt (B) boochriebeiien Bentonit-Uiederfschläge würden vereinigt, um in einer -beliebigen Menge, die von der Kapazität der vorhandenen Auootattung, dor Zeiteinteilung odor anderen durchgreifenden "tiborleguiisoii abhängt, weiter verarbeitet eu werden. Iia vorließonden Beiox>iöl werden zum Zwecke der Erläuterung »ehn Chargen voreinigt.

Wenn eine injiaierbare Urokinasesuscuüraensötsung erhalten werden .soll, sollten während des geoaiaten folgenden präparativon

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HeratGllungaverfaarene Wasser, Reagonsien und Gefäße pyrögenfrei aein.

Die gefrorenen Bentonitnioderachläge (ungefähr 1,25 kg)_r die durch Behandlung von insgesamt 1600 Litern Urin gewonnen wurden* werden susamisengegebon und partiell "bei Zimmertemperatur auftauen gelassen; die vereinigten Fiederschläge ?rarden homo~ genisiert ait geringen Mengen kalten Waaaera von weniger als 10⁰C. Das Horaogenat wird auf 32 Liter durch Zugäbe von Wasser von 10⁰C verdünnt und der pH~Wert wird sorgfältig auf 4,00 £ O₅05 durch langsame Zugabe von n-H01 unter gutem Rühren otellt. Der iiiederaehlag wird durch Zentrifugieren in der Kälte bei 1500 g isoliert; das überstehende Waschfässer wird ver-Tiorfon. Das Waschen wird wiederholt, doch ist der Hoiaogenisierungaachritt im allgemeinen während dieser gleiten Wasichproasdu unnötig. Der zweimal gewaschene Bentonit-liiederachleg ??ird in 25,6 liter Waoser suopendiert, voraugnweise bei etwa 37°C_t und 6,4 Mt er 2,0 #ige (G/V) wäßrige lösung von ejS-Bismino^-ätliOÄ ecridin-lactat-inouohydratj, die vorher auf pH 4,0 eingestellt wurde, v/orden bei einer Temperatur von 37⁰C oder woniger angegeben . Die Temperatur dee Geiniochea wird dann auf 37 ± 1°C orhöht und dor pH-Wert unter konstantem Rühren auf 4,00 eingo» «teilt. 3)aa Gomiach 'tfird dann bei 1500 g 20 Minuten zentrifugiert und dor ffiedorschlag verworfen; die überatehcnde Fiüflfjigkoit, die? mehr ala 90 # der im uraprünglichen Urin vorhandenen Aktivität enthält, wird achnell auf 0 - 4⁰C abgekühlt und der

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pH-Wort \7ird dann auf 6,50 4; O_f05 durch vorsichtige Zugabe von n-HCl unter Rühren eingestellt· Sine aliquote Proba i?ird sur sofortigen Untersuchung

Die nächste YeriTahrensstufe (D) muß unversüglich angeschlossen werden.

(D) Adaorjybioa von Urokinano m\ Calciuaffhoapliat^ol

Eine Caloiuaphosphatgelouspension wird folgendermaßen hergestellt:

Eine lösung von 55₁5 g Calciumchlorid in 3 »5 Liter destilliertes! Wasser \*ird zn einer 7/öB\mg von 122,5 g ITa-PO, »12 HgO in 3,5 Liter destilliertem Wascer augegöTaen. Das Geasiach T/ird 30 Minuten in der Kälte gorulirt und daa Gel durch 10-»iinütiges Zentrifugieren bei 1500 g wnä O⁰C geisasaaslt; das Gelvolumen beträgt ungefähr T,5 Mter. Da3 GoI wird erneut in 4 Liter 0,0725 m-BaHgB}« suspendiert und 30 Hinuten gerührt nv4 erneut ciicch Zentrifugieren gessiaaielt. Das Gel wird dann avioiiaai mit 4 Ltr.*·Portionen Wasser gewaschen; daß Endvolumon des se?itri fugierton GoIo betrSgt ungefShr 800 ml (entaprechond 50 g Ca_x(PO^)₀* bezogen auf Srockenge-Hicht). Daa Gel wird in soviel destillierten Wasser suspendiert_t daß das Gecamtvoluraen 2000 τύ. beträgt und 25 Mg (besogen auf Troolcerigev?ioht) Ca«(PO^) enthält.

Die wäßrige Löcamg voa ö.D-Dianiiiio-iVöthoxyacrid monohydrat und Urokinase von pH 6,50, die entapreohend obigeia

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Abschnitt (O) erhalten >7urds_r wird sit soviel Caieiimpiioaphatgolf3"aopeision_r die ?<ie oben beschrieben erhalten wurde» behandelt, daß 1 mg_t besogen auf Trockengewicht, Ca_v(P0_Ä)p pro 200 CSA-Einheiton Urokinase vorliegt, Me Düreliselmittsiaenge an gebrauchtem Ca-(PO,)_o beträgt 33 xag (besogen auf Srockengev/icht) pro Liter bis su dieser Strife aufgearbeitetes} Urin. Palis spezielle Verauehsdaten nicht vorliegen,, wird die 50 ag Trockengewicht entsprechende Menge Ca^(PO₄,.)« pro Liter bis zu dieser Verfahrensstufe aufgearbeiteten Urins zugesetzt, um hinreichende Adsorption von Urokinase sicherzustellen. Die Ca_x(POi)₀-GeI-suspension wird au der Urolcinaselösuag schnell unter heftigem Bühron bei 4⁰C oder darunter sugesetst. Me EührgeschTTinsigkeit wird dann sofort vermindert und imter diesen Bedingungen 30 Kinnten gehalten, wonach die Gelfraktion durch Zentrifugieren isoliert wird. Bevor die überstehende Flüssigkeit varvforfea wird, sollte man sich durch eine Probsnestiismung vergö-wissern, daß •weniger als 5 $> der ursprünglichen Urokinasealctivität darin verbleiben. Das Gel, das adsorbierte Urokinase und 6,9-Diaaino-2-äthoxyccriäin-lactat enthält, wird durch gelindes Dispergieren, in 10 Volumen Woaser von 4 ⁰C oder darunter g&waschen. Das Gel wird dann erneut durch Zentrifugieren isoliert und gewogen; die Waschflüssigkeit wird verworfen· Mae Menge von O_r725 s-Ilatriiunphoophatpuffer vom pH 6_t50 + 0,02, dio go^richtsisitßig der Menge Flüssigkeit entspricht, die in dem feuchten Gel eingeschlossen istj wird su dem Gel zugefügt und daa Gemisch wird

109821/151? BADORiGlNAl.

langsam gerührt» um eine gleiolimäSiga !Dispersion des GeXs au erhalten. Sine aliquot© Probe v/ird sur Bestimmung der Wirksamkeit und Pyrogenit&t und sur vorläufigen Untersuchung der Thermostabilität entnommen. Die aliquote Menge Golsuspenaion wird isentrifugiert, bsw. vorsugeneios eingefroren und cli© Suspenaion vor dem Zentrifugieren aufgetaut. Bei Verwendung der uliersteheiiöen Fraktion sollten intravenöse Losen von 200 CIA-Einheiten/lcg bei dieser Verfahrensstufe nur geringfügig pyrogen wirken, ö.h« der jOeraperaturanatiog in Verauchorstten sollte nicht raelir al π 0,6 - 0_F8°C "betragen. Palis dieses Erfordernio nicht erfüllt wirdt kann sur Entfernung der Pyrogene eine Behandlung des Bluats mit Ca^(P0^)p-6el, das mit .6,9-Biamino-2-ätho2yacridin-lactat-monohydrat vorbehandelt ist, durchgeführt Herden. AIo Vorsichtsmaßnahme kann zusätzlich eine vorläufige TTnterBuchung.für öie Stufen (E) und (1) an einer aliquoten Probe durchgeführt werden, und falls dieser Vorverouch. Verluste iVoev 30 $ erkannen läßt, die auf das Srhitsen in Stufe (1?) zurückeufCüireu sind, da in diesem lalle vermutlich atörende Verimreinisimgen In äo-n Präparat vorhanden sind, iat ea era beaten_t die thex'miache Behandlung in Stufe (P) aufsuschieben, bis daa UrolcixiasoprSp&rcit an CarboxyDiethylcelluloae adsorbiert und davon mieder ©luiort ist entsprechend der Verfahreiißstufe, die normalerweise auf dio thermiache Behandlung folgen würde.

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Sie erhaltene Suspension wird nun achnell In einem verschlossenen Gefäß an der Gefäßwand eingefroren und bei -20⁰O oder darunter mindestens 16 Stunden lang gelagert. Die gefrorene Suspension ist unter diesen Bedingungen mehrere Wochen stabil. Darüber hinaus erlaubt dieser Einfrier soha?i;i;t eine ausgezeichnete nachfolgende EIution der Urokinase, die auf andere Weise nioht abglich 1st. Mehrere Gelchargen können bei dieser Verfahrensβtuf© gesammelt werden, um anschließend vor der weiteren Reinigung vereinigt zu werden· .

(B) . EIu ti on der Urokinase

Vorzugsweise sollte diese Verfahrensstufe nur in Angriff genOBiDWη worden, wenn es die Zelt erlaubt, auch die Stufe F ohne Unterbrechung In einem Arbeitegang durchzuführen; bevor begonnen wird, sollten Vorrersuche auoh eine ausreichende Thermo-Stabilität erkennen lassen (vgl. Abschnitt (?))·

Der Puffer, In dem das Oa₅(PO^)₂-GeI, wie oben in Abschnitt (D) boschrieben, eingefroren wurde, dient auch als Elutlonsmittel. Die gefrorene Suspension von Ca₅(PO^)₂-GeI wird vorsichtig und sohnell aufgetaut unter der kloiaotmöglichen Rührlnteneität, die nötig 1st, um eine Temperatur von weniger als 4⁰O aufrecht zu erhalten. Die völlig aufgetaute Suspension wird dann auf einer groben ßlasfritte filtriert. Der Rückstand auf der Nuteoho wird dann unter Verdrängung der eingeschlossenen flüssigkeit gewaschen; als Waschflüssigkeit wird eine Gesamt-

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menge von dem I₉ 5-fachen Rückhaltevoluisien an 0_s3'625 n-ff phosphatpufier von pH 6,50 + 0,02 verwendet. 3)ao mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat enthält im allgemeinen etwa 87 - 97 $ der ursprünglich im Bentoniteluat vorhandenen Urokinase aktivitätj die Eöoung ist gelb gefärbt, waa auf teilweise EIution des adsorbierten 6_f9-Mamino-2-äthoxyacridin-lectat~ffionohyclrata von Ca^(FO^)₂ zurückzuführen ist. Das gelöste 6_Tg-Diafflino-2-äthosyacridin-laotat-monoiiydrat wird anschließend von don vereinigten ürokinaoeoluaten entfernt, indem es durch ein Bett aus einer geeignet ins Gleichgewicht gesetssten Carboxymethylcellulose, V7io im folgenden beschrieben, durchgeochickt wird:

(1) I¹Ur jeden ml au entfärbendes Bltiat werden sunächa-ö

8 mg Oarbozyraothylcelluloae v?ie unten beochriebßn vorbohandelt. Dann wird diese Carboxymethylcellulose gegon 0,3625 m~Katriuniphoaphatpuffer von pH 6,50 £ 0,05 ina Gleichgöwicht gesetat. P Die ina Gleichgev/icht geoetszt© Carboxyiaetiiylcelluloae wird Bit Hilfe von zusätsslichen Mengen Puffer auf eine grobe Gleafritte überführt und der Ifutacheninhalt v?ird durch Schwerkraft abtropfen gelaaoen. Zur Ersielung der beaten Resultate oollto daa Bett aus ina Gleichgewicht gesetzter CorboxymethylcelluloDe ao hoch wie bx-oit sein*

(2) Die vereinigten Urokinaseβluate werden durch diooos Bett aua Carboxymethylcellulose durchlaufen gelaaßsn unter Vermeidung von Kanalbildung und Burohbruch dos 6,9-Diaraino-2~ätho2£y~ acridiii-lactat-monohydrata ·

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(2) EacMea die Urokiiiaselöaung dieses Bett durchlaufen hat₉ vi'ItUl die surücli gehaltene I-ösung durch die minimal nötige Menge an 0₉3S25 la-Hatriunphosphatpuffer von pH 6,50 £ 0_$05 er~ setat· Die Piltrat« worden vereinigt und sofort dor Verfahrensatufe (P) unterworfen»

Herotellung von vorfrehanfiolter OarfeoxyaothylcolJUilpse:

200 g Carboxymethylcellulose ("Cellex-CM Cation Exchange Cellulose" - 3io-Bod üaboratorieaj Kapaaität: 0,4 biß 0,6 iaXq,u. pro (Jraiam) trordea in 4 Liter. 0,29 u-TS&^BSOa euepondiert und 30 Minuten gcriftirt· i)ie CarooxyiaeihyXcelluloae wird durch Sch^or« kraft a'ofiltriert durch eine grotiö (Jlasfritte und ea wird solange durch äaa Bett Wasser geschickt, Mo das filtrat neutral reogievb. Die Garhoxyiaethylcolluloße wird dami in A- liiter 0,145 in-Hs-POi, 30 Minuten cucpendiert und orneut auf einer ölaafritte ge^ascliGöi, bis das Waschwasner neutral reagiert. Falls die Carboxymethylcellulose gelagert werden eoll, wird βJLe in gefrorenem Zustand bei -20⁰C gelagert. Kurs vor Gebrauch wird die Carboxymethylcellulose gegen den geeigneten Puffer, d.h. gegen O_s3625 ei-Hatriumphoaphat in Stufe (E) und gegen 0,0725 m-Hatriumphoöphat-Puffer in den Stufen (G) und (H), ine Gleichgewicht gesetzt. Nach dem ins Gleichgewicht setzen wird die Carboxymethylcellulose in der ainiraaloten Menge Puffer suspendiert_t die nötig ist, um ein leichtes Überführen su ermöglichen. Die Konsentration der Carboxymethylcellulose wird auf der Basis des uroprünglich

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BAD OBlGlNAU

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verwendeten Sroekongewichta berechnet

(P)^rjgtiaxT£ieoh9 Ba&anfllunft ,yon

Diese Verfahrensαtufe *rf.rä durchgeführt, vrenn die Mög~ . liohkeit, irgendwelche pathogene Viren aus dew Urin im Endprodukt zurttckßuhalten, auf ein Minimum verringert werden ο oll.

^ Im allgemeinen tritt bei dieaer Verfahrensstufe ein -Verlust en Urokinasoaktivität von etwa 20 # auf; ee sollte ein Vorveraucla sur Bestimmung des Einflusses der thermischen Behandlung durohgeführt werden, uia im voraus das Auümaß.des Verlusteo in äedesr einzelnen Charge oder einest vereinigten Ansatz zu bestimmen. Der Vorversuch wird entweder mit der aliquoten Mongö durchgö~ fuhrt, die wie in Abschnitt (D) beschrieben, entnoif&aon v;ird, oder mit einem repräsentativen vereinigten Ansäte solcher aliquoter Mengen, έθώά verschiedene Einzeichargon eusamniengegeben werden sollen.

" Die in Verfahrens stufe (B) erhaltene entfärbte Urokinacelööimg wird nun durch Zugabe von festem_t wasserfreiem KaH₉PO₄ auf eine Ehoephatkonzentration von 0,50 Molar eingeoteilt; der pH-Wert wird sorgfältig auf 6,25 +. 0,05 eingestellt! es wird schwach gerührt und Schaumbildung vermieden. Die Lösung wird so schnell wie möglich auf 60° ± 0,5°0 erhitzt und bei dieser Temperatur 10 Stunden belassen; zu keiner Zeit sollte irgendein Seil der Lösung die angegebene Temperatur überschreiten. Während des Erhitsono wird das Rühren der LÖoung durch geeignetes Sin-

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tauchen der Urokinaselo&ung in das Heisbad vermieden. Aliquote Proben werden periodisch sur untersuchung der Urokiüaao-AIrfcivität entnommen. Am Schluß der Erhitsungspsriode wird die lösung in einem Eisbaä unter 5⁰C gekühlt. Lagerung bei O⁰C über ITaeht ist dann ausreichend· Die geringe Menge koaguliertes Protein» das sich während der thermischen Behandlung dea urokinasepräparats gebildet hat, wird, nachdem das Präparat abgekühlt mirde, durch Filtration durch eine mittlere Glasfritte mit Hilfe von Diatoaeenerde (Super CeI - Johno-Hanville) entfernt; für die aua 1600 Ltr. Urin gewonnene Menge Urokinase aollton nicht mehr als 1,0 g Diatomeenerde notwendig Bein. Das Viltrat wird in einem Eiabad gesammelt.

(G) Adsorption von Urokinase an Carboxymethylcellulose und Blution von diesem Material

Wegen der starken Adsorption von Urokinase an Glas ist es wünschenswert, Polyäthylengefäfte oder ähnliches nicht*» adsorbierendes Material au verwenden, um urokinaselösungen zu erhalten, wenn die Phosphatkonzentrationen unter 0,29 Molar bei den nachfolgenden Aufarbeitungeschritten liegen·

Das am Schluß der Stufe (1?) erhaltene PiItrat wird mit 6 Volumen kaltem Wasser von weniger als 4⁰C verdünnt und vorsichtig auf einen pH-Wert von 6,00 £ 0,05 mit kaltem 0,0725 m-HjPO^ titriert; lokaler Säureüberschuß und jedes unnötige Bühren sind zu vermeiden; der Rührer sollte aus Polyäthylen oder einem

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ähnlichen Material besteben. Zu dor Lösung wird unter Rühren die unten angeg ebene Menge an Carboxymethylcellulose augos et st, die zunächst wie in Stufe (E) angegeben vorbehandelt wurde und dann mit 0,0725 m-Hatriumphosphatpuffer von pH 6,00 + 0,05 ina Gleichgewicht gesetzt wurde; die Menge der zu diesem Zeitpunkt zugegebenen Carboxymethylcellulose beträgt 1,0 mg (bezogen auf Trockengewicht) für jeweils 600 CTA-Einhei ten Urokinase; ungefähr 10 g Carboxymethylcellulose werden für die aus 1600 Litern Urin gewonnene Urokinase erforderlich sein· In einem Eisbad wird ungefähr eine Stunde langsam gerührt. Nach den ersten 15 Hinuten Rühren wird ein aliquoter Seil für eine Schnellbeatiomung der restlichen Aktivität in der überstehenden, nach dem Zentrifugieren erhaltenen Flüssigkeit entnommen; wenn der Versuch ergibt» daß mehr als 7 $ der Gesamtaktivität nicht adsorbiert wurden, wird die berechnete susätsliohe Menge an vorbehandelter, ina Gleichgewicht gesetster Carboxymethylcellulose der Hauptzaenge an Suspension unter Rühren zugesetzt, die notwendig ist, um 93 % oder mehr Adsorption zu erzielen; die Gesamtmenge an verwendeter Carboxymethylcellulose sollte 1 rag (bezogen auf Trockengewicht) für jeweils 000 CTA-Binhelten Urokinase nicht überschreiten· 30 bis 60 Minuten nach, der letzten Zugabe von Carboxymethylcellulose wird die Suspension durch Schwerkraft filtriert durch eine grob9 Glasf ritte; das Bett aus Carboxymethylcellulose wird auf dem Filter wieder~ holt mit einer Gesamtmenge von 10 Volumen unter 4°C kaltem

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O_f0725 m-JTatriumphoaphatpuffer von pH 6,00 _+ 0,05 gewaaohsn; Kanalbildung ist au vermeiden. Hach dem letzten Waschen wird achtfach abgesaugt, um einen festen aber feuchten filterkuchen su erzielen. Der filterkuchen TrtLrd quantitativ in Qin austariertes Gefäß tiberführt und sein Gewicht bestimmt; nach der Subatraktion deo Trockengewichts an vorhandener öarboxymethylcellulose im Kuchen läßt eich daa Gewicht an eingeschlossener Flüssigkeit berechnen. Sine Menge an unter 4°C kalten 0,51 E-Katriumphosphatpuffer von pH 6,50 +, 0,05, die dem Gewicht der eingeschlossenen Flüssigkeit entspricht, wird nun zugegeben. Zu dieser Suspension wird dann ein oolchea Volumen an kaltem, 0,29 m-Hatriuiaphoaphatpuffer von pH 6,50 + O₁.05 zugesetzt„ daß die Suspension achätssungQTreicie 40.000 - 50.000 CTA-Einheiten/ml enthält· Die Suapenoion wird eine Stunde bei 0 - 4⁰C gerührt und dann durch eine Bittiere Glaafritte filtriert. Daa im filterkuchen eingeachloeeene Eluat wird oorgfältig durch taschen iait einein minima3.en Volucen an kaltem 0,29 m-Hatriiunphoaphatpuffer von pH 6,50 + 0,05 eroetzt. Die TTroklnaoealctivitSt in vereinigtem Eluat und Waschflüssigkeit beträgt im allgemeinen 20.000 - 25.000 CXA-Binheiten/ml und e:atapricht im allgemeinen einer Ausbeute von Θ5 - 90 f> der Aktivität, die zu Beginn dieser Verfahronsetufe vorlag» Aliquote Mengen des vereinigten Eluats mit der Waschflüsoigkeit werden entnommen und zur Bestimmung von spezifischer Aktivität, Pyrogonität und Throxaboplastingohalt verwendet· Die Hauptmonge wird an

_badobiqinau

schnell
öor Gefäßwand/eingefroren, z.B. in einom Troclceneisbad, und bei -20⁰C oder darunter in Abhängigkeit vom Ergebnis der Versuche gelagert.

(H) Per freien Wahl uherlaaoen? Zweite Adsorption von Urofcmaöo sel Carboxyiaethylcellulooe und Elation von die gem Material..

Diese Verfahrenootufe wird in allgemeinen nur denn durchgeführt, wenn weitere Reinigung des Uroklnasepräparato am Ende der Stufe (G) gewünscht wird. Technik und Arbeitsweise dieser Verfahrensstufe ähneln der unmittelbar vorausgehenden. Bio can Schluß der Stufe (β) erhaltene gefrorene Lösung wird voi'sichtig und so schnell wie möglich unter minimalem Rühren aufgetaut, ohne j ο do ch die örtliche Temperatur yotl aufgetauten Teilen auf über 4°C ansteigen zu lassen. Die Lösung wird ia einem Polyäthylengefäß mit 3,00 Vlumen kaltem Wasser verdünnt, um die Phosphatkonssentration auf 0,0725 Molar zu erniedrigen; der ρΠ-Wert wird dann auf 6,00 + 0,05 durch Zugabe von 0,725 m-H^PO^ vermindert. Unter leichtem Rühren werden 1,0 sag (bezogen auf Trockengewicht) CarboxyiaotliylcelluloEtG, die vorher, Trio in Stufe (E) beschrieben, vorbehandelt und anschließend gegen 0,0725 m-Natriiuaphosphatpuffer von pH 6,00 ♦ 0,05 ins Gleichgewicht gesetzt worden war, für jeweils 1.000 CTA-Einheiten vorhandener Urokinase zugegeben» Sach 30 Minuten schwachem Rühren wird die Suspension filtriert und der Filterkuchen wie in Abschnitt (G) beschrieben gewaschen· Der feste, aber feuchte

BAD

!Filterkuchen wird gewogen und das Gericht der eingeschlossenen Flüssigkeit berechnet; es wird eine solche Geftichteiaenge an kaltem 0,51 m-lSiatriuiaphosphat von pH 6,80 £ 0,02 zugegeben, die dein (rOEFicht der eingeschlossenen Pitts si&keit entspricht. Die Suspension wird dann mit einem solchen Volumen unter 4⁰O kaltem

pH
ftatriwuphoaphatpuff&r von/6,80 £ O₉02 veraetat, das ausreicht, um eine Suspension bu ergeben, die sch&tzungoireiee 60.000 CTA-Einheiten/zal enthält» Die Suspension wird von Zeit ssu Zeit bsi 0 - 4⁰C eine Stunde gerührt und darin durch eine mittlere Glas«· fritte rait Hilfe von leichtem Saugen filtriert. Bar Filterkuchen wird alt der minimalsten Menge kalten 0,29 &~3?atriLmphoophatpuffer vom pH 6,80 + 0,02 gewaschen, die erforderlich ist, um das eingeschlossene Eluac zu ereetsen. Voreinigtoa Eluat und Waschflüssigkeit sollten etwa 50.000 CSA-I3inheiten TTrokinase/ial entsprechend einer Ausbeute von mehr als 90 £ der zu Beginn άοτ Verfahrens ßtufe vorhandenen Urokinaseaktivität enthalten. Ea werden wiederum aliquote Teile für die erforderlichen Bestimmungen entnommen. Die Hauptmenge ?7ird dann an der Gefäßwand eingefroren und bei -20⁰C oder weniger in Abhängigkeit vom Yerauchsexgibnis der aliquoten Proben gelagert.

(I) Sterile Filtration

Die am Schluß des Abschnitte (G) oder (H) erhaltene gefrorene Lösung Tiird wie oben in Abschnitt (H) beschrieben auf-

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-getaut. Der pH-Wert des Produktes am Schlüsse &qv Stufe (G) beträgt 6,50, während der pH-Wert am Ende der Stufe (H) 6,60 beträgt* Der pH-Wert sollte erforderlichenfalls vorsichtig auf 6,80 mit Hilfe von kalter n-KaOH eingestellt werden· Bine aliquote Menge von aufgetauter I'ösung wird zur Bestimmung des Uro~ kinasegehalts entnommen· Die Hauptmonge wird dann aseptisch durch das kleinste Seitz-SK-Filter, das eine brauchbare Flltrationsgeschwlndigkeit ergibt, filtriert; ein Pilter von 5 osi Durehmesser genügt für 300 ml Löoiuig. Das Aufnahaegefäß für das Eiltrat sollte in ein Eiabad gestellt werden. Fallο sich eine Klärung vor der Durchführung dieser Filtration al ο notwendig erweist, kann diese Klärung durch hochtouriges Zentrifugloren in einer Kühlsentrifuge oder durch Filtration durch ein Seita-K-5-SHter mit dem kleinsten Durchmesser bevrirkt werden·

f.Ή Abfüllung, Gefriertroclraung und lagerung

Das Abfüllen in entsprechende Glasflaschen hängt von den Versuchsergebnissen ab, die mit den aliquoten Proben, die in Abschnitt (I) entnommen wurden, erhalten werden; ein Verlust von 5 i> wird während der nachfolgenden Mltrations- und Gefriertrocknung α operationen in Kauf genommen· Die Gefriertrocknung wird unter aseptischen Bedingungen in Standardgeräten mit den folgenden K oiifikationen der Standardausführung durchgeführt ϊ Das Einfrieren der gefüllten Gefäße wird so schnell durchgeführt, wie es die Kapazität der Apparatur erlaubt; die Kapazität der Gefäße

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beträgt das zehn- bis fünfzehnfache des Volumens an eingefüllter Flüssigkeit; v/egen der vorhandenen Phosphate beträgt der Feuchtigkeitsgehalt der lyophilisierten Gefäße 3 - 5 i»\ intensivere Dehydration sollte vermieden werden. Abgedichtete, fertiggestellte Flaaohen werden unterhalb der Gefriartemperatur gelagert#

Die folgende Tabelle faßt die Ausbeuteangaben und die Angaben für die spezifische Aktivität der Urokinase, die entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren in 58 Versuchsan&ätzen gewonnen wurde, zusammen.

Durchschnitt- Durchschnittliche CTA-Ein- liehe apezifiheiten Uroki- sehe Urokinasenase,die pro Aktivität Liter Urin ge- (CTA-Einheiten Verfahrensstufe wonnen wurde /mg Protein)

Vereinigte Urinchargen	6,850	34
Bentonit-Eluat	6,600	schwer bestimmbar
(E) entfärbtes Ca,(PO^^-Eluat	6,300	6,000 - 8,000
(F) erhitzte Lösung	4,700
(Q) Carboxymethylcellulose- Eluat	4,000	30,000 -35,000
(H) zweites Carboxymethyl- cellulose-Sluat	3,600	50,000 -55,000

Urinproben und Bentoniteluate wurden im allgemeinen mit dem Pibrinplattentost untersucht· Die restlichen vier Proben wurden nach einer reproduzierbaren Methode, die sioh vom Test

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nach Fletcher für Plasmin ableitet, untersucht« Es ist selbstverständlich schwierig, genaue Verauohsergebniöse für Urinproben au erhalten» wegen der wechselnden Mengen an vorhandenen Urokinaao-Inhibitoren, Salzen, protoolytieohen Ensymen und anderen Paktoren, die dio Veraucheergebniose beeinflussen. '

Beispiel 2

A. 535 Mter normaler mensohlicher Urin von Männern, der im Laufe des vorangehenden Tages ge sau molt und unter Kühlung auf etwa 4⁰C in der Zwischenzeit gelagert wurde, wurde auf eine Temperatur zwischen 0° und 2⁰C in einem Kessel aus rostfreiem Stahl gekühlt und der pH-Wert des Urins wurde auf 5,0 £ 0,05 duroh Zugabe von Eisessig eingestellt. JDae Rühren des Urins in der Kälte wurde ©ine Stunde fortgesetst» wobei sich ein liiederschlag bildete. Dieser Niederschlag mtrde durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 1500 g und O⁰C isoliert. Auf diese Weise wurden 500 ml feuchter Niederschlag gesammelt, der hauptsächlich aus Harnsäuresaleen, Harnsäure und Muooproteinen bestand, die im wesentlichen die gesamte im Urin vorhandene und als Auogangsmaterial verwendete Urokinase in adsorbierter oder anderweitig gebundener Form enthielten« Her beim Zentrifugieren erhaltene Überstand wurde verworfen. Die 500 ml feuchter Hiedersohlag, die als Fraktion A bezeichnet vrurden, wurden eingefroren und im gefroreren Zustand bin zur weiteren Verarbeitung gelagert.

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Die vorstehende Arbeitsweise wurde zweimal mit je zwei weiteren 535 Liter Chargen normalem menschlichen Urin von Mnnorn wiederholt_t sodaß auf diese Weise die gefrorenen Mieder aohläge von insgesamt etwa 1600 Litern normalem menschlichen Urin von Miinnern erhalten wurden, die, wie durch Versuche bestimmt wurde, 10.900.000 CEA-Einheiten Urokinase enthielten.

B. Der gefrorene Niederschlag (Fraktion A), der, wie im obigen Abschnitt A beschrieben erhalten wurde, wurde vereinigt und aufgetaut und dann durch Anteigen mit 80 Idter kaltem Wasser gewaschen. Der pH-Wert der erhaltenen Suspension mirde auf 3,8 durch Zugabe voniy&Salzaäure eingestellt und die Suspension wurde gekühlt und 15 Minuten gerührt. Dann mirde die Suspension zentrifugiert· Der überstand wurde verworfen und der Rückstand wurde durch Anteigen mit einer zweiten 80 Idter-Portion kaltem Wasser und Zentrifugieren der erhaltenen Suspensio2i bei pH 3,8 gewaschen und der Überstand wurde verworfen* Urokinase wurde aus dem gewaschenen niederschlag folgendermaßen eluiert! Der Niederschlag imrde mit 12 Liter Wasser bei 20⁰C angeteigt und der pH-Wert der entstandenen Suspension wurde . durch Zugabe von η-Salzsäure auf 2,0 eingestellt· Zu dieser Suspension wurden 4000 ml einer 1 #igen wäßrigen Lösung von 6,9-Diajmino~2»ätho:xyaoridin-laotat-monohydrat zugegeben, das vorher auf pH 2,0 durch Zugabe von η-Salzsäure eingestellt und auf 20⁰C gekühlt «orden war. Elution der Urokinase wurde be-

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wirkt, indem das Gemisch 30 Minuten gerührt wurde, wobei die Temperatur bei 20°0 £ 2°C und der pH bei 2,0 gehalten mirde. Gemisch wurde dann bei 1500 g ungefähr eine halbe Stunde

bei O - 4⁰O zentrifugiert. Der entstandene Niederschlag vrurde verworfen und der Überstand, der die Urokinase enthielt, wurde auf 0 - 4°O gekühlt. Es wurde soviel Natriumchlorid (80 g) zugesetzt, um eine Konzentration von 0,5 5^ (G/7) zu erzielen und der pH-Wert wurde durch Zugabe γοη n-ITatriumhydroxydlöoung auf 6,5 + 0,05 eingestellt. Dann wurden 2,3 Volumen wasserfreier Äthylalkohol (oder wahlweise 2,9 Volumen 95 $igor Äthylalkohol) zugesetzt, der vorher auf -35⁰O gekühlt worden war, das erhaltene Gemisch wurde nötigenfalls gekühlt, um die temperatur nicht über 4^O|3 ansteigen au lassen. 15 Minuten nach Zugabe des Äthylalkohols wurde der gebildete Niederschlag gesammelt, indem 20 Minuten bei 1500 g und O⁰O zentrifugiert wurde. Dieser Niederschlag wurde homogenisiert in einem gleichen Volumen kaltem Wasser zwischen 0 und 4⁰C und dann wurde das Gemisch mit kaltem Wasser auf. ein Gesamtvolumen von 12 Mtern verdünnt. Durch dieses Verdünnen wurde sichtlich der gesamte niederschlag gelöst. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung, der ungefähr 7,0 betrug, wurde durch Zugabe von η-Salzsäure unter Rühren in einem Eiebad auf 5,00 £ 0,02 eingestellt.(In einigen fällen erwies es sich als vorteilhaft, den pH-Wert ßuorst auf 4,2 - 4»5 und dann erst auf 5,00 + 0,02 einzustellen, um optimale Ausbeuten an der urokinae ehalt igen Fraktion zu erhalten.) Räch

1 0 9 8 2 1 / 1 B 1 ? ⁶AD Original

- 55 -

30-mintitigem Rühren des Gemisches wurde der gebildete Nieder-

Zentrifugieren schlag durch 10-mintttigGa / . bei 1500 g und 0 0 gesammelt.

Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Der gesaamolte Niederschlag, der alo Fraktion B bezeichnet wurde, enthielt ungefähr 85 $> der in der obigen Fraktion A vorhandenen Urokinase-Aktivität. Fraktion B wurde eingefroren und bei -2O⁰C aufbewahrt, bis mit der nächsten Verfahrensatufe C begonnen wurde.

In jedem der folgenden Vorfahrenaschritte wurdennur pyrogenfreie Geräte und Reagentien, einschließlich Wasser, die mit den urokinas ehalt igen Fraktionen in Berührung kommen, verwendet.

C. Der im obigen Abschnitt B erhaltene gefrorene Hiederschlag (Fraktion B) wurde aufgetaut und dann in 12 liter kaltem Wasser durch Zugabe von η-Salzsäure gelöst, bis der pH-Wert der Lösung 3,0 betrug, wobei während dieser Zugabe gerührt und in einem Eisbade gekühlt wurde· Nochmaliges Ausfällen der urokinaoehaltigen Fraktion wurde dann durch Zugabe von n-Natriumhydroxydlösung, bis der pH-Wert 5,00 ± 0,02 betrug, bewirkt. Die erhaltene Suspension wurde 10 Minuten bei 1500 g und 0°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. In gleicher Weise wurde nooh drei oder mehrmals der Niederschlag durch Zugabe von Salzsäure gelöst, durch Zugabe von Natriumhydroxydlöaung erneut ausgefällt und durch Zentrifugieren gesammelt, wobei der Über* stand jeweils verworfen wurde. Der auf diese Weise schließlich

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— 3ο —

erhaltene Niederschlag wurde alo Fraktion C bezeichnet. Bis ziuB Gebrauch in der nächsten Verfahrensstufe D wurde die Fraktion O in gefrorenem Zustand aufbewahrt·

D. Der im obigen Abschnitt O beschriebener gefrorene Niederschlag (Fraktion C) wurde aufgetaut und dann homogenisiert in 6 Id tern einer 0,25 $igen w&Srigen Lösung von 6,9-Diarairc«· 2-iithoxyaoridin-lactat-monohydrat, aas auf pH 5,00 + 0,02 durch Zugabo von n-Phoßphorsäure eingestellt worden war, und das entstandene Gemisch wurde 30 Minuten bei ungefähr 25 + 5°C gerührt« Der Niederschlag wurde durch 30 minütlges Zentrifugieren bei 1500 g und O⁰C isoliert und verworfen· Der Überstand, der etwa 95 # der in obiger Fraktion C vorhandenen Urokinase-Aktivität aufwies, wurde auf eine Konzentration von etwa 7000 Einheiten Urokinase pro ml durch Zugabe von 7 Litern einer 0,25 $ igen wäßrigen Lösung von 6,9-Dia2aino-2-äthoxyaoridin-iactatmonohydrat, die auf pH 5,00 £ 0,02 durch Zugabe von n-Hiosphorsäure eingestellt worden war, verdünnt. Ein Caloiumphoaphatgel wurde folgendermaßen hergestellt: 535 g Calciumchlorid wurden in 35 Litern Wasser gelöst und diese Lösung wurde bu einer Lösung aus 1225 g ITa^PO* · 12H₂O in 35 Litern Wasser zugesetst; das entstandene Gemisch wurde 30 Hinuten in einem Bisbad gerührt und das gebildete Gel durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 1500 β und O⁰C gesammelt; das auf diese Weise gesammelte Gel,

das ein Volumen von etwa 15 Litern hatte, wurde in 4-0 Litern

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0,0725 H-SaHgPO^ suspendiert, die Suspension wurde 30 Minuten gerührt und das Gel wurde erneut durch Zentrifugieren gesammelt j dann wurde das Gel mit zweimal 40 Idtern Wasser gewä sollen und in ausreichend Wasser suspendiert, um ein Gesamtvolumen von 20 Litern mit einem Gehalt von 25 g Ca-(PO^)₂ pro Liter au ergeben» Die auf diese Weise hergestellte Gelsuapension wurde unter Rühren zu dem urokinasehaltigen Präparat in einem Verhältnis von einem Volumen Suspension auf sieben Volumen Urokinasepräparat zugesetzt, «ras einem Verhältnis von etwa 1 mg Ca^(PO*)g pro 2000 Einheiten Urokinase entspricht, nachdem dieses Gemisch 30 Minuten gerührt worden war, wurde das erhaltene Gel durch Zentrifugieren isoliert und mit 10 Volumen Wasser gewaschen. Das so gesammelte Gel mirde gewogen und mit einem gleichen Ge» wicht an 0,58 m-Ifetriumphosphatlösung (pH 6,5 ± 0,02) versetzt und dann mirde 0,29 ra-ITatriumphosphatlösung zugegeben, um eine homogene Suspension, die ungefähr 50.000 Einheiten Urokinase pro ml enthielt, zu erzielen. Diese Suspension wurde an der Gefäßwand eingefroren und bei. -20⁰G über Nacht aufbewahrt. Die Suspension wurde dann aufgetaut und 30 Minuten bei 1500 g 'and O⁰C zentrifugiert! der Überstand wurde gesammelt und zurückbehalten. Der Niederschlag wurde zweimal mit einem gleichen Volumen kalter 0,29 m-liaHgPO^-IiöBung (pH 6,5) gewaschen· Der Überstand und die Waschflüssigkeiton, die wegen der Anwesenheit einer geringen Hengo 6,9~Mamino»2~äthqxyaorldi& gelb waren, wurden vereinigt; diese Lösung enthielt ungefähr 90 i» der in der obigen Fraktion C vorhandenen Urokinase-

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aktivität· (In einigen Yersuohsansätzen lag die Ausbeute im Bereich von 87 Mb 97 5»). Die gelbe Plüsaigkeit wurde entfärbt* indem daa 6,9~Maxaino-2-ätnoxyacridin daraus entfernt Ynirde, indem sie durch, ein Bett einer ins Gleichgewicht gesetzten Carboxymethylcellulose geaohickt wurde, die folgendermaßen hergestellt mirdes 2000 g Oarboxymethylcellulose-Ionenaustauacher (Auatauscherkapazitäti 0,4 bia 0,9 Milliäquivalent pro g) wurden in 40 Litern Q₇29 m-l^HPO^-Löaung suspendiert und die erhaltene Lösung mirde 30 Minuten gerührt. Die Suspension wurde durch Schwerkraft durch eine grobe Glasfritte filtriert und durch die auf diese Weise gesammelte Feataubatanz wurde Wasser laufen gelassen, bis das Piltrat neutral reagierte. Die Postaubstanz wurde in 40 Litern 0,145 m-HjPO* 30 Minuten suspendiert und die Suspension wurde erneut durch eine grobe Glasfritte filtriert und die Carboxymethylcellulose wurde mit Wasser gewaschen, bis das Waschfässer neutral war. (Palls die Carboxymethylcellulose gelagert werden soll, wird sie in dieser Verfahrenaatufe eingefroren und in gefrorenem Zustand bei -20⁰O aufbewahrt)· Diese vorbehandelte Carboxymethylcellulose wurde in einer Menge von 8 mg/wl der wie oben beschrieben vereinigten gelben Flüssigkeit gegen 0,29 m-ITatriumphosphatliSsung (pH 6,5) ins Gleichgewicht gesetzt und die so erhaltene im Gleichgewicht befindliche Carboxymethylcellulose wurde mit Hilfe von zusätzlicher 0,29 m-Natriumphoaphatlösung (pH 6,5) auf eine grobe Glasfritte überführt· Das nasso Bett

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aus CarboxymethylcollulosG wurde durch Schwerkraft abtropfen gelaasen. Dao Bett war ungefähr 1 Zoll hoch und et??a 2 Zoll breit· Die gelbe, urokinasehaltlge Plüssigkeit wurde durch das Carboxyraathylöellulosebett filtriert und danach mirde 0,29 m-HatriuEiphoaphatlöaung (pH 6,5) durchlaufen gelassen, un das Bett 2u "waschen. Dao so erhaltene Filtrat, das ale JPraktion D I)O se lohnet wurde, war im wesentlichen farblos und frei von 6,9-Diamino-2-äthoxyaoridin· Diese Fraktion Tmrde nach dem unten aufgeführten nächsten Verfahrenssohritt E unverzüglich weiter verarbeitet.

E. Die 'eiüäß dem obigen Abschnitt D erhaltene Fraktion D TTurde mit 3 Volumen Wasser von 0 - 4⁰O verdünnt» wobei die EhoaphaiJfeonsentration auf 0,0725 Molar verringert mirde, und die verdünnte Lösung wurde mit 0,0725 ra-H^PO^ auf pH 6,0 £ 0»°5 titriert. Vorbehandelte Carboxymethylcellulose, die wie in Abschnitt D beschrieben erhalten wurde, vfurde gegen 0,0725 m- ■ Natriumphosphatpuffer von pH 6,0 + 0,05 ins Gleichgewicht ge~ setsst und zu der urokinasehaltigen Xtöaung in einer Menge von 1 mg (bezogen auf Trockengewicht) Carboxymethylcellulose pro 800 CIA-Einheiten Urokinase zugegeben. ITach 15-al nut igen Rühren., des Gemisches mirde eine geringe aliquote Menge entnommen und zentrifugiert und die noch im Überstand befindliche Urokinaseaktivität vmrde durch eine Schnellmethode bestimmt, vroboi gefunden mirde, daß sie ungefähr 5 $> der in Fraktion B befindlichen Menge betrug. (Wenn diese Untersuchung einen Wert von

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mehr öl a 5 % erkennen ließ, wurde auf alle Fälle eine susäteliohQ Menge von im Gleichgewicht befindlicher Carboxymethylcellulose EU der Hauptmsagö an Suspension zugesetzt; die Gesaiatmeiige on Carboxymethylcellulose» bezogen auf 3?roekengevd.clit, überstieg jedoch in keinem Pail 1 mg pro 500 CTA-Einheiten Urokinase). Die Eauptmenge Suopenaion wurde dann durch Schwerkraft durch oine grobe Glaafritte filtriert» Der öo gewonnene ETiederschlag mirde auf dem Filter mit insgesamt 10 Volumen kalter 0,0725 m-Isatriumphosphatloaung (pH 6_t0 ± 0,05) gewaschen und bei der Filtration wurde schwach abgesaugt, bin ein fester feuchter Kuchen erhalten wurde. Der feuchte Filterkuchen wurde gewogen und daß Volumen der im Kuohen eingeschlossenen Flüssigkeit mirde au 6,5 ral berechnet. Der feuchte Kuchen wurde dann in 6,5 ml kalter 0,51 ra-lfatriumphosphatlöaung (pH 6,00 + 0,05) auspendiert und ein ausreichendem Volumen (70 al) kalter 0,29 m-ITatriumphosphatlösung (pH 6,00 + 0,05) vmrde zugesetzt, um eine Suspension mit annähernd 50*000 CiPA-Einheiten Urokinase pro ml su erhalten. Die erhaltene Suopension wurde eine Stunde bei O⁰C gerührt und dann durch eine mittlere Glasfritte filtriert. Das im Filterkuchen eingeschlossene Sluat wurde durch Waschen mit 100 ml kalter 0,29 m-Natriuisphosphatlösung (pH 6,00 + 0,05) verdrängt. Das 331uat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und als Fraktion E bezeichnet; diese Fraktior hi.tte ein Volumen von 230 ml und ent-, hielt 37.000 CTA-Einheiten Urokinase pro nl. Die Urokinase-

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aktivität in Fraktion E betrug 85 # der in Fraktion S vorhandenen· Fraktion E wurde eingefroren und bei -20⁰C bis but weiteren Verarbeitung aufbewahrt.

F. um evtl. vorhandene Viren, z.B. Hepatitis virus, su inaktivieren, wurde Fraktion E folgendermaßen behandelt: Sie Fraktion wurde aufgetaut und die vorhandene Phosphatkonzentration γοη 0,29-Molar durch Zugabe von Ha₂HPOj auf 0,50-Mo.lar erhöht· Sie so erhaltene Lösung, die einen pH-Wert von 6,8 aufwies, wurde auf 60,0 ± 0,5⁰C 10 Stunden erwärmt. Sie durch dieses Behandlungsverfahren erhaltene Lösung wurde als Fraktion F bezeichnet; sie besaß 70 $> der in Fraktion E . vorhandenen ürokinaseaktivität. Fraktion F wurde in einem Eisbad gekühlt und Über ftacht bei O⁰C aufbewahrt. .

G. Fraktion F wurde mit kaltem destilliertem Wasser verdünnt, um die Phosphatkonzentration von 0,50-Molar, auf 0,0725-Molar zu erniedrigen und der pH-Wert der verdünnten Lösung wurde auf 6,00 + 0,05 durch Zugabe von 0,0725 m-H^PO^ vermindert. Sie erhaltene Lösung wurde in einem Eisbad gerührt und dann wurde im Gleichgewicht befindliche Carboxymethylcellulose zugesetzt, die dadurch hergestellt worden war, daß vorbehandelte Carboxymethylcellulose, die gemäß dem in Absohnitt S beschriebenen Vorfahren erhalten wurde, gegen 0,0725 Bi-Katriumphosphat-, lösung von pH 6,00 +, 0,05 ins Gleichgewicht gesetzt wurde, wo bei die Zugabe in einer Menge von 1,0 g (bezogen auf Trooken-

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gewicht) pro 1.000.000 in der Iiöouag befindlicher CIA-Einheiten Urokinase erfolgte. Hackdem das Gemisch 30 Minuten gerührt worden war, wurde es filtriert und in der in Stufe E beschriebenen Weise gewaschen. Dor erhaltene feuchte Kuchen wurde gewogen und das Volumen der im Kuchen eingeschlossenen Flüssigkeit wurde zu 33 ml berechnet. Der feuchte Kuchen wurde dann in 33 ml kalter 0,51 a-Natriumphoaphatlösung (pH 6,80 + 0>02) suspendiert und ein ausreichendes Volumen (20 ml) kalter, 0,29 m~ tfatriumphoaphatlösung (pH 6,80 + 0,02) wurde zugegeben, um eino Suspension mit ungefähr 60.000 CTA-Einheiten Urokinase pro ml zu erhalten. Diese Suspension wurde mit Unterbrechungen eine Stunde bei O⁰C gerührt und dann duroh eino mittlere ßlasfritte filtriert« Das im Filterkuchen eingeschlossene Eluat wurde durch Waschen mit 40 ml einer kalten 0,29 M-Natriuiaphoaphatlöaung (pH 6,80 £ 0,02) verdrängt. Das Eluat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und als Fraktion G bezeichnet» Diese Fraktion hatte ein Volumen von 110 ml und enthielt 49*000 CIA-Einheiten Urokinase pro ml. Die Urokinase-Aktivität in Fraktion Q betrug 91 $t der in Fraktion F vorhandenen Aktivität. Fraktion Q wurde eingefroren und bei -20⁰C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt«

H. Fraktion G wurde aufgetaut und dann zur Sterilisation aseptisch duroh ein Seitz-EK-Filter filtriert· Die sterile Lösung wurde gefriergetrocknet·

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Sie in den obigen Abschnitten A bis H und in Beispiel 1 beschriebene lOlge von VerfahrenoBtufen wurde wiederholt mit der Ausnahme,, daß Stufe F, also die thermische Behandlung, weggelassen wurde. Unter leiohtem Rühren wurden zwei Volumen auf O - 4⁰C gekühlter, gesättigter Aramoniuaisulfatlösung au

aa Ende der Stufe H erhaltenen Eluat zugesetzt. Das Gemisch, wurde eins Stunde in der Kälte stehen gelassen und die ausgefallene Urokinasefraktion wurde durch hoohtourige Zeatrifugation in einer Kühlzentrifuge (19*000 UpM 20 Hinuten in einer Servall-Zontrifugo) isoliert. Die überstehende PlÜBDigkeit wurde dekantiert und verworfen. Der llioderechlag wurde · in 0,29 m-Natriumphosphatpuffer vom pH 6,5 diapergiert, um eine Konzentration von 3 x 10 CIA-Einheiten pro ml bu erhalten. Das Gemiach wurde bei 0 - 4⁰C gegen Mufig gewechseltes destilliertes Wasser in einer wirksamen Dialyoiorvorrichtuug dialyalort, bia der spezifische Widerstand der UrokinasslUBung auf 2.500 0hm anstieg. Sobald die Leitfähigkeit durch die Dialyse bis auf den obigen Wert reduziert \rar, war in der Suspension ein in «resentliohen inerter und üblicherweise kristalliner Niederschlag vorhanden und der pH-Wert betrug 6,6. Diese Suspension vrarde zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Unter schwachem, jedoch wirkungsvollem Rühren wurde der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit mit 0,1 n-ffaOH von 0° - 4°0 auf 7,00 eingestellt und das Präparat wurde beobachtet, ob nach

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15 Miauten erneut Niederschlagsbildung auftrat. Die Lösung wurde nötigenfalls durch Zentrifugieren geklärt» Die Ausbeute an Urokinaee-Aktivität betrug 85 - 90 55 der in Stufe H vorhandenen Aktivität« Zu je 10 mi klarer Urokinaeelösung wurden 0,2 g festes Natriumchlorid zugegeben und der pH-Wert der Löaung mrde sorgfältig mit 0,1 n-H01 auf 5,30 £ 0,05 eingeotollt. Die lösung wurde mit festem Natriumchlorid gesättigt und die entstandene Suspension wurde bei 0 - 4⁰C über Macht aufbewahrt· Die auf diese Weise ausgefällte Urokinase wurde durch Zentrifugieren isoliert. Die durchschnittliche Ausbeute an XTjJOkinase-Aktivität betrug bei diesem Verfahrensschritt 83#. Der tJrokinaaoniederechlag wurde in 10 #iger wäßriger liatrium-.chloridlöoung von 4-⁰O gelöst, um eine lösung nlt ungefähr 150.000 CTA-Einheiten pro ml zu erhalten; der pEMffort der Lösung wurde, auf 5,00 +, 0,05 eingestellt« Έθ wurde soviel festes Natriumchlorid zugesetzt, um halbe Sättigung an Natriumchlorid au ersielen und die lösung wurde zur Entfernung von unlb'slichora Material zentrifugiert. Dann mirde die TJrokinaselösurtg bei A⁰C mit zusätzlichem festen Natriumchlorid versetzt, bis die Lösung ©in echvraeh-trübes Aussehen zeigte? mit anderen Worten, bei schwachem Rühren wurde ein "seidenartiger* Schimmer sichtbar. Die NatriumchlOiridkonzentration wurde dann nach und nach innerhalb von mehreren Tagen erhöht, bis 98 &Lge Sättigung erreicht war·

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Bio sich au© der Söaung aufgrund der obigen Verfahrensweise abscheidenden Urokinaaekriotalle waren farblose, dünne Pl&ttchen von ungewöhnlicher Brüehigkeit und Sprödigkeitj uiitei· dom Mikroskop wurden sie bei Anwendung von nur mäßigem Druck auf das Deckgläsehen leicht in Bruchstücke verbrochen·

Wenn das obige einmal kristallisierte Präparat noch ". · zweimal us^riatalliaiert wurde, erreichte die spezifische Urokinase-Aktivität einen konstanten Maximalwert (in weiteren Versuchsansätzen wurde gefunden, daß zwei- oder dreimaliges Umkristallisieren im allgemeinen für diesen Zweck ausreichend war). Bin mittlerer Auabeuteverlust von 12 $> der gesamten ITrokinase-Aktivität wurde bei jeder TTmkristallisation gefunden· Die maximale apesiflache Aktivität, die mit federn von drei Kristallcliargen erreicht wurde, betrug 652*000 ^ 29.Ö0O (s.d.) CIA-Einheiten pro mg Stickstoff (Kjeldahl), oder 104*000 ± 4*800 (s.d.) CTA-Einhoiten pro mg geschätztes Protein. (Ss wurde angenommen» daß die Proteinkongentration das 6,25-facne der Stickstoffkonzentratipn betrug? die Stiok-. stoffkonsentration Kurde nach dem Mikro-Kjeldahl-Vorfahrön '.;' ^: bestimmt,^ Eins Lösung der kristallinen Urokinase mit 0,100 mg N/ml zeigte "eine optische Dichte von 0,853 bei 280 φ in 1,00 cm Küvetten.)

29 mg kristalline Urokinase wurden aus 2.270 Eitern ^; (600 gallons) menschlichem Urin von Männern erhalten, was einer Gosamtausbeutö von 24 f» entspricht. Sei der Polyacrylamidgol-

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-» 4ο —

platten-Elektrophorese zeigten Lösungen dieser kristallinen menschlichen Urokinase nu · eine einzige» scharf definierte Komponente. Sie kristalline menschliche Urokinase wurde auch in der Ultrazentrifuge auf Homogenität untersucht« Alle Ultrazentrifugcnversuche wurden bei 1O₉O⁰C in einer analytischen Spinoo-Hodell E-Ultrazentrifuge durchgeführt, die alt einer Phaoenplatte, sohlierenoptisohem System, Rotor-Iemperatur-Anzeiger und Kontrolleinheit ausgestattet war. Sedimentationskurven von Lösungen kristalliner Urokinase wurden "bei (A) pH 2,1 und (B) pH 6,8 in mit Überaohichtungszellen durchgeführten

geschah Versuchen erhalten. Die Übersohlohtunf / 12 Minuten, bevor die !fahrgeschwindigkeit 59.780 UpM erreicht hatte«

Sohlieren-Biaphragmavrinkel 6O^C· In Ansatz (A) entsprach die Uroklnasekonzentratiott einer optischen Dichte 280 SHi a 4,05 in 0,21 m-Naöl, 0,07 Phosphat bei pH 2,1; die Kurven wurden 22, 62 und 94 Hinuten, nachdem die Rotor- . geschwindigkeit $9*780 UpK erreicht hatte, fotografiert. Zn Ansäte (B) entsprach die Urokinaeekonaentration einer optischen Diohte 280 κα « 4,22 in 0,£i m-KaOl, 0,07 Phoaphat von pH 6,8; die Kurven irurden 13, 53 und 85 Minuten, nachdem die RotorgeBChWindigkeit 59*780 UpU erreicht hatte, fotografiert.

Die Löttfe bei pH 2,1 und pH 6,8 zeigten in beiden fällen nur eine einzige sysuaetrisohe Gradientenkurve*.^n dem . bei pH 6j8 gefahrenen Ansatz zeigte die Kurve jedoch, eine ^v.

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relativ schnelle und irgendwie übertriebene Verbreiterung beim Durchqueren der Zelle; darüber hinaus zeigte der aus den Ultra-Zentrifugendaten berechnete acheinbare Diffusionekoeffizient eins gewisse Abhängigkeit von der Größe dea Zentrifugalfoldes. Während die Anwesenheit nur eines einsigen symmetrischen Gipfele ' in den Sedimentationskurven natürlich die Homogenität- der Urokinaeopräparate anzeigte, sprach die relativ schnelle und progressive Verbreiterung der Kurve bei pH 6,8 für eine PoIydisperaität bei diesem pH-Wert.

Um die bei der Sedimentation bei pH 2,1 gefundene Homogenität der kristallinen Urokinase mit der bei pH 6,8 auftretenden PolvdiepereitSt in Einklang zu bringen, wurde angenoamöü, dad bei den höheren pH-Wort Urokinase relativ schnell einem Aasoziation-Dissoslation-Gleichgewicht unterliegt« Falls die £instollungogeschwindigkeit des Assoziations-Sissoziatione-Gloiohgewichts nicht größer wäre ale die Geschwindigkeit der ultrazentrifugalen Trennung der verschiedenen Molekülarten (Monomere, Dimere usw.), müßte mehr als ein Gradient während der Sedimentation auftreten· In Asaoziations-Dlssoziationssyetemen, bei denen nur eine einsige Komponente beteiligt ist, bewegt eich der Sedimentationsgradient mit einer Geschwindigkeit dea Geirichtsmittels; darüber hinaus ist der Gradient auch noch der Ort, wo sich die Gleichgewichte dauernd wieder einstellen wegen der Konzentrationsänderungen über den ganzen Gradienten· Am Schwanzende des Gradienten, tro die

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Proteinkonzeniration niedrig ist, wird die Dissoziation in die monomere Form selbstverständlich begünstigt. Ba die monomeren Moleküle weniger rauch aedimentieren als das Durcheohnittsmaterisl in der Platoauzone vor dem Gradienten, bleiben die Sonoreren zurück und verursachen eine größere Verbreiterung dea Gradienten als sie auftreten würdo, Trenn nvar die . ; Monomaren anlesend wären. Sine Bestätigung für den Befund, ·;., daß kristalline Urokinase dazu neigt, in Lösung bei £0 6,8 reversibel zu aggregieren, mtrdo dadurch erhalten, daß eine Konzentrationsabhängigkeit dea gewichtsmittleren Molekular- *_: geniohts des Enzyms in lösung bei diea em pH-Wert festgestellt mirde. In diesen Verau&nsserien wurden die Solekttlargevichte '"'"'·' naoh der Archibald-Gleiehung berechnet (J. Ehys. and Colloid ■ , One*., £1, Ί204 (1947))i · ■ - -

ET idcr/dac}

JM

Zn der Gleichung bedeuten: B » Gaakonstante, 8,314 x 10 org/ aol/Grad; T ■ absolute Temperatur; f »Dichte der LOaung; ta » Winkölgeechwindigkeit des Zentritugenrotora in Badianen pro Sekunde» (UpM) (2 i")/60j x^ » Abstand des Ueniacun von der Rotationsachse; c_m und (do/dx)_m « Konssentration bew. Konssentratlonagradlent am Meniecuo; V a partielles spesifisches Volumen von Urokinase, das su 0,735 hI/g ^{töi 10}°^c ansionommen Tiurde» Hie Heniscuäkonsientration c_m viurde naoh der Gleichung von Klainer und Kogeles (19) berechnet.;

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^co -

In der Gleichung bedeuten: o_Q = Anfangskonsentration der Urokinase in optischen Einheiten, wie sie in Überschichtungsläufen in der Ultrazentrifuge bestirnt- wurde; X ist eine Stelle in der Plateauaone (wo tiberall (dc/dx) gleich KuIl ist). Experimentelle Bestimmungen wurden gemäß dem Verfahren von Sehaohmann durchgeführt (Methods in Enzymology, Vol. IV» S.P. Colowiek and H.O. Kaplan, Herausgeber, Academic Press» Kew York, 1957, S.32). Im wesentlichen läßt sich die Archibald-Methode während der Annäherung an ein Sedimentationsgleioheoaioht la einem Ultrazentrifugenfeld anwenden. Sie erlaubt die Bestimmung des gayichtomittleron Molekulargovrichto τοη gelösten Molekülen, die am Meniaoua einer Lösung vorhanden sind, wenn die Konzentrationsvertoilung in der Gegend des Meniscus bekannt ist.

Sie Molekulargewichtsdaten, die Über ein Bereich von Menisouskonzentrationen τοη Urokinase bei pH 6,8 erhalten wurden, ließen erkennen, daß der reziproke Wert dem Gerichts- : mittels des liolekulargewichto in !linearer Abhängigkeit τοη der Konzentration in dem bei pH 6,8 untersuchten Konzentration« bereioh ist. Die Methode der kleinsten Quadrate dieser Daten führte zu der folgenden Gleichung für die Hegressionskurre:

« 1,853 - 0,OS64(o)

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In dieaor Gleichung "bedoutet c dio Uroicinasekonsentration, ausgedrückt in optischer Dichte bei 280 wi in 1,00 cir-ifellon. Danach v?arde bei unendlicher Verdünnung ein Wort von 54-000 £ 900 (o.e.) für das Molekulargewicht der monomeren Urokinase erhalten; dieser Wert beruht jedoch auf der Annahme» daß das partielle spezifische Volumen 0,735 lal/g bei 10°C beträgt. Ähnliche Holelmlargesfiohtsheatiasungen, Tfie sie bei pH 6,8 durchgeführt mirden, mirdon an Orokinaselösungon auch bei pH 2,1 und pH 10,5 durchgeführt. Innerhalb der Fehlergrenze mirde bei koinom der beiden pH-Werte VOsot das untersuchte Exmzentrationsbereich eine Konsentrationoabhängigkeit des scheinbaren Molekulargewichte beobachtet;. Bei pH 2,1 vrurde der Mittelwert und der Standardfehler bei einer Vorsuchsoerie von 11 MolekulargewichtobeatiiaEiungen zu 52.500 +, 530 gefunden. Bei pH 10,5 wurde der Mttel^ert und der Standardfehl&r für eine Serie von 8 Bo&timsiungen zu 53.300 ± 440 gefunden· Jodor dieser beiden Werte lag in guter ÜbereinstisoBung mit den Wert von 54·.000 + 900, der durch Extrapolation der Werte bei pH 6,8 bei unendlicher Verdünnung abgeleitet mirde. Vermutlich wurde die Aggregation bei den mahr extremen pH-Werten durch abstoßende Kräf te der elektrostatieohen Ladungen an den fionomeren Molekülen gehessat; andererseits ist os auch möglich, dass ein relativ geringer Grad an Aggregation durch ein nicht ideales Verhalten der Lösungen oder durch analytische ünempfindliohkeit, der Bestimmung nicht zugänglioh ist.

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— pi —

Sie experimentelle Gestaltung der MolekulargewichtsbeStimmungen bei jedem untersuchten pEMr/ert lieferte auch einen weiteren Beweis für die Homogenität der kristallinen Urokinaoöpriiparate j die Verauehsdurehführung erlaubte darüberhinaus bei Jedem pH-Wert die Unterouchung einer Einseiprobe Über ein ziemlich weites Bereich an ISenieeuskonsentrationen· Während der Archibald-Versuche vrurde jede von mehreren ver-0chiedenen Anfangakonzentrationen der Urokinase drei vor- i achiedenen Zentrifugalfeidern ausgesetzt. Xn Systemen» die eich in der Ultrazentrifuge als polydispera erweisen, bewirken die höheron Zentrifugalfelder bevorzugt eine Verarmung der schneller sedistentieronden Molekulart aus der Menlecuszone» Wenn die Polydicpersität auf eine reversible Aggregation suriicksufuhren iat, führt die bevorzugte Verarmung au einer Ueueinstellung des Gleichgewichts der Molekülart und damit ssu einer Lösung, deren ZuoauEsensotaung identisch rait einer Zusammensetzung ist, die durch einfache Verdünnung derselben LöQungokonzentration erhalten v?ird. Das gewicht emittiere Molekulargewicht der Lösung am Meniscus eines solchen Systems ist strar kons ent rations abhängig, jedoch unabhängig davon, ob die Vorminderung der Konzentration in erster Linie durch einfache Verdünnung oder durch fraktionierung in der Ultra* zentrifuge bewirkt wird. Biese Verhältnisse wurden mit Urokinaselösungon bei pH 6,8 gefunden· Bei den beiden anderen untersuohten pH-Werten vrurde die Homogenität der kristallinen ' .,

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Urokinase auch noch dadurch, angezeigt., daß keine Anseichen für ein© Abhi-mgigfceit der ArcMbaia von der Groß© der angöV7andi;eji Zentrifug&lfelder

Die oben beschriebenen erfindungogeaUoea Verfahren führen au hochgoreinigten tfrokiiiaeepräparatsn, die ±m vrsaontliehaa frei von I^rrosöaen tmd thromboplastiechen SubDtanisen waren und die eich boi der Aiiflöaung von intravasculören Gerinnseln im aonschliciion Körper ale Tdrksaai erwiesen. Darüber hinaus war die beschriebene kristalline Urokinase nicht nur im wesentlichen frei von ^rogenea und throaboplßfltischen Substanzen» sondern ebenso frei von potentiell antigenen Verunreinigungen, ood&B die kriGtalline TJrokinaoe beim ttenachen wiederholt an^owandt ?mrden kann, ohne ochv?ero energische Eeaktionen befürchten su jsUoaen.

lach dem Stand der Technik mtrde die Wirksamkeit von TJrokinaeopripjixaten in aohroren voreohiadönon Aktivitäteeinheit an ausgedrückt, wovon jede auf einer bc&tiisnten Standardbdstisaiungeiaethod'e basierte. Sie in vorliegender Anmeldung verwendeten C TA-Ei nli ei ten entsprechen der Standardurokinaoeeinhöit, dio kürelich vom "Comsiittee on Shrombolytic Agents« Rational Haart Institute" genehmigt mirdai vgl. Sherry, Alk^aeraig und Gleicher» J. lab. & Clin. H&d, 64, 145-153 (Juli 196Λ).

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BAD

Claims (3)

Patentansprüche

1.) Verfahren zur Gewinnung von Urokinase in kristalliner Form aus einer Urokinaseaufbereitung mit einer Urokinaseaktivität von mindestens 40 000 CTA-Einheiten pro mg Protein, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufbereitung mit Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6 bis 7 zur Herstellung einer Lösung mit einer Uronkinase-Aktivität von mindestens 100 000 CTA-Einheiten pro ml gelöst wird, die erhaltene Lösung bei einer Temperatur im ungefähren Bereich von O⁰C bis 4⁰C gegen Wasser dialysiert wird, bis der spezifische Widerstand auf mindestens 2 500 Ohm ansteigt, der gebildete Niederschlag entfernt und verworfen wird, die Urokinase aus der Lösung mit Natriumchlorid ausgesalzen wird, die auf diese Weise ausgefällte Urokinase gesammelt und in wäßriger Natriumchloridlösung gelöst wird und die Urokinase aus der Lösung mit Natriumchlorid ausgesalzen wird, wobei die Urokinase in kristalliner Form gewonnen wird.

2.) Menschliche Urokinase in praktisch homogener Form mit einem Molekulargewicht von etwa 54 000 und einer spezifischen Urokinaseaktivität von annähernd 652 000 CTA-Einheiten pro mg Stickstoff und annähernd 104 000 CTA-Einheiten pro mg geschätztem Protein, die völlig frei von pyrogenen und thrombo-

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plastischen Substanzen ist.

3.) Injizierbare Zubereitung von menschlicher Urokinase zur Auflösung von Blutklumpen im Menschen, die im -wesentlichen aus einer wäßrigen Lösung von menschlicher Urokinase gemäß Anspruch 2 besteht.

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