-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
1. GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Erzeugung
von Antihämophiliefaktoren
oder Konzentraten aus Blut und insbesondere ein Verfahren und eine
Vorrichtung, die eine schnelle und effiziente Präparation von Gerinnungsfaktoren
aus Blut von einzelnen Blutspendern erlaubt.
-
2. BESCHREIBUNG VON VERWANDTEM
STAND DER TECHNIK
-
Individuen
mit einer aus einer Serie von genetischen Abnormalitäten, die
die Proteine betreffen, die für die
Blutgerinnung verantwortlich sind, sind mit einer Krankheit geschlagen,
bei der das Blut nicht in normaler Weise gerinnt, was die Individuen
der Gefahr unkontrollierter Blutung aussetzt. Seit vielen Jahren
wurde dieser Zustand durch die Verabreichung von Konzentraten der
fehlenden oder defekten Proteine behandelt. Bis zu diesem Zeitpunkt
gibt es jedoch kein kosteneffektives Verfahren um jedes dieser Proteine
künstlich
herzustellen, so dass sie aus menschlichem Spenderblut gereinigt
werden müssen.
Obwohl Verfahren für
die Herstellung dieser Konzentrate aus einzelnen Einheiten von Spenderblut
vorhanden sind, sind diese Verfahren im allgemeinen weniger effizient
als eine groß angelegte
Präparation
aus gesammeltem Blut. Zu diesem Zeitpunkt werden die große Vielzahl
von Antihämophilifaktoren
(AHF, auf bekannt als Faktor VIII) und andere Blutfaktoren aus gesammeltem
Plasma hergestellt. Da ein Bluter einer Behandlung für die Gesamtzeit
seiner Lebenszeit bedarf, erhält
er (die Mehrzahl der Bluter sind männlich) notwendigerweise Blutprodukte
von einer großen Anzahl
von Spendern.
-
Das
Vorhandensein von AIDS-(Acquired Immuno Deficiency Syndrome) Virus
in der Blutversorgung bedeutet, dass viele Bluter mit dieser schrecklichen
Erkrankung infiziert wurden. Obwohl die Tests zum Erkennen von AIDS-verseuchtem
Blut verbessert wurden, kann immer noch infiziertes Blut unentdeckt
bleiben. Da Bluter einer großen
Anzahl von Spendern ausgesetzt sind haben sie ein erhöhtes Risiko.
Selbst wenn das AIDS-Problem gelöst
ist, besteht noch die Gefahr anderer blutübertragener Erkrankungen, wie
z.B. verschiedener Arten der Hepatitis und anderer infektiöser Stoffe,
was es wünschenswert macht,
die Verwendung von gesammeltem Blut bei der Herstellung von Blutkonzentraten
zu reduzieren. Wenn jeder Bluter AHF, gereinigt von nur einem einzelnen
oder einer kleinen Anzahl von Spendern erhalten würde, würde die
Gefahr von durch Blut übertragenen
Infektionen deutlich reduziert werden.
-
Die
grundlegenden Herstellungsverfahren dieser Gerinnungskonzentrate
aus dem Blut haben sich in den letzten paar Jahrzehnten nicht deutlich
verändert.
Im allgemeinen wird AHF aus gesammeltem Plasma durch einen Kaltpräzipitationsschritt
abgeleitet. Verschiedene Additive, wie z.B. Ethanol oder Polyethylenglycol werden
in der Regel zugefügt,
um die Effizienz des Kaltpräzipitationsschritts
zu erhöhen.
Folgend auf die Kaltpräzipitation
wird das teilweise gereinigte AHF weiter durch zusätzliche
Präzipitationsschritte
oder chromatographische Verfahren, in letzter Zeit unter Verwendung
monoklonaler Antikörper,
gereinigt. Für
zusätzliche
Informationen im Hinblick auf die grundlegenden Techniken der AHF-Reinigung
und die Entwicklungsgeschichte dieser Verfahren wird der Leser auf
die US-Patente Nr. 3.650.475, 3.631.018, 3.682.881, 4.069.216 und 4.305.871
vom vorliegenden Erfinder und die darin zitierten Referenzen verwiesen.
-
AUFGABEN UND
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitzustellen,
wodurch ausgezeichnete AHF-Erträge
wie auch Erträge
an Fibrinogen, Fibronectin und "Fibrin-Klebstoff" oder "Fibrin-Versiegelungsmittel" einfach aus individuellen
Bluteinheiten erzeugt werden können;
es
ist eine zusätzliche
Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine einfach zu verwendende Vorrichtung
zur Durchführung
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, wobei
die Vorrichtung eine Modifikation an oder Zusatz zu einer traditionellen
Bluttasche ist und
es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erzeugung eines
Prothrombinkomplexes aus demselben Plasma bereitzustellen, das zur
Produktion von AHF verwendet wird.
-
Diese
und zusätzliche
Aufgaben werden durch das Verfahren zur Dehydratation einer einzelnen
Einheit von Plasma vor dem Niedrigtemperaturschritt, der verwendet
wird um das Kaltpräzipitat
herzustellen, erfüllt.
Diese Dehydratation wird entweder erreicht, indem ein wasserabsorbierendes
Material in einer Bluttasche platziert wird, so dass das Plasma,
das in der Tasche ist, dehydratisiert wird oder indem das wasserabsorbierende
Material innerhalb einer Kartusche platziert wird, so dass das Plasma
beim Passieren durch die Kartusche dehydratisiert wird. Im allgemeinen
ist das bevorzugte wasserabsorbierende Material ein chromatografisches
Gel mit Poren, die zu klein sind, als dass sie Gerinnungsproteine
durchlassen würden,
aber groß genug um
Wassermoleküle
passieren zu lassen. Geeignete Gele bestehen aus Kohlenhydra ten
oder Polyacrylamid und werden allgemein bei verschiedenen chromatografi
schen Verfahren verwendet. Kohlehydratgele, wie z.B. SEPHADEX® (eingetragene
Marke für
vernetzte Dextringele), erzeugt von Pharmacia-Upjohn, werden in
der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Andere dehydratisierende
Matrizes, wie Stärke,
Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol (d.h. Aquacides, Marke
von Calbiochem) oder Gelatine könnten
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden aber allgemein
aufgrund der signifikanten Möglichkeit,
dass solche Materialien signifikante Mengen der Gerinnungsproteine,
wie auch das Wasser absorbieren würden nicht bevorzugt, außer sie
würden
mit einer Dialysemembran verwendet. Eine alternative Ausführungsform
der Erfindung ersetzt das einfache wasserabsorbierende Gel durch
eines, das außerdem
Ionenaustauschfähigkeiten aufweist,
wie z.B. DEAE (Diethylaminoethyl) SEPHADEX® (eingetragene
Marke von Pharmacia-Upjohn), das eine spezielle Affinität für eine Anzahl
von Blutgerinnungsfaktoren aufweist, kollektiv bekannt als Prothrombinkomplex.
Folgend auf den Dehydratisierungsschritt wird DEAE SEPHADEX eluiert,
um den Prothrombinkomplex zu produzieren.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Die
Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung sind insbesondere
im Hinblick auf die beigefügten
Ansprüche
dargestellt. Die vorliegende Erfindung, sowohl im Hinblick auf ihre
Organisation als auch Arbeitsweise, zusammen mit weiteren Aufgaben
und Vorteilen, kann am besten durch Bezugnahme auf die folgende
Beschreibung verstanden werden, wobei die begleitenden Zeichnungen
mit in die Betrachtung einbezogen werden.
-
1 zeigt
eine bei der Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendete Kartusche;
-
2 zeigt
die Vorrichtung gemäß 1,
verbunden zwischen zwei Bluttaschen;
-
3 zeigt
eine alternative Ausführungsform,
bei der das dehydratisierende Material als permeables Paket innerhalb
der Bluttasche eingeschlossen ist, und
-
4 zeigt
die Verwendung einer breiten Säule
zur Elution des Prothrombinkomplexes aus dem Paket gemäß 3.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Die
folgende Beschreibung wird bereitgestellt, um dem Fachmann die Durchführung und
Verwendung der Erfindung zu ermöglichen
und zeigt die besten Ausführungsformen,
die der Erfinder für
die Durchführung seiner
Erfindung in die Betrachtung mit einbezieht. Verschiedene Modifikationen
werden dem Fachmann dennoch deutlich erkenntlich, da die grundlegenden
Prinzipien der vorliegenden Erfindung hier spezifisch definiert wurden,
um ein Verfah ren und eine Vorrichtung zur effizienten Produktion
von AHF und anderer Blutproteine aus einzelnen Plasmaeinheiten bereitzustellen.
-
Das
traditionelle Verfahren zur Erzeugung von AHF, wie auch die z.Zt.
verwendeten Verfahren, arbeiten auf der Grundlage, dass die Schlüsselplasmaproteine
aus einer Lösung
bei niedrigen Temperaturen, wenn sie ausreichend konzentriert sind,
präzipitieren
(ein Kaltpräzipitat
bilden). Wenn eine Proteinlösung
eingefroren wird, bilden sich Eiskristalle und die Proteine, die
aus den Kristallen ausgeschlossen sind, werden immer stärker konzentriert.
Abhängig
von den besonderen Proteinen können
die Proteine tatsächlich
aus der Lösung ausfallen,
d.h. ein Präzipitat
bilden, wenn das Protein besser mit sich selbst oder anderen Proteinen
als mit Wasser in Wechselwirkung tritt. Dieses Verfahren kann die
Proteine denaturieren (sie irreversibel unlöslich machen), so dass es üblich ist,
die Proteinlösungen
schnell und auf eine niedrige Temperatur (d.h. –20°C oder niedriger) einzufrieren,
um die Bildung von Eiskristallen zu minimieren und das Wachstum
dieser Kristalle, die sich bilden, zu verhindern. Dies wird durchgeführt um eine
Proteindenaturierung auf den Eiskristalloberflächen zu begrenzen. Selbst wenn
das Einfrieren mit großer
Sorgfalt durchgeführt
wird, können
Eiskristalle zu einer "Aktivierung" des Prothrombinkomplexes
führen,
was zu einer spontanen Gerinnselbildung führt.
-
Der
erste Schritt in einem typischen Verfahren zur Erzeugung eines Plasma-Kaltpräzipitats
ist die Zentrifugation von Gesamtblut um das Plasma von den roten
Blutzellen zu trennen. Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet wohl
bekannt und wird häufig
in speziellen Zentrifugen durchgeführt, die individuelle Bluttaschen
halten, so dass die Plasma/Rote-Blutzell-Abtrennung auftritt, sogar
ohne dass die Bluttasche geöffnet
werden muss. Groß angelegte
Verfahren können
ebenfalls verwendet werden, jedoch betrifft die vorliegende Erfindung
insbesondere die Reinigung individueller Einheiten von Blut, um
die Anzahl von Spendern zu minimieren, der jeder Patient ausgesetzt
wird. Folgend auf die Zentrifugation ist es allgemein üblich das überstehende
Plasma in eine "Satelliten"-Bluttasche für die weitere
Verarbeitung auszudrücken.
Nachdem das Plasma abgetrennt ist, ist das typische Verfahren das
schnelle Einfrieren des Plasmas und dann das langsame Auftauen des
gefrorenen Plasmas bei 4°C,
währenddessen
AHF und andere Proteine ein Kaltpräzipitat bilden, das einfach durch
Filtration oder Zentrifugation geerntet werden kann. Dieses Kaltpräzipitat
ist nicht irreversibel unlöslich gemacht
und kann einfach in einem Puffer mit niedriger Innenstärke extrahiert
(wieder gelöst)
werden, wie auf dem Gebiet wohl bekannt ist.
-
Die
Kaltpräzipitation
ergibt sich, wenn die Entfernung von Wasser aus der direkten Nachbarschaft
der Proteinmoleküle
dazu führt,
dass sich die Proteine vorzugsweise miteinander anstatt mit Wasser
assoziieren. Diese "Entfernung" von Wasser kann
durch die Verwendung von Additiven bewirkt oder verstärkt werden,
die das Wasser "an
sich binden" und
dazu führen,
dass es weniger mit den Proteinen in Wechselwirkung tritt. Diese
Additionssubstanzen können
aus einer Vielzahl von hydrophilen Materialien gewählt werden,
wie z.B. Ethanol, Polyethylenglycol, Heparin und PLURONIC® Polyolpolymeren.
Diese und andere Materialien, die verwendet werden, um den Ertrag
des Kaltpräzipitats
zu erhöhen,
arbeiten im allgemeinen auf eine Verminderung der effektiven Aktivität von Wasser
in der Mischung hin. D.h., die Wassermoleküle treten vorzugsweise mit
dem zugefügten
hydrophilen Materialien anstatt mit den Proteinen in Wechselwirkung.
Dies ermöglicht
es den Proteinen miteinander in Wechselwirkung zu treten und daher
aus der Lösung
zu präzipitieren.
Die Erniedrigung der Temperatur erniedrigt auch die Aktivität von Wasser
und unterstützt
die Protein-Protein-Wechselwirkungen.
-
Die
grade erwähnten
hydrophilen Additive haben den Vorteil, dass sie relativ kostengünstig und
einfach in ihrer Verwendung sind. Ihre Verwendung benötigt jedoch
in der Regel zusätzliche
Waschschritte um sicherzustellen, dass die Additive nicht in das
endgültige
AHF-Produkt mit hinübergetragen
werden. Die Notwendigkeit einer Zugabe von hydrophilen Materialien
macht auch eine zusätzliche
Manipulation des Plasmas nötig.
Dies kann bei Präparationen
im große
Umfang nicht unbedingt ein signifikanter Nachteil sein, wenn viele Plasmaeinheiten
von einer Anzahl von Spendern gesammelt werden. Eine solche zusätzliche
Manipulation des Plasmas wird jedoch bei der vorliegenden Erfindung
nicht begünstigt,
die einzelne Einheiten von Plasma verwendet und versucht, Arbeit
und Arbeiterkontakt mit dem Plasma möglichst zu begrenzen. Der gegenwärtige Erfinder
hat erkannt, dass es ein zusätzlicher
Weg zur Begrenzung der Wasseraktivität und zur Erhöhung der
Bildung eines Kaltpräzipitats
ist, einfach die tatsächliche
Wassermenge in der Lösung
zu vermindern. Dies wird bewirkt, indem das Plasma mit einem dehydratisierenden
Material behandelt wird, das Wasser, jedoch nicht Protein aus dem
Plasma absorbiert. Viele unterschiedliche dehydratisierende Materialien
sind auf die vorliegende Erfindung anwendbar. Die Schlüsselkriterien
sind die, dass das Material unlöslich
ist und dass es die Plasmaproteine in minimaler Weise denaturiert
oder absorbiert. Eine große
Anzahl polymerer Materialien, wie z.B. polymerisiertes Polyvinylalkoholacetal,
Kohlenhydratgele und hydrophile organische Polymere (d.h., Polyacrylamid)
sind für
die vorliegende Erfindung geeignet. Andere dehydratisierende Mittel,
wie z.B. Carboxymethylcellulose können unter Zugabe einer semipermeablen
Membran zur Verhinderung einer Absorption von Proteinen verwendet
werden. Diese Membran erhöht
jedoch die Komplexität
und verlangsamt im allgemeinen die Dehydratation.
-
Das
z. Zt. bevorzugte dehydratisierende Material ist SEPHADEX (G-25
bis G-100). Andere ähnliche SEPHADEX-Produkte,
wie auch andere vernetzte polymere Materialien mit ähnlichen
Eigenschaften, können verwendet
werden. Die SEPHADEX-Materialien bestehen aus kleinen Kügelchen
vernetzter Dextrine (Glucosepolymere). Das Material ist so konstruiert,
dass die Poren zwischen den vernetzten Kohlenhydratmolekülen zu klein
sind um irgendwelche Proteine, außer den kleinsten, durchzulassen.
Wasser und kleine lösliche
Stoffe können
jedoch einfach durch diese Poren dringen, wo das Wasser durch Wechselwirkung
mit (Schwellung). der Kohlenhydrate eingefangen wird. Solche Materialien
werden in der Proteinbiochemie beim Entsalzen und chromatografischem
Fraktionieren von Proteinen oder anderen Mischungen von Makromolekülen weit
verbreitet verwendet. So weit dem vorliegenden Erfinder bekannt
ist, wurden sie jedoch nicht direkt für die Produktion von AHF aus
einzelnen Plasmaeinheiten verwendet. Andere Dehydratisierungsverfahren,
wie z.B. eine Ultrafiltration, können
ebenfalls verwendet werden, jedoch sind solche Verfahren nicht so
einfach auf Wegwerfapparate anzuwenden und bilden keinen Teil der
vorliegenden Erfindung.
-
Ein
signifikanter Vorteil der Verwendung von Dehydratisierungsmitteln
ist derjenige, dass geeignete Mengen von Kaltpräzipität durch einfaches Kühlen (d.h.
auf 4°C)
gebildet werden können,
ohne dass es tatsächlich
notwendig ist, ein tatsächliches
Einfrieren und Auftauen des dehydratisierten Plasmas durchzuführen, wodurch
es ermöglich
wird, die Gerinnungsfaktoren zu erhalten, die nicht durch Kontakt
mit Eiskristallen aktiviert wurden. Natürlich kann das Plasma, nachdem
eine erste Menge Kaltpräzipitat
durch Kühlen
gebildet wurde, dann einem Gefrierschritt und Auftauschritt unterzogen
werden, um eine zweite Menge des Kaltpräzipitats zu ergeben.
-
Unterschiedliche
Arten von SEPHADEX schwellen mit unterschiedlichen Raten an. Um
diese Unterschiede zu bewerten, wurden 1 g Aliquots vier unterschiedlicher
Arten von Sephadex mit 30 ml destilliertem Wasser jeweils getränkt und
die Schwellung wurde beobachtet und gemessen. Tabelle 1 zeigt das
endgültige Volumen
von vollständig
angeschwollenen Gels nach 24 Stunden.
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Gels mit "hoher Zahl" zu einem sehr viel größerem Ausmaß anschwellen
(eine größere Menge
Wasser aufnehmen). Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass diese Gels weniger
fest vernetzt sind und größere Porengrößen aufweisen.
Im wesentlichen werden Gels mit größerer Zahl für die Dehydratisierung
in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, da sie größere Mengen
Wasser aufnehmen. Man muss jedoch dabei die Tatsache in die Betrachtung
mit einbeziehen, dass diese selben Gele größere Poren aufweisen, die auch
höher-molekulare
Proteine aufnehmen können.
So muss die Effektivität
der Dehydratation gegen einen möglichen
Proteinverlust in der Gelmatrix bei der Selektion idealer Gele zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung ins Gleichgewicht gesetzt
werden. Im allgemeinen absorbiert ein G-75-Gel keine exzessive Menge
an Protein (im Vergleich mit seinen günstigen Dehydratisierungseigenschaften).
Offenere Gele, d.h. G-100 und darüber, nehmen mehr und mehr Proteine
auf und werden weniger begünstigt.
-
BEISPIEL I
-
Dieses
Beispiel verwendet eine Dehydratisierungskartusche 10,
so wie die in 1 dargestellte. Diese Kartusche
weist einen im allgemeinen zylindrischen Hohlkörper 12 mit einer
Einlassmündung 14 und
einer Auslassmündung 16 auf.
Der hohle Körper
ist mit ausreichend SEPHADEX-Gel 18 gefüllt, um effizient eine einzelne
Einheit (ungefähr
500 ml) Plasma zu dehydratisieren. Eine Fritte 19 (häufig nur
eine Scheibe aus einem feinen Nylonsieb oder ähnlichem Material) wird bereitgestellt,
um das SEPHADEX an einem Auslaufen durch die Auslaufmündung 16 zu
verhindern. Eine zweite Fritte 19' kann ebenfalls bereitgestellt
werden, um ein Auslaufen durch die Einlassmündung 14 zu verhindern.
Es wurde festgestellt, dass optimale Ergebnisse erhalten werden,
wenn das Plasma um mindestens ungefähr 50 % dehydratisiert wird;
d.h., wenn 100 ml Plasma auf 50 ml reduziert werden, jedoch wird
jede Wasserentfernung zu einem Anstieg des präzipitierten Proteins führen. Der
Einlass 14 und die Auslaufmündung 16 sind mit
Standardverbindungsstücken 22 versehen,
so dass die Kartusche 10 einfach mit dem flexiblen Schlauch 24 verbunden
werden kann, zwischen einer ersten Bluttasche 26 und einer
zweiten Bluttasche 28 (siehe 2). Abhängig von
der präzisen
Art der verwendeten Bluttaschen kann der Schlauch an die Bluttasche
bereits vorher befestigt sein oder, wenn er nicht so befestigt ist,
kann er an der Kartusche vorher befestigt sein. Alternativ können separate
Längen
an Schläuchen
verwendet werden.
-
Diejenigen,
die mit der Verwendung von SEPHADEX und ähnlichen Materialien vertraut
sind, werden sich bewusst sein, dass diese beim Tränken mit
Wasser deutlich anschwellen. Daher ist es wichtig, ausreichend Freiraum
in der Kartusche 10 zu erlauben, um sich dieser Schwellung
anzupassen. Die Menge des benötigten
Volumens hängt
von der Art des gewählten
SEPHADEX ab, wobei die Materialien mit hoher Zahl (d.h., G-100 gegenüber G-25)
in einem sehr viel größeren Ausmaß anschwellen
(siehe Tabelle 1). Wenn eine Einlassfritte 19' verwendet wird,
muss diese Fritte 19' in
der Lage sein sich zu deformieren oder ihre Stellung zu verändern, wenn
das SEPHADEX-Gel anschwillt.
-
Bei
der Verwendung fließt
das Plasma aus der ersten Bluttasche 26 durch die Kartusche 10 in
die zweite Bluttasche 28. In der Regel wird dieser Fluss
einfach durch die Schwerkraft ausgelöst. Alternativ kann der Plasmafluss
durch jedes von einer Anzahl von Verfahren unterstützt werden,
die eine Öffnung
der Tasche vermeiden und eine potentielle Kontamination von Personalverfahren
riskieren, wie z.B. ein peristaltisches Pumpensystem, angelegt an
die Schläuche 24 oder
einer Art Blutmanschette oder Kammer, angelegt an die Bluttasche 26 wären geeignet.
Der kritische Faktor ist der, dass die Plasmaflussrate durch die
Kartusche ausreichend langsam ist, dass eine geeignete Dehydratation
auftritt. Der Dehydratisierungsgrad, der erreicht wird, ist ein
Produkt der Flussrate und des Verhältnisses zwischen gesamtem
Plasmavolumen und SEPHADEX-Volumen. Eine langsamere Flussrate und/oder
ein erhöhtes
Volumen von zur Verfügung
stehendem SEPHADEX werden zu einem größeren Dehydratisierungsniveau
führen.
Eine bestimmte Menge von Plasma wird jedoch permanent von dem SEPHADEX
zurückgehalten,
so dass je größer das
SEPHADEX-Volumen
ist, desto größer die
Menge des verlorengegangenen Plasmas sein wird. Wenn die Dehydratation
auch zu exzessiv ist, kann Protein innerhalb der Kartusche ausfällen und
wird verloren gehen.
-
Nachdem
das Plasma vollständig
durch die Kartusche passiert ist, ist es vorteilhaft, eine zusätzliche Zeit
(einige Minuten) zu warten, damit Restplasma aus der Kartusche auslaufen
kann. Es ist auch möglich, zusätzlich zurückgehaltenes
Plasma auszudrücken,
indem eine geringe Menge (d.h. mit einer Flussrate von 1 bis 5 ml/min
Luft) bei niedrigem Druck durch die Kartusche geblasen wird. Folgend
auf die Behandlung des Plasmas durch Dehydratisierung durch die
Kartusche wurde die zweite Bluttasche dann in eine –80°C Gefriervorrichtung
platziert, um ein schnelles Einfrieren des dehydratisierten Plasmas
zu erreichen. Nachdem die gefrorene Bluttasche mindestens über Nacht
gefroren geblieben ist, wurde sie langsam in einem 4°C zirkulierenden Wasserbad
aufgetaut. Nachdem das Auftauen vollständig war, war dass Kaltpräzipitat
deutlich als feines weißes
Präzipitat
zu erkennen, das durch Zentrifugation der Tasche geerntet wurde.
Alternativ kann der gesamte Inhalt der Tasche in eine Zentrifugenflasche
für einen
Ernteschritt übertragen
werden oder das Präzipitat kann
durch Filtration gefangen werden. Folgend auf die Zentrifugation
wird der Überstand
durch Aspiration entfernt. Der Übertrag
der Überstandsblutproteine
kann durch vorsichtiges Spülen
der Innenseite der Tasche/Flasche, sowie der Oberfläche des
Kaltpräzipitat-Pellets
mit kalter isotonischer Salzlösung
begrenzt werden.
-
Das
Kaltpräzipitat
kann dann rekonstituiert werden, indem es in einer irgendeiner Zahl
von physiologisch akzeptablen Lösungen,
wie z.B. reinem, Pyrogen-freiem Wasser, normaler Salzlösung, Zitrat-haltiger Salzlösung, Trispuffer
bei ungefähr
pH 7,0 oder anderen Lösungen,
die auf dem Gebiet gut bekannt sind, gelöst wird. Die Konzentration
an AHF oder Faktor VIII wird durch das Volumen der verwendeten Flüssigkeit
zur Rekonstitution des Kaltpräzipitats
gesteuert. Das erfindungsgemäße Verfahren
gewinnt ungefähr
zweimal so viel Proteine wie das übliche Verfahren für eine ungefähr 100%ige
Verbesserung. Das Kaltpräzipitat
enthält andere
Proteine neben Faktor VIII. Insbesondere enthält das Kaltpräzipitat
in der Regel Fibrinogen und Fibronectin. Es kann vorteilhaft, diese
durch Wärmedenaturation
zu entfernen (d.h., US-Patent 4.305.871) oder andere wohl bekannte
Verfahren; diese Proteine können
jedoch verwendet werden, um "Fibrin-Kleber" oder "Fibrin-Siegelmittel" herzustellen, die
in der Regel zur Kontrolle einer lokalen Blutung während einer
operativen Chirurgie wertvoll sind. Wenn gewünscht, kann der durch erneutes
Lösen des
Kaltpräzipitats
erzeugte Faktor VIII anderen wohl bekannten Reinigungsverfahren
unterzogen werden, um noch höhere
Reinheitsniveaus zu erreichen, jedoch sind solche Schritte im allgemeinen
nicht notwendig.
-
BEISPIEL 2
-
Die
anderen Gerinnungsfaktoren, die kein Kaltpräzipitat bilden, können sehr
wichtig sein. Von besonderem Interesse sind die Faktoren II, VII,
IX und X, hergestellt in der Leber, die den sogenannten Prothrombinkomplex
bilden. Während
dieses Material verwendet werden kann um die Hämophilie B (Faktor IX-Defizienz) zu
behandeln, ist es besonders wertvoll bei der Behandlung einer nicht-kontrollierten
Blutung, die mit einer fortgeschrittenen Lebererkrankung in Beziehung
steht (z.B. peptische Geschwüre
und Ösophagus-Varizen).
Eine erstaunliche Anzahl von Patienten mit Lebererkrankungen benötigen chirurgische
Eingriffe, die sie gegenüber nicht-kontrollierten
Blutungen empfänglich
machen. Wenn der Prothrombinkomplex gefangen werden kann, wird er
ein zusätzliches
Produkt darstellen, um die Produktion von AHF zu beto nen. Da viele
Patienten mit Lebererkrankungen schließlich einer Transplantationsoperation
unterzogen werden, unter gleichzeitiger Verwendung von immunosupressiven
Arzneimitteln ist es wichtig zu vermeiden, dass diese Patienten
einer großen Anzahl
von Viren ausgesetzt werden, die in den gesammelten Blutprodukten
vorliegen können.
Die vorliegende Erfindung ist so entworfen, dass einzelne Bluteinheiten
von bekannten Spendern verarbeitet werden, so dass der Prothrombinkomplex
mit höherer
Wahrscheinlichkeit erkrankungsfrei sein wird. Zusätzlich wird
der Prothrombinkomplex, der gemäß der vorliegenden
Erfindung ohne Einfrieren erzeugt wurde, weniger wahrscheinlich
thrombogen sein, da das Einfrieren dazu neigt, das Material zu aktivieren,
da nämlich
die vorliegende Erfindung die Erzeugung des Kaltpräzipitats
aus nicht-eingefrorenem
Plasma erlaubt.
-
Um
den Prothrombinkomplex mit der vorliegenden Erfindung zu erzeugen,
ersetzt man nur das SEPHADEX durch DEAE (Diethylaminoethyl) SEPHADEX,
einem Material, das für
die Ionenaustauschchromatographie wie auch für die Dehydratisierung geeignet
ist. Es ist bekannt, dass Ionenaustauschmaterialien wie DEAE-Sephadex
eine ungewöhnliche
Affinität
für Proteine
des Prothrombinkomplexes aufweisen. Alles was notwendig ist, ist
sicherzustellen, dass eine ausreichende Ionenaustauschkapazität vorliegt,
um eine Hauptmenge des Prothrombinkomplexes, der in einer Einheit
des Plasmas vorliegt, zu absorbieren. Allgemein ist die Menge von
benötigtem
DEAE-Sephadex zur Absorption des Prothrombinkomplexes niedriger
als die benötigte Menge
für eine
optimale Dehydratisierung; daher ist es vorteilhaft, zusätzliches
SEPHADEX zuzufügen,
vorzugsweise reguläres
Sephadex, was ökonomischer
ist und seine Verwendung wird bevorzugt. Ein zusätzlicher Grund reguläres Sephadex
zuzufügen
ist der, dass DEAE-Sephadex Proteine bindet, wenn es dehydratisiert. Das
Nettoergebnis kann sein, dass, obwohl das Plasmavolumen substantiell
reduziert ist, die lösliche
Proteinkonzentration dieselbe verbleibt, so dass sich keine Verbesserung
des Kaltpräzipitatertrags
ergibt. Die Zugabe von regulärem
SEPHADEX (d.h., G-75) führt
zu einer zusätzlichen
Dehydratisierung, die benötigt
wird, um den Ertrag des Kaltpräzipitats
zu verbessern. Weiterhin kann es zum Erhalt einer optimalen Proteinbindung
an DEAE-SEPHADEX wünschenswert
sein, dass das Material dehydratisiert oder vorher angeschwollen
wird, in welchem Fall das DEAE-Gel zu keiner oder wenig Dehydratisierung
führt und
dann ist die Zugabe von regulärem
SEPHADEX absolut notwendig. Folgend auf die Dehydratisierung des
Plasmas, wie oben erklärt,
wird die Kartusche 10 aus dem System entfernt, und mit
einigen Säulenvolumen
Salzpuffer (d.h., 0,8 % Natriumchlorid in 0,02 M Trispuffer, pH
6,9) zur Entfernung von kontaminierenden Proteinen gespült. Das
erste Säulenwaschvolumen
kann erhalten und mit dem Material in der zweiten Bluttasche 28 gepoolt
werden.
-
Folgend
auf die Salzspülung
der Kartusche 10 wird der Prothrombinkomplex durch Durchfließen von 0,5
M Natriumchlorid (gepuffert mit Tris, wie im Fall des Salzlösungspuffers)
eluiert. Im allgemeinen wird die Hauptmenge des Prothrombinkomplexes
in den ersten wenigern Millimetern, zum Fliessen durch die Kartusche,
eluiert. Natürlich
kann, wie auf dem chromatografischen Gebiet bekannt, eine Gradientenelution
verwendet werden, um eine verbesserte Reinigung zu erhalten. Der
eluierte Komplex kann auch weiter durch verschiedene andere biochemische
Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, gereinigt werden. Im
Normalfall wird das Material zur Isotonizität mit Wasser oder Puffer verdünnt oder
kann in physiologischer Salzlösung
dialysiert werden. Der Grad der endgültigen Verdünnung wird von der gewünschten
Stärke
des Endprodukts abhängen.
Die Stabilität
des Komplexes kann durch Zugabe von 1 bis 5 % sterilisiertem menschlichem
Serum-Albumin erhöht
werden.
-
BEISPIEL 3
-
Anstelle
der Kartusche 10 kann das dehydratisierende Material der
vorliegenden Erfindung direkt in die Bluttasche inkorporiert werden
mit einer resultierenden Abnahme des Volumens von verworfenem Material. Obwohl
es möglich
ist, loses SEPHADEX in die zweiter Bluttasche 28 einzuschließen, können sich
Probleme bei der Entfernung von SEPHADEX von dem dehydratisierten
Plasma ergeben. Im allgemeinen kann die Zentrifugation das SEPHADEX
nicht effektiv pelletisieren. Ein kleiner Filterstopfen aus Glaswolle,
PVAA (Polyvinyllkohol-Acetatschwamm) oder ähnlichen Materialien, kann
jedoch in den Auslass 16 eingeschlossen werden um das SEPHADEX
zu fangen und daran zu hindern, dass Kaltpräzipitat zu kontaminieren, oder
das lose SEPHADEX kann in geeigneter Weise durch eine stromabwärts gelegene
Filterkartusche (vor der Erzeugung des Kaltpräzipitats) gefangen werden.
Wenn loses DEAE-SEPHADEX verwendet wird, kann der stromabwärts gelegene
Filter als Säule
für die
Elution des DEAE-SEPHADEX dienen. Alternativ kann das DEAE-SEPHADEX in
der stromabwärts
gelegenen Filterkartusche platziert werden. Eine zusätzliche
Option ist der Einschluss des dehydratisierenden SEPHADEX-Materials
in eine permeable Umschließung,
wie z.B. eine Tasche aus Nylon-Sieb oder ähnlichem Material. Diese Ansätze erzeugen
einer spezielle Bluttasche 32 entweder mit losem SEPHADEX
oder mit einem umschlossenen SEPHADEX-Paket 34. Es ist
auch möglich,
das Paket 34 aus einer differentiell permeablen Membran,
wie z.B. einem Dialyseschlauch, zu konstruieren. Dies ermöglicht die Verwendung
von Dehydratisierungsmitteln (d.h., Aquacides) für allgemeine Zwecke; dieser
Ansatz führt
jedoch im allgemeinen zu einer sehr viel langsameren Dehydratisierung
als die Verwendung eines chromatografischen Materials entweder lose
in der Bluttasche oder umschlossen in einem vollständig permeablen
Paket 34.
-
Die
Kombination Tasche-Paket kann mit einem Kartuschenfilter wie oben
erklärt,
verwendet werden.
-
Bei
der Verwendung dieser Vorrichtung, nachdem die Plasmaeinheit in
die Tasche 32 abgegeben ist, wird die Plasma-gefüllte Tasche 32 auf
einem Schüttel-
oder Rotationsmischer platziert, um das eingeschlossene Plasma zu
zirkulieren, während
die Dehydratisierung stattfindet. Da kein derartig direkter Kontakt
zu Plasma und SEPHADEX wie im Fall der Kartusche vorliegen kann,
kann der Dehydratisierungsprozess etwas länger dauern. Folgend auf die
Dehydratisierung kann das Plasma gekühlt oder in situ eingefroren
werden oder kann in eine andere Bluttasche vor dem Kaltpräzipitationsschritt übertragen
werden.
-
Die
Erträge
können
unter Verwendung des Pakets 34 etwas niedriger liegen,
da es im allgemeinen nicht möglich
ist, so viel zurückgehaltenes
Plasma aus dem Paket 34, wie aus dem Kartuschenfilter 10 zu
entfernen. In dieser Ausführungsform
ist es auch nicht günstig
gleichzeitig DEAE-SEPHADEX in dem Paket 34 zur Erzeugung
eines Prothrombinkomplexes zu verwenden. Dies liegt daran, dass
die Bluttasche 32 aufgeschnitten werden muss, um an das
Paket 34 für
Elutionszwecke zu gelangen. Dies ist auch ein gewisses Sicherheitsrisiko,
da es die Möglichkeit
eines Kontakts mit potentiell kontaminierten Plasma erhöht. Gute
Ergebnisse können
durch einfaches Einführen
des Pakets 34 in eine leere breite Säule 36, wie dargestellt
in 4, erhalten werden oder das Paket 34 kann
geöffnet
werden und der Inhalt auf eine Säule
gegossen werden, wie auf dem Gebiet bekannt. Das Paket 34 kann
einfach auf die Säule 36 gedrückt werden
und ein Oberteil 38 wird inseriert. Zu diesem Zeitpunkt
kann das Paket gespült
und exakt, wie bei dem Kartuschenfilter 10 in Beispiel 2,
eluiert werden.
-
Alternativ
kann ein etwas schlechterer Ertrag an Prothrombinkomplex durch Elution
des Pakets 34 in situ mit der Bluttasche 32 erhalten
werden. In diesem Fall wird das benötigte Volumen des Elutionspuffers
in die Bluttasche 32 eingegeben und die Tasche auf einer
Mischvorrichtung platziert. Die Elution benötigt in diesem Fall deutlich
länger
und wird am besten mit beiden Volumen des Eluats, die darauffolgend
gesammelt wurden, wiederholt. Dieses Verfahren kann eine zusätzliche
Manipulation benötigen
um dieses erhöhte
Volumen zu dehydratisieren, um den Prothrombinkomplex auf das gewünschte Stärkeniveau
einzustellen.
-
Für experimentelle
Zwecke kann der Ansatz 30 mit losem SEPHADEX bei der Bewertung
des Verfahrens so entworfen werden, dass einfach verschiedene Volumen
SEPHADEX in Plasmaaliquots gemischt werden. Bei diesem Experiment
wurden 2,0, 1,5, 1,0 oder 0,5 g trockenes SEPHADEX G-75 in 25 ml
Volumen menschliches Plasma dispergiert. Das dispergierte SEPHADEX
wurde gut ge mischt und dann 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert,
um dem G-75 ein vollständiges
Anschwellen zu ermöglichen.
Das SEPHADEX wurde aus jeder Probe gefiltert und ein 5 ml-Teil jeder
Probe wurde für
24 Stunden bei 5°C
gelagert. Während dieser
Zeit wurde ein Kaltpräzipitat
gebildet, das durch Zentrifugation bei 2.000 UPM für 5 Minuten
geerntet wurde. Das Volumen des Präzipitats wurde gemessen und
geerntet. Der Überstand
wurde für
2 Stunden bei –70°C eingefroren
und dann für
24 Stunden bei 5°C
aufgetaut, was zu einem zweiten Kaltpräzipitat führte, das ebenfalls durch Zentrifugation
geerntet wurde. Tabelle 2 vergleicht den Ertrag des Kaltpräzipitats
gemäß der Menge
von Sephadex G-75.
-
-
Aus
diesen Ergebnissen wird deutlich, dass der Anstieg in dem Ertrag
des Kaltpräzipitats
nicht linear als Funktion der Menge von zugefügtem SEPHADEX zu erkennen ist.
Die Erhöhung
von SEPHADEX von 0,5 bis 1,0 g (100%iger Anstieg von SEPHADEX) führt zu einem
125%igen Anstieg des Kaltpräzipitats.
Die Erhöhung
von SEPHADEX von 1,5 auf 2,0 g (eine 33%iger Anstieg von SEPHADEX)
führt zu
einem weiteren 75%igen Anstieg an Kaltpräzipitat (dies würde sich
zu einem Gesamt-225%igen Ertrag aufrechnen). Wenn das Plasma konzentrierter
wird, führt
es zu einer progressiv größeren Menge
Kaltpräzipitat.
Wenn exzessive Mengen SEPHADEX zugefügt werden gibt es eine gewisse
Gefahr einer Erniedrigung der Qualität des Kaltpräzipitats,
da andere Plasmaproteine (neben den Koagulationsfaktoren) in größer werdende
Menge ausfallen. Wahrscheinlich ist eine Rate von ungefähr 1 g SEPHADEX
pro 100 ml Plasma fast optimal.
