Verfahren zur Herstellung von Urokinase
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Urokinase aus wässrigen Lösungen, die diese enthalten, z. B. aus dem Urin von Säugetieren. Auch die Reinigung der so gewonnenen Urokinase ist vorgesehen.
Urokinase, ein Enzym, das im Urin von Säugetieren vorkommt, katalysiert die Umwandlung von Plasminogen (Profibrinolysin) zu Plasmin (Fibrinolysin), einem Enzym, das zum Auflösen von Fibringerinnseln fähig ist. Urokinase-enthaltende Präparate haben sich als therapeutische Mittel als wertvoll erwiesen, insbesondere bei der fibrinolytischen Behandlung von thromboembolischen Krankheiten des Menschen.
Es ist bekannt, Urokinase-enthaltende Präparate aus dem Urin von Säugetieren durch verschiedene Verfahren zu gewinnen, die im allgemeinen die folgenden Verfahrensstufen umfassen: Behandlung von Säugetierurin mit einem Reagenz, das die Bildung eines Urokinase-haltigen Niederschlags bewirkt; Sammeln des Urokinase-haltigen Niederschlags; und Elution des Niederschlags, um eine Urokinase-enthaltende Lösung herzustellen. In einigen Fällen wurde das so erhaltene Eluat als solches wegen seiner fibrinolytischen Aktivität verwendet, um die Reinheit der Urokinase zu verbessern. Nach den bekannten Verfahren gelang es nicht, ein kristallines Präparat von Urokinase herzustellen.
Es sind verschiedene Reagentien bekannt, die beim Kontaktieren mit Säugetierurin eine Abtrennung eines leicht zu sammelnden Niederschlags bewirken, der im wesentlichen die gesamten, oder einen Grossteil der Urinproteine, einschliesslich der Urokinase, enthält, zusammen mit anderem proteinartigen Material. Andererseits bringen Pyrogene, Inhibitoren, thromboplastische Substanzen und dergleichen beim Aufarbeiten des erhaltenen Urokinase-haltigen Niederschlags zur Abtrennung der Urokinase in guter Ausbeute und hoher Qualität von dem Ausfällungsmittel und von den verunreinigenden Proteinen viele schwierige Probleme mit sich.
Als Folge davon litten alle diese Verfahren an schwerwiegenden Nachteilen, obwohl die bekannten Methoden mehr oder weniger konzentrierte Präparate von Urokinase herzustellen gestatteten, und keines die ser Verfahren führte zu einem kristallinen Urokinase
Präparat.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neuar tige Verbesserungen in bestimmten Verfahrensschritten der oben erwähnten allgemeinen Methoden zur Isolie rung und Reinigung von Urokinase aus Säugetierurin zu schaffen, um damit ein neues Verfahren zur Gewin nung von Urokinase zu liefern, das diese verbesserten
Verfahrensschritte beinhaltet, so dass Urokinase in guter Ausbeute und von einem hohen Reinheitsgrad ge wonnen wird, und um Urokinase in kristallin er Form herzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von Urokinase, das sich dadurch auszeich net, dass man eine Urokinase enthaltende wässrige
Lösung mit einem Reagenz behandelt, das die Bildung eines Urokinase enthaltenden Niederschlages bewirkt und anschliessend den Urokinase enthaltenden Nieder schlag mit 6,9-Diamino-2-äthoxy-acridin eluiert.
Bei einer speziellen Ausführungsart des erfindungs gemässen Verfahrens verwendet man als Urokinase enthaltende wässrige Lösung Säugetierharn und als den Urokinase enthaltenden Niederschlag bildendes
Reagenz wird entweder eine Säure die in einer solchen
Menge zugesetzt wird, dass der pH-Wert des Harnes auf 4 bis 5,5 gebracht wird, oder ein saures Absorp tionsmlttel, das die Urokinase infolge einer chemischen
Reaktion bindet, eingesetzt.
Gemäss einer weiteren Ausführungsart des erfin dungsgemässen Verfahrens wird man als Reagenz, das aus der Urokinase enthaltenden Lösung die Bildung eines Urokinase enthaltenden Niederschlages bewirkt,
Kalziumphosphat-Gel oder ein entsprechendes amor phes wasserunlösliches Erdalkaliphosphat verwenden, wobei auf dem Gel bzw. dem Erdalkaliphosphat
6,9-Diamino-2-äthoxy-acridin absorbiert ist. Man kann als Urokinase enthaltende wässrige Lösung eine solche verwenden, die mindestens 500 CTA-Einheiten Urokinase pro ml enthält und als Reagenz zur Herstellung des Urokinase enthaltenden Niederschiages eine bei einem pH-Wert von 5,0 bis 6,5 mit der Urokinase enthaltenden Lösung zusammengebrachte Carboxymethylcellulose verwenden.
Ferner ist es möglich, dass ein Urokinasepräparat mit einer Urokinaseaktivität von mindestens 40.000 CrA-Einheiten pro mg Protein mit Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6 bis 7 zur Herstellung einer Lösung mit einer Urokinase-Aktivität von mindestens 100.000 CTA-Einheiten pro ml gelöst wird, die erhaltene Lösung bei einer Temperatur im ungefähren Bereich von O C bis 40 C gegen Wasser dialysiert wird, bis der spezifische Widerstand auf mindestens 2.500 Ohm ansteigt, der gebildete Niederschlag entfernt und verworfen wird, die Urokinase aus der Lösung mit Natriumchlorid ausgesalzen wird,
die auf diese Weise ausge fällt Urokinase gesammelt und in wässriger Natriumchloridlösung gelöst wird und die Urokinase aus der Lösung mit Natriumchlorid ausgesalzen wird, wobei die Urokinase in kristalliner Form gewonnen wird.
In der Folge werden einzelne Schritte und spezielle Ausführungsarten des erfindungsgemässen Verfahrens näher erläutert: l. Elution von Urokinase aus Urokinase-haltigen, aus Urin gewonnenen Niederschlägen
In einer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbesserung der Elutionsstufe der oben gezeigten, allgemeinen Methode zur Gewinnung von Urokinase, wonach Urin von Säugetieren mit einem Reagenz behandelt wird, das die Bildung eines Urokinase-haltigen Niederschlages bewirkt, der entstandene Niederschlag gesammelt wird und die Urokinase dann aus dem Niederschlag eluiert wird, wobei die Verbesserung die Elution der Urokinase aus dem UrokinaseWenthal- tenden Niederschlag mit einer verdünnten wässrigen Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin umfasst.
Die Konzentration des 6,9-Diamino-2-äthoxyacridins in der Elutionslösung beträgt 0,1 bis 2 oder mehr Gewichtsprozent und vorzugsweise etwa 0,4 Gewichtsprozent.
Der pH der Lösung wird auf einen Wert im. ungefähren Bereich von 1,5-7 eingestellt; vorzugsweise ist die Lösung sauer im pH-Bereich von 2-5. Gewünschtenfalls kann das 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin aus dem Eluat durch Aussalzen mit Natriumchlorid oder einem äquivalenten wasserlöslichen anorganischen Salz leicht entfernt werden. Wahlweise und vorteilhafterweise wird die Entfernung des 6,9-Diamino-2-äthoxyacridins in Zusammenhang mit dem im Folgenden im Abschnitt II beschriebenen Verfahren zur Entfernung von Pyrogenen aus Urokinase-Lösung bewirkt.
Die Ausfällung des Urokinase-haltigen Niederschlags nach der oben beschriebenen Methode ist leicht durchzuführen, zum Beispiel durch Anwendung der vielen gut bekannten Methoden zur Ausfällung von Urokinase aus Säugetierurin. In den Fällen, wo die Elutionsstufe nicht sofort auf die Ausfällungsstufe folgt, z. B. dann, wenn eine Anzahl von Chargen an Niederschlag über eine Anzahl von Tagen gesammelt und dann zusammengegeben wird, um eine zufriedenstellende Ausbeute an Urokinase sicherzustellen, sollte der nasse Urokinase,haltige Niederschlag sofort nach dem Sammeln eingefroren und in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden. Die gefrorenen Niederschläge werden aufgetaut, wenn sie für den Elutionsscliritt gebraucht werden.
Es ist insbesondere vorzuziehen, den Urokinase haltigen Niederschlag in der Weise zu gewinnen, dass der Säugetierurin mit Bentonit oder einer äquivalenten Aluminiumsilikatzusammensetzung kontaktiert und danach der Bentonit mit der daran adsorbierten Urikonase, beispielsweise durch Zentrifugieren, gesammelt wird. Im allgemeinen wird bevorzugt, etwa 0,1-0,5 g Bentonit pro Liter Urin zu verwenden, um schnelle und ausreichende Adsorption von Urokinase sicherzustellen. Obwohl nach dem Stand der Technik bekannt war, dass Bentonit wirkungsvoll die gesamte Urokinase aus Urin adsorbiert, wurde nach den bekannten Verfahren keine praktische Methode zur Rückgewinnung der adsorbierten Urokinase von dem Bentonit beschrieben.
Es wurde nun gefunden, dass eine wässrige Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin, vorzugsweise bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 1,5-7, ein hochwirksames Elutionsmittel zur Wiedergewinnung von Urokinase von Bentonit, an dem die Urokinase adsorbiert ist, darstellt.
Eine weitere bequeme und einfache Methode zur Gewinnung eines Urokinase enthaltenden Niederschlags aus Säugetierurin, die im Zusammenhang mit dem oben beschriebenen Verfahren verwendet werden kann, umfasst das Einstellen des pH-Werts des Urins auf einen Wert im ungefähren Bereich von 4-5,5, z. B.
durch Zugabe von Essigsäure oder einer anderen geeigneten Säure, Abkühlen des in der Weise angesäuerten Urins und Sammeln des gebildeten Urokinasewhalti- gen Niederschlages.
Es wurde noch eine weitere Methode gefunden, wonach Urokinase in guter Ausbeute aus dem Urokinase-haltigen Niederschlag, der durch Ansäuren des Urins gebildet wurde, eluiert werden kann. Die neue Methode umfasst das ausgiebige Waschen des Urokinase-haltigen Niederschlags mit angesäuertem Wasser bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 3,2-5,5 und danach die Elution der Urokinase aus dem so gei waschenen Niederschlag mit angesäuertem Wasser bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 1,5 bis 3, wobei ein pH-Wert von 2 bevorzugt wird.
II. ntfernung von Pyrogenen von Urokinase-Lösungen
In anderer, Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Entfernung von Pyrogenen aus wässrigen Urokinase-Lösungen.
Es ist bekannt, Pyrogene aus wässrigen Lösungen von biologisch aktiven Materialien, einschliesslich von verschiedenen zur Injektion vorgesehenen Enzymtypen, durch Zugabe eines wasserunlöslichen Erdalkaliphosphats wie Calciumphosphat zu entfernen, um die Pyrogene, nicht jedoch das gewünschte biologisch aktive Material zu adsorbieren, wobei das Phosphat mit den darauf adsorbierten Pyrogenen dann entfernt und verworfen wird. Diese bekannte Methode bewirkt jedoch nicht die Abtrennung von Pyrogenen von Uro kinase, da Urokinase ebenfalls durch das wasserunlösliche Phosphat adsorbiert wird und darüber hinaus konventionelle Elutionsmittel sowohl die adsorbierten Pyrogene als auch die adsorbierten Urokinase von dem unlöslichen Phosphat entfernen.
Es wurde nun gefunden, dass, wenn eine pyrogenhaltige wässrige Lösung von Urokinase mit Calcium phosphatgel oder einem äquivalenten amorphen wasserunlöslichen Erdalkaliphosphat, das 6,9-Diamino2-äthoxyacridin adsorbiert enthält, kontaktiert wird, die Urokinase und ein Grossteil der Pyrogene auf das Gel adsorbiert wird und durch Elution mit einem Puffer aus Natriumphosphat oder einem äquivalenten Phosphat, die adsorbierte Urokinase und nur ein geringer Teil des adsorbierten 6,9-Diamino-2-äthoxyacridins entfernt werden, während fast die gesamten Pyrogene auf dem Gel verbleiben. Der Elutionsschritt verläuft sehr viel wirksamer, wenn das Gel eingefroren und danach aufgetaut wird.
Die relativ geringe Menge an 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin, die in dem entstandenen Eluat vorhanden sind, können aus dem Urokinase-haltigen Eluat durch Behandlung mit Natriumchlorid oder einem äquivalenten wasserlöslichen anorganischen Salz ausgesalzen oder durch Adsorbtion an Carboxymethylcellulose entfernt werden. Wahlweise wird die Urokinase ausgefällt und aus dem Eluat durch Zugabe eines niederen Alkanols isoliert, wobei das 6,9-Diamino2-äthoxyacridin in Lösung bleibt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die neue Methode zur Pyrolgenentfernung die folgenden Verfahrensschritte: Kontaktieren einer Pyrogen-haltigen wässrigen Urokinaselösung bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6,0-7,0 mit Calciumphosphatgel, das 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin adsorbiert enthält, wobei die Urokinase und ein Grossteil der Pyrogene an das Calciumphosphatgel adsorbiert werden; Sammeln des Calciumphosphatgels mit den darauf adsorbierten Verbindungen Urokinase, Pyrogene und 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin, Waschen des Gels mit Wasser unter Verwerfen der Waschflüssigkeit;
Suspendieren des Gels in einem Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6,0-7,0, wobei die molare Konzentration von Natriumphosphat mindestens 0,25 beträgt und vorzugsweise in ungefähren Bereich von 0,25-0,50 liegt, wobei wiederum eine molare Konzentration von 0,36 besonders bevorzugt wird; Einfrieren des entstandenen Gemisches und danach Auftauen desselben, wobei die Urokinase und eine geringe Menge von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin von dem Gel in den Phosphatpuffer eluiert werden und der grösste Teil der Pyrogene am Gel adsorbiert bleibt; und Abtrennen des restlichen 6,9-Diamino-2-äthoxy- acridins von der Urokinase.
Das obige Verfahren ist insbesondere vorteilhaft, wenn es zur Entfernung von Pyrogenen aus dem 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-enthaltenden wässrigen Urokinaselösungen, die im obigen Abschnitt I als Elutionsmittel beschrieben sind, angewandt wird, da in diesem Falle das zur Adsorbierung auf das Calciumphosphat benötigte 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin bereits vorhanden ist und damit keine Vorbehandlung des Calciumphosphats erforderlich ist; und gleichzeitig dient natürlich das Verfahren zur Entfernung des Pyrogens auch dazu, den grössten Teil des 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-Elutionsmittels von der Urokinase abzutrennen.
III. Adsorption von Urokinase auf Carboxymethylcellulose und
Elution von diesem Material
In weiterer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Methode zur Reinigung und Konzentrierung von Urokinase in wässrigen Lösungen, die mindestens 500 CTA-Einheiten Urokinase pro ml Lösung enthalten, also in Lösungen, in denen die Urokinasekonzentration etwa das hundert- oder mehrfache der Konzentration an Urokinase, die üblicherweise im Urin vorhanden ist und 66 CTA-Einheiten pro ml ausmacht, beträgt. Die neue Methode umfasst die folgenden Verfahrensschritte: Kontaktieren einer wässrigen Lösung, die mindestens 500 CTA-Einheiten Urokinase pro ml enthält, bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 5,0 bis 6,5 mit Carboxymethylcellulose, welche die Urokinase adsorbiert; und anschliessend Elution der Urokinase von der Carboxymethylcellulose.
Die Elution wird leicht bewirkt durch Verwendung wässriger Lösungen hoher Ionenstärke, z. B.
einer Natriumphosphatpufferlösung; oder wahlweise können statt des Salzes oder der Pufferlösung auch stark saure Medien von einem pH-Wert bis hinab zu 1,5, oder stark basische Medien von einem pH-Wert bis hinauf zu 11,5 verwendet werden. Diese neue Methode kann entweder in einem chargenweisen Verfahren durchgeführt werden, bei dem die wässrige Lösung und die Carboxymethylcellulose vermischt werden und zwischen den festen und flüssigen Phasen Gleichgewichte eingestellt werden, oder in einer kontinuierlichen Waschprozedur, wie in einer Elution durch eine Säule.
In einem chargenweisen Verfahren wird die Carboxymethylcellulose mit der darauf adsorbierten Urokinase gesammelt und die Urokinase wird von der Carboxymethylcellulose eluiert, vorzugsweise mit Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6,0-7,0, wobei die molare Konzentration an Natriumphosphat mindestens 0,25 beträgt und vorzugsweise im ungefähren Bereich von 0,25-0,50 liegt, wobei eine molare Konzentration von 0,29 besonders bevorzugt wird.
In einer kontinuierlichen Ausführungsform liegt der pH-Wert des Natriumphosphatpuffers vorzugsweise im ungefähren Bereich von 1-11 und die molare Konzentration an Natriumphosphat liegt im ungefähren Bereich von 0.005-0,5, wobei eine Konzentration von etwa 0,05 im pH-Bereich von 2-5 und 7-11 bevorzugt wird, und eine Konzentration von mindestens 0,05 und wünschenswerterweise von etwa 0,2 im pH-Bereich von 5-7 bevorzugt wird.
Die meisten Pyrogene werden durch diese Carboxymethylcellulosebehandlung von der Urokinase abgetrennt. Darüber hinaus wird eine wesentliche Konzentrierung der Urokinase bewirkt. Wenn daher die Methode zur Reinigung von Urokinase mit einer relativ niedrigen durchschnittlichen spezifischen Urokinaseaktivität, z. B. im ungefähren Bereich von 1000 bis 20 000 CTA-Einheiten pro mg Protein, verwendet wird, weist die Urokinase in dem resultierenden Eluat eine wesentlich gesteigerte Aktivität auf, im allgemeinen das 5- bis 10-fache oder mehr.
Das urokinasehaltige Eluat, das nach dem im obigen Abschnitt II beschriebenen Verfahren gewonnen wird, ist insbesondere zur Verwendung als Ausgangsmaterial bei diesem Carboxymethylcellulose-Verfahren geeignet. In diesem Falle sollte die molare Konzentration des Natriumphosphats im Eluat durch Verdünnen auf einen Wert unter 0,15 vermindert werden, um maximale Adsorption von Urokinase auf Carboxymethylcellulose zu gewährleisten.
Durch Anwendung beider Methoden, nämlich sowohl der Adsorption auf Carboxymethylcellulose als auch der Adsorption auf 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin behandeltes Calciumphosphat, wird Urokinase erhalten, die im wesentlichen pyrogenfrei ist.
IV. Gewinnung von Urokinase in hochkonzentrierter Form aus Säugetierurin
In weiterer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Methode zur Gewinnung von Urokinase im Hinblick auf ein neues Verfahren zur Gewinnung von Urokinase in hochkonzentrierter Form aus Säugetierurin, in dem die verschiedenen anderen oben beschriebenen erfindungsgemässen Merkmale kombiniert sind.
Dieses neue Verfahren umfasst die folgenden Verfahrensschritte: Behandlung von Säugetierurin mit einem Reagenz, das die Bildung eines urokinasehaltigen Niederschlags bewirkt, Elution der Urokinase von dem urokinasehaltigen Niederschlag mit einer verdünnten wässrigen Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin;
Kontaktieren des entstandenen Eluats, vorzugsweise bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6,0-7,0, mit Calciumphosphatgel, wobei die Urokinase, Pyrogene und ein geringer Teil des 6,9-Diami- no-2-äthoxyacridins auf dem Gel adsorbiert werden, und anschliessend Sammeln des Gels, Suspendieren des Gels in einem Natriumphosphatpuffer (vorzugsweise bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6,0-7,0, wobei die molare Konzentration des Natriumphosphats im ungefähren Bereich von 0,25 bis 0,50 liegt) und Einfrieren des Gemisches und anschliessendes Auftauen desselben, wobei die Urokinase und ein geringer Teil des 6,9-Diamino-2-äthoxyacridins von dem Gel in den Phosphatpuffer eluiert werden und die Hauptmenge der Pyrogene am Gel adsorbiert bleibt;
; Kontaktieren des urokinasehaltigen Eluats mit Carboxymethylcellulose, die das restliche 6,9-Diamino2-äthoxyacridin adsorbiert; Abtrennen der Carboxymethylcellulose mit dem darauf adsorbierten 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin von der urokinasehaltigen Lösung; Einstellen der molaren Konzentration des Natriumphosphats in der urokinasehaltigen Lösung auf einen Wert, der nicht grösser ist als ungefähr 0,15 und Kontaktieren der entstandenen Lösung bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 5,0 bis 6,5 mit Carboxyme thylcellulose, die die Urokinase adsorbiert; und Elution der Urokinase von der Carboxymethylcellulose, vorzugsweise mit einem Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6,0 bis 7,0, wobei die molare Konzentration des Natriumphosphats mindestens 0,25 beträgt.
V. Herstellung von kristalliner menschlicher Urokinase
In weiterer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung menschliche Urokinase in kristalliner, im wesentlichen homogener Form und Mittel zur Gewinnung derselben.
Seit der Entdeckung der Urokinase vor mehr als einem Jahrzehnt wurde eine Reihe von Verfahren zur partiellen Reinigung des Enzyms beschrieben. Viele der mehr grundsätzlichen chemischen und biologischen Untersuchungen der Urokinase litten jedoch an dem Mangel an im wesentlichen homogenen Präparaten.
Nunmehr ist es gelungen, menschliche Urokinase in kristalliner, im wesentlichen homogener Form dadurch zu gewinnen, dass als Ausgangsmaterial wässrige Lösungen hochgereinigter menschlicher Urokinasepräparate mit einer Aktivität von 40 000 oder mehr CTA Einheiten pro mg Protein verwendet werden. Die erforderlichen Ausgangspräparate für dieses Verfahren wurden durch Anwendung der verschiedenen weiteren Merkmale dieser Erfindung, wie sie vorstehend beschrieben sind, verfügbar.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird menschliche Urokinase in kristalliner Form folgendermassen gewonnen: Lösen eines Urokinasepräparats mit einer Urokinaseaktivität von mindestens 40 000 CTA-Einheiten pro mg Protein mit Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert im ungefähren Bereich von 6 bis 7 zur Herstellung einer Lösung mit einer Urokinaseaktivität von mindestens 100 000 CTA-Einheiten pro ml;
Dialysieren der erhaltenen Lösung bei 04 C gegen Wasser, bis Ider spezifische Widerstand auf mindestens 2500 Ohm ansteigt, Entfernen und Verwerfen des gebildeten Niederschlags, Aussalzen der Urokinase aus der Lösung durch Behandeln mit Natriumchlorid, Sammeln der auf diese Weise ausgefällten Urokinase und Lösen derselben in wässriger Natriumchloridlösung; und Aussalzen der Urokinase aus der Lösung mit Natriumchlorid, wobei die Urokinase in kristalliner Form erhalten wird. Durch weitere Umkristallisation dieses Produktes wie in Beispiel 3 beschrieben, wird Urokinase in kristalliner, im wesentlichen homogener Form erhalten.
Das so erhaltene Produkt hat ein Molekulargewicht von etwa 53 300 und eine spezifische Aktivität von 652 000129 800 (s. d.) CIA-Einheiten pro mg Stickstoff (4jeldahl), oder 10400014800 (s. d.) CTA-Einheiten pro mg geschätztes Protein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Die engen Bereiche für pH, Temperatur, Konzentrationen und dergleichen werden in diesen Beispielen nur deshalb angegeben, um in einer Serie von Ansätzen ausreichend gut reproduzierbare Resultate zu erzielen und diese Angaben stellen keine kritischen Bedingungen dar, die in einem bestimmten Falle für eine zufriedenstellende Nacharbeitbarkeit notwendig sind.
Beispiel 1 (A) Sammeln des Urins
Menschlicher Urin von Männern wird direkt über Borsäurepulver (U. S. P.) in reinen 19 Liter (5-gallon) Polyäthylenballongefässen, die mit reinen 10 Zoll Polyäthylentrichtern ausgestattet sind, gesammelt. Die Menge an Borsäure, die in jedem Ballon vorhanden ist, sollte so bemessen sein, dass nach dem Sammeln des beabsichtigten Volumens Urin die Endkonzentration an Borsäure annähernd 0,25 0/o (G/V) beträgt; wenn z. B. beabsichtigt ist, dass der Inhalt der Ballons durchschnittlich 11,5 Liter (3 gallons) Urin aufnehmen soll, sollten 30 g Borsäure in jedem Ballon vor Gebrauch eingeführt werden. Die Trichter enthalten die üblicherweise verwendeten Desodoransblocks aus p Dichlorbenzol.
Vorteilhafterweise sollten die Sammelperioden 12 Stunden nicht überschceiten, da zur Erzielung der besten Resultate Bakterienwachstum und Bildung von Pyrogenen im Urin auf ein Minimum beschränkt werden sollte. Die vollen Gefässe werden also sofort nach der relativ volumenreichen morgendlichen Harnabgabe gesammelt. Eine derartige Zeiteinteilung erlaubt das Aufarbeiten des Urins mit der geringsten Verzögerung. Wenn Urin während der folgenden 12 Stunden-Periode gesammelt wird, wird er unter Kühlung aufbewahrt, bis er am nächsten Morgen aufgearbeitet wird.
(B) Adsorption von Urokinase aus Urin
Zu 160 Liter zusammengeschüttetem menschlichen Urin werden bei 15-250C 24 g Bentonitpulver (U. S. P.) unter Rühren zugegeben. Um eine gleichmässige Dispersion des Bentonits sicherzustellen, wird er vorzugsweise als eine frisch bereitete 3 0/obige Suspension in Urin zugesetzt. Nachdem das Gemisch 20 Minuten oder länger gerührt wurde, wird der gebildete Niederschlag isoliert durch Zentrifugieren, z. B. in einer eiswassergekühlten Zentrriuge mit einer ein Viertel Zoll Zulaufröhre und einer Durchlaufrate von 473 Ltr./Std.
(125 gal/hr). Der Niederschlag wird aus der Zentrifuge unverzüglich entnommen und sofort in einem Poly äthylenbeutel oder einer Polyäthylenflasche eingefroren; das Durchschnittsgewicht des so erhaltenen nassen Niederschlags beträgt 0,8 g pro Liter Urin (in einer repräsentativen Serie von Versuchsansätzen bewegt sich die Menge zwischen 0,65 und 1,4g). Der Urin überstand wird nach Probeentnahme verworfen, während der Niederschlag, der über 98 O/o der im Urin ur sprünglich vorhandenen Urokinase enthält, im gefrorenen Zustand aufbewahrt wird, bis eine ausreichende Zahl von Chargen beisammen sind, um mit der weiteren Reinigung fortzufahren.
(C) Elution von adsorbierter Urokinase von Bentonit
Die erhaltenen, wie in Abschnitt (B) beschriebenen Bentonit-Niederschläge werden vereinigt, um in einer beliebigen Menge, die von der Kapazität der vorhandenen Ausstattung, der Zeiteinteilung oder anderen durchgreifenden Überlegungen abhängt, weiter verarbeitet zu werden. Im vorliegenden Beispiel werden zum Zwecke der Erläuterung zehn Chargen vereinigt.
Wenn eine injizierbare Urokinasezusammensetzung erhalten werden soll, sollten während des gesamten folgenden präparativen Herstellungsverfahrens Wasser, Reagenzien und Gefässe pyrogenfrei sein.
Die gefrorenen Bentonitniederschläge (ungefähr 1,25 kg), die durch Behandlung von insgesamt 1600 Litern Urin gewonnen wurden, werden zusammengegeben und partiell bei Zimmertemperatur auftauen gelassen; die vereinigten Niederschläge werden homogenisiert mit geringen Mengen kalten Wassers von weniger als 10 C. Das Homogenat wird auf 32 Liter durch Zugabe von Wasser von 100 C verdünnt und der pH-Wert wird sorgfältig auf 4,00 F 0,05 durch langsame Zugabe von n-HCl unter gutem Rühren eingestellt.
Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren in der Kälte bei 1500 g isoliert; das überstehende Waschwasser wird verworfen. Das Waschen wird wiederholt, doch ist der Homogenisierungsschritt im allgemeinen während dieser zweiten Waschprozedur unnötig. Der zweimal gewaschene Bentonit-Niederschlag wird in 25,6 Liter Wasser suspendiert, vorzugsweise bei etwa 37 C, und 6,4 Liter 2,0 0Folge (GjV) wässrige Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat-monohydrat, die vorher auf pH 4,0 eingestellt wurde, werden bei einer Temperatur von 370 C oder weniger zugegeben.
Die Temperatur des Gemisches wird dann auf 3711 0C erhöht und der pH-Wert unter konstantem Rühren auf 4,00 eingestellt. Das Gemisch wird dann bei 1500 g 20 Minuten zentrifugiert und der Niederschlag verworfen; die überstehende Flüssigkeit, die mehr als 90 O/o der im ursprünglichen Urin vorhandenen Aktivität enthält, wird schnell auf 040 C abgekühlt und der pH-Wert wird dann auf 6,50+0,05 durch vorsichtige Zugabe von n-HCl unter Rühren eingestellt. Eine aliquote Probe wird zur sofortigen Untersuchung entnommen.
Die nächste Verfahrensstufe (D) muss unverzüglich angeschlossen werden.
(D) Adsorption von Urokinase an Calciumphosphatgel
Eine Calciumphosphatgelsuspension wird folgendermassen hergestellt:
Eine Lösung von 53,5 g Calciumchlorid in 3,5 Liter destilliertem Wasser wird zu einer Lösung von 122,5 g NaaPO4 12H2O in 3,5 Liter destilliertem Wasser zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten in der Kälte gerührt und das Gel durch 10-minütlges Zentrifugieren bei 1500 g und 0 C gesammelt; das Gelvolumen beträgt ungefähr 1,5 Liter. Das Gel wird erneut in 4 Liter 0,0725 m-NaH2PO4 suspendiert und 30 Minuten gerührt und erneut durch Zentrifugieren gesammelt. Das Gel wird dann zweimal mit 4 Liter Portionen Wasser gewaschen; das Endvolumen des zentrifugierten Gels beträgt ungefähr 800 ml (entsprechend 50 g Ca2(PO4)2, bezogen auf Trockengewicht).
Das Gel wird in soviel destillierten Wasser suspendiert, dass das Gesamtvolumen 2000 ml beträgt und 25 mg (bezogen auf Trockengewicht) Ca8(PO4)2/ml enthält.
Die wässrige Lösung von 6,9-Diamin2-äthoxy- acridin-lactat-monohydrat und Urokinase von pH 6,5O, die entsprechend obigem Abschnitt (C) erhalten wurde, wird mit soviel Calciumphosphatgelsuspension, die wie oben beschrieben erhalten wurde, behandelt, dass 1 mg, bezogen auf Trockengewicht, Cas(po4)2 pro 200 CTA-Einheiten Urokinase vorliegt. Die Durchschnitts menge an gebrauchtem Cas(PO4)2 beträgt 33 mg (bezogen auf Trockengewicht) pro Liter bis zu dieser Stufe aufgearbeitetem Urin. Falls spezielle Versuchsdaten nicht vorliegen, wird die 50 mg Trockengewicht entsprechende Menge Ca3(P04)2 pro Liter bis zu dieser Verfahrensstufe aufgearbeiteten Urins zugesetzt, um hinreichende Adsorption von Urokinase sicherzustellen.
Die Cas(PO4)2-Gelsuspension wird zu der Urokinaselösung schnell unter heftigem Rühren bei 40 C oder darunter zugesetzt. Die Rührgeschwindigkeit wird dann sofort vermindert und unter diesen Bedingungen 30 Minuten gehalten, wonach die Gelfraktion durch Zentrifugieren isoliert wird. Bevor die überstehende Flüssigkeit verworfen wird, sollte man sich durch eine Probe bestimmung vergewissern, dass weniger als 5 O/o der ursprünglichen Urokinaseaktivität darin verbleiben. Das Gel, das adsorbierte Urokinase und 6,9-Diamino 2-äthoxyacridin-lactat enthält, wird durch gelindes Dispergieren in 10 Volumen Wasser von 4 C oder darunter gewaschen. Das Gel wird dann erneut durch Zentrifugieren isoliert und gewogen; die Waschflüssigkeit wird verworfen.
Eine Menge von 0,725 m-Natriumphosphatpuffer vom pH 6,50c0,02, die gewichts mässig der Menge Flüssigkeit entspricht, die in dem feuchten Gel eingeschlossen ist, wird zu dem Gel zugefügt und das Gemisch wird langsam gerührt, um eine gleichmässige Dispersion des Gels zu erhalten. Eine aliquote Probe wird zur Bestimmung der Wirksamkeit und Pyrogenität und zur vorläufigen Untersuchung der Tilermostabilität entnommen. Die aliquote Menge Gelsuspension wird zentrifugiert, bzw. vorzugsweise eingefroren und die Suspension vor dem Zentrifugieren aufgetaut.
Bei Verwendung der überstehenden Fraktion sollten intravenöse Dosen von 200 CTA-Einheiten/kg bei dieser Verfahrensstufe nur geringfügig pyrogen wirken, d. h. der Temperaturanstieg an Versuchsratten sollte nicht mehr als 0,6-0,8 C betragen. Falls dieses Erfordernis nicht erfüllt wird, kann zur Entfernung der Pyrogene eine Behandlung des Eluats mit Ca3(PO4)2 Gel, das mit 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat-monohydrat vorbehandelt ist, durchgeführt werden.
Als Vorsichtsmassnahme kann zusätzlich eine vorläufige Untersuchung für die Stufen (E) und (F) an einer aliquoten Probe durchgeführt werden, und falls dieser Vorversuch Verluste über 30 O/o erkennen lässt, die auf das Erhitzen in Stufe (F) zurückzuführen sind, da in diesem Falle vermutlich störende Verunreinigungen in dem Präparat vorhanden sind, ist es am besten, die thermische Behandlung in Stufe (F) aufzuschieben, bis das Urokinasepräparat an Carboxymethylcellulose adsorbiert und davon wieder eluiert ist entsprechend der Verfahrensstufe, die normalerweise auf die thermische Behandlung folgen würde.
Die erhaltene Suspension wird nun schnell in einem verschlossenen Gefäss an der Gefässwand eingefroren und bei -20 C oder darunter mindestens 16 Stunden lang gelagert. Die gefrorene Suspension ist unter diesen Bedingungen mehrere Wochen stabil. Dar über hinaus erlaubt dieser Einfrierschritt eine ausgezeichnete nachfolgende Elution der Urokinase, die auf andere Weise nicht möglich ist. Mehrere Gelchargen können bei dieser Verfahrensstufe gesammelt werden, um anschliessend vor der weiteren Reinigung vereinigt zu werden.
(E) Elution der Urokinase
Vorzugsweise sollte diese Verfahrensstufe nur in Angriff genommen werden, wenn es die Zeit erlaubt, auch die Stufe F ohne Unterbrechung in einem Arbeitsgang durchzuführen; bevor begonnen wird, sollten Vorversuche auch eine ausreichende Thermostabilität erkennen lassen (vgl. Abschnitt [F]).
Der Puffer, in dem das Caa(PO4)2-Gel, wie oben in Abschnitt (D) beschrieben, eingefroren wurde, dient auch als Elutionsmittel. Die gefrorene Suspension von Ca3(PO4)2-Gel wird vorsichtig und schnell aufgetaut unter der kleinstmöglichen Rührintensität, die nötig ist, um eine Temperatur von weniger als 4" C aufrecht zu erhalten. Die völlig aufgetaute Suspension wird dann auf einer groben Glasfritte filtriert. Der Rückstand auf der Nutsche wird dann unter Verdrängung der eingeschlossenen Flüssigkeit gewaschen; als Waschflüssigkeit wird eine Gesamtmenge von dem 1,5-fachen Rückhaltevolumen an 0,3625 n-Natriumphosphatpuffer von pH 6,50+0,02 verwendet.
Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat enthält im allgemeinen etwa 87-97 o/o der ursprünglich im Bentoniteluat vorhandenen Urokinaseaktivität; die Lösung ist gelb gefärbt, was auf teilweise Elution des adsorbierten 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat-monohydrats von Ca5(PO4) zurückzuführen ist. Das gelöste 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat-monohydrat wird anschliessend von den vereinigten Urokinaseeluaten entfernt, indem es durch ein Bett aus einer geeignet ins Gleichgewicht gesetzten Carboxymethylcellulose, wie im folgenden beschrieben, durchgeschickt wird: (1) Für jeden ml zu entfärbendes Eluat werden zunächst 8 mg Carboxymethylcellulose wie unten beschrieben vorbehandelt. Dann wird diese Carboxymethylcellulose gegen 0,3625 m-Natriumphosphatpuffer von pH 6,50+0,05 ins Gleichgewicht gesetzt.
Die ins Gleichgewicht gesetzte Carboxymethylcellulose wird mit Hilfe von zusätzlichen Mengen Puffer auf eine grobe Glasfritte überführt und der Nutscheninhalt wird durch Schwerkraft abtropfen gelassen. Zur Erzielung der besten Resultate sollte das Bett aus ins Gleichgewicht gesetzter Carboxymethylcellulose so hoch wie breit sein.
(2) Die vereinigten Urokinaseeluate werden durch dieses Bett aus Carboxymethylcellulose durchlaufen gelassen unter Vermeidung von Kanalbildung und Durchbruch des 6,9-Diamino-2-äthoxy-acridin-lactatmonohydrats.
(3) Nachdem die Urokinaselösung dieses Bett durchlaufen hat, wird die zurückgehaltene Lösung durch die minimal nötige Menge an 0,3625 m-Natrium phosphatpuffer von pH 6,50+0,05 ersetzt. Die Filtrate werden vereinigt und sofort der Verfahrensstufe (F) unterworfen.
Herstellung von vorbehandelter Carboxymethylcellulose
200g Carboxymethylcellulose ( Cellex-CM Cation Exchange Cellulose - Bio-Rod Laboratories; Kapazität: 0,4 bis 0,6 mAqu. pro Gramm) werden in 4 Liter suspendiert und 30 Minuten gerührt. Die Carboxymethylcellulose wird durch Schwerkraft abfiltriert durch eine grobe Glasfritte und es wird solange durch das Bett Wasser geschickt, bis das Filtrat neutral reagiert.
Die Carboxymethylcellulose wird dann in 4 Liter 0,145 m-HsPO4 30 Minuten suspendiert und erneut auf einer Glasfritte gewaschen, bis das Waschwasser neutral reagiert. Falls die Carboxymethylcellulose gelagert werden soll, wird sie in gefrorenem Zustand bei -20" C gelagert. Kurz vor Gebrauch wird die Carboxymethyloellulose gegen den geeigneten Puffer, d. h. gegen 0,3625 m-Natriumphosphat in Stufe (E) und gegen 0,0725 m-Natriumphosphat-Puffer in den Stufen (G) und (H), ins Gleichgewicht gesetzt. Nach dem ins Gleichgewichtsetzen wird die Carboxymethylcellulose in der minimalsten Menge Puffer suspendiert, die nötig ist, um ein leichtes Überführen zu ermöglichen. Die Konzentration der Carboxymethylcellulose wird auf der Basis des ursprünglich verwendeten Trockengewichts berechnet.
(F) Thermische Behandlung von Urokinasepräparaten
Diese Verfahrens stufe wird durchgeführt, wenn die Möglichkeit, irgendwelche pathogene Viren aus dem Urin im Endprodukt zurückzuhalten, auf ein Minimum verringert werden soll. Im allgemeinen tritt bei dieser Verfahrensstufe ein Verlust an Urokinaseaktivftät von etwa 20 o/o auf; es sollte ein Vorversuch zur Bestimmung des Einflusses der thermischen Behandlung durchgeführt werden, um im voraus das Ausmass des Verlustes in jeder einzelnen Charge oder einem vereinigten Ansatz zu bestimmen. Der Vorversuch wird entweder mit der aliquoten Menge durchgeführt, die wie in Abschnitt (D) beschrieben, entnommen wird, oder mit einem repräsentativen vereinigten Ansatz solcher aliquoter Mengen, wenn verschiedene Einzelchargen zusammengegeben werden sollen.
Die in Verfahrens stufe (E) erhaltene entfärbte Urokinaselösung wird nun durch Zugabe von festem, wasserfreiem NaH2PO4 auf eine Phosphatkonzentration von 0,50 Molar eingestellt; der pH-Wert wird sorgfältig auf 6,25 + 0,05 eingestellt; es wird schwach gerührt und Schaumbildung vermieden. Die Lösung wird so schnell wie möglich auf 60 1 0,5 C erhitzt und bei dieser Temperatur 10 Stunden belassen; zu keiner Zeit sollte irgendein Teil der Lösung die angegebene Temperatur überschreiten. Während des Erhitzens wird das Rühren der Lösung durch geeignetes Eintauchen der Urokinaselösung in das Heizbad vermieden. Aliquote Proben werden periodisch zur Untersuchung der Urokinase-Aktivität entnommen. Am Schluss der Erhitzungsperiode wird die Lösung in einem Eisbad unter 50 C gekühlt.
Lagerung bei 0 C über Nacht ist dann ausreichend. Die geringe Menge koaguliertes Protein, das sich während der thermischen Behandlung des Urokinasepräparats gebildet hat, wird, nachdem das Präparat abgekühlt wurde, durch Filtration durch eine mittlere Glasfritte mit Hilfe von Diatomeenerde (Super Cel - Johns-Manville) entfernt; für die aus 1600 Ltr.
Urin gewonnene Menge Urokinase sollten nicht mehr als 1,0 g Diatomeenerde notwendig sein. Das Filtrat wird in einem Eisbad gesammelt.
(G) Adsorption von Urokinase an Carboxymethylcellulose und Elution von diesem Material
Wegen der starken Adsorption von Urokinase an Glas ist es wünschenswert, Polyäthylengefässe oder ähnliches nichtadsorbierendes Material zu verwenden, um Urokinaselösungen zu erhalten, wenn die Phosphatkonzentrationen unter 0,29 Molar bei den nachfolgenden Aufarbeitungsschritten liegen.
Das am Schluss der Stufe (F) erhaltene Filtrat wird mit 6 Volumen kaltem Wasser von weniger als 4 C verdünnt und vorsichtig auf einen pH-Wert von 6.00 1 0,05 mit kaltem 0,0725 m-HsPO4 titriert; lokaler Säureüberschuss und jedes unnötige Rühren sind zu vermeiden; der Rührer sollte aus Polyäthylen oder einem ähnlichen Material bestehen.
Zu der Lösung wird unter Rühren die unten angegebene Menge an Carboxymethylcellulose zugesetzt, die zunächst wie in Stufe (E) angegeben vorbehandelt wurde und dann mit 0,0725 m-Natriumphosphatpuffer von pH 6,00 1 0,05 ins Gleichgewicht gesetzt wurde; die Menge der zu diesem Zeitpunkt zugegebenen Carboxymethylcellulose beträgt 1,0 mg (bezogen auf Trockengewicht) für jeweils 800 CrA-Einheiten Urokinase; ungefähr 10 g Carboxymethylcellulose werden für die aus 1600 Litern Urin gewonnene Urokinase erforderlich sein. In einem Eisbad wird ungefähr eine Stunde langsam gerührt.
Nach den ersten 15 Minuten Rühren wird ein aliquoter Teil für eine Schnellbestimmung der restlichen Aktivität in der überstehenden, nach dem Zentrifugieren erhaltenen Flüssigkeit entnommen; wenn der Versuch ergibt, dass mehr als 7 O/o der Gesamtaktivität nicht adsorbiert wurden, wird die verechnete zusätzliche Menge an vorbehandelter, ins Gleichgewicht gesetzter Carboxymethylcellulose der Hauptmenge an Suspension unter Rühren zugesetzt, die notwendig ist, um 93 O/o oder mehr Adsorption zu erzielen; die Gesamtmenge an verwendeter Carboxymethylcellulose sollte 1 mg (bezogen auf Trockengewicht) für jeweils 500 CTA-Einheiten Urokinase nicht überschreiten. 30 bis 60 Minuten nach der letzten Zugabe von Carboxymethylcellulose wird die Suspension durch Schwerkraft filtriert durch eine grobe Glasfritte;
das Bett aus Carboxymethylcellulose wird auf dem Filter wiederholt mit einer Gesamtmenge von 10 Volumen unter 4 C kaltem 0,0725mNatri- umphosphat Puffer pH 6,00 + 0,05 gewaschen; Kanalbildung ist zu vermeiden. Nach dem letzten Waschen wird schwach abgesaugt, um einen festen aber feuchten Filterkuchen zu erzielen. Der Filterkuchen wird quantitativ in ein austariertes Gefäss überführt und sein Gewicht bestimmt; nach der Substraktion des Trockengewichts an vorhandener Carboxymethylcellulose im Kuchen lässt sich das Gewicht an eingeschlossener Flüssigkeit berechnen. Eine Menge an unter 40 C kaltem 0,51 m-Natriumphosphatpuffer von pH 6,50 1 0,05, die dem Gewicht der eingeschlossenen Flüssigkeit entspricht, wird nun zugegeben.
Zu dieser Suspension wird dann ein solches Volumen an kaltem, 0,29 m Natriumphosphatpuffer von pH 6,50 1 0,05 zugesetzt, dass die Suspension schätzungsweise 40 000-50000 CTA-Einheiten/ml enthält. Die Suspension wird eine Stunde bei 0-40 C gerührt und dann durch eine mittlere Glasfritte filtriert. Das im Filterkuchen eingeschlossene Eluat wird sorgfältig durch Waschen mit einem minimalen Volumen an kaltem 0,29 m-Natriumphosphatpuffer von pH 6,50 + 0,05 ersetzt. Die Urokinaseaktivität in vereinigtem Eluat und Waschflüssigkeit beträgt im allgemeinen 20 000-25 000 CTA-Einheiten/ml und entspricht im allgemeinen einer Ausbeute von 85-90 O/o der Aktivität, die zu Beginn dieser Verfahrensstufe vorlag.
Aliquote Mengen des vereinigten Eluats mit der Waschflüssigkeit werden entnommen und zur Bestimmung von spezifischer Aktivität, Pyrogenität und Thromboplastingehalt verwendet. Die Hauptmenge wird an der Gefässwand schnell eingefroren, z. B. in einem Trockeneisbad, und bei 200 C oder darunter in Abhängigkeit vom Ergebnis der Versuche gelagert.
(H) Der freien Wahl überlassen:
Zweite Adsorption von Urokinase an Carboxymethylcellulose und Elution von diesem Material
Diese Verfahrensstufe wird im allgemeinen nur dann durchgeführt, wenn weitere Reinigung des Urokinasepräparats am Ende der Stufe (G) gewünscht wird.
Technik und Arbeitsweise dieser Verfahrensstufe ähneln der unmittelbar vorausgehenden. Die am Schluss der Stufe (G) erhaltene gefrorene Lösung wird vorsichtig und so schnell wie möglich unter minimalem Rühren aufgetaut, ohne jedoch die örtliche Temperatur von aufgetauten Teilen auf über 40 C ansteigen zu lassen. Die Lösung wird in einem Polyäthylengefäss mit 3,00 Volumen kaltem Wasser verdünnt, um die Phosphatkonzentration auf 0,0725 Molar zu erniedrigen; der pH-Wert wird dann auf 6,00 + 0,05 durch Zugabe von 0,725 m-H3PO4 vermindert.
Unter leichtem Rühren werden 1,0 mg (bezogen auf Trockengewicht) Carboxymethylcellulose, die vorher, wie in Stufe (E) beschrieben, vorbehandelt und anschliessend gegen 0,0725 m-Natriumphosphatpuffer von pH 6,00 1 0,05 ins Gleichgewicht gesetzt worden war, für jeweils 1000 CTA-Einheiten vorhandener Urokinase zugegeben.
Nach 30 Minuten schwachem Rühren wird die Suspension filtriert und der Filterkuchen wie in Abschnitt (G) beschrieben gewaschen. Der feste, aber feuchte Filter kuchen wird gewogen und das Gewicht der eingeschlossenen Flüssigkeit berechnet; es wird eine solche Gewichtsmenge an kaltem 0,51 m-Natriumphosphat von pH 6,80 + 0,02 zugegeben, die dem Gewicht der eingeschlossenen Flüssigkeit entspricht. Die Suspension wird dann mit einem solchen Volumen unter 4 C kaltem Natriumphosphatpuffer von pH 6,80 + 0,02 versetzt, das ausreicht, um eine Suspension zu ergeben, die schätzungsweise 60 000 CTA-Einheiten/ml enthält. Die Suspension wird von Zeit zu Zeit bei 04" C eine Stunde gerührt und dann durch eine mittlere Glasfritte mit Hilfe von leichtem Saugen filtriert.
Der Filterkuchen wird mit der minimalsten Menge kaltem 0,29 m-Natriumphosphatpuffer vom pH 6,80 1 0,02 gewaschen, die erforderlich ist, um das eingeschlossene Eluat zu ersetzen. Vereinigtes Eluat und Waschflüssigkeit sollten etwa 50 000 CTA-Einheiten Urokinase/ml entsprechend einer Ausbeute von mehr als 90 O/o der zu Beginn der Verfahrensstufe vorhandenen Urokinaseaktivität enthalten. Es werden wiederum aliquote Teile für die erforderlichen Bestimmungen entnommen. Die Hauptmenge wird dann an der Gefässwand eingefroren und bei -20" C oder weniger in Abhängigkeit vom Versuchsergebnis der aliquoten Proben gelagert.
(I) Sterile Filtration
Die am Schluss des Abschnitts (G) oder (H) erhaltene gefrorene Lösung wird wie oben in Abschnitt (H) beschrieben aufgetaut. Der pH-Wert des Produktes am Schlusse der Stufe (G) beträgt 6,50, während der pH-Wert am Ende der Stufe (H) 6,80 beträgt. Der pH-Wert sollte erforderlichenfalls vorsichtig auf 6,80 mit Hilfe von kalter n-NaOH eingestellt werden. Eine aliquote Menge von aufgetauter Lösung wird zur Bestimmung des Urokinasegehalts entnommen. Die Hauptmenge wird dann aseptisch durch das kleinste Seitz-EK-Filter, das eine brauchbare Filtrationsgeschwindigkeit ergibt, filtriert; ein Filter von 5 cm Durchmesser genügt für 500 ml Lösung. Das Aufnahmegefäss für das Filtrat sollte in ein Eisbad gestellt werden.
Falls sich eine Klärung vor der Durchführung dieser Filtration als notwendig erweist, kann diese Klärung durch hochtouriges Zentrifugieren in einer Kühlzentrifuge oder durch Filtration durch ein Seitz K-5-Filter mit dem kleinsten Durchmesser bewirkt werden.
(J) Ab füllung, Gefriertrocknung und Lagerung
Das Abfüllen in entsprechende Glasflaschen hängt von den Versuchsergebnissen ab, die mit den aliquoten Proben, die in Abschnitt (I) entnommen wurden, erhalten werden; ein Verlust von 5 O/o wird während der nachfolgenden Filtrations- und Gefriertrocknungsoperationen in Kauf genommen. Die Gefriertrocknung wird unter aseptischen Bedingungen in Standardgeräten mit den folgenden Modifikationen der Standardausführung durchgeführt: Das Einfrieren der gefüllten Gefässe wird so schnell durchgeführt, wie es die Kapazität der Apparatur erlaubt; die Kapazität der Gefässe beträgt das zehn- bis fünfzehnfache des Volumens an eingefüllter Flüssigkeit; wegen der vorhandenen Phosphate beträgt der Feuchtigkeitsgehalt der lyophilisierten Gefässe 3-5 O/o; intensivere Dehydration sollte vermieden werden.
Abgedichtete, fertiggestellte Flaschen werden unterhalb der Gefriertemperatur gelagert.
Die folgende Tabelle lässt die Ausbeuteangaben und die Angaben für die spezifische Aktivität der Urokinase, die entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren in 58 Versuchsansätzen gewonnen wurde, zusammen.
Verfahrensstufe Durchschnittliche Durchschnittliche
CTA-Einheiten spezifische
Urokinase, die Urokinase-Aktivität pro Liter Urin (CTA-Einheiten gewonnen wurde /mg Protein) Vereinigte Urinchargen 6,850 34 Bentonit-Eluat 6,600 schwer bestimmbar (E) entfärbtes Cas(PO4)2-Eluat 6,300 6,0Ow8,000' (F) erhitzte Lösung 4,700 (G) Carboxymethylcellulose- 4,000 30,00035,000
Eluat (H) zweites Carboxymethyl- 3,600 50,0055,000 celluloseEluat
Urinproben und Bentoniteluate wurden im allgemeinen mit dem Fibrinplattentest untersucht. Die restlichen vier Proben wurden nach einer reproduzierbaren Methode, die sich vom Test nach Fletcher für Plasmin ableitet, untersucht.
Es ist selbstverständlich schwierig, genaue Versuchsert,ebnisse für Urinproben zu erhalten, wegen der wechselnden Mengen an vorhandenen Urokinase-Inhibitoren, Salzen, proteolytischen Enzymen und anderen Faktoren, die die Versuchsergebnisse beeinflussen.
Beispiel 2 A. 535 Liter normaler menschlicher Urin von Männern, der im Laufe des vorangehenden Tages gesammelt und unter Kühlung auf etwa 40 C in der Zwischenzeit gelagert wurde, wurde auf eine Temperatur zwischen 0 und 2 C in einem Kessel aus rostfreiem Stahl gekühlt und der pH-Wert des Urins wurde auf 5,0 + 0,05 durch Zugabe von Eisessig eingestellt. Das Rühren des Urins in der Kälte wurde eine Stunde fortgesetzt, wobei sich ein Niederschlag bildete. Dieser Niederschlag wurde durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 150 g und 0 C isoliert.
Auf diese Weise wurden 500 ml feuchter Niederschlag gesammelt, der hauptsächlich aus Harnsäuresalzen, Harzsäure und Mucoproteinen bestand, die im wesentlichen die gesamte im Urin vorhandene und als Ausgangsmaterial verwendete Urokinase in adsorbierter oder anderweitig gebundener Form enthielten. Der beim Zentrifugieren erhaltene Überstand wurde verworfen. Die 500 ml feuchter Niederschlag, die als Fraktion A bezeichnet wurden, wurden eingefroren und im gefrorenen Zustand bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
Die vorstehende Arbeitsweise wurde zweimal mit je zwei weiteren 535 Litern Chargen normalem menschlichen Urin von Männern wiederholt, so dass auf diese Weise die gefrorenen Niederschläge von insgesamt etwa 1600 Litern normalem menschlichen Urin von Männern erhalten wurden, die, wie durch Versuche bestimmt wurde, 10 900 000 CTA-Einheiten Urokinase enthielten.
B. Der gefrorene Niederschlag (Fraktion A), der, wie im obigen Abschnitt A beschrieben wurde, wurde vereinigt und aufgetaut und dann durch Anteigen mit 80 Liter kaltem Wasser gewaschen. Der pH-Wert der erhaltenen Suspension wurde auf 3,8 durch Zugabe von n/2-Salzsäure eingestellt und die Suspension wurde gekühlt und 15 Minuten gerührt. Dann wurde die Susr pension zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Rückstand wurde durch Anteigen mit einer zweiten 80 Liter-Portion kaltem Wasser und Zentrifugieren der erhaltenen Suspension bei pH 3,8 gewaschen und der Überstand wurde verworfen. Urokinase wurde aus dem gewaschenen Niederschlag folgendermassen eluiert: Der Niederschlag wurde mit 12 Liter Wasser bei 200 C angeteit und der pH-Wert der entstandenen Suspension wurde durch Zugabe von n-Salzsäure auf 2,0 eingestellt.
Zu dieser Suspension wurden 4000 ml einer 1 0/obigen wässrigen Lösung von 6,9-Dia mino-2-äthoxyacridin-lactat-monohydrat zugegeben, das vorher auf pH 2,0 durch Zugabe von n-Salzsäure eingestellt und auf 20 C gekühlt worden war. Elution der Urokinase wurde bewirkt, indem das Gemisch 30 Minuten gerührt wurde, wobei die Temperatur bei 20 C t 2" C und der pH bei 2,0 gehalten wurde. Das Gemisch wurde dann bei 1500 g ungefähr eine halbe Stunde bei 0-4 C zentrifugiert. Der entstandene Niederschlag wurde verworfen und der Überstand, der die Urokinase enthielt, wurde auf 0 C gekühlt.
Es wurde soviel Natriumchlorid (80 g) zugesetzt, um eine Konzentration von 0,5 O/o (G/V) zu erzielen und der pH-Wert wurde durch Zugabe von n-Natriumhydroxydlösung auf 6,5 1 0,05 eingestellt. Dann wurden 2,3 Volumen wasserfreier Äthylalkohol (oder wahlweise 2,9 Volumen 95 cioiger Äthylalkohol) zugesetzt, der vorher auf -350 C gekühlt worden war, das erhaltene Gemisch wurde nötigenfalls gekühlt, um die Temperatur nicht über 40 C ansteigen zu lassen. 15 Minuten nach Zugabe des Äthylalkohols wurde der gebildete Niederschlag gesammelt, indem 20 Minuten bei 1500 g und 0 C zentrifugiert wurde.
Dieser Niederschlag wurde homogenisiert in einem gleichen Volumen kaltem Wasser zwischen 0 und 4" C und dann wurde das Gemisch mit kaltem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 12 Litern verdünnt. Durch dieses Verdünnen wurde sichtlich der gesamte Niederschlag gelöst. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung, der ungefähr 7,0 betrug, wurde durch Zugabe von n-Salzsäure unter Rühren in einem Eisbad auf 5,00 + 0,02 eingestellt. (In einigen Fällen erwies es sich als vorteilhaft, den pH-Wert zuerst auf 4,24,5 und dann erst auf 5,00 1 0,02 einzustellen, um optimale Ausbeuten an der urokinasehaltigen Fraktion zu erhalten!) Nach 30-minütigem Rühren des Gemisches wurde der gebildete Niederschlag durch 10minütiges Zentrifugieren bei 1500 g und 0 C gesammelt. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen.
Der gesammelte Niederschlag, der als Fraktion B bezeichnet wurde, enthielt ungefähr 85 O/o der in der obigen Fraktion A vorhandenen Urokinase-Aktivität.
Fraktion B wurde eingefroren und bei 200 C aufbewahrt, bis mit der nächsten Verfahrensstufe C begonnen wurde.
In jedem der folgenden Verfahrensschritte wurden nur pyrogenfreie Geräte und Reagentien, einschliesslich Wasser, die mit den urokinasehaltigen Fraktionen in Berührung kommen, verwendet.
C. Der im obigen Abschnitt B erhaltene gefrorene Niederschlag (FraktionB) wurde aufgetaut und dann in 12 Liter kaltem Wasser durch Zugabe von n-Salzsäure gelöst, bis der pH-Wert der Lösung 3,0 betrug, wobei während dieser Zugabe gerührt und in einem Eisbade gekühlt wurde. Nochmaliges Ausfällen der urokinasehaltigen Fraktion wurde dann durch Zugabe von n-Natriumhydroxydlösung, bis der pH-Wert 5,00 + 0,02 betrug, bewirkt. Die erhaltene Suspension wurde 10 Minuten bei 1500 g und 0 C zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen. In gleicher Weise wurde noch drei oder mehrmals der Niederschlag durch Zugabe von Salzsäure gelöst, durch Zugabe von Natriumhydroxydlösung erneut ausgefällt und durch Zentrifugieren gesammelt, wobei der Überstand jeweils verworfen wurde. Der auf diese Weise schliesslich erhaltene Niederschlag wurde als Fraktion C bezeichnet.
Bis zum Gebrauch in der nächsten Verfahrensstufe D wurde die Fraktion C in gefrorenem Zustand aufbewahrt.
D. Der im obigen Abschnitt C beschriebene, gefrorene Niederschlag (Fraktion C) wurde aufgetaut und dann homogenisiert in 6 Litern einer 0,25 0/obigen wässrigen Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactatmonohydrat, das auf pH 5,00 + 0,02 durch Zugabe von n-Phosphorsäure eingestellt worden war, und das entstandene Gemisch wurde 30 Minuten bei ungefähr 25 + 5 C gerührt. Der Niederschlag wurde durch 30 > minütiges Zentrifugieren bei 1500 g und 0 C isoliert und verworfen.
Der Überstand, der etwa 95 o/o der in obiger Fraktion C vorhandenen Urokinase-Aktivität aufwies, wurde auf eine Konzentration von etwa 7000 Einheiten Urokinase pro ml durch Zugabe von 7 Litern einer 0,25 0/obigen wässrigen Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat-monohydrat, die auf pH 5,00 + 0,02 durch Zugabe von n-Phosphorsäure eingestellt worden war, verdünnt.
Ein Calciumphosphatgel wurde folgendermassen hergestellt: 535 g Calciumchlorid wurden in 35 Liter Wasser gelöst und diese Lösung wurde zu einer Lösung aus 1225 g Na3PO4 - 12H2O in 35 Litern Wasser zugesetzt; das entstandene Gemisch wurde 30 Minuten in einem Eisbad gerührt und das gebildete Gel durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 1500 g und 0 C gesammelt; das auf diese Weise gesammelte Gel, das ein Volumen von etwa 15 Litern hatte, wurde in 40 Litern 0,0725 m-NaHSPO4 suspendiert, die Suspension wurde 30 Minuten gerührt und das Gel wurde erneut durch Zentrifugieren gesammelt; dann wurde das Gel mit zweimal 40 Litern Wasser gewaschen und in ausreichend Wasser suspendiert, um ein Gesamtvolumen von 20 Litern mit einem Gehalt von 25 g Ca(PO4)2 pro Liter zu ergeben.
Die auf diese Weise hergestellte Gelsuspension wurde unter Rühren zu dem urokinasehaltigen Präparat in einem Verhältnis von einem Volumen Suspension auf sieben Volumen Urokinasepräparat zugesetzt, was einem Verhältnis von etwa 1 mg Ca3(PO4)2 pro 2000 Einheiten Urokinase entspricht. Nachdem dieses Gemisch 30 Minuten gerührt worden war, wurde das erhaltene Gel durch Zentrifugieren isoliert und mit 10 Volumen Wasser gewaschen. Das so gesammelte Gel wurde gewogen und mit einem gleichen Gewicht an 0,58 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,5 + 0,02) versetzt und dann wurde 0,29 m-Natriumphosphatlösung zugegeben, um eine homogene Suspension, die ungefähr 50 000 Einheiten Urokinase pro ml enthielt, zu erzielen. Diese Suspension wurde an der Gefässwand eingefroren und bei 200 C über Nacht aufbewahrt.
Die Suspension wurde dann aufgetaut und 30 Minuten bei 1500g und 00 C zentrifugiert, der Über- stand wurde gesammelt und zurückbehalten. Der Niederschlag wurde zweimal mit einem gleichen Volumen kalter 0,29 m-NaH2PO4-Lösung (pH 6,5) gewaschen.
Der Überstand und die Waschflüssigkeiten, die wegen der Anwesenheit einer geringen Menge 6,9-Diamino2-äthoxyacridin gelb waren, wurden vereinigt; diese Lösung enthielt ungefähr 90 O/o der in der obigen Fraktion C vorhandenen Urokinaseaktivität. (In einigen Versuchsansätzen lag die Ausbeute im Bereich von 87 bis 98 O/o). Die gelbe Flüssigkeit wurde entfärbt, indem das 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin daraus entfernt wurde, indem sie durch ein Bett einer ins Gleichgewicht gesetzten Carboxymethylcelluiose geschickt wurde, die folgendermassen hergestellt wurde: 2000 g Carboxymethylcellulose-Ionenaustauscher (Austauscher- kapazität:
0,4 bis 0,9 Milliäquivalent pro g3 wurden in 40 Litern 0,29 m-Na2EPO4-Lösung suspendiert und die erhaltene Lösung wurde 30 Minuten gerührt.
Die Suspension wurde durch Schwerkraft durch eine grobe Glasfritte filtriert und durch die auf diese Weise gesammelte Festsubstanz wurde Wasser laufen gelassen, bis das Filtrat neutral reagierte. Die Festsubstanz wurde in 40 Litern 0,145 m-HsPO4 30 Minuten suspendiert und die Suspension wurde erneut durch eine grobe Glasfritte filtriert und die Carboxymethylcellulose wurde mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral war. (Falls die Carboxymethylcellulose gelagert werden soll, wird sie in dieser Verfahrensstufe eingefroren und in gefrorenem Zustand bei 200 C aufbewahrt).
Diese vorbehandelte Carboxymethylcellulose wurde in einer Menge von 8 mg/ml der wie oben beschrieben vereinigten gelben Flüssigkeit gegen 0,29 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,5) ins Gleichgewicht gesetzt und die so erhaltene im Gleichgewicht befindliche Carboxymethylcellulose wurde mit Hilfe von zusätzlicher 0,29 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,5) auf eine grobe Glasfritte überführt. Das nasse Bett aus Carboxymethylcellulose wurde durch Schwerkraft abtropfen gelassen. Das Bett war ungefähr 1 Zoll hoch und etwa 2 Zoll breit. Die gelbe, urokinasehaltige Flüssigkeit wurde durch das Carboxymethylcelluiosebett filtriert und danach wurde 0,29 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,5) durchlaufen gelassen, um das Bett zu waschen.
Das so erhaltene Filtrat, das als Fraktion D bezeichnet wurde, war im wesentlichen farblos und frei von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin. Diese Fraktion wurde nach dem unten aufgeführten nächsten Verfahrensschritt E unverzüglich weiter verarbeitet.
E. Die gemäss dem obigen Abschnitt D erhaltene Fraktion D wurde mit 3 Volumen Wasser von 040 C verdünnt, wobei die Phosphatkonzentration auf 0,0725 Molar verringert wurde, und die verdünnte Lösung wurde mit 0,0725 m-H3PO4 auf pH 6,0+0,05 titriert.
Vorbehandelte Carboxymethylcellulose, die wie in Abschnitt D beschrieben erhalten wurde, wurde gegen 0,0725 m-Natriumphosphatpuffer von pH 6,010,05 ins Gleichgewicht gesetzt und zu der urokinasehaltigen Lösung in einer Menge von 1 mg (bezogen auf Trokkengewicht) Carboxymethylcellulose pro 800 CTA Einheiten Urokinase zugegeben.
Nach 15-minütigem Rühren des Gemisches wurde eine geringe aliquote Menge entnommen und zentrifugiert und die noch im Überstand befindliche Urokinaseaktivität wurde durch eine Schnellmethode bestimmt, wobei gefunden wurde, dass sie ungefähr 5 O/o der in Fraktion E befindlichen Menge betrug. (Wenn diese Untersuchung einen Wert von mehr als 5 o/o erkennen liess, wurde auf alle Fälle eine zusätzliche Menge von im Gleichgewicht befindlicher Carboxymethylcellulose zu der Hauptmenge an Suspension zugesetzt; die Gesamtmenge an Carboxymethylcellulose, bezogen auf Trockengewicht, überstieg jedoch in keinem Fall 1 mg pro 500 CTA-Einheiten Urokinase). Die Hauptmenge Suspension wurde dann durch Schwerkraft durch eine grobe Glasfritte filtriert.
Der so gewonnene Niederschlag wurde auf dem Filter mit insgesamt 10 Volumen kalter 0,0725 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,0+0,05) gewaschen und bei der Filtration wurde schwach abgesaugt, bis ein fester feuchter Kuchen erhalten wurde. Der feuchte Filterkuchen wurde gewogen und das Volumen der im Kuchen eingeschlossenen Flüssigkeit wurde zu 6,5 ml berechnet. Der feuchte Kuchen wurde dann in 6,5 ml kalter 0,51 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,00 + 0,05) suspendiert und ein ausreichendes Volumen (70 ml) kalter 0,29 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,00+0,05) wurde zugesetzt, um eine Suspension mit annähernd 50 000 CTA-Einheiten Urokinase pro ml zu erhalten.
Die erhaltene Suspension wurde eine Stunde bei 0 C geführt und dann durch eine mittlere Glasfritte filtriert.
Das im Filterkuchen eingeschlossene Eluat wurde durch Waschen mit 100 ml kalter 0,29 m-Natrium phosphatlösung (pH6,00+0,05) verdrängt. Das Eluat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und als Fraktion E bezeichnet; diese Fraktion hatte ein Volumen von 230 ml und enthielt 38 000 CTA-Einheiten Urokinase pro ml. Die Urokinaseaktivität in Fraktion E betrug 85 O/o der in Fraktion D vorhandenen. Frak tion E wurde eingefroren und bei -200 C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt.
F. Um evtl. vorhandene Viren, z. B. Hepatibs virus, zu inaktivieren, wurde Fraktion E folgendermassen behandelt: Die Fraktion wurde aufgetaut und die vorhandene Phosphatkonzentration von 0,29-Molar durch Zugabe von Na2HPO4 auf 0,50-Molar erhöht.
Die so erhaltene Lösung, die einen pH-Wert von 6,8 aufwies, wurde auf 60,0+0,5 C 10 Stunden erwärmt.
Die durch dieses Behandlungsverfahren erhaltene Lösung wurde als Fraktion F bezeichnet; sie besass 70 o/o der in Fraktion E vorhandenen Urokinaseaktivität. Fraktion F wurde in einem Eisbad gekühlt und über Nacht bei 0 C aufbewahrt.
G. Fraktion F. wurde mit kaltem destilliertem Wasser verdünnt, um die Phosphatkonzentration von 0,50 Molar auf 0,0725-Molar zu erniedrigen und der pH-Wert der verdünnten Lösung wurde auf 6,0010,05 durch Zugabe von 0,0725 m-H3PO4 vermindert. Die erhaltene Lösung wurde in einem Eisbad gerührt und dann wurde im Gleichgewicht befindliche Carboxymethylcellulose zugesetzt, die dadurch hergestellt worden war, dass vorbehandelte Carboxymethylcellulose, die gemäss dem in Abschnitt D beschriebenen Verfahren erhalten wurde, gegen 0,0725 m-Natriumphosphatlösung von pH 6,00+0,05 ins Gleichgewicht gesetzt wurde, wobei die Zugabe in einer Menge von 1,0 g (bezogen auf Trockengewicht) pro 1000 000 in der Lösung befindlicher CTA-Einheiten Urokinase erfolgte.
Nachdem das Gemisch 30 Minuten gerührt worden war, wurde es filtriert und in der in Stufe E beschriebenen Weise gewaschen. Der erhaltene feuchte Kuchen wurde gewogen und das Volumen der im Kuchen eingeschlossenen Flüssigkeit wurde zu 33 ml berechnet. Der feuchte Kuchen wurde dann in 33 ml kalter 0,51 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,80+0,02) suspendiert und ein ausreichendes Volumen (20 ml) kalter, 0,29 m-Natriumphosphatlösung (pH 6 6,80 + 0,02) wurde zugegeben, um eine Suspension mit ungefähr 60 000 CTA-Einheiten Urokinase pro ml zu erhalten.
Diese Suspension wurde mit Unterbrechungen eine Stunde bei 0 C gerührt und dann durch eine mittlere Glasfritte filtriert. Das im Filterkuchen eingeschlossene Eluat wurde durch Waschen mit 40 ml einer kalten 0,29 m-Natriumphosphatlösung (pH 6,8010,02) verdrängt. Das Eluat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und als Fraktion G bezeichnet. Diese Fraktion hatte ein Volumen von 110 mol und enthielt 49 000 CTA-Einheiten Urokinase pro ml. Die Urokinase-Aktivität in Fraktion G betrug 91 0/o der in Fraktion F vorhandenen Aktivität. Fraktion G wurde eingefroren und bei -20 C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt.
H. Fraktion G wurde aufgetaut und dann zur Sterilisation aseptisch durch ein Seitz-EK-Filter filtriert.
Die sterile Lösung wurde gefriergetrocknet.
Beispiel 3
Die in den obigen Abschnitten A bis H und in Beispiel 1 beschriebene Folge von Verfahrensstufen wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass Stufe F, also die thermische Behandlung, weggelassen wurde. Unter leichtem Rühren wurden zwei Volumen auf 0-4" C gekühlter, gesättigter Ammoniumsulfatlösung zu dem am Ende der Stufe H erhaltenen Eluat zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde in der Kälte stehen gelassen und die ausgefallene Urokinasefraktion wurde durch hochtourige Zentrifugation in einer Kühlzentrifuge (15.000 UpM 20 Minuten in einer Servall-Zentrifuge) isoliert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und verworfen. Der Niederschlag wurde in 0,29 m Natriumphosphatpuffer vom pH 6,5 dispergiert, um eine Konzentration von 3X105 CTA-Einheiten pro ml erhalten.
Das Gemisch wurde bei 0-4 C gegen häufig gewechseltes destilliertes Wasser in einer wirksamen Dialysiervorrichtung dialysiert, bis der spezifische Widerstand der Urokinaselösung auf 2500 Ohm anstieg. Sobald die Leitfähigkeit durch die Dialyse bis auf den obigen Wert reduziert war, war in der Suspension ein im wesentlichen inerter und üblicherweise kristalliner Niederschlag vorhanden und der pH-Wert betrug 6,6. Diese Suspension wurde zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Unter schwachem, jedoch wirkungsvollem Rühren wurde der pH-Wert der übersteh henden Flüssigkeit mit 0,1 n-NaOH von 0-4 C auf 7,00 eingestellt und das Präparat wurde beobachtet, ob nach 15 Minuten erneut Niederschlagsbildung auftrat.
Die Lösung wurde nötigenfalls durch Zentrifugieren geklärt. Die Ausbeute an Urokinase-Aktivität betrug 85-90 o/o der in Stufe H vorhandenen Aktivität. Zu je 10 ml klarer Urokinaselösung wurden 0,2 g festes Natriumchlorid zugegeben und der pH-Wert der Lösung wurde sorgfältig mit 0,1 n-HCl auf 5,30+0,05 eingestellt. Die Lösung wurde mit festem Natriumchlorid gesättigt und die entstandene Suspension wurde bei 0-4 C über Nacht aufbewahrt. Die auf diese Weise ausgefällte Urokinase wurde durch Zentrifugieren isoliert. Die durchschnittliche Ausbeute an Urokinase Aktivität betrug bei diesem Verfahrensschritt 83 0/o.
Der Urokinaseniederschlag wurde in 10 0/obiger wässriger Natriumchloridlösung von 40 C gelöst, um eine Lösung mit ungefähr 150 000 CTA-Einheiten pro ml zu erhalten; der pH-Wert der Lösung wurde auf 5,0010,05 eingestellt. Es wurde soviel festes Natriumchlorid zugesetzt, um halbe Sättigung an Natriumchlorid zu erzielen und die Lösung wurde zur Entfernung von unlöslichem Material zentrifugiert. Dann wurde die Urokinaselösung bei 4 C mit zusätzlichem festem Natriumchlorid versetzt, bis die Lösung ein schwachtrübes Aussehen zeigte; mit anderen Worten, bei schwachem Rühren wurde ein seidenartiger Schimmer sichtbar. Die Natriumchloridkonzentration wurde dann nach und nach innerhalb von mehreren Tagen erhöht, bis 98 0/obige Sättigung erreicht war.
Die sich aus der Lösung aufgrund der obigen Verfahrensweise abscheidenden Urokinasekristalle waren farblose, dünne Plättchen von ungewöhnlicher Brüchigkeit und Sprödigkeit; unter dem Mikroskop wurden sie bei Anwendung von nur mässigem Druck auf das Deckgläschen leicht in Bruchstücke zerbrochen.
Wenn das obige einmal kristallisierte Präparat noch zweimal umkristallisiert wurde, erreichte die spezifische Urokinase-Aktivität einen konstanten Maximalwert (in weiteren Versuchsansätzen wurde gefunden, dass zweioder dreimaliges Umkristallisieren im allgemeinen für diesen Zweck ausreichend war). Ein mittlerer Ausbeuteverlust von 12 O/o der gesamten Urokinase-Aktivität wurde bei jeder Umkristallisation gefunden.
Die maximale spezifische Aktivität, die mit jedem von drei Kristallchargen erreicht wurde, betrug 652 000129 800 (s. d.) CTA-Einheiten pro mg Stickstoff (Kjeldahl), oder 104 000+4800 (s. d.) CTA-Einheiten pro mg geschätztes Protein. (Es wurde angenommen, dass die Proteinkonzentration das 6,25-fache der Stickstoffkon zentration betrug; die Stickstoffkonzentration- - wurde nach dem Mikro-Kjeldahl-Verfahren bestimmt. Eine Lösung der kristallinen Urokinase mit 0,100 mg N/ml zeigte eine optische Dichte von 0,853 bei 280 mm in 1,00 cm Küvetten).
29 mg kristalline Urokinase wurden aus 2270 Litern (600 gallons) menschlichen Urin von Männern erhalten, was einer Gesamtausbeute von 24 0/0 entspricht. Bei der Polyacrylamidgelplatten-Elektropho- rese zeigten sich Lösungen dieser kristallinen menschlichen Urokinase nur eine einzige, scharf definierte Komponente. Die kristalline menschliche Urokinase wurde auch in der Ultrazentrifuge auf Homogenität untersucht. Alle Ultrazentrifugenversuche wurden bei 10,0 C in einer analytischen Spinco-Modell E-Ultrazentrifuge durchgeführt, die mit einer Phasenplatte, schlierenoptischem System, Rotor-Temperatur-Anzeiger und Kontrolleinheit ausgestattet war.
Sedimentationskurven von Lösungen kristalliner Urokinase wurden bei (A) pH 2,1 und (B) pH 6,8 in mit tZberschich- tungszellen durchgeführten Versuchen erhalten. Die Überschichtung geschah 12 Minuten, bevor die Rotorgeschwindigkeit 59 780 UpM erreicht hatte.
Schlieren-Diaphragmawinkel 600. In Ansatz (A) entsprach die Urokinasekonzentration einer optischen Dichte 280 m,c = 4,05 in 0,21 m-NaCl, 0,07 Phosphat bei PpH 2,1; die Kurven wurden 22, 62 und 94 Minuten, nachdem die Rotorgeschwindigkeit 59 780 UpM erreicht hatte, fotografiert. In Ansatz (B) entsprach die Urokinasekonzentration einer optischen Dichte 280 mu = 4,22 in 0,21 ri-NaCl, ,07 Phosphat von pH 6,8; die Kurven wurden 13, 53 und 85 Minuten, nachdem die Rotorgeschwindigkeit 59 780 UpM erreicht hatte, fotografiert.
Die Läufe bei pH 2,1 und pH 6,8 zeigten in beiden Fällen nur eine einzige symmetrische Gradientenkurve.
In dem bei pH 6,8 gefahrenen Ansatz zeigte die Kurve jedoch eine relativ schnelle und irgendwie übertriebene Verbreiterung beim Durchqueren der Zelle; darüber hinaus zeigte der aus den Ultrazentrifugaten berechnete scheinbare Diffusionskoeffizient eine gewisse Abhängigkeit von der Grösse des Zentrifugalfeldes. Während die Anwesenheit nur eines einzigen symmetrischen Gipfels in den Sedimentationskurven natürlich die Homogenität der Urokinasepräparate anzeigte, sprach die relativ schnelle und progressive Verbreiterung der Kurve bei pH 6,8 für eine Polydispersität bei diesem pH-Wert.
Um die bei der Sedimentation bei pH 2,1 gefundene Homogenität der kristallinen Urokinase mit der bei pH 6,8 auftretenden Polydispersität in Einklang zu bringen, wurde angenommen, dass bei dem höheren pH-Wert Urokinase relativ schnell einem Assoziation Dissoziation-Gleichgewicht unterliegt. Falls die Einstellungsgeschwindigkeit des Assoziations-Gleichgewichts nicht grösser wäre als die Geschwindigkeit der ultrazentrifugalen Trennung der verschiedenen Molekülarten (Monomere, Dimere usw.), müsste mehr als ein Gradient während der Sedimentation auftreten.
In Assoziations-Dissoziationssystemen, bei denen nur eine einzige Komponente beteiligt ist, bewegt sich der Sedimentationsgradient mit einer Geschwindigkeit des Gewichtsmittels; darüber hinaus ist der Gradient auch noch der Ort, wo sich die Gleichgewichte dauernd wieder einstellen wegen der Konzentrationsänderungen über den ganzen Gradienten. Am Schwanzende des Gradienten, wo die Proteinkonzentration niedrig ist, wird die¯Dissoziation in die monomere Form selbstverständlich begünstigt. Da die monomeren Moleküle weniger rasch sedimentieren als das Durchschnittsmaterial in der Plateauzone vor dem Gradienten, bleiben die Monomeren zurück und verursachen eine grössere Verbreiterung des Gradienten als sie auftreten würde, wenn nur die Monomeren anwesend wären.
Eine Bestätigung für den Befund, dass kristalline Urokinase dazu neigt, in Lösung bei pH 6,8 reversibel zu aggregieren, wurde dadurch erhalten, dass eine Konzentrationsabhängigkeit des gewichtsmittleren Molekulargewichts des Enzyms in Lösung bei diesem pH-Wert festgestellt wurde. In diesen Versuchsserien wurden die Molekulargewichte nach der Archibald-Gleichung berechnet (J. Phys. and Colloid Chem., 51, 1204 [1947])
EMI12.1
In der Gleichung bedeuten: R = Gaskonstante, 8,314X107erg/mol/Grad; T = absolute Temperatur; e = Dichte der Lösung; w = Winkelgeschwindigkeit des Zentrifugenrotors in Radianen pro Sekunde, (UpM) (260; xm = Abstand des Meniscus von der Rotationsachse; cm und (dc/dx)m = Konzentration bzw.
Konzentrationsgradient am Meniscus; V = partielles spezifisches Volumen von Urokinase, das zu 0,735 ml/ g bei 100 C angenommen wurde. Die Meniscuskonzentration cm wurde nach der Gleichung von Klainer und Kegeles (19) berechnet:
EMI12.2
In der Gleichung bedeuten: c0 = Anfangskonzentration der Urokinase in optischen Einheiten, wie sie in Überschichtungsläufen in der Ultrazentrifuge bestimmt wurde; X ist eine Stelle in der Plateauzone (wo überall (dc/dx) gleich Null ist). Experimentelle Bestimmungen wurden gemäss dem Verfahren von Schachmann durchgeführt (Methods in Enzymology, Vol. IV, 5. P.
Colowick and N. O. Kaplan, Herausgeber, Academic Press, New York, 1957, S. 32). Im wesentlichen lässt sich die Archibald-Methode während der Annäherung an ein Sedimentationsgleichgewicht in einem Ultrazentrifugenfeld anwenden. Sie erlaubt die Bestimmung des gewichtsmittleren Molekulargewichts von gelösten Molekülen, die am Meniscus einer Lösung vorhanden sind, wenn die Konzentrationsverteilung in der Gegend des Meniscus bekannt ist.
Die Molekulargewichtsdaten, die über ein Bereich von Meniscuskonzentration von Urokinase bei pH 6,8 erhalten wurden, liessen erkennen, dass der reziproke Wert des Gewichtsmittels des Molekulargewichts in linearer Abhängigkeit von der Konzentration in dem bei pH 6,8 untersuchten Konzentrationsbereich ist. Die Methode der kleinsten Quadrate dieser Daten führte zu der folgenden Gleichung für die Regressionskurve:
EMI13.1
In dieser Gleichung bedeutet c die Urokinasekonzentration, ausgedrückt in optischer Dichte bei 280 m,u in 1,00 cm-Zellen. Danach wurde bei unendlicher Verdünnung ein Wert von 54 000 i 900 (s. e.) für das Molekulargewicht der monomeren Urokinase erhalten; dieser Wert beruht jedoch auf der Annahme, dass das partielle spezifische Volumen 0,735 ml/g bei 10"C beträgt.
Ähnliche Molekulargewichtsbestimmungen, wie sie bei pH 6,8 durchgeführt wurden, wurden an Urokinaselösungen auch bei pH 2,1 und pH 10,5 durchgeführt.
Innerhalb der Fehlergrenze wurde bei keinem der beiden pH-Werte über das untersuchte Konzentrationsbereich eine Konzentrationsabhängigkeit des scheinbaren Molekulargewichts beobachtet. Bei pH 2,1 wurde der Mittelwert und der Standardiehler bei einer Vcrsuchsse; rie von 11 Molekulargewichtsbestimmungen zu 52 500 + 530 gefunden. Bei pH 10,5 wurde der Mittelwert und der Standardfehler für eine Serie von 8 Bestimmung gen zu 53 300 i 440 gefunden. Jeder dieser beiden Werte lag in guter Übereinstimmung mit dem Wert von 54 000 1 900, der durch Extrapolation der Werte bei pH 6,8 bei unendlicher Verdünnung abgeleitet wurde.
Vermutlich wurde die Aggregation bei den mehr extremen pH-Werten durch abstossende Kräfte der elektrostatischen Ladungen an den monomeren Molekülen gehemmt; andererseits ist es auch möglich, dass ein relativ geringer Grad an Aggregation durch ein nicht ideales Verhalten der Lösungen oder durch analytische Unempfindlichkeit der Bestimmung nicht zugänglich ist.
Die experimentelle Gestaltung der Molekulargewichtsbestimmungen bei jedem untersuchten pH-Wert lieferte auch einen weiteren Beweis für die Homogenität der kristallinen Urokinasepräparate; die Versuchs durelhihrmg erlaubte darüber hinaus bei jedem pH-Wert die Untersuchung einer Einzelprobe über ein ziemlich weites Bereich an Meniscuskonzentrationen.
Während der Archibald-Versuche wurde jede von mehreren verschiedenen Anfangskonzentrationen der Urokinase drei verschiedenen Zentrifugalfeldern ausgesetzt. In Systemen, die sich in der Ultrazentrifuge als polydispers erweisen, bewirken die höheren Zentrifugalfelder bevorzugt eine Verarmung der schneller sedimentierenden Molekül art aus der Meniscuszone. Wenn die Polydispersität auf eine reversible Aggregation zurückzuführen ist, führt die bevorzugte Verarmung zu einer Neueinstellung des Gleichgewichts der Molekülart und damit zu einer Lösung, deren Zusammensetzung identisch mit einer Zusammensetzung ist, die durch einfache Verdünnung derselben Lösungskonzentration erhalten wird.
Das gewichtsmittlere Molekulargewicht der Lösung am Meniscus eines solchen Systems ist zwar konzentrationsabhängig, jedoch unabhängig davon, ob die Verminderung der Konzentration in erster Linie durch einfache Verdünnung oder durch Fraktionierung in der Ultrazentrifuge bewirkt wird.
Diese Verhältnisse wurden mit Urokinaselösungen bei pH 6,8 gefunden. Bei den beiden anderen untersuchten pH-Werten wurde die Homogenität der kristallinen Urokinase auch noch dadurch angezeigt, dass keine Anzeichen für eine Abhängigkeit der Archibald-Molekulargewichtswerte von der Grösse der angewandten Zentrifugalfelder sprachen.
Die oben beschriebenen erfindungsgemässen Verfahren führen zu hochgereinigten Urokinasepräparaten, die im wesentlichen frei von Pyrogenen und thromboplastischen Substanzen waren und die sich bei der Auflösung von intravasculären Gerinnseln im menschlichen Körper als wirksam erwiesen. Darüber hinaus war die beschriebene kristalline Urokinase nicht nur im wesentlichen frei von Pyrogenen und thromboplastischen Substanzen, sondern ebenso frei von potentiell antigenen Verunreinigungen, so dass die kristalline Urokinase beim Menschen wiederholt angewandt werden kann, ohne schwere allergische Reaktionen befürchten zu müssen.
Nach dem Stand der Technik wurde die Wirksamkeit von Urokinasepräparaten in mehreren verschiedenen Aktivitätseinheiten ausgedrückt, wovon jede auf einer bestimmten Standardbestimmungsmethode basierte. Die in vorliegender Anmeldung verwendeten CTA-Einheiten entsprechen der Standardurokinaseeinheit, die kürzlich vom Committee on Thrombolytic Agents, National Heart Institute genehmigt wurde; vgl. Sherry, Alkjaersig und Fletcher, J. Lab. & Clin.
Med., 64, 145-153 (Juli 1964).