DE1054405B

DE1054405B - Verfahren zur Gewinnung von Urokinasekonzentraten

Info

Publication number: DE1054405B
Application number: DEL25202A
Authority: DE
Inventors: Niels Ole Kjeldgaard; Jorgen Ploug
Original assignee: Leo Pharmaceutical Products Ltd AS
Current assignee: Leo Pharma AS
Priority date: 1955-07-01
Filing date: 1956-06-29
Publication date: 1959-04-09
Also published as: FR1209859A; NL96631C; BE549167A; US2983647A; GB802326A; CH353848A

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Konzentraten der Urokinase, die bekanntlich der plasminogene oder fibrinolytische Aktivator des menschlichen Urins ist.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Urokinasekonzentrate aus menschlichem Urin zu gewinnen, deren Lösungen Menschen ohne nachteilige Wirkungen intravenös injiziert werden können, um fibrinöse Koagulate aufzulösen und eine Wirkung gegen die Thrombophlebitis auszuüben.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Verfahren, das im wesentlichen darin besteht, daß aus dem Urin durch Behandlung mit einem Adsorptionsmittel und Eluierung des Adsorbates eine Urokinaselösung hergestellt und diese an ein synthetisches Kationenaustauscherharz adsorbiert wird, das einen wesentlichen Gehalt an Carboxylgruppen hat und mit einer wäßrigen Elektrolytlösung mit einem p_H-Wert zwischen 5 und 7 und einer Kationenstärke zwischen 0,1 und 1 Grarnmaquivalent pro Liter bis zur Erreichung des Gleichgewichtes zwischen der Elektrolytlösung und dem Austauscherharz vorbehandelt ist, worauf das erhaltene Adsorbat mit einer wäßrigen Elektrolytlösung mit einem p_H-Wert eluiert wird, der zur Bildung eines Eluates mit einem p_H-Wert zwischen 5 und 11 führt.

Die durch die erste Adsorptions- und Eluierungsstufe dieses Verfahrens aus dem Urin erhaltene Urokinaselösung enthält noch erhebliche Verunreinigungen, die durch die zweite Adsorptions- und Eluierungsstufe entfernt werden. Die Menge dieser Urokinaselösung ist jedoch verhältnismäßig gering, und der p_H-Wert des durch die zweite Adsorptions- und Eluierungsstufe erhaltenen UYokinasekonzentrates wird daher vom P_a-Wert der Elektrolytlösung beeinflußt, mit welcher das in dieser Stufe verwendete Austauscherharz vorbehandelt worden ist. Ein besonders reines Urokinasekonzentrat wird erhalten, wenn zur Eluierung des Adsorbates am Austauscherharz eine Elektrolytlösung verwendet wird, deren p_H-Wert oder Kationenstärke oder beide höher sind als der oder die entsprechenden Werte der zur Vorbehandlung des Austauscherharzes bis zur Erreichung des Gleichgewichtes verwendeten Elektrolytlösung.

Die erste Adsorptions- und Eluierungsstufe des Verfahrens kann in verschiedener Weise durchgeführt werden. Eine besonders zweckmäßige Ausführungsform dieser Stufe besteht darin, daß Urin verwendet wird, dessen Wasserstoffionenkonzentration auf einen p_H-Wert zwischen 3 und 8, vorzugsweise zwischen 6 und 8, eingestellt ist, und als Adsorptionsmittel Kieselsäuregel, d. h. die mehr oder weniger feinkörnige kolloidale Kieselsäure, die durch Ausfällung von wäßriger Alkalimetallsilikatlösung mit einer Säure und Auswaschen und Trocknen des Niederschlages er-

Vearfalixen zur Gewinnung von
Urokinasekonzentxaten

Anmeldex:

Levens kemiske Fabrik ved A. Kongsted, Kopenhagen

Vertreter: Dipl.-Ing. Dipl.-Chem. Dr. phil.
Dr. techn. J. Reitstötter, Patentanwalt,
München 15, Haydnstr. 5

Beanspruchte Priorität:
Großbritannien vom 1. Juli 1955

Niels Ole Kjeldgaard, Kopenhagen,
und J0rgen Ploug, Herlev (Dänemark),
sind als Erfinder genannt worden

halten wird, oder ein kationenaustauschendes Silikat, z. B. natürliche oder künstliche Zeolithe, worauf das erhaltene Adsorbat mit wäßriger Elektrolytlösung mit einem P_a-Wert eluiert wird, der zur Bildung eines Eluates mit einem p_H-Wert zwischen 9 und 11,5 führt. Verdünnte wäßrige Ammoniaklösung ist eine besonders geeignete Elektrolytlösung. Als Adsorptionsmittel können auch andere unlösliche Salze, vorzugsweise in ausgefällter Form, z. B. Bariumsulfat (von Kaula, J. lab. elin, med., 1955, Bd. 44, S. 944) oder Calciumphosphat (Lundquist und Mitarbeiter, Biochem. J., 1955, Bd. 59, S. 69) verwendet werden. Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform dieser Verfahrensstufe kann als Adsorptionsmittel Oxycellulose bei einem D ₁₁-Wert zwischen 3 und 7 und zur Eluierung des erhaltenen Adsorbates eine wäßrige Elektrolytlösung mit einem p_H-Wert zwischen 8 und 11 verwendet werden.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung können die beiden Adsorptions- und Eluierungsstufen in der Weise durchgeführt werden, daß der Urin oder die Urokinaselösung und die zur Eluierung verwendeten Elektrolytlösungen durch eine Kolonne des Adsorptionsmittels hindurchgeleitet werden. Dabei ist es zweckmäßig, aber nicht notwendig, bei der Eluierung in der ersten Stufe des Verfahrens eine Fraktionierung des Eluates vorzunehmen und diejenigen Fraktionen

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auszuscheiden, die nur verhältnismäßig geringe Mengen Urokinase enthalten. In der zweiten Eluierungsstufe ist es zur Erzielung eines reinen Urokinasekonzentrates in der Regel notwendig, eine Fraktionierung vorzunehmen und nur die Fraktionen zu gewinnen, welche die Hauptmenge Urokinase enthalten. Diese Arbeitsweise ist besonders geeignet, wenn in der ersten Stufe des Verfaihrens Kieselsäuregel oder Zeolithe als Adsorptionsmittel verwendet werden, während es bei Anwendung der anderen erwähnten Adsorptionsmittel zweckmäßiger ist, die erste Adsorptionsstufe durch Vermischen des Urins mit dem Adsorptionsmittel unter Umrühren und anschließende Filtrierung durchzuführen.

Um die zweite Adsorptions- und Eluierungsstufe *5 des erfindungsgemäßen Verfahrens einfacher zu gestalten, empfiehlt es sich, die durch die erste Stufe des Verfahrens gewonnene Urokinaselösung vor Durchführung der zweiten Stufe auf unter 10%, vorzugsweise unter 5%, ihres Volumens zu konzentrieren durch Ausfällung und Wiederauflösung der Urokinase oder bzw. und durch Gefriertrocknung und Wiederauflösung. Zur Ausfällung der Urokinase aus ihrer Lösung kann man ihren p_H-Wert auf unter 4, vorzugsweise auf einen Wert zwischen 1 und 2, einstellen und dann ein Salz zusetzen, durch welches Proteine ausgefällt werden, z. B. Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat. Dabei werden zur Ausfällung der Urokinase in der Regel Salzmengen benötigt, die zur Bildung einer mehr als 50%igen Salzlösung führen. Die Ausfällung der Urokinase kann aber auch durch Zusatz von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, z. B. Äthanol, Aceton oder Dioxan, bewirkt werden. Sobald eine Äthanolkonzentration der Lösung erreicht ist, die 80 Volumprozent entspricht, ist praktisch die gesamte Urokinase ausgefällt. Wenn eine Gefriertrocknung angewendet wird, ist es zweckmäßig, die Urokinaselösung vorher durch Dialyse mit Wasser von Elektrolyten zu befreien. Die aus der ausgefällten Urokinase durch Wiederauflösung hergestellte Urokinaselösung wird vor ihrer Weiterverarbeitung auf einen p_H-Wert zwischen 6 und 10, vorzugsweise zwischen 7 und 9, eingestellt.

Aus den durch das Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Urokinasekonzentraten können durch Gefriertrocknung, zweckmäßig nach vorheriger Dialyse mit Wasser zwecks Entfernung von Elektrolyten, zur Injektion geeigneter Präparate erhalten werden, die mehr als 3000 Einheiten der im Beispiel definierten Art pro mg enthalten. Präparate mit geringerer Reinheit sind nicht empfehlenswert für Injektionszwecke.

Beispiel

Durch Zusatz von 28°/oiger Natriumhydroxydlösung zu 300 ml Männerurin wurde der p_H-Wert auf 7,5 eingestellt, wodurch eine voluminöse Fällung erzielt wurde, die keine Urokinase enthielt und abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde mit einer Geschwindigkeit von 500 ml in der Minute durch eine Kolonne, 7,5 · 62,5 cm, geleitet, die Kieselsäuregel enthielt, das in der Kolonne zunächst mit 5 1 5°/oiger Salzsäure, dann mit 51 Wasser und zuletzt mit 51 IOVoiger Natriumchloridlösung ausgewaschen war. Etwa 90% der Urokinase des Urins wurden an das Kieselsäuregel adsorbiert. Die adsorbierte Urokinasemenge wurde errechnet aus den durch die Methode von S. M ü 11 e r t z, Acta Physiologica Scandinavica, 1952, Bd. 25, S. 93, bestimmten Werten für den verwendeten Urin und für das Eluat.

Die Kolonne wurde dann mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 4°/oigen wäßrigen Ammoniaklösung mit einer Geschwindigkeit von 150 ml in der Minute eluiert. Etwa 2 1 des zunächst erhaltenen, etwas gelblichen Eluates enthielten keine Urokinase und wurden ausgeschieden. Der p_n-Wert des folgenden bräunlichen Eluates änderte sich dann schnell. Es wurden etwa 2 1 dieses Eluates gewonnen, die etwa 70% der Urokinase des verwendeten Urins enthielten.

Dieses Eluat wurde mit 20% ungelöstem Natriumchlorid, bezogen auf das Gewicht des Eluates, versetzt und anschließend mit Salzsäure versetzt, bis ein Pj ₁-Wert von etwa 1,5 erreicht war. Der dadurch erzeugte voluminöse Niederschlag, der die gesamte Urokinase des Eluates enthielt, wurde abfiltriert und in Wasser unter Zusatz von verdünnter Natriumhydroxydlösung bis zu einem p_H-Wert von etwa 8 gelöst. Die ungelöste Substanz, im wesentlichen Kieselsäure, wurde abgeschleudert, und die erhaltene rotbraune Lösung wurde über Nacht mit Wasser dialysiert. Durch Gefriertrocknung des Dialysates wurden 2 bis 3 g Trockensubstanz erhalten.

Der Urokinasegehalt dieser Trockensubstanz betrug 400 bis 700 Einheiten pro mg, bestimmt durch eine wie folgt geänderte Ausführungsform der Methode von Fletcher, Biochem. J., 1954, Bd. 56, S. 677.

In einem Reagenzglas, 9 •IOO mm, wurden 0,5 ml einer 0,1 molaren Phosphorpuffersalzlösung mit einem PH-Wert 7,2 und 0,01 bis 0,1 ml der Urokinaselösung und 0,1 ml einer Trombinlösung mit 100 NJH-Einheiten pro ml und 1,0 ml einer 0,8%igen Ochsenfibrinogenlösung gemischt, und die Lösung wurde darauf bei 37° C inkubiert. Nach 1 Minute war die Lösung zu einem homogenen Koagulat gelatiniert, und auf der Oberfläche des Koagulates wurde eine Glaskugel mit einem Durchmesser von 7 mm angebracht. Als Lysiszeit wurde die Zeit gemessen, in der die Glaskugel den Boden des Reagenzglases ohne Schütteln desselben erreicht. Infolge der Schwierigkeit, ein Fibrinogen zu beschaffen, das reproduzierbare lytische Eigenschaften hat, konnte keine absolute Einheit auf der Grundlage der ermittelten Lysiszeit festgelegt werden. Es wurde deshalb ein willkürlich ausgewähltes Zwischenprodukt, das bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung erhalten worden war, als Standard gewählt und auf der Grundlage der mit diesem Zwischenprodukt ermittelten Aktivität eine relative Einheit festgesetzt. Normaler Urin enthält etwa fünf solcher Einheiten pro ml.

In der zweiten Adsorptionsstufe des Verfahrens wurde eine Lösung von etwa 4 g der erhaltenen Trokkensubstanz in 40 ml einer Puffersalzlösung, die 5,4 g Na₂H P O₄-2 H₂O und 8,5 g NaH₂PO₄ und 5,8 g NaCl im Liter enthielt und einen p_H-Wert 6,2 und eine Kationenstärke von etwa 0,23 Grammäquivalenten im Liter hatte, durch eine Kolonne mit synthetischem Kationenaustauscherharz geleitet, die in folgender Weise hergestellt war.

»Amberlite IRC 50 (XE-97)« der Firma Röhm & Haas, Philadelphia, USA., wurde durch ein Sieb mit 200 Maschen gesiebt, um die feinsten Teilchen zu entfernen, und darauf zunächst in der von Hi rs, Moore und Stein, I. B. C, 1953, Bd. 200, S. 493, angegebenen Weise und dann mit der vorstehend beschriebenen Puffersalzlösung behandelt. Eine zur Füllung eines Chromagraphierungsrohres, 2 · 41 cm, ausreichende Menge des so behandelten Austauscherharzes wurde in der gleichen Puffersalzlösung suspendiert, worauf die Suspension in das Rohr eingefüllt

Claims

wurde, in dem sich das Austauscherharz absetzte, während die überschüssige Puffersalzlösung abgezogen wurde. Nach dem Durchleiten der Lösung von etwa 4 g der Trockensubstanz in der Puffersalzlösung durch diese Kolonne wurde diese mit 100 ml der Puffersalzlösung gewaschen, wodurch die größte Menge der Proteine und färbenden Bestandteile des Adsorbates entfernt wurden. Die Kolonne wurde dann mit 0,5 molarer Natriumchloridlösung unter Fraktionierung eluiert und der Urokinasegehalt jeder Fraktion bestimmt. Die Fraktionen, welche die Hauptmenge der Urokinase enthielten, wurden gesammelt mit Wasser dialysiert und dann der Gefriertrocknung unterworfen. Die Ausbeute betrug etwa 150 mg Urokinase mit einer Aktivität von etwa 10 000 Einheiten pro mg. Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Urokinasekonzentraten aus menschlichem Urin, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Urin durch Behandlung mit einem Adsorptionsmittel und Eluierung des Adsorbates eine Urokinaselösung hergestellt und diese an ein synthetisches Kationenaustauscherharz adsorbiert wird, das einen wesentlichen Gehalt an Carboxylgruppen hat und mit einer wäßrigen Elektrolytlösung mit einem p_H-Wert zwischen 5 und 7 und einer Kationenstärke zwischen 0,1 und 1 Grammäquivalent pro Liter bis zur Erreichung des Gleichgewichtes zwischen der Elektrolytlösung und dem Austauscherharz vorbehandelt ist, worauf das erhaltene Adsorbat mit einer wäßrigen Elektrolytlösung mit einem p_H-Wert eluiert wird, der zur Bildung eines Eluates mit einem p_H-Wert zwischen 5 und 11 führt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Eluierung des Adsorbates am Austauscherharz eine Elektrolytlösung verwendet wird, deren p_H-Wert oder Kationenstärke oder beide höher sind als der oder die entsprechenden

Werte der zur Vorbehandlung des Austauscherharzes bis zur Erreichung des Gleichgewichtes verwendeten Elektrolytlösung.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Urokinaselösung Urin verwendet wird, dessen Wasserstoffionenkonzentration auf einen p_H-Wert zwischen 3 und 8 eingestellt ist, und als Adsorptionsmittel Kieselsäuregel oder ein kationenaustauschendes Silikat und daß das erhaltene Adsorbat mit wäßriger Elektrolytlösung mit einem P_s-Wert eluiert wird, der zur Bildung eines Eluates mit einem p_H-Wert zwischen 9 und 11,5 führt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Urokinaselösung aus Urin als Adsorptionsmittel Oxycellulose bei einem p_H-Wert zwischen 3 und 7 und zur Eluierung des erhaltenen Adsorbates eine wäßrige Elektrolytlösung mit einem p_H-Wert zwischen 8 und 11 verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Adsorption des Urins und Eluierung des Adsorbates erhaltene Urokinaselösung vor der nachfolgenden Adsorption an das Austauscherharz auf unter IO⁰Ai, vorzugsweise unter 5%, ihres Volumens konzentriert wird durch Ausfällung und Wiederauflösung der Urokinase oder bzw. und durch Gefriertrocknung und Wiederauflösung.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Chemisches Zentralblatt, 1942, II, S. 1247, Michael Laskowski und James B. Lumen, Krist. Katalase aus Rindererythrouyten, 1950,1, S. 202, Josef S chormüller, Über die Adsorption von krist. Trypsin an verschiedene Adsorbentien, 1954, S. 4635, Charles A. Z i 111 e, Adsorptionsuntersuchungen von Enzymen;

Zeitschrift für Angewandte Chemie vom 21. 10. 1953, S.521;

USA.-Patentschrift Nr. 2 442 452.