DE2143816B2

DE2143816B2 - Verfahren zur gewinnung von menschlicher urokinase

Info

Publication number: DE2143816B2
Application number: DE19712143816
Authority: DE
Inventors: Nobuhisa Dr.pharm. Omiya; Koji Nobuhiko; Murayama Yukio; Urawa Saitama; Ogawa (Japan)
Original assignee: Mochida Seiyaku K.K., Tokio
Priority date: 1970-09-04
Filing date: 1971-09-01
Publication date: 1973-03-08
Also published as: FR2105243B1; SE372538B; GB1305510A; BR7105833D0; US3723251A; NL164091C; DE2143816A1; DE2143816C3; JPS4810232B1; DK128568B; NL164091B; FR2105243A1; NL7112068A; CA952457A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Urokinase aus Urokinase enthaltenden Flüssigkeiten durch Bindung der Urokinase an ein Adsorbens und durch Elution der Urokinase von dem Adsorbens.

Urokinase ist bekanntlich ein Enzym, das in kleinen Mengen in menschlichem Harn vorkommt und sich als wirksam zur Behandlung verschiedener Formen von Thrombosen erwiesen hat, da es, wenn es intravenös injiziert wird, pathologisch gebildetes Fibrin oder fibrinöse Koagulationen, die die Blutgefäße verstopfen, lösen kann.

Zur Gewinnung von Urokinase aus menschlichem Harn nach dem Verfahren der eingangs genannten Art sind verschiedene absorbierende Materialien bekannt, wie beispielsweise Schwermetalle, Bariumsulfat, Kieselsäure und deren Salze und verschiedene Ionenaustauscher. So ist die Verwendung von Bariumsulfat aus J. Lab. & CHn. Med. 44, S. 944 (1954) und der japanischen Patentpublikation Sho 44-8064 (1969) bekannt. Die Verwendung von Silicagel ist aus Biochim. Biophys. Acta, 24, S. 278 (1957), der britischen Patentschrift 802 326 und der japanischen Patentpublikation Sho 34-547 (1959) bekannt. Die Verwendung von Cellulosephosphat ist aus Vox Sang., 7, S. 739 (1962) und der japanischen Patentpublikation Sho 42-8911 bekannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, das wirksamer als die bisherigen ist. Es wurde nun ein Verfahren gefunden, das wirksamer als alle bekannten Verfahren und einfach durchzuführen ist und sich zur Gewinnung von gereinigter Urokinase in industriellem Maßstab eignet.

Das Verfahren der eingangs genannten Art ist nun erflndungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert der Flüssigkeit zwischen 4,8 bis 7,5, vorzugsweise zwischen 5,5 bis 6,5, als Adsorbens ein synchronisches Acrylnitrilfasern enthaltendes Material einsetzt.

In vorteilhafter Weise kann die Elution der adsorbierten Urokinase mit einer alkalischen Lösung vorgenommen werden.

Dem ernndungsgoii»Uß verwendeten Adsorbens sind aber auch Acrylnitrilfasern und Stoffe aus diesen Fasern äquivalent. Acrylnitritrilfasern oder Stoffe daraus sind ebenfalls im Handel erhältlich.

Das erfindungsgemäß zu verwendende synthetische Acrylnitrilfasern enthaltende Material ist so billig und so leicht zugänglich, daß es nach dem Gebrauch weggeworfen werden kann, und es erfordert keine Vorbehandlung vor der Verwendung. Wenn es jedoch erwünscht ist, kleine Flecken von der Faser zu entfernen, so kann dieser Zweck einfach durch vorhergehendes Eintauchen der Faser in Wasser und Bewegen in diesem erreicht werden. Wenn Luftblasen, die zwischen den Fasern eingeschlossen sind, vor dem Inkontaktbringen der Fasern mit dem Harn entfernt werden sollen, so kann dies mit einer ähnlichen Behandlung erreicht werden.

Da die Fasern in kleinen Mengen ausreichend wirksam sind und die an diesen Fasern adsorbierte Urokinase leicht abgetrennt werden kann, ist das erfindungsgemäße Verfahren wirtschaftlich jedem der bekannten Verfahren überlegen.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß der Arbeitsaufwand für das Sammeln von Harn herabgesetzt wird oder wegfallen kann.

So kann insbesondere die große Arbeit, die zum Sammeln von Harn erforderlich ist, durch das einfache Sammeln kleiner leichter Acrylnitrilfasern, die in den Urinalen liegen oder einen Teil der Abflußleitung, die mit dem Boden des Urinais verbunden ist, füllen, ersetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich somit außerordentlich gut für die industrielle Extraktion von Urokinase.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist im wesentlichen das folgende: Menschlicher Harn wird in Kontakt mit synthetischer Acrylnitrilfasern gebracht, um Urokinase aus de.d Harn an den Fasern zu adsorbieren, die herausgenommen werden, um zur Entfernung des restlichen Harns mit Wasser gewaschen zu werden. Die Elution erfolgt dann unter Verwendung einer alkalischen Lösung. Da die Harnzusammensetzung durch die Aufnahme von Nahrung oder Wasser, die Bewegung, die Zeit oder klimatische Einflüsse stark beeinflußt wird, ist es schwierig, einen normalen pH-Wert für der Harn festzulegen, doch kann angenommen werden, daß dieser im allgemeinen zwischen 4,8 und 7,5 liegt (Hidenobu Majima, »Physiology«, Bunkodo. 1968). In diesem pH-Bereich von 4,8 bis 7,5 kann Urokinase an synthetische Acrylnitrilfasern adsorbiert werden, doch ist für höhere Ausbeuten ein pH-Bereich von 5,5 bis 6,5 zu bevorzugen. Wenn beispielsweise zur Elution der adsorbierten Urokinase eine wäßrige 4%>ige Ammoniaklösung verwendet wird, so wird eine Elutionsrate von 94°/o erreicht.

Der Kontakt des Harns mit den synthetischen Acrylnitrilfasern wird wirksamer gemacht, indem das obige Verfahren nach Behandlung des Harns bei Zimmertemperatur durch Einstellung seines pH-Wertes auf 7,5 bis 9,5 oder vorzugsweise, auf 8,5 und somit Entfernung der gebildeten Sedimente durchgeführt wird.

Die erhaltene Urokinase enthaltende Lösung wird dann zu einem für medizinische Zwecke geeigneten Präparat konzentriert oder gereinigt. Es ist bekannt, daß zur Konzentrierung die folgenden Methoden zur Verfügung stehen: Aussalzen mittels Ammoniumsulfat, Sedimentation mittels eines organischen Lösungsmittels, Verwendung eines Ultrafilters. Zur Reinigung können verschiedene Ionenaustauscher verwendet werden, doch wird eine Urokinase hoher Reinheit

durch einen weiteren Kontakt mit synthetischen Acrylnitrilfasern erhalten.

Im folgenden soll die selektive Adsorption von Urokinase an synthetische Acrylnitrilfaseni im einzelnen gezeigt werden. Die nachfolgende Tabelle I zeigt die Ausbeuten an Urokinase aus verschiedenen Fasern, die durch Inkontaktbringen von 2 g Fasern mit 3 1 Harn mit einem pH-Wert von 6,0 erhalten wurden. Die Fasern wurden mit Wasser gewaschen, und die Urokinase wurde dann unter Verwendung einer wäßrigen 4 «/eigen Ammoniaklösung eluiert.

	Hauptbestandteil	Ausbeute P/o)	20	8
Tabelle 1
Ausbeuten an Urokinase	Cellulose	15
Fasern
Adsorbierende	Vinylchlorid	89 »5
Baumwolle
Synthetische	Acrylnitril
Vinylchloridfaser
Synthetische
Acrylnitrilfaser ..

Die Tabelle I zeigt die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens bezüglich der Ausbeute an Urokinase.

Die folgende Tabelle II zeigt einen Vergleich zwischen üblichen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Tabelle 2

Vergleich zwischen üblichen Verfahren und dem
erfindungsgemäßen Verfahren

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Adsorptionsmedium	Ausbeute	Spezifische Aktivität
	("/0)	(E/mg)
Bariumsulfat	70	800
Silicagel	54	525
Cellulosephosphat	79	310
Carboxymethylcellulose ..	35	297
Schwach saures Kationen
austauscherharz	88	508
Synthetische
Acrylnitrilfaser	91	3800

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45

Aus Tabelle II ist klar ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine höhere Ausbeute an Urokinase als die üblichen Verfahren ergibt. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die bisher bekannten sogenannten Adsorbentien nicht nur Urokinase sondern auch große Mengen von Verunreinigungen adsorbieren, so daß die Reinheit des Elutionsproduktes gering ist, und die Bedeutung dieser Adsorbentien lediglich in dem Herausholen der Urokinase aus dem Harn zu sehen ist.

Aus den Tabellen I und II ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein ausgezeichnetes Verfahren ist, das sich nicht nur durch die Möglichkeit der Gewinnung in hohen Ausbeuten, sondern auch durch eine hohe Selektive bezüglich der Urokinaseadsorption auszeichnet.

Die Urokinaseeinheiten wurden durch die Fibrinplattenmethode nach Ploug und Mitarb (J. Ploug, Biochem. Biophys. Acta, Bd. 24, S. 278 [1957] bestimmt.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Srläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Ein gesammeltes großes Volumen von frischem Harn von vielen gesunden Personen wurde unter Rühren unter Verwendung einer 10^e/aigen Natriumhydroxydlösung auf pH 8,5 eingestellt Das erhaltene Sediment wurde abfiltriert oder durch Abzentrifugieren entfernt. Darm wurde unter kräftigem Rühren 6n-Salzsäure allmählich zur Einstellung auf pH 5,5 zugegeben. Unmittelbar anschließend wurden in einer Menge von 70 g/1001 Harn unter kräftigem Rühren synthetische Acrylnitrilfasern eingebracht. Diese Fasern, die so in Kontakt mit dem Harn gebracht warden, wurden in einen großen Trichter überführt und mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser farblos und klar war. Dann wurde das Waschwasser durch Abpressen entfernt. Anschließend wurde die an den Fasern adsorbierte Urokinase unter Verwendung von 2 1 einer wäßrigen 4 °/oigen Ammoniaklösung durch Elution abgetrenn . Ammoniumsulfat wurde zu dem Eluat unter Rühren bis zu einer Sättigung von 60% zugegeben. Nach Fortsetzung des Rührens für eine weitere Stunde wurde der Niederschlag durch 30minütiges Abzentrifugieren bei 20 000 g abgetrennt, in 500 ml Wasser gelöst und dann über Nacht einer Dialyse unter Verwendung der 100 fachen Menge Wasser unterzogen. Die so erhaltene Lösung enthielt etwa 85% der Urokinase in dem ursprünglichen Harn. Ihre spezifische Aktivität betrug etwa 24 000 E/mg.

Beispiel 2

Unter kräftigem Rühren wurde 6n-Salzsäure allmählich zu einer rohen Urokinaselösung, die wie im Beispiel 1 erhalten war, zur Einstellung auf pH 5,5 zugegeben. Unmittelbar danach wurden synthetische Acrylnitrilfasern in die rohe Urokinaselösung in einer Menge von 100 g/l Lösung eingebracht, und es wurde kräftig gerührt. Die anschließende Behandlung war die gleiche wie im Beispiel 1, und die Elution wurde unter Verwendung von 1 1 einer wäßrigen 4"/oigen Ammoniaklösung durchgeführt. Anschließend wurde wie im Beispiel 1 aufgearbeitet.

Die schließlich erhaltene Lösung enthielt etwa 80% der Urokinase in der rohen Urokinaselösung. Ihre spezifische Aktivität betrug über 13 000 E/mg.

Beispiel 3

100 g Kaolin wurden zu 1001 frischem Harn, aus dem das Sediment durch Filtrieren abgetrennt worden war, zugegeben, und das Gemisch wurde dann gründlich gerührt. Das Kaolin wurde durch Abzentrifugieren gewonnen und gewaschen, bis die Waschflüssigkeit farblos und klar war. Anschließend wurde die an dem Kaolin absorbierte Urokinase durch EIulion unter Verwendung von 31 einer wäßrigen 4% igen Ammoniaklösung abgetrennt und dann über Nacht einer Dialyse unterzogen. Die so erhaltene rohe Urokinaselösung wurde mit 6n-Salzsäure auf

pH 5,5 eingestellt. 45 g Textiistücke aus synthetischen Acrylnitrilfasern wurden dann unter gutem Rühren zugegeben. Anschließend wurde die gleiche Arbeitsweise wie im Beispiel 1 durchgeführt. Die EIution wurde unter Verwendung von 11 einer wäßrigen 4°/oigen Ammoniaklösung vorgenommen. Die anschließende Behandlung war die gleiche wie im Beispiel 1.

Die so erhaltene Lösung enthielt etwa 75°/o der Urokinase in der rohen Lösung oder etwa 4O°/o der Urokinase in dem ursprünglichen Harn, wobei ihre spezifische Aktivität über 10 000 E/mg betrug.

Claims

Patentanspräche:

1. Verfahren zur Gewinnung von menschlicher Urokinase aus Urokinase enthaltenden Flüssigkeiten durch Bindung der Urokinase an ein Adsorbens und durch Elution der Urokinase von dem Adsorbens, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert der Flüssigkeit zwischen 4,8 und 7,5, vorzugsweise zwischen 5,5 und 6,5 als Adsorbens ein synthetische Acrylnitrilfasem enthaltendes Material einsetzt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution der adsorbierten Urokinase mit einer alkalischen Lösung vornimmt.