DE2350691C2

DE2350691C2 - Herstellung von Pankreas-Elastase

Info

Publication number: DE2350691C2
Application number: DE2350691A
Authority: DE
Inventors: Masayuki Kawagoe Saitama Yoshizawa; Kengo Niiza Saitama Araki; Atsushi Funabashi Chiba Koide; Yoshitaka Tokyo Matsuoka
Original assignee: EISAI Co Ltd TOKYO JP
Current assignee: EISAI Co Ltd TOKYO JP
Priority date: 1972-10-09
Filing date: 1973-10-09
Publication date: 1981-11-12
Also published as: DE2350691A1; US3904479A; FR2202102B1; JPS4966882A; AR200149A1; GB1443059A; FR2202102A1; JPS5021557B2; NL180334B; DK136610B; ES419496A1; NL7313893A; DK136610C; NL180334C

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Patentansprüche 2 bis 6 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung von Elastase vorgeschlagen worden. Ein typisches Verfahren ist beispielsweise das von U. J. Lewis et al. in J. Biol. Chem, 222, Seite 705 ff. (1965), beschriebene Verfahren. Dieses Verfahren besteht darin, daß man Pankreatin mit einer 0,1-M-Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,5 extrahiert, die durch eine 450/oige gesättigte Ammoniumsulfatlösung ausgefällte Fraktion sammelt, sie in einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,8 löst, die Lösung gegen fließendes Wasser dialysiert, um das ausgefällte Euglobulin zu sammeln, den Euglobulinniederschlag in Wasser suspendiert, zu der wäßrigen Suspension des Euglobulins festes Ammoniumsulfat zugibt bis zur Erzielung einer Sättigung von 35%, um die erhaltenen Niederschläge zu sammeln, die gesammelten Niederschläge in einer Carbonatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,8 löst und zu der Lösung Impfkristalle zugibt, um Elastasekristalle auszufällen.

In diesem bekannten Verfahren ist jedoch die Durchführung einer Dialyse zum separaten Sammeln von Euglobulin als einer der wesentlichen Verfahrensschritte erforderlich. Es ist bekannt, daß zur Durchführung einer Dialyse eine Spezialapparatur erforderlich ist und daß sie für die Produktion in einem großtechnischen Maßstabe nicht geeignet ist, obgleich sie für die Produktion im Labormaßstabe angewendet werden kann. Dieses Verfahren eignet sich daher nicht für die großtechnische Herstellung von Elastase.
Alle bekannten Verfahren neben dem obengenannten Lewis-Verfahren stellen Laborverfahren dar, die einen Dialysevorgang umfassen und sie sind daher als technisches Verfahren für die Herstellung von Elastase nicht geeignet.

Andererseits hat es sich gezeigt, daß bei der direkten Kristallisation von Elastase ohne Durchführung einer Dialyse in diesen bekannten Verfahren die Kristallisation von Elastase schwierig ist wegen des Vorhandenseins von Verunreinigungen, wodurch die Produktausbeute vermindert und auch die Reinheit der Elastase stark herabgesetzt wird.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Pankreas-Elastase anzugeben, das auch in großtechnischem

Maßstäbe durchgeführt werden kann.

Es wurde gefunden, daß dieses Ziel erfindungsgemäß erreicht werden kann.

Da das Pankreas sämtlicher Säugetiere Elastase enthält, sind sie alle als Ausgangsmaterial für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbar, wobei jedoch das Schweinepankreas wegen seines hohen Gehaltes an Elastase am günstigsten ist. Alle Säugetierpankreaten (Pankreassäfte), die im Handel in Form von rohem Pankreas, Pankreatin und getrocknetem Pankreas erhältlich sind, können als Ausgangsmaterial für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. Für die Extraktion von Elastase aus diesem Ausgangspankreas (Pankreassaft) sollte ein wäßriges Lösungsmittel, wie

z. B. schwach saures oder schwach alkalisches Wasser oder eine wäßrige Salzlösung oder Pufferlösung, verwendet werden. Diese Extraktion kann nach einer üblichen Methode, wie sie in dem obigen Lewis-Verfahren angewendet wird, durchgeführt werden. In den darauffolgenden beiden Aussalzstufen können üblicherweise zum Aussalzen anorganische Salze, wie z. B. Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Natriumchlorid, verwendet werden. Zweckmäßig wird Ammoniumsulfat verwendet

Bei Verwendung von Ammoniumsulfat zum Aussalzen kann die Elastase am wirksamsten erhalten werden, wenn die erste Aussalzung mit einer 45°/oigen Salzsättigung und die zweite Aussalzung mit einer 35°/oigen Salzsättigung durchgeführt werden. Der Bereich des pH-Wertes von 5 bis 10 der wäßrigen Lösung während der Inkubation der Lösung bei 5 bis 5O⁰C zur Herabsetzung der Molekulargewichte der darin enthaltenen Proteinverunreinigungen wird so gewählt, daß die Elastase stabilisiert werden kann und daß die Protease ihre stärkste Verdauungsaktivität innerhalb dieses pH-Wertbereiches erreichen kann.

Die Einschlüsse oder Proteinverunreinigungen werden durch die gleichzeitig vorhandene Protease zersetzt und die Zersetzungsgeschwindigkeit nimmt zu, wenn die Temperatur der Lösung erhöht wird Wenn die Inkubationszeit zu lang ist, werden aber nicht nur die darin enthaltenen Proteine, sondern auch die Elastase zersetzt. Dementsprechend sollte die Inkubationszeit entsprechend der Inkubationstemperatur in geeigneter

Weise festgelegt werden.

Die optimale Inkubationszeit hängt von dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und der Art des Ausgangsmaterials u. dgl. ab, sie liegt jedoch gewöhn-

lieh innerhalb des Bereiches von etwa 15 bis etwa 100 Stunden bei 5 bis 15° C, von etwa 5 bis etwa 30 Stunden bei 15 bis 3O⁰C und von etwa 1 bis etwa 10 Stunden bei 30 bis 40° C. Der hier verwendete Ausdruck »optimale Inkubationszeit« bezeichnet die Inkubationszeit, bei der die Ausbeute an Elastasekristallen, die in der nachfolgenden Kristallisationsstufe ausgefällt werden, maximal ist.

Die Inkubationstemperatur darf den Wert von 50° C nicht überschreiten, weil dann, wenn die Inkubation bei einer Temperatur oberhalb 50" C durchgeführt wird, die optimale Inkubationszeit bei einer solchen Temperatur kurzer wird, jedoch dann, wenn die Inkubation für einen längeren Zeitraum als der optimalen Inkubationszeit durchgeführt wird, die ausgefällte Elastasemenge ziemlich abrupt abnimmt Deshalb ist bei einer Temperatur oberhalb 50⁰C eine geeignete Zeitkontrolle der Inkubationszeit bei der praktischen Durchführung der Erfindung schwierig.

Andererseits erfordert die Inkubation bei einer Temperatur von unterhalb 5" C eine zu lange Zeit zur Erzielung maximaler Ausbeuten an Elastasekristallen in der nachfolgenden Kristallisationsstufe und deshalb ist eine derart niedrige Temperatur bei der praktischen Durchführung der Erfindung ebenfalls unerwünscht.

Alle Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens sollten vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb 4° C durchgeführt werden mit Ausnahme der obenerwähnten Inkubationsstufe, die bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 5 bis 50° C durchgeführt werden muß.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß keine Dialysestufe erforderlich ist, daß jedoch eine direkte Kristallisation von Elastase möglich ist, wodurch die Durchführung des Verfahrens sehr stark vereinfacht wird, und daß durch die Kristallisationsstufe die Elastase in einer höheren Reinheit erhalten werden kann als bei den üblichen Verfahren, die eine Dialysestufe umfassen, wie z. B. dem Lewis-Verfahren. So beträgt beispielsweise die Ausbeute an Elastase bei dem Lewis-Verfahren 500 mg Elastase pro 100 g Pankreatin, während die Ausbeute an Elastase nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auf etwa 600 mg pro 100 g Pankreatin erhöht wird.

Durch Elektrophorese mit einem Celluloseacetatstreifen (pH 10,0, Glycinatpufferlösung, μΐη = 0,1) wurde gefunden, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Elastasekristalle aus zwei Komponenten bestehen, die denjenigen ähnlich sind, die nach den üblichen Verfahren erhalten werden, so daß es sich dabei um den üblichen sogenannten »kristallinen Elastase komplex« handelt. Die Aktivität des nach .dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen kristallinen Elastasekomplexes in bezug auf die Zersetzung von Elastin wird durch Elastaseeinheiten angegeben.

Der hier verwendete Ausdruck »Elastaseeinheit (El. U)« ist wie folgt definiert: zu 4 ml einer Substratlösung, die 24 mg Elastinsubstrat (bezogen auf das Trockengewicht) enthält, wird 1 ml einer Lösung zugegeben, die eine ausgewählte Menge der zu untersuchenden Elastase enthält, der pH-Wert wird auf 8,8 eingestellt und die Mischung wird 30 Minuten lang bei 37° ±0,1° C inkubiert. Nach der Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von 5 ml einer 0,6-M-Acetatpufferlösung (pH 5,3). die 0,05% Natriumlaurylsulfat enthält, gestoppt. Dann wird die Mischung zentrifugiert und die E 275 πιμ-Absorption der überstehenden Lösung wird bestimmt. Die Tyrosinmenge ^g) wird aus der Absorption errechnet, wobei man davon ausgeht, daß die Absorption auf das Tyrosin zurückgeht. Die Elastaseaktivität, die 1 μg Tyrosin aus dem Elastinsubstrat pro Minute freisetzt, ist als eine Elastaseeinheit (1 El. U) definiert.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

50 kg Schweinepankreatin wurden zu 5001 einer 0,1-M-Acetatpufferlösung (pH 4,5), die vorher auf 4° C abgekühlt worden war, zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und über Nacht

is stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert. Zu dem Filtrationsrückstand wurde eine weitere Menge von 1001 der gleichen Pufferlösung zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und dann erneut filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und dazu wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß die Salzkonzentration einer Sättigung von 45% entsprach. Der dadurch abgetrennte feuchte Niederschlag (22 kg) wurde erneut in 1321 einer 0,1-M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gelöst und in einem Inkubator 20 Stunden lang bei 2O⁰C stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C und Zugeben von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, erhielt man 7 kg eines feuchten Niederschlages, der durch Filtrieren gesammelt wurde. Dieser Niederschlag wurde in 42 I einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, es wurden Elastase-Impfkristalle zugegeben und es wurde bei 5° C gerührt, um die Elastasekristalle auszufällen. Die Ausbeute an Elastasekristallen betrug 300 g, die Aktivität der Elastase betrug 150 El. U/mg.

Beispiel 2

1 kg getrocknetes Schweinepankreas wurde zu 101 einer 0,1-M-Acetatpufferlösung (pH 4,5X die vorher auf 4⁰C abgekühlt worden war, zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert. Zu dem Filtrationsrückstand wurde eine weitere Menge von 21 der gleichen Pufferlösung zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und dann erneut filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und dazu wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge gegeben, daß die Salzkonzentration auf eine Sättigung von 45% gebracht wurde. Der dadurch abgetrennte feuchte Niederschlag (352 g) wurde in 21 I einer 0,1-M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) erneut aufgelöst und in einem Inkubator 20 Stunden lang bei 15° C stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C und nach der Zugabe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, erhielt man 53,5 g eines feuchten Niederschlages, der durch Filtrieren gesammelt wurde. Dieser Niederschlag wurde in O32I einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, es wurden Elastase-Impfkristalle zugegeben und die Lösung wurde bei 5° C gerührt, um die Elastasekristalle auszufällen. Die Ausbeute an Elastasekristallen betrug 4,95 g, die Aktivität der Elastase betrug 139 El. U/mg.

Beispiel 3

2 kg rohes Schweinepankreas, das durch einen Fleischwolf zerkleinert worden war, wurden zur Aktivierung 8 Stunden lang bei 30⁰C stehengelassen und zu 61 einer O.l-M-Acetatpufferlösung (pH 4,5) zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert. Zu dem Filtrationsrückstand wurde eine weitere Menge von 1 1 der gleichen Pufferlösung zugegeben und ι ο die Mischung wurde eine Stunde lang gerührt und dann erneut filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und dazu wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß die Salzkonzentration auf eine Sättigung von 45% gebracht wurde. Der dadurch abgetrennte feuchte Niederschlag (83 g) wurde in 0,51 einer 0,1-M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) erneut gelöst und in einem Inkubator 20 Stunden lang bei 20⁰C stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C unter Zugabe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, erhielt man 21,9 g eines feuchten Niederschlags, der durch Filtrieren gesammelt wurde. Dieser Niederschlag wurde in 130 ml einer O.l-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, mit Elastasekristallen geimpft und zur Einleitung der Kristallisation bei 5° C gerührt. Die Ausbeute an Elastasekristallen betrug 1,84 g, die Aktivität der Elastase betrug 150 El. U/mg.

Beispiel 4

1 kg Schweinepankreatin wurde zu 101 einer 0,1-M-Acetatpufferlösung (pH 4,5), die vorher auf 4⁰C abgekühlt worden war, zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert. Zu dem Filtrationsrückstand wurde eine weitere Menge von 21 der gleichen Pufferlösung zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und dann erneut filtriert Die Filtrate wurden vereinigt und dazu wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß die Salzkonzentration auf eine Sättigung von 45% gebracht wurde. Der so abgetrennte feuchte Niederschlag (396 g) wurde in 2,41 einer 0,1 -M-Boratpufferlösung (pH 7,0) erneut gelöst und in einem Inkubator bei 22°C 24 Stunden lang stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C und der Zugabe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, erhielt man 77,7 g eines feuchten Niederschlages, de durch Filtrieren gesammelt wurde. Dieser Niederschlag wurde in 0,47 1 einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, mit Elastasekristallen geimpft und zur Einleitung der Kristallisation bei 5° C gerührt. Die Ausbeute an Elastasekristallen betrug 6,0 g, die Aktivität der Elastase betrug 144 El. U/mg.

Beispiel 5

2 kg rohes Schweinepankreas, das durch einen Fleischwolf zerkleinert worden war, wurden zur Aktivierung 8 Stunden lang bei 30° C stehengelassen und dann zu 6 I einer 0,1-M-Acetatpufferlösung (pH 4,5) zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert. Zu dem Filtrationsrückstand wurde eine weitere Menge von 1 1 der gleichen Pufferlösung zugegeben und

35

40

45 die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und dann erneut filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und dazu wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß die Salzkonzentration auf eine Sättigung von 45% gebracht wurde. Der so abgetrennte feuchte Niederschlag (82,8 g) wurde in 0,51 einer 0,1-M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) erneut gelöst und 96 Stunden lang bei 5⁰C stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C und der Zugabe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, erhielt man 38 g eines feuchten Niederschlages, der durch Filtrieren gesammelt wurde. Dieser Niederschlag wurde in 230 ml einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, mit Elastasekristallen geimpft und zur Einleitung der Kristallisation bei 5° C gerührt. Die Ausbeute an Elastasekristallen betrug 1,8 g, die Aktivität der Elastase betrug 110 El. U/mg.

Beispiel 6

10 kg Schweinepankreatin wurden zu 1201 einer 0,1-M-Acetatpufferlösung (pH 4.5), die vorher auf 4°C abgekühlt worden war, zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert. Zu dem Filtrat wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß die Salzkonzentration auf eine Sättigung von 45% gebracht wurde. Der dadurch abgetrennte feuchte Niederschlag (4 kg) wurde in 241 einer 0,1-M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) erneut gelöst und eine 250-ml-Portion der Lösung wurde in einem Thermostaten bei den in der folgenden Tabelle angegebenen Temperaturen und während der in der folgenden Tabelle angegebenen Zeiten stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C und der Zugabe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, wurde der durch Filtrieren erhaltene und gesammelte feuchte Niederschlag in der sechsfachen Menge des Volumens des Niederschlages einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, mit Elastasekristallen geimpft und zur Einleitung der Kristallisation bei 5" C gerührt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben, in der auch die Bezugsdaten eines Vergleichsversuchs angegeben sind, bei dem keine Thermostatinkubation durchgeführt wurde.

50

55

60

65

Inkubationszeit	Elastasekristalle (mg)	30"C
(Std.)	25°C	60
0 (Kontrollversuch)	60	660
10	90	480
15	270	510
20	720	330
25	570	150
30	540

Beispiel 7

10 kg Schweinepankreatin wurden zu 1201 einer 0,1-M-Acetatpufferlösung (pH 4,5), die vorher auf 4° C abgekühlt worden war, zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und über Nacht

stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert. Zu dem Filtrat wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß die Salzkonzentration einer Sättigung von 45% entsprach. Der so abgetrennte feuchte Niederschlag (4 kg) wurde in 241 einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,5) erneut aufgelöst und eine 1-1-Portion der Lösung wurde in einem Inkubator bei 20" C innerhalb der in der folgenden Tabelle angegebenen Zeiten stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C und der Zugabe von

Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, wurde der dabei erhaltene, durch Filtrieren gesammelte Niederschlag in dem 6fachen des Volumens des Niederschlages einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, mit Elastasekristallen geimpft und zur Einleitung der Kristallisation bei 5° C gerührt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben, die auch Vergleichsdaten eines Vergleichsversuches enthält, bei dem keine Thermostatinkubation durchgeführt wurde.

Inkubationszeit (Std.)

0 5

(Kontrollversuch)

15

25

Elastasekristalle (mg)

70

Beispiel 8

1400

2160

660

5 kg getrocknetes Schweinepankreas wurden zu 501 einer 0,1-M-Acetatpufferlösung (pH 4,5) zugegeben, die vorher auf 4° C abgekühlt worden war, und die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert. Zu dem Filtrat wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß die Salzkonzentration einer Sättigung von 45% entsprach. Der so abgetrennte feuchte Niederschlag (1,7 kg) wurde in 101 einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,5) erneut gelöst und eine 1-1-Portion der Lösung wurde in einem Inkubator bei 20° C innerhalb der in der folgenden Tabelle angegebenen Zeiten stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C und der Zugabe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, wurde der erhaltene, durch Filtrieren gesammelte Niederschlag in dem 6fachen des Volumens des Niederschlages einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, mit Elastasekristallen geimpft und zur

jo Einleitung der Kristallisation bei 5° C gerührt. Die dabei erhaltenen Ereignisse sind in der folgenden Tabelle angegeben, in der auch die Vergleichsdaten eines Vergleichsversuches enthalten sind, der ohne Thermostatinkubation durchgeführt wurde.

Inkubationszeit (Std.)

0 5

(Kontrollversuch)

15

25

Elastasekristalle (mg)

1240

1460

1470

1600

Beispiel 9

10 kg eines rohen Schweinepankreas, das mittels eines Fleischwolfes zerkleinert worden war, wurden zur Aktivierung 8 Stunden lang bei 30° C stehengelassen und dann zu 901 einer 0,1-M-Acetatpufferlösung (pH 4,5) zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden lang gerührt, über Nacht stehengelassen und filtriert Zu dem Filtrat wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß die Salzkonzentration einer Sättigung von 45% entsprach. Der so abgetrennte feuchte Niederschlag (1,3 kg) wurde in 731 einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,5) wieder aufgelöst und eine 1-1-Portion der Lösung wurde in einem Inkubator bei 20° C innerhalb der in der folgenden Tabelle angegebenen Zeiten stehengelassen. Nach dem Filtrieren zum Entfernen des Schlammaterials und nach dem anschließenden Abkühlen auf 4° C und der Zugabe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine Konzentration entsprechend einer Sättigung von 35% erzielt wurde, wurde der dabei erhaltene, durch so Filtrieren gesammelte Niederschlag in dem 6fachen des Volumens des Niederschlages einer 0,1-M-Carbonatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, mit Elastasekristallen geimpft und zur Einleitung der Kristallisation bei 5° C gerührt Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben, die auch Vergleichsdaten eines Vergleichsversuches enthält, bei dem keine Thermostatinkubation durchgeführt wurde.

Elastasekristalle (mg) Inkubationszeit (Std.)

0 5

(Kontrollversuch)

15

25

1750

2290

2390

2060

130240/106

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Pankreas-Elastase, wobei ein flüssiger Extrakt eines Säugetier-Pankreas ausgesalzen wird und die dabei erhaltenen die Elastase enthaltenden Niederschläge in einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 5 bis 10 gelöst werden, dadurch gekennzeichnet, daß diese Lösung mindestens eine Stunde lang bei 5 bis 50° C inkubiert und dann erneut ausgesalzen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangs-Pankreas ein Schweinepankreas verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Aussalzstufen unter Verwendung von Ammoniumsulfat durchgeführt werden.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Aussalzung bei einer Sättigung von 45% und die zweite Aussalzung bei einer Sättigung von 35% durchgeführt wird.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei 5 bis 15° C eine Inkubationszeit innerhalb des Bereiches von etwa 15 bis etwa 100 Stunden, bei 15 bis 30⁰C eine Inkubationszeit innerhalb des Bereiches von etwa 5 bis etwa 30 Stunden und bei 30 bis 40⁰C eine Inkubationszeit von etwa 1 bis etwa 10 Stunden angewendet wird.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Verfahrensstufen mit Ausnahme der Inkubationsstufe bei einer Temperatur unterhalb 4° C durchgeführt werden.