CN103667225B - 一种制备弹性蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备弹性蛋白酶的方法。本发明的技术方案是将动物胰脏经过绞碎，灵活运用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液盐溶、硫酸铵盐析等现代蛋白纯化技术，制备弹性蛋白酶。本发明操作简单、成本低，非常适用于规模化大生产。

Description

一种制备弹性蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是灵活运用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液盐溶、硫酸铵盐析等现代蛋白纯化技术，从合格的动物胰脏中制备弹性蛋白酶的方法。
背景技术
弹性蛋白酶，广泛存在于哺乳动物胰脏，弹性蛋白酶的水解机制，是首先使弹性蛋白质的结构变疏松并溶解，对甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)残基有很高的水解，将已溶解的弹性蛋白质降解成可溶的多肽及氨基酸。
胰弹性酶原合成于胰脏的腺泡组织，经胰蛋白酶或肠激酶激活后才成为活性酶。人胰每克含0.3-6.2单位弹性酶，牛、猪胰弹性酶含量大约高5倍。
弹性蛋白酶经济价值极高，在医药方面主要作为治疗药物：(1)治疗高血脂症：(2)防治动脉粥样硬化：(3)抑制脂肪肝发展：(4)治疗慢性气管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病：(5)外用于消除皮肤焦痂、碎屑，用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等症。
药用的弹性蛋白酶主要从猪胰脏中提取，目前，我们通过检索发现弹性蛋白酶的提取分离技术多采用离子交换树脂从胰脏提取液分离精制而得，如南昌市浩然生物医药有限公司公开了《从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶》专利(申请号：200810107092.8)，常州千红生化制药有限公司纯化弹性蛋白酶的方法(申请号：200710020819.4)专利，均采用树脂进行纯化，树脂的价格昂贵，使大规模工业化生产成本高。
而本发明是灵活运用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液盐溶、硫酸铵盐析等现代蛋白纯化技术，使用磷酸盐、丙酮、硫酸铵等价格便宜的辅料，制备弹性蛋白酶，不仅在一定程度上降低了成本，且产品的收率也能达到15万单位/kg胰脏。
发明内容
本发明的目的是从合格的动物胰脏中提取弹性蛋白酶。
本发明的技术方案是：将合格的动物胰脏经过绞碎后，灵活运用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液提纯及硫酸铵盐析结晶等现代蛋白纯化技术，制备弹性蛋白酶的方法。本发明操作简单、成本低，非常适合于规模化大生产。包括如下步骤：
(1)水解：将新鲜或冷冻猪胰脏绞碎置于容器中，加入2～5倍量0℃以下的丙酮，在0℃左右搅拌脱水0.5～1.5小时，离心得沉淀物，加入0.5～1.5倍量的水及0.01～0.02倍量胰酶搅拌溶解，用6％～10％氢氧化钠溶液调至pH值至6.0～9.0，于15℃～25℃保温搅拌1～3小时，再加入硅藻土充分搅拌，过滤。
(2)沉淀：收集滤液与1.5～3倍量丙酮搅匀，静置10～14小时，虹吸弃去上层丙酮清液，用1.5～2倍量丙酮分3～4次洗涤沉淀物，过滤甩干，干燥，即得弹性蛋白酶粗品。
(3)提纯：将粗品与45～60倍量磷酸缓冲液搅拌0.5～1.5小时，于15℃～25℃静置15～25小时，按照溶液的体积加入其量约3％～7％的硅藻土拌匀，过滤；往滤液中加入硫酸铵，至硫酸铵浓度达35％～45％。过滤，得盐析物；将盐析物再按1g：8～10ml的比例溶于碳酸缓冲液，然后在搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，直至微浑，0℃～8℃下静置48～72小时，慢慢形成针状结晶，过滤。
(4)干燥：滤取晶体并用水冲洗3～5次，冷冻干燥，即可得弹性蛋白酶。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
所述的利用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液提纯及硫酸铵结晶等现代蛋白纯化技术，制备弹性蛋白酶的方法，包括如下步骤：
1.水解：将新鲜猪胰脏绞碎置于容器中，加入3倍量0℃的丙酮，在0℃左右搅拌脱水1小时，离心得沉淀物，加入1倍量水及0.015倍量胰酶搅拌溶解，用8％氢氧化钠溶液调至pH值至7.5，于20℃保温搅拌2小时，再加入0.01倍量硅藻土充分搅拌，过滤。
2.沉淀：收集滤液与2倍量丙酮搅匀，静置12小时，虹吸弃去上层丙酮清液，用2倍量丙酮分4次洗涤沉淀物，过滤甩干，干燥，约得120g弹性蛋白酶粗品。
3.提纯：将粗品与52倍量磷酸缓冲液搅拌混合1小时，于20℃静置20小时，加入其量约5％的硅藻土拌匀，过滤；往滤液中加入硫酸铵至浓度达40％，过滤，约得35g盐析物；将盐析物再按1g：10ml的比例溶于碳酸缓冲液，然后在搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，直至微浑，4℃下静置72小时，慢慢形成针状结晶，过滤。
4.干燥：滤取晶体并用水冲洗3次，冷冻干燥，约可得4.5g弹性蛋白酶。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (1)

1.一种制备弹性蛋白酶的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)水解：将新鲜猪胰脏绞碎置于容器中，加入3倍量0℃的丙酮，在0℃左右搅拌脱水1小时，离心得沉淀物，加入1倍量水及0.015倍量胰酶搅拌溶解，用8％氢氧化钠溶液调至pH值至7.5，于20℃保温搅拌2小时，再加入0.01倍量硅藻土充分搅拌，过滤；
(2)沉淀：收集滤液与2倍量丙酮搅匀，静置12小时，虹吸弃去上层丙酮清液，用2倍量丙酮分4次洗涤沉淀物，过滤甩干，干燥，得120g弹性蛋白酶粗品；
(3)提纯：将粗品与52倍量磷酸缓冲液搅拌混合1小时，于20℃静置20小时，加入其量约5％的硅藻土拌匀，过滤；往滤液中加入硫酸铵至浓度达40％，过滤，得35g盐析物；将盐析物再按1g∶10ml的比例溶于碳酸缓冲液，然后在搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，直至微浑，4℃下静置72小时，慢慢形成针状结晶，过滤；
(4)干燥：滤取晶体并用水冲洗3次，冷冻干燥，可得4.5g弹性蛋白酶。
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胰弹性蛋白酶的制备方法;颜凯;《生化药物杂志》;19851231;第78页右栏第13-14,22-24,30行 *

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Denomination of invention: A method for preparing Elastase

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Granted publication date: 20160817

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Pledgor: QINGDAO KANGYUAN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

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