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Verfahren zur Gewinnung von Abwehrfermenten Zusatz zum Patent 737
689 In dem Hauptpatent ist ein Verfahren zur Gew9innung von Abwehrfermenten geschützt,
Bei dem Harn gegen Lackmus neutralisiert wird, worauf mit geeigneten organischen
Lösungsmitteln, wie z. B. Aceton oder Äthylalkohol, die in dem Harn enthaltenen
Abwehrfermente niedergeschlagen werden. Der Niederschlag wird dann gegebenenfalls
nach einer weiteren üblichen Reinigung in einer Kochsalzlösung aufgenommen, und
durch Sättigung dieser Lösung mit Kochsalz werden die Albumin und sonstigen Verunreinigungen
abgeschieden. Nach üblichen Methoden, z. B. durch Dialyse, wird das Kochsalz aus
der die Fermente enthaltenden Kochsalzlösung entfernt, worauf aus der salzfreien
Lösung die Fermente mit Aceton oder Äthylalkohol niedergeschlagen werden.
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In weiterer Ausbildung des Verfahrens des Hauptpatents wurde nun
gefunden, daß man statt Harn auch Serum oder Organextrakte verwenden kann. Durch
Zugabe von Aceton zu Serum wird eine Fällung erhalten, die die Abwehrfermente neben
einer Reihe von Verunreinigungen, insbesondere solchen eiweißartiger Natur, enthält.
Dieser Niederschlag wird abfiltriert, von dem anhaftenden Aceton im Vakuum befreit
oiund dann etwa in der doppelten Menge destillierten Wassers aufgenommen. Man kann
die Lösung dann unmittelbar mit Kochsalz sättigen, oder aber man kann auch eine
weitere übliche Reinigung einschalten, beispielsweise derart, daß man die Lösung
mit Ammonsulfat sättigt, wodurch die Fermente ausgefällt werden. Das überschüssige
Ammensalfat kann dann durch Dialyse entfernt werden. Die Weiterverarbeitung des
Niederschlages erfolgt nach dem Verfahren des Hauptpatents.
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In gleicher Weise wie Serum können auch Organextrakte verarbeitet
werden. Diese Extrakte werden durch Ausziehen des betreffenden
Organs,
wie z. B. Gehirn, Milz, Tumorgewebe u. dgl., mit physiologischer Kochsalzlösung
gewonnen.
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Die in der ltzten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Ausfällung
mit organischen Lösungsmitteln erhaltenen hochkonzentrierten Fermentp räparate werden
zwecks Applikation vorteilhaft dadurch in Lösung gebracht, daß man sile in einer
Kochsalzlösung aufnimmt, aus der dann nach üblichen Verfahren, z. B. durch Dialyse,
das Kochsalz entfernt wird.
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Im folgenden soll das erfindungsgemäße Verfahren an Hand einiger
Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
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Beispiel 1 1100 ccm Diphtheriepferdeserum (4oofach) werden mit 1100
ccm Aceton versetzt. Die dabei entstehende Fällung läßt man 24 Stunden sich absetzen.
Dann zieht man die üblerstehende Lösung ab und sammelt den Niederschlag auf einer
Nutsche. Die Lösung wird verworfen, der Niederschlag in 31 dest.Wasser aufgeschwemmt
und mit Kochsalz bis zur Sättigung versetzt. Dabei bildet sich ein Niederschlag,
der durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetremit und verworfen wird. Die Lösung
wird gegen dest. Wasser dialysiert.
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Sie enthält die Abwehrfermente in gereinigter Form und kann in bekannter
Weise weiterverarbeitet werden, z. B. durch Einengen auf etwa 2000 ccm, und durch
Versetzen mit 500/0 Alkohol oder Aceton kann man daraus die Abwehrfermente in fester
Form erhalten.
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Beispiel 2 1100 ccm Diphtheriepferdeserum (400fach) werden mit 1100
ccm Aceton versetzt. Die dabei entstehende Fällung läßt man 24 Stttnden sich absetzen.
Dann zieht man die überstehende Lösung ab und sammelt den Niederschlag auf einer
Nutsche. Die Lösung wird verworfen, der Niederschlag in 31 dest.Wasser aufgeschwemmt.
Die weitere Verarbeitung erfolgt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
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Beispiel 3 1100 ccm diphtheriepferdeserum (400fach) werden mit 1100
ccm Aceton versetzt. Die dabei entstehende Fällung läßt man 24 Stunden sich absetzen.
Dann zieht man die überstehende Lösung ab und sammelt den Niederschlag auf einer
Nutsche. Die Lösung wird verworfen, der Niederschlag in 31 destWasser aufgeschwemmt.
Daraufhin gibt man zu der Aufschwemmung allmählich Ammonsulfat unter stetigem Umrühren
bis zur Sättigung.
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Der hierbei ausfallende Niederschlag enthält die Enzyme neben viel
Ballasteiweißkörpern.
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Nach einigem Stehen trennt man durch Filtrieren die Lösung von der
Fällung. Die Lösung ist enzymatisch inaktiv und wird verworfen. Die Ammonsulfatfällung
wird in 4700 ccm Wasser aufgenommen und 48 Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert.
Nach dem Dialysieren beträgt das Volumen der Dialyseninnenflüssigkeit 6500 ccm.
Sie wird unter Rühren allmählich mit steigenden Mengen von Kochsalz bis zur Sättigung
versetzt. Dabei bildet sich ein kräftiger Niederschlag, der inaktiv ist und verworfen
wird.
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Die überstehende Lösung, die man durch Filtration von dem Niederschlag
abtrennen kann, wird zur Entfernung des Kochsalzes-48 Stunden gegen fließendes Wasser
dialysiert, dank auf 3000 ccm eingeengt. Die Lösung enthält die Abwehrfermente in
weitgehend gereinigter Form. Durch Ausfällen mit Aceton oder Alkohol können dieselben
daraus in bekalt, er Weise als Trockensubstanz gewonnen werden.
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Beispiel 4 100 mg der nach dem Verfahren der Beispiele I bis 3 gewonnenen
gereinigten Abwehrfermente werden in 300 ccm physiologischer Kochsalzlösung gelöst.
Die Lösung wird dann anschließend gegen dest. Wasser dialysiert, um das Kochsalz
zu entfernen. Auf diese Weise erhält man eine hochkonzentrierte, von Elektrolyten
freie Lösung der Abwehrfermente.
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Beispiel 5 1000 g frischen Kalbsgehirns werden kurz gewässert, von
Bindegewebe und größeren Blutgefäßen befreit, mit Sand zu einem sehr feinen Brei
verrieben. Dieser Organbrei wird mit 51 physiologischer Kochsalzlösung 12 Stunden
bei Zimmertemperatur extrahiert. Dann wird die überstehende Lösung abfiltriert.
Das Filtrat wird mit dem gleichen Volumen Aceton versetzt. Der dabei sich bildende
Niederschlag, der die Abwehrfermente enthält, wird nun nach dem in den Beispielen
I bis 4 angegebenen Verfahren weiterverarbeitet.