DE580284C - Verfahren zur Darstellung von ein Hormon oder ein Gemisch von Hormonen enthaltenden Fluessigkeiten aus Nebenschilddruesen - Google Patents

Verfahren zur Darstellung von ein Hormon oder ein Gemisch von Hormonen enthaltenden Fluessigkeiten aus Nebenschilddruesen

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DE580284C
DE580284C DEA64036D DEA0064036D DE580284C DE 580284 C DE580284 C DE 580284C DE A64036 D DEA64036 D DE A64036D DE A0064036 D DEA0064036 D DE A0064036D DE 580284 C DE580284 C DE 580284C
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/55Glands not provided for in groups A61K35/22 - A61K35/545, e.g. thyroids, parathyroids or pineal glands

Description

:; Die Erfindung betrifft ein Verfahren, um
Π aus Nebenschilddrüsen (g1^xidula_paratliyteo^.
' ' idea)_ Flüssigkeiten herzustellen, die Hormone enthalten, welche neben anderen Eigenschäften die Fähigkeit besitzen, das Wachstum von Geweben zu verzögern oder zu verhindern.
Es wurde bereits vorgeschlagen, aus Nebenschilddrüsen einen Extrakt darzustellen, der ein Hormon enthält, das injiziert die Wirkung hat, den Calciumgehalt des Blutes über den normalen Gehalt zu erhöhen oder, in anderen Worten, die sogenannte Hypercalcaemie zu erzeugen. Das Verfahren zur Darstellung dieses Extrakts ist im Journal of Biological Chemistry, 1925, Band 66, S. 135, beschrieben.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, aus Nebenschilddrüsen Flüssigkeiten zu erhalten, die Hormone enthalten, die das Wachstum von Geweben verzögern oder verhindern, aber injiziert keine Hypercalcaemie erzeugen.
Gemäß der Erfindung umfaßt das Verfahren zur Darstellung von Flüssigkeiten, die ein Hormon oder ein Gemisch von Hormonen enthalten, aus der Schilddrüse die folgenden Stufen: Ein säureenthaltender Extrakt der Nebenschilddrüse wird bis zu einem PH-Wert von etwa 4,6 bis 5,0 neutralisiert; die unlöslichen ausgefallenen Stoffe werden abfiltriert; das Filtrat wird einer weiteren Behandlung unterworfen, um das in ihm enthaltene Hormon oder das Gemisch der Hormone zu konzentrieren und zu reinigen.
Eine Ausführung des Verfahrens nach der Erfindung umfaßt die folgenden Stufen: Die Nebenschilddrüsen werden mit einer säurehaltigen Flüssigkeit extrahiert; der flüssige Extrakt wird von den unlöslichen Stoffen abgetrennt; die Säure in dem flüssigen Extrakt wird neutralisiert, und zwar vorzugsweise bis auf einen pn-Wert von 4,6 bis 5,0. Das Gemisch bleibt in der Kälte stehen, bis keine weiteren unlöslichen Stoffe mehr ausfallen; die während des Stehens abgeschiedenen unlöslichen Stoffe werden abfiltriert, das Filtrat wird unter vermindertem Druck konzentriert. Der pH-Wert wird, falls notwendig) wieder auf 4,6 bis 5,0 eingestellt. Die Flüssigkeit bleibt stehen, bis keine' weiteren unlöslichen Stoffe sich abscheiden, die Flüssigkeit wird abgetrennt.
Die erhaltene Flüssigkeit enthält das gewünschte Hormon oder ein Gemisch der Hörmone und kann in dieser Form oder nach Aufarbeitung angewandt, z. B. injiziert, werden.
Der Rückstand der Drüsen kann gegebenenfalls nochmals mit der säurehaltigen Flüssigkeit extrahiert werden. Der flüssige Extrakt kann entweder der zu neutralisierenden Hauptmenge zugefügt werden, oder er kann für sich neutralisiert werden, worauf das Filtrat zu der Hauptmenge des zu konzentrierenden Filtrats zugefügt wird. Gegebenenfalls kann die Extraktion mit der säurehaltigen Flüssigkeit mehrmals wiederholt werden.
Um die zufriedenstellendsten Ergebnisse zu erhalten, ist die Neutralisation der Säure in dem Extrakt so auszuführen, daß der Extrakt einen pH-Wert von 4,8 besitzt; dies scheint der beste Wert zu sein, bei dem unerwünschte unlösliche Stoffe ausfallen.
Die Nebenschilddrüsen werden vorzugsweise in zerkleinerter Form angewandt, wie man sie z. B. durch Zerschneiden der gefrorenen Drüsen erhält.
Die säureenthaltende Flüssigkeit kann aus Wasser bestehen, einem Alkohol, wie z. B. Äthylalkohol, oder einem Keton, wie z. B. Aceton, und einer Säure, wie etwa Schwefelsäure. Es hat sich gezeigt, daß eine Extraktion mit einem Gemisch von 90 Volumprozent 3O°/0igen Alkohols und 10 Volumprozent Schwefelsäure eine hochaktive Flüssigkeit liefert.
Die säurehaltige Flüssigkeit kann auch aus einer verdünnten wäßrigen- Säure bestehen, wie verdünnter Schwefelsäure oder verdünnter Salzsäure. Der säurehaltige flüssige Extrakt kann unter Anwendung von Wärme dargestellt werden; Fett, das sich beim Abkühlen aus dem Extrakt ausscheidet, wird vor der Neutralisation entfernt.
Die Extraktion in der Wärme darf nicht so heftig durchgeführt werden, daß alle Proteine zu Aminosäuren hydrolysiert werden. Sie soll so geleitet werden, daß nur eine sehr kleine Menge von Aminosäuren im Endprodukt vorhanden ist.
♦5 Gegebenenfalls kann das ausgeschiedene Fett wieder mit der säurehaltigen Flüssigkeit extrahiert und abgekühlt und der Extrakt zu der Hauptmenge des Extrakts zugefügt werden. Oder das Fett kann mit einem Lösungsmittel aufgelöst und diese Lösung mit einer säurehaltigen Flüssigkeit extrahiert werden; die Fettlösung wird abgetrennt und die säurehaltige Flüssigkeit zu der Hauptmenge des Extrakts wie oben zugefügt. Die Drüsen können auch mit einem Fettlösungsmittel, wie Aceton, Benzol oder Toluol, vor der Extraktion mit der säurehaltigen Flüssigkeit extrahiert werden. Gegebenenfalls kann die Extraktion mit der säurehaltigen Flüssigkeit mit einer Behandlung mit einem Fettlösungsmittel kombiniert werden; zu diesem Zweck werden die Drüsen mit einem Gemisch der säurehaltigen Flüssigkeit und dem Fetüösunjgsmittel, wie Aceton, Benzol oder Toluol, geschüttelt, das dann von der säurehaltigen Flüssigkeit abgetrennt wird.
Die unlöslichen Stoffe, die sich beim ersten Stehen ausscheiden, können in verdünnter Alkalilösung von einem ρπ-Wert von 8,0 bis 9,0 wieder aufgelöst werden; der pH-Wert wird dann mit verdünnter Säure auf 4,6 bis 5,0 gebracht, und nach einigem Stehen können die unlöslichen Stoffe wieder abgetrennt und die Flüssigkeit zu ' der zu konzentrierenden Hauptmenge hinzugefügt werden.
Der nach der Extraktion mit der säurehaltigen Flüssigkeit verbleibende Rückstand der Nebenschilddrüsen kann mit verdünntem Alkali behandelt werden; die hieraus erhaltene alkalische Lösung kann entweder zu einem pH-Wert von 4,6 bis 5,0 neutralisiert oder zur Neutralisierung der in einem vorher erhaltenen Extrakt befindlichen Säure verwendet werden. Wenn der pH-Wert auf 4,6 bis 5,0 eingestellt ist, werden die sich ausscheidenden unlöslichen Stoffe beispielsweise durch Filtration entfernt und die Flüssigkeit der zu konzentrierenden Hauptmenge zugefügt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Ausführung des Darstellungsverfahrens der Erfindung.
i. 450 g gefrorene Nebenschilddrüsen werden zerkleinert. 300 ecm Schwefelsäure werden mit 1800 ecm Wasser vermischt und abgekühlt. 900 ecm technischer Alkohol werden hinzugefügt und das Gemisch zu den Drüsen zugegeben. 700 ecm Benzol werden sodann zugegeben und das Ganze 48 Stunden lang geschüttelt. Das Drüsenmaterial wird abgeseiht und das Benzol abgetrennt. Die saure, alkoholische Flüssigkeit wird unter Kühlung durch schrittweisen Zusatz von starker Natronlaugelösung neutralisiert, bis der pn-Wert 4,8 beträgt. Sodann wird technischer Alkohol zugefügt, bis die Alkoholkonzentration 75 °/o beträgt, um das Natriumsulfat auszufällen.
Nachdem die Flüssigkeit in der Kälte gestanden hat, wird das Natriumsulfat und die anderen unlöslichen Stoffe, die ausgefallen sind, abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bis zu einem Volumen konzentriert, bei dem 1 ecm 2 g Nebenschilddrüse äquivalent sind. Die Flüssigkeit wird dann abgekühlt und der pn-Wert, falls nötig, auf 4,8 eingestellt. Nach Zusatz von 0,3 °/0 Kresol als Konservierungsmittel läßt man die Flüssigkeit stehen, bis keine unlöslichen Stoffe mehr ausfallen. Schließlich wird die Flüssigkeit durch ein bakterienfestes Filter filtriert und ist dann fertig zur Injektion.
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2. ioo g fein zerkleinerte Nebenschilddrüsen werden 48 Stunden lang unter dauerndem Schütteln mit 1 1 einer Flüssigkeit· mazediert, die 85 Volumprozent Alkohol und 5 Volumprozent konzentrierte Schwefelsäure enthält. Am Ende dieser Periode neutralisiert man die Flüssigkeit mit mindestens 40°/„iger Natronlauge, bis die Flüssigkeit schwach sauer gegen Lackmus ist. Man kühlt dann ab und läßt über Nacht an einem kühlen Ort stehen. Sodann wird filtriert, der Alkohol abdestilliert und auf etwa 50 ecm konzentriert. Dann wird abgekühlt, der pn-Wert auf etwa 4,8 eingestellt, 0,3 °/0 Kresol zugefügt
iS und über Nacht an einem kühlen Ort stehengelassen. Schließlich wird filtriert. Das FiI-. trat enthält dann das gewünschte Hormon.
3. 100 g fein zerkleinerte Nebenschilddrüsen werden auf einem siedenden Wasserbade mit 100 ecm verdünnter Schwefelsäure, die 5 °/o konzentrierte Schwefelsäure enthält, 45 Minuten Jang erhitzt. Dann wird abgekühlt, das Fett abgeschieden und die Reaktion der Lösung durch Zusatz von Natronlaugelösung auf ein pH = 9 eingestellt. Es wird durch ein Tuch gesiebt, der Rückstand gepreßt und die trübe Flüssigkeit zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und die Reaktion der Lösung durch Zusatz verdünnter Schwefelsäure auf ein pn = 4,8 eingestellt. Man läßt einige Stunden lang in der Kälte stehen und zentrifugiert (Lösung A). Der Niederschlag wird in 15 ecm verdünntem Alkali bei einem pH = 9 wieder aufgelöst, die Reaktion der Lösung wieder auf ein ph = 4,8 eingestellt, einige Stunden in der Kälte stehengelassen, zentrifugiert und die Lösung zu der Lösung A hinzugefügt. Dann wird so viel technischer Alkohol zugefügt, daß Natriumsulfat ausfällt; darauf läßt man die Mischung über Nacht stehen. Das Natriumsulfat und andere unlösliche Stoffe werden abfiltriert; dann wird unter vermindertem Druck auf 50 ecm konzentriert. Der ρπ-Wert wird nötigenfalls auf 4,8 eingestellt. Dann werden 0,3 °/0 Kresol zugesetzt und an einem kühlen Ort über Nacht stehengelassen. Schließlich wird nitriert. Das Filtrat enthält das gewünschte Hormon.
4. 100 g fein zerkleinerte Nebenschilddrüsen werden mit etwa 1 1 Aceton 48 Stunden lang mazeriert. Es wird filtriert und wieder mit 5°° ccm Aceton 24 Stunden lang mazeriert; der Rückstand wird in einem Luftstrom, schließlich in einem Vakuumexsiccator über Calciumchlorid getrocknet. Er wird zu einem mäßig feinen Pulver zerrieben und dieses auf einem siedenden Wasserbade 45 Minuten lang mit 100 ecm verdünnter Schwefelsäure erhitzt, die 5 °/0 der konzentrierten Säure enthält. Es wird abgeseiht; die Reaktion der Lösung durch Zusatz von Natriumhydroxydlösufig" auf ein pn = 8 gebracht und filtriert (Lösung B).
Der Rückstand wird mit ioo ecm verdünntem Alkali bei einem pn von etwa 9 eine halbe Stunde lang mazeriert und abgeseiht (Lösung C). Die Lösungen B und C werden vereinigt, die Reaktion des Gemisches wird durch Zusatz von verdünnter Schwefelsäure auf ein pH = 4,8 eingestellt und, nachdem man einige Stunden hat stehenlassen, wird zentrifugiert. Die Lösung wird abgetrennt und der Rückstand in 15 ecm verdünntem Alkali bei einem pH = 9 wieder aufgelöst; die Reaktion der Lösung wird wieder auf ein Ph — 4,8 eingestellt. Man läßt einige Stunden stehen, zentrifugiert und vereinigt die Lösung mit der ersten Lösung. Dann wird genügend technischer Alkohol zugesetzt, um das Natriumsulfat auszufällen; das Gemisch läßt man über Nacht stehen. Das Natriumsulfat und die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert, die Flüssigkeit unter vermindertem Drude auf 50 ecm konzentriert. Der pH-Wert wird nötigenfalls auf 4,8 gebracht, man fügt 0,3 °/0 Kresol hinzu und läßt über Nacht an einem kühlen Ort stehen. · Schließlich wird filtriert. Das Filtrat enthält das gewünschte Hormon. .

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Darstellung von ein Hormon oder ein Gemisch von Hormonen enthaltenden Flüssigkeiten aus Neben-Schilddrüsen» nach welchem ein säurehaltiger Extrakt der Nebenschilddrüsen bis auf ein pn von etwa 4,6 bis 5,0 neutralisiert wird, die unlöslichen ausgefallenen Stoffe abfiltriert werden und das Filtrat einer weiteren Behandlung unterworfen wird, um das in ihm enthaltene Hormon oder das Gemisch der Hormone zu konzentrieren und zu reinigen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Drüsen einer Extraktion mit einer säurehaltigen Flüssigkeit unterworfen werden, der flüssige Extrakt von den unlöslichen Stoffen abgetrennt wird, die Säure in dem flüssigen Extrakt, zweckmäßig auf ein pn von 4,6 bis 5,0, neutralisiert wird, das Gemisch in der Kälte stehenbleibt, bis keine weiteren unlöslichen Stoffe mehr ausfallen, die während des Stehens ausgefallenen unlösliehen Stoffe abfiltriert werden, das Filtrat konzentriert wird, der ρπ-Wert auf etwa 4,6 bis 5,0, vorzugsweise 4,8, eingestellt wird, das Gemisch stehenbleibt, bis sich keine weiteren unlöslichen Stoffe mehr abscheiden und schließlich die Flüssigkeit abgetrennt wird.
3· Verfahren nach Ansprüchen ι und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Drüsen vor der Behandlung mit der säurehaltigen Flüssigkeit mit einem Fettlösungsmittel extrahiert werden und gegebenenfalls die Fettlösung· mit der säurehaltigen Flüssigkeit extrahiert und dieser Extrakt bei dem Herstellungsverfahren verwertet wird.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit der säurehaltigen Flüssigkeit mit einer Behandlung mit einem Fettlösungsmittel kombiniert wird und zu diesem Zwecke die Drüsen mit einem Gemisch der säurehaltigen Flüssigkeit und dem Fettlösungsmittel geschüttelt werden, worauf das unlösliche Material abgeseiht und das Fettlösungsmittel von der säurehaltigen Flüssigkeit abgetrennt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der
Flüssigkeit mit -verdünnter Alkalilauge auf einen pn-Wert 8 bis 9 eingestellt wird, die unlöslichen Stoffe abgetrennt werden, die Reaktion der Flüssigkeit mit verdünnter Säure auf einen pH-Wert von 4,6 bis S,o, vorzugsweise 4,8, eingestellt wird und das Gemisch in der Kälte stehenbleibt, bis keine weiteren unlöslichen Stoffe ausfallen, worauf die Flüssigkeit abgetrennt wird.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der- Rückstand der Nebenschilddrüsen nach der Extraktion mit der säurehaltigen Flüssigkeit mit verdünntem Alkali behandelt, dann abfiltriert wird, das alkalische FiI-trat dann mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,6 bis 5,0 gebracht und stehengelassen wird, worauf die unlöslichen Stoffe abgetrennt und die Flüssigkeit zu der zu konzentrierenden Hauptmenge zugefügt wird.
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