DE737689C

DE737689C - Verfahren zur Gewinnung von Abwehrfermenten aus Harn

Info

Publication number: DE737689C
Application number: DEC55559D
Authority: DE
Original assignee: Chemische Fabrik Promonta GmbH
Current assignee: Chemische Fabrik Promonta GmbH
Priority date: 1939-12-23
Filing date: 1939-12-23
Publication date: 1943-07-21

Description

Verfahren zur Gewinnung von Abwehrfermenten aus Harn Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung -von Abwehrfermenten aus Harn, insbesondere Schwangerenharn, Harn von Basedowkranken, Carzinomkranken, Tuberkulosekranken u. dgl.
Es ist bekannt, aus Harn oder Organextrakten durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol oder Aceton, und durch Aufnahme der Fällung in physiologischer Kochsalzlösung Abwehrfermente zu gewinnen bzw. zu reinigen. Für die Gewinnung von Abwehrfermenten in Form von therapeutisch wirksamen Präparaten ist aber die übliche Aceton- oder Alkoholfällung nicht geeignet, da bei ihrer Anwendung neben den Abwebrfermenten eine Menge von hochmolekularen, fermentativ unwirksamen Stoffen, insbesondere Ballasteiweißstoffen, mit niedergeschlagen wird. Diese Stoffe, die bei der Entgiftung des Organismus von der Niere ausgeschieden werden, begleiten die Abwehrfermente im Harn. Im Hinblick auf die Gefahr eines anaphylaktischen Schocks können daher die Abwehrfermente nicht durch die übliche Alkohol- oder Acetonfällung hinreichend gereinigt werden. Selbst wenn man den ungereinigten Alkoholniederschlag einer Vordialyse unterwerfen würde, wäre noch keine genügende Abtrennung der Ballasteiweißstoffe zu erzielen.
Erfindungsgemäß werden die Abwehrfermente, die man aus dem vorher zweckmäßig mit n-Natronlauge oder n-Salzsäure neutral lisierten Harn mit geeigneten organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Aceton oder Äthylalkohol, ausgefällt hat, in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und aus dieser Lösung durch Sättigung mit Kochsalz die Albumine und Verunreinigungen niedergeschlagen. Die die Fermente enthaltenden Lösungen werden dann nach üblichen Methoden, z. B. Dialyse, vom Kochsalz befreit, worauf aus der salzfreien Lösung die Fermente mit geeigneten Lösungsmitteln, wie z. B. Aceton oder Äthylalkohol, niedergeschlagen werden. Bei der Ausfällung der Albumine und Verunreinigungen aus der mit Kochsalz gesättigten Lösung bleiben die Abwehrfermente in Lösung. Hierin unterscheidet sich dieser Reinigungsschritt von einer bekannten Arbeitsweise, bei der eine die Abrehrfermente enthaltende Lösung mit Ammonsulfat gesättigt wird. Durch die Sättigung mit Ammonsulfat werden nämlich die Abwehrfermente zusammen mit den Verunreinigungen ausgefällt.
Vor dem durch Sättigung mit Kochsal bewirkten Reinigungsschritt können die mit Aceton oder Äthylalkohol ausgefällten Fermente gegebenenfalls auch noch einer weiteren Reinigung nach bekannten Methoden, wie z. B. einer Adsorption an geeignete Adsorbentien oder der bereits erwähnten Ammoniumsulfatsättigung. unterworfen werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden aus den Abwehrfermenten die Ballasteiweißstoffe sowie die toxischen Stoffwechselprodukte weitgehend beseitigt. Die in der Endstufe des Verfahrens mit Aceton oder Äthylalkohol ausgefällten Niederschläge enthalten die wirksamen Fermente in sehr konzentrierter Form. Diese Niederschläge köllnen mit Wasser gewaschen werden.
Die Menge der bei den erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Enzyme ist sehr verschieden und hängt in erster Linie von dem Fermentgehalt der zur Anwendung gelangenden Harne ab. Im allgemeinen erhält man etwa 350 bis 7oomg aus tool Harn. Um in jedem Fall optimale Ausbeuten zu erzielen, ist es zweckmäßig, die die Fermente enthaltende Kochsalzlösung sowie den durch Übersättigung der Kochsalzlösung erhaltenen, aus den Albuminen und Verunreinigungen bestehenden Niederschlag vor ihrer Trennung längere Zeit im Thermostaten erhöhten Temperaturen von beispielsweise 37? C auszusetzen.
Die durch Ausfällung mit organischen Lösungsmitteln erhaltenen hochkonzentrierten Enzympräparate können beispielsweise dadurch in Lösung gebracht werden, daß man sie in einer Kochsalzlösung aufnimmt und aus der Lösung dann das Kochsalz nach üblichen Verfahren, z. B. durch Dialyse, wieder entfernt.
Im folgenden soll das erfindungsgemäße Verfahren an Hand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert werden, ohne daß eine Beschränkung der Erfindung auf die in dem Ausführungsbeispiel verwendeten Ausgangsmaterialien, Stofimengen u. dgl. beabsichtigt ist.
Beispiel 1001 des aufzuarbeitenden Harnes werden mit Natronlauge bzw. Salzsäure gegen Lackmus neutralisiert und mit Iool Aceton oder Äthylalkohol versetzt und gut durchgerührt.
Innerhalb 1/2 Stunde scheidet sich ein Niederschlag ab. Diesen läßt man etwa 2 Stunden stehen. Nach dieser Zeit wird die überstehende Lösung filtriert. Der Filterrückstand enthält die Fermente. Man erhält aus rool Harn etwa 70g feuchten Niederschlag (getrocknet etwa 32g). Dieser Niederschlag wird bei Zimmertemperatur in 5 @ destilliertem Wasser unter Zugabe von Kochsalz durch Umrühren gelöst. Die Lösung ist in den meisten Fällen bräunlich trübe. Nach vollständiger Lösung der Fermente wird so lange Kochsalz zugegeben. bis Sättigung der Lösung eingetreten ist und sich kein Kochsalz mehr löst. In wenigen Minuten schon tritt eine starke Ausfällung der Albumine ein. Man ljißi. den Niederschlag nebst der überstehendei Lösung bei etwa 37°C 4 Stunden lang im Thermostaten stehen. Nach dieser Zeit hat sich die Ausflockung vollständig vollzogen Nunmehr wird der Niederschlag abfiltriert.
Der Filterrückstand ist inaktiv und enthält keine Abwehrfermente. Das klare Filtrat enthält die wirksamen Enzyme. Es wird nun diese Fermentlösung zur Befreiung von Kochsalz 24 Stunden gegen fließendes Lcitungswasser bei Zimmertemperatur dialysiert. Der Inhalt des Dialysierschlauches kann nach dieser Reinigung bereits zu bakteriologischen oder tierexperimentellen Arbeitell verwendet werden. Zur Isolierung der Fermentpräparate wird diese Lösung nochmals mit Aceton zu gleichen Teilen versetzt. Es wird dabei eill sehr feinflockiger Niederschlag ausgesclliedell. der zum Absetzen einige Stunden benötigt Nach 12 bis 24 Stunden hat sich der feinflockige Niederschlag sedimentiert. Die überstehende Lösung ist wasserklar. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und ist in Wasser bei Abwesenheit von Neutralsalzen nicht lfislich. Er kann deshalb sviederholt zur Reinigung voll Aceton mit destilliertem Wasser ausgewaschen werden. Um hochkonzentrierte Fermentlösungen zu erhalten, kann der Niederschlag in 25 ccm physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen werden. Statt der Kochsalzlösung kann man auch Pufferlösungen, die zweckmäßig ein pH von 6,S besitzen, verwenden.

Claims

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Enzyme können zu Heilzwecken Anwendung finden. So kann beispielsweise durch parenterale Zufuhr dieser Fermente eine konstitutionelle Schwäche in der Abwehrfermentbildung therapeutisch behandelt werden, z. B. bei innersekretoriscllen Stören gen und bei manchen Infektionskrankheiten P A T E N T A N S P R Ü C H E : 1. Verfahren zur Gewinnung von Abwehrfermenten aus Harn, wobei aus dem gegen Lackmus neutralisierten Harn die Fermente mit geeigneten organischen Lö sungsmitteln, wie z. B. Aceton oder Äthylalkohol, niedergeschlagen werden, dadurch gekennzeichnet, daß man die niedergeschlagenen Fermente, gegebenenfalls nach einer weiteren Reinigung nach bekannten Methoden, z. B. durch Ammoniumsulfatsättigung, in physiologischer Kochsalzlösung aufnimmt, durch Sättigung dieser Lösung mit Kochsalz die Albumine und Verunreinigungen abscheidet und aus der die Fermente enthaltenden Kochsalzlösung nach üblichen Methoden, z.B. durch Dialyse, das Kochsalz entfernt, worauf aus der salzfreien Lösung die Fermente mit geeigneten Lösungsmitteln, wie z. B. Aceton oder Äthylalkohol, niedergeschlagen werden.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die die Fermente enthaltende Kochsalzlösung sowie der durch die Ixochsalzlösung ausgefällte die Verunreinigungen enthaltende Niederschlag vor ihrer Trennung längere Zeit im Thennostaten erhöhten Temperaturen von etwa 37 ausgesetzt werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Abwehrfermente aus den in der letzten Stufe des Verfahrens mit organischen Lösungsmitteln erhaltenen Niederschlägen dadurch in Lösung gebracht werden, daß man sie mit physiologischer Kochsalz lösung aufnimmt und aus der Lösung nachträglich das Kochsalz nach üblichen Verfahren, z. B. durch Dialyse, wieder entfernt.