DE2333884A1

DE2333884A1 - Verfahren zur herstellung von gereinigtem albumin und das dabei erhaltene gereinigte albumin

Info

Publication number: DE2333884A1
Application number: DE19732333884
Authority: DE
Inventors: Paule Gattel; Jacques Liautaud; Maire-France Makula; Robert Plan
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1972-07-05
Filing date: 1973-07-03
Publication date: 1974-01-31
Also published as: JPS555493B2; NL179911B; FR2190436B1; BE801887A; NL7309362A; GB1441752A; DE2333884C3; FR2190436A1; NL179911C; JPS4985218A; CA1004980A; DE2333884B2; LU67930A1

Description

Pale η tun« Kite

Dr. E. ßoettner
Dipl.-Ing. H.-J. Müller

Dr. Th. Berendt

D 8 München 80

Lucile-Grahn-Slr.,3», Tel. 47 St 55

Institut Merieux, 17, rue Bourgelat, Lyon 2° (Frankreich)

Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin und das dabei erhaltene gereinigte Albumin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin, insbesondere Humanalbumin, und ebenso das nach diesem Verfahren gewonnene gereinigte Albumin. .

Es ist bereits eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung von Human- oder Tieralbumin bekannt, die von Plasmalösungen unterschiedlicher Herkunft ausgehen. Keines dieser Verfahren hat es jedoch ermöglicht, ins Gewicht fallende Mengen von gereinigtem, nicht-denaturiertem Albumin, beispielsweise Humanalbumin, in wirtschaftlich tragbarer Weise herzustellen, vor allem in den Fällen, in denen das verwendete Ausgangsaaterial, wie gefrorene Plazenta, PIazentarblut oder jede Art von hämolysiertem Blut, von Anfang an zahlreiche Verunreinigungen enthält, die bis zum heutigen Tag nicht in technisch befriedigender Weise entfernt werden konnten.

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Die vorliegende Erfindung offenbart nun ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin, insbesondere Humanalbumin, das in technisch einfacher und wirtschaftlicher Weise durchgeführt werden kann und es ermöglicht, große Mengen hoch gereinigten Albumins aus leicht zugänglichen Quellen, wie gefrorener Plazenta oder hämolysiertem Blut, herzustellen.

Das so erhaltene gereinigte Albumin kann, sofern es von Menschen stammt, zur Herstellung von als Transfusionsflüssigkeiten verwendbaren Proteinlösungen dienen, beispielsweise für die Behandlung von Schockzuständen oder für die Fälle, in denen eine lebensbedrohende Verminderung des im Kreislauf zirkulierenden Blutes erfolgt ist. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene gereinigte Albumin wird von dem Smpfängerorganismus ganz besonders gut vertragen und löst keine Reaktionen aus, wie sie bei den bislang verwendeten Albuminpräparaten, die aus den erwähnten Ausgangsmaterialien hergestellt worden sind, auftreten.

Die vorliegende Erfindung betrifft demnaoh ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin, insbesondere Humanalbumin, aus Plazentas, Plazentarblut oder irgendeinem hämolysierten Blut, und es ist gekennzeichnet durch die Kombination von Stufen, die darin bestehen, das Hämoglobin zu eliminieren, ferner die Enzyme, wie die alkalischen Phosphatasen, durch Fällung der Proteine mittels einer Säure, wie Trichloressigsäure oder einer Polyphosphorsäure, zu entfernen und auch die Blutgruppensubstanzen zu eliminieren.

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Die Eliminierung des Hämoglobins kann vorzugsweise in Gegenwart einer Äthanol-Konzentration von unter 6o % durch Zusatz eines Halogenkohlenwasserstoffes, wie Chloroform, erfolgen. Sie kann indessen auch durch Zugabe eines Halogenkohlenwasserstoffes ohne Alkohol oder nach irgendeinem anderen an sich bekannten Verfahren erfolgen.

Die Entfernung bzw. Eliminierung der Enzyme, wie der Phosphatasen, die vorzugsweise nach der Stufe der Hämoglobin-Eliminierung durchgeführt wird, wird mit besonderem Vorteil in Gegenwart einer Äthanol-Konzentration von unter 60 % mittels Zusatz von Trichloressigsäure vorgenommen. Die Konzentration der Säure soll zwischen 3 und 10 χ 10" Mol/Liter liegen, wobei die Säure zur Proteinlösung bei einer Temperatur von unter 0°C, vorzugsweise bei -5° bis -10° C, bis zur vollständigen Ausfällung der Proteine zugegeben wird.

Abgesehen von der Eliminierung der Enzyme ermöglihht diese Stufe zugleich, die Albuminmenge in Lösung beträchtlich zu konzentrieren infolge der Tatsache, daß das Albumin ausfällt.

In gewissen Fällen ist es auch möglich, die Fällung mit Trichloressigsäure durch eine Fällung mit einer Polyphosphorsäure zu ersetzen.

Die Stufe der Eliminierung der Blutgruppensubstanzen wird vorzugsweise mit einer Äthanolkonzentration von über 55 %? beispielsweise in der Größenordnung von 75 %* bei einer Protein-Konzentration von weniger als 10 g pro Liter oder bis zu 10 g pro Liter unter Zusatz von Trichloressigsäure

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zur Lösung bei einer Temperatur von unter 0° C, z.B. bei -5° bis -10° C, vorgenommen. Die Menge der Triehloressigsäure soll vorzugsweise 5 bis 8 χ 10" Mol/Liter betragen. Die erhaltene Ausfällung wird verworfen. In diesem Stadium sind die Gruppensubstanzen eliminiert.

Diese Stufe ermöglicht gleichzeitig die Eliminierung der alkalischen Phosphatäsen in einer solchen Weise, daß evtl. die vorangehende Stufe der Eliminierung der Phosphatasen fortgelassen werden kann. Sie wird dann vorzugsweise durch eine einfache Konzentrierung der Proteine ersetzt.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform kann im übrigen beim erfindungsgemäßen Verfahren nach den oben beschriebenen Stufen eine weitere Stufe angeschlossen werden, die darin besteht, die letzten, evtl. noch vorhandenen Spuren von heterogenen Proteinen und ebenso die denaturierte Albuminfraktion zu eliminieren, und zwar durch eine Thermokoagulation in Gegenwart einer Fettsäure mit kurzer Kette, wie Caprylsäure.

Vorzugsweise führt man die Thermokoagulation, nachdem man erforderlichenfalls den Proteingehalt auf einen Wert von höchstens 50 g/Liter und das p™ auf einen Wert zwischen 4,5 und 5,5 eingestellt hat, bei einer Temperatur von 52° bis 64 C, am besten zwischen 56° C und 6o° C, durch. Man verwendet Natriumeaprylat in einer Konzentration von vorzugsweise 2 bis 12 g/Liter je nach der Protein-Konzentration. Die Dauer der Thermokoagulation beträgt vorzugsweise mehr als 1/2 Stunde.

Nach einer verbesserten Ausführungsform der Erfindung ist es auch möglich, eine Klärung vorzusehen, und zwar vorzugsweise vor der Entfernung der Gruppensubstanzen.

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Diese Klärung erfolgt durch Zugabe eines Silieiumdioxydgels, wie "Aerosil", und anschließendes Zentrifugieren, wobei die gesammelte Fällung verworfen wird. Die Aerosil-Konzentration kann größenordnungsmäßig vorteilhafterweise 0,2 % betragen.

Zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehört auch das so hergestellte Albumin, welches durch Eigenschaften gekennzeichnet ist, die praktisch identisch sind mit den Eigenschaften des organischen natürlichen Albumins, und dieses Albumin kann für die Behandlung von Krankheitszuständen bei Benschlichen Patienten, z.B. in Form von Plasma, verwendet werden.

Die praktische Durchführung der Erfindung soll nun anhand eines Beispiels veranschaulicht werden, das lediglich der Erläuterung dient, aber die Erfindung in keiner Beziehung einschränken 3oll.

Beispiel

Aus einem Ausgangsmaterial von etwa 7 Tonnen Plazenta bereitet man sich zunächst in an sich bekannter Weise die nach Fällung der Globuline mit Äthanol verbleibende überstehende Flüssigkeit.

(1) Die Eliminierung des Hämoglobins Man gibt zum alkoholischen überstand, dessen Äthanolgehalt 25 % und dessen Protein-Gehalt ungefähr 58 g pro kg Plazenta beträgt, Chloroform in solcher Menge, daß das Gesamtvolumen etwa 17 000 Liter beträgt und das Ganze einen Chloroformgehalt von 0,6 % aufweist. Das p« wird auf einen Wert zwischen 6,0 und 6,1 eingestellt.

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Aus der überstehenden Flüssigkeit, die unter diesen Bedingungen auf einer Temperatur von etwa 24 C gehalten wird, scheidet sich ein Niederschlag aus, der abgetrennt und verworfen wird.

Durch diesen Umstand wird das Volumen des Überstandes auf ungefähr 16 000 Liter verringert. Zu diesem Zeitpunkt liegt die Protein-Ausbeute größenordnungsmäßig bei 8 g/kg, und der größte Teil des Hämoglobins ist eliminiert worden.

(2) Eliminierung der Enzyme

Zu den l6000 Litern der überstehenden Flüssigkeit, die - wie oben angegeben - erhalten wurden und die ungefähr 25 % Äthanol enthalten, gibt man nach Senken der Temperatur auf -8° C Trichloressigsäure zu, bis eine Konzentra-

tion von 4,2 χ 10 Mol/Liter eingestellt ist.

Die Menge der Proteine liegt in der Größenordnung von 4 g/Liter.

Man erhält auf diese Weise eine Fällung in einer Menge von ungefähr 1 000 kg, während der Überstand in einer Volumenmenge von etwa 15 000 Liter verworfen wird. Zu diesem Zweck bedient man sich vorzugsweise hermetisch verschlossener Zentrifugen mit kontinuierlichem Ausstoß der ausgefällten Masse.

Auf diese Weise sind die alkalischen Phosphatasen und andere Enzyme, wie die Transaminasen, eliminiert oder denaturiert worden.

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Die ausgefällte Nasse wird sofort wieder in verdünnter Sodalösung in Lösung gebracht bis zum neutralen p„, und das Volumen wird mit Wasser auf 1^00 Liter aufgefüllt.

(3) Klärung

Die wieder gelöste Fällung wird mit Siliciuradioxydpulver ("Aerosil") versetzt, bis ein Aerosil-Gehalt von ungefähr 0,2 % eingestellt ist. Es bildet sich so ein Niederschlag von annähernd 50 kg, der abzentrifugiert wird. Die überstehende, geklärte Lösung entspricht dann einer Protein-Ausbeute von ungefähr 6,5 g/kg.

Eliminierung der Qruppensubstanzen Es ist darauf hinzuweisen, daß die Gruppensubstanzen in der Hauptsache aus Polysacchariden der Wände der roten Blutkörperchen bestehen, die während der Hämolyse in Lösung gegangen sind und eliminiert werden müssen.

Die geklärte Lösung wird zu diesem Zweck in einem Gemisch aus Äthanol und Triehloressigsaure derart verdünnt, daß der Alkohol-Anteil etwa 75 % und der Triohloressigsäure-Anteil ungefähr 8 χ 10~² Mol/Liter beträgt. Der Protein-Gehalt liegt in der Größenordnung von 10 g/Liter. Die Temperatur wird auf ungefähr -7°C gehalten, und es bildet sich ein Niederschlag in einer Menge von ungefähr 10 kg, der verworfen wird, und auf diese Weise sind die Gruppensubstanzen eliminiert worden. Diese Stufe vervollständigt gleichzeitig die Eliminierung evtl. noch vorhandener restlicher Enzyme.

Der Überstand, der ungefähr 8 g Proteine pro Liter enthält, wird filtriert. Das p™ wird auf einen Wert ,zwischen

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6,5 und 7 eingestellt und die Temperatur ständig auf einem Wert zwischen -5° und -10⁰G gehalten. Zu diesem Zeitpunkt bildet sich eine Albumin-Fällung, die abzentrifugiert wird.

Man erhält ungefähr l40 kg der Fällung, und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen.

(5) Reinigung des Albumins

Die Fällung wird erneut in Wasser gelöst, bis eine Volumenmenge von ungefähr 280 Liter gebildet ist; die Protein-Ausbeute beträgt zu diesem Zeitpunkt 5 s/kg·

Nach einer Dialyse gegen destilliertes Wasser zwecks Eliminierung des Alkohols stellt man den Protein-Anteil auf 20 g/Liter ein, versetzt die Lösung mit einer Natriumcaprylatlösung bis^iner Konzentration von 2,41 χ 10 Mol/Liter (4 g/Liter), und man stellt z.B. mit einem Acetatpuffer das p_H auf einen Wert zwischen 5*0 und 5,05.

Diese Lösung wird ungefähr 1 Stunde auf 60°C gehalten.

Die verbliebenen Proteine - außer dem Albumin - sind so koaguliert worden, und sie werden verworfen als Fällung mit den letzten Hämoglobin-Spuren und ebenso der denaturierten Albuminfraktion. Es bleibt allein das praktisch reine Albumin in Lösung.

Die überstehende Flüssigkeit, auf ungefähr 1 750 Liter aufgefüllt, wird dann filtriert. Die verdünnte Albumin-Lösung wird danach konzentriert durch Versetzen mit Alkohol bis zu 40 %, das p_H auf 4,8 bis 4,9 und die Temperatur auf etwa -8°C eingestellt. Es bildet sich dann ein

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Niederschlag, der zunächst gesammelt und dann wieder in Lösung gebracht wird, und diese neue Lösung wird danach dialysiert und dann mit Aluminiumoxyd-Gel behandelt. Es erfolgt dann ein Konzentrieren im Vakuum, danach eine sterilisierende Filtration, die letztlich ungefähr 95 Liter einer konzentrierten Lösung von praktisch reinem Albumin von 200 g Albumin/Liter liefert. In dieser Endstufe beträgt die Protein-Ausbeute größenordnungsmäßig 2,7 g/kg. Die Farbe der Lösung gleicht derjenigen der meisten hochwertigen Lösungen, die aus Plasma gewonnen wurden.

Die anhand dieses Beispiels beschriebene Erfindung kann selbstverständlich in verschiedener Hinsicht mehrfach variiert werden. So können z.B. gewisse Vorstufen fortgelassen oder noch durch ähnliche, an sich bekannte Stufen ersetzt werden. Darüber hinaus kann die Reihenfolge, in der die vorangehend beschriebenen Stufen durchgeführt werden, modifiziert werden.

Das auf diese Weise hergestellte Humanalbumin ist von den Gruppensubstanzen und den alkalischen Plazenta-Phosphatasen befreit und verursacht beim perfundierten Hund keinen hypotensiven Effekt. Durch seinen niedrigen Hämoglobin-Gehalt ist es den meisten aus Plasma stammenden Albuminen gleichwertig, ja sogar überlegen.

Dieses Albumin kann für therapeutische Zwecke bei menschlichen Patienten ohne jede Nachteile verwendet werden, und es entspricht allen Kriterien, die man zur Kontrolle des Albumins anzuwenden pflegt.

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Claims

233388A Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin, insbesondere Humanalbumin, aus gefrorener Plazenta, Plazentarblut oder jeder anderen Art von hämolysiertem Blut, gekennzeichnet durch die Kombination von Stufen, die darin bestehen, das Hämoglobin zu eliminieren, ferner die Enzyme, wie die alkalischen Phosphatasen, durch Fällen der Proteine mittels einer Säure, wie Trichloressigsäure oder einer Polyphosphorsäuren zu eliminieren, und die Blutgruppensubstanzen zu entfernen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fällung der Proteine mittels Trichloressigsäure herbeigeführt und die überstehende Flüssigkeit verworfen wird,

3- Verfahren gemäß Ar sprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fällung der Proteine mittels einer Polyphosphorsäure herbeigeführt und die überstehende Flüssigkeit verworfen wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fällung der Proteine durch Zusatz von Trichloressigsäure in Gegenwart einer Äthanol-Konzentration von unter 60 # herbeigeführt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Säure größenordnungsroäßig 3 bis 10 χ 10"² Mol/Liter beträgt.

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6. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur auf unter 0° C, vorzugsweise zwischen -5 und -10 C, gehalten wird.

7. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Eliminierung des Hämoglobins in Gegenwart von Äthanol bei einer Konzentration von unter 60 % durch Zusatz eines Halogenkohlenwasserstoffes, vornehmlieh Chloroform, erfolgt.

8. Verfahren gemäß Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß das Chloroform bei einer Konzentration von etwa 0,6 % und einem p„ zwischen 6 und 6,1 bei einer Temperatur von etwa + 22° C verwendet wird.

9. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zwecks Eliminierung der Gruppensubstanzen die Xthanol-Konzentration auf einen Wert Über 55 % eingestellt und Trichloressigsäure zugesetzt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, daß die Xthanol-Konzentration annähernd 75 % beträgt.

11. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Protein-Konzentration von weniger als 10 g/Liter arbeitet.

12. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppensubstanzen bei einer Temperatur von unter 0⁰C, vorzugsweise bei -5° bis -10° C, eliminiert werden.

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13. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der TrI-Chloressigsäure ungefähr 5 bis 8 χ 10 Mol/Liter beträgt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1 und irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Eliminierung der Enzyme und die Eliminierung der Gruppensubstanzen gleichzeitig durchgeführt werden.

15· Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ferner eine Thermokoagulation in Gegenwart eines Caprylats, vornehmlich Natriumeaprylat, durchgeführt wird.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Thermokoagulation durchgeführt wird, nachdem die Protein-Konzentration auf einen Wert von höchstens 50 g/Liter eingestellt worden ist, wobei das ρ», 4,5 bis 5,5 beträgt und die Temperatur der Thermokoagulation zwischen 52° C und 64° C, vorzugsweise zwischen 56° C und 60° C, liegt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Natriumcaprylät-Konzentration 2 bis 12 g/Liter beträgt.

18. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Dauer der Thermokoagulation mehr als 1/2 Stunde beträgt.

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19. Verfahren gemäß Irgendeinem der Ansprüche 1 bis l8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Klärung durch Zugabe eines Siliciumdioxyd-Qels durchgeführt wird.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19« dadurch gekennzeichnet, daß man "Aerosll" bis zu einer Konzentration von ungefähr 0,2 % zugibt.

21. Gereinigtes Albuminpräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es nach irgendeinem der Verfahren, wie sie In den Ansprüchen 1 bis 20 beansprucht werden, erhalten worden ist, wobei das genannte Präparat im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, denaturiertem Albumin und Hämoglobin.

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