DE2333884A1 - Verfahren zur herstellung von gereinigtem albumin und das dabei erhaltene gereinigte albumin - Google Patents
Verfahren zur herstellung von gereinigtem albumin und das dabei erhaltene gereinigte albuminInfo
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Description
Dr. E. ßoettner
Dipl.-Ing. H.-J. Müller
Dipl.-Ing. H.-J. Müller
Dr. Th. Berendt
D 8 München 80
Institut Merieux, 17, rue Bourgelat, Lyon 2° (Frankreich)
Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin und das dabei erhaltene gereinigte Albumin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin, insbesondere Humanalbumin,
und ebenso das nach diesem Verfahren gewonnene gereinigte Albumin. .
Es ist bereits eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung von Human- oder Tieralbumin bekannt, die von Plasmalösungen
unterschiedlicher Herkunft ausgehen. Keines dieser Verfahren hat es jedoch ermöglicht, ins Gewicht fallende
Mengen von gereinigtem, nicht-denaturiertem Albumin, beispielsweise Humanalbumin, in wirtschaftlich tragbarer Weise
herzustellen, vor allem in den Fällen, in denen das verwendete Ausgangsaaterial, wie gefrorene Plazenta, PIazentarblut
oder jede Art von hämolysiertem Blut, von Anfang an zahlreiche Verunreinigungen enthält, die bis zum
heutigen Tag nicht in technisch befriedigender Weise entfernt werden konnten.
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Die vorliegende Erfindung offenbart nun ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin, insbesondere
Humanalbumin, das in technisch einfacher und wirtschaftlicher Weise durchgeführt werden kann und es ermöglicht,
große Mengen hoch gereinigten Albumins aus leicht zugänglichen Quellen, wie gefrorener Plazenta oder hämolysiertem
Blut, herzustellen.
Das so erhaltene gereinigte Albumin kann, sofern es von
Menschen stammt, zur Herstellung von als Transfusionsflüssigkeiten verwendbaren Proteinlösungen dienen, beispielsweise
für die Behandlung von Schockzuständen oder für die Fälle, in denen eine lebensbedrohende Verminderung
des im Kreislauf zirkulierenden Blutes erfolgt ist. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene gereinigte
Albumin wird von dem Smpfängerorganismus ganz besonders
gut vertragen und löst keine Reaktionen aus, wie sie bei den bislang verwendeten Albuminpräparaten, die
aus den erwähnten Ausgangsmaterialien hergestellt worden sind, auftreten.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnaoh ein Verfahren
zur Herstellung von gereinigtem Albumin, insbesondere Humanalbumin, aus Plazentas, Plazentarblut oder irgendeinem
hämolysierten Blut, und es ist gekennzeichnet durch die Kombination von Stufen, die darin bestehen, das Hämoglobin
zu eliminieren, ferner die Enzyme, wie die alkalischen Phosphatasen, durch Fällung der Proteine mittels einer
Säure, wie Trichloressigsäure oder einer Polyphosphorsäure, zu entfernen und auch die Blutgruppensubstanzen
zu eliminieren.
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Die Eliminierung des Hämoglobins kann vorzugsweise in Gegenwart einer Äthanol-Konzentration von unter 6o % durch
Zusatz eines Halogenkohlenwasserstoffes, wie Chloroform, erfolgen. Sie kann indessen auch durch Zugabe eines Halogenkohlenwasserstoffes
ohne Alkohol oder nach irgendeinem anderen an sich bekannten Verfahren erfolgen.
Die Entfernung bzw. Eliminierung der Enzyme, wie der Phosphatasen, die vorzugsweise nach der Stufe der Hämoglobin-Eliminierung
durchgeführt wird, wird mit besonderem Vorteil in Gegenwart einer Äthanol-Konzentration
von unter 60 % mittels Zusatz von Trichloressigsäure vorgenommen.
Die Konzentration der Säure soll zwischen 3 und 10 χ 10" Mol/Liter liegen, wobei die Säure zur
Proteinlösung bei einer Temperatur von unter 0°C, vorzugsweise bei -5° bis -10° C, bis zur vollständigen Ausfällung
der Proteine zugegeben wird.
Abgesehen von der Eliminierung der Enzyme ermöglihht
diese Stufe zugleich, die Albuminmenge in Lösung beträchtlich zu konzentrieren infolge der Tatsache, daß
das Albumin ausfällt.
In gewissen Fällen ist es auch möglich, die Fällung mit
Trichloressigsäure durch eine Fällung mit einer Polyphosphorsäure zu ersetzen.
Die Stufe der Eliminierung der Blutgruppensubstanzen wird vorzugsweise mit einer Äthanolkonzentration von über 55 %?
beispielsweise in der Größenordnung von 75 %* bei einer
Protein-Konzentration von weniger als 10 g pro Liter oder bis zu 10 g pro Liter unter Zusatz von Trichloressigsäure
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zur Lösung bei einer Temperatur von unter 0° C, z.B. bei -5° bis -10° C, vorgenommen. Die Menge der Triehloressigsäure
soll vorzugsweise 5 bis 8 χ 10" Mol/Liter betragen.
Die erhaltene Ausfällung wird verworfen. In diesem Stadium sind die Gruppensubstanzen eliminiert.
Diese Stufe ermöglicht gleichzeitig die Eliminierung der alkalischen Phosphatäsen in einer solchen Weise, daß evtl.
die vorangehende Stufe der Eliminierung der Phosphatasen fortgelassen werden kann. Sie wird dann vorzugsweise durch
eine einfache Konzentrierung der Proteine ersetzt.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform kann im übrigen beim erfindungsgemäßen Verfahren nach den oben
beschriebenen Stufen eine weitere Stufe angeschlossen werden, die darin besteht, die letzten, evtl. noch vorhandenen
Spuren von heterogenen Proteinen und ebenso die denaturierte Albuminfraktion zu eliminieren, und zwar durch
eine Thermokoagulation in Gegenwart einer Fettsäure mit kurzer Kette, wie Caprylsäure.
Vorzugsweise führt man die Thermokoagulation, nachdem man erforderlichenfalls den Proteingehalt auf einen Wert von höchstens
50 g/Liter und das p™ auf einen Wert zwischen 4,5 und
5,5 eingestellt hat, bei einer Temperatur von 52° bis 64 C, am besten zwischen 56° C und 6o° C, durch. Man verwendet
Natriumeaprylat in einer Konzentration von vorzugsweise
2 bis 12 g/Liter je nach der Protein-Konzentration. Die Dauer der Thermokoagulation beträgt vorzugsweise mehr
als 1/2 Stunde.
Nach einer verbesserten Ausführungsform der Erfindung ist es auch möglich, eine Klärung vorzusehen, und zwar
vorzugsweise vor der Entfernung der Gruppensubstanzen.
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Diese Klärung erfolgt durch Zugabe eines Silieiumdioxydgels,
wie "Aerosil", und anschließendes Zentrifugieren,
wobei die gesammelte Fällung verworfen wird. Die Aerosil-Konzentration
kann größenordnungsmäßig vorteilhafterweise 0,2 % betragen.
Zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehört auch
das so hergestellte Albumin, welches durch Eigenschaften gekennzeichnet ist, die praktisch identisch sind mit
den Eigenschaften des organischen natürlichen Albumins, und dieses Albumin kann für die Behandlung von Krankheitszuständen
bei Benschlichen Patienten, z.B. in Form von Plasma, verwendet werden.
Die praktische Durchführung der Erfindung soll nun anhand eines Beispiels veranschaulicht werden, das lediglich
der Erläuterung dient, aber die Erfindung in keiner Beziehung einschränken 3oll.
Aus einem Ausgangsmaterial von etwa 7 Tonnen Plazenta
bereitet man sich zunächst in an sich bekannter Weise die nach Fällung der Globuline mit Äthanol verbleibende
überstehende Flüssigkeit.
(1) Die Eliminierung des Hämoglobins Man gibt zum alkoholischen überstand, dessen Äthanolgehalt
25 % und dessen Protein-Gehalt ungefähr 58 g pro kg
Plazenta beträgt, Chloroform in solcher Menge, daß das Gesamtvolumen etwa 17 000 Liter beträgt und das Ganze einen
Chloroformgehalt von 0,6 % aufweist. Das p« wird auf einen
Wert zwischen 6,0 und 6,1 eingestellt.
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Aus der überstehenden Flüssigkeit, die unter diesen Bedingungen auf einer Temperatur von etwa 24 C gehalten
wird, scheidet sich ein Niederschlag aus, der abgetrennt und verworfen wird.
Durch diesen Umstand wird das Volumen des Überstandes
auf ungefähr 16 000 Liter verringert. Zu diesem Zeitpunkt liegt die Protein-Ausbeute größenordnungsmäßig
bei 8 g/kg, und der größte Teil des Hämoglobins ist eliminiert worden.
(2) Eliminierung der Enzyme
Zu den l6000 Litern der überstehenden Flüssigkeit, die
- wie oben angegeben - erhalten wurden und die ungefähr 25 % Äthanol enthalten, gibt man nach Senken der Temperatur
auf -8° C Trichloressigsäure zu, bis eine Konzentra-
tion von 4,2 χ 10 Mol/Liter eingestellt ist.
Die Menge der Proteine liegt in der Größenordnung von 4 g/Liter.
Man erhält auf diese Weise eine Fällung in einer Menge
von ungefähr 1 000 kg, während der Überstand in einer Volumenmenge von etwa 15 000 Liter verworfen wird. Zu
diesem Zweck bedient man sich vorzugsweise hermetisch verschlossener Zentrifugen mit kontinuierlichem Ausstoß
der ausgefällten Masse.
Auf diese Weise sind die alkalischen Phosphatasen und andere Enzyme, wie die Transaminasen, eliminiert oder
denaturiert worden.
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Die ausgefällte Nasse wird sofort wieder in verdünnter
Sodalösung in Lösung gebracht bis zum neutralen p„, und
das Volumen wird mit Wasser auf 1^00 Liter aufgefüllt.
(3) Klärung
Die wieder gelöste Fällung wird mit Siliciuradioxydpulver
("Aerosil") versetzt, bis ein Aerosil-Gehalt von ungefähr
0,2 % eingestellt ist. Es bildet sich so ein Niederschlag von annähernd 50 kg, der abzentrifugiert wird. Die überstehende,
geklärte Lösung entspricht dann einer Protein-Ausbeute von ungefähr 6,5 g/kg.
Eliminierung der Qruppensubstanzen Es ist darauf hinzuweisen, daß die Gruppensubstanzen in
der Hauptsache aus Polysacchariden der Wände der roten Blutkörperchen bestehen, die während der Hämolyse in Lösung
gegangen sind und eliminiert werden müssen.
Die geklärte Lösung wird zu diesem Zweck in einem Gemisch aus Äthanol und Triehloressigsaure derart verdünnt, daß
der Alkohol-Anteil etwa 75 % und der Triohloressigsäure-Anteil
ungefähr 8 χ 10~2 Mol/Liter beträgt. Der Protein-Gehalt liegt in der Größenordnung von 10 g/Liter. Die Temperatur
wird auf ungefähr -7°C gehalten, und es bildet sich ein Niederschlag in einer Menge von ungefähr 10 kg,
der verworfen wird, und auf diese Weise sind die Gruppensubstanzen eliminiert worden. Diese Stufe vervollständigt
gleichzeitig die Eliminierung evtl. noch vorhandener restlicher Enzyme.
Der Überstand, der ungefähr 8 g Proteine pro Liter enthält,
wird filtriert. Das p™ wird auf einen Wert ,zwischen
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6,5 und 7 eingestellt und die Temperatur ständig auf einem Wert zwischen -5° und -100G gehalten. Zu diesem
Zeitpunkt bildet sich eine Albumin-Fällung, die abzentrifugiert wird.
Man erhält ungefähr l40 kg der Fällung, und die überstehende
Flüssigkeit wird verworfen.
(5) Reinigung des Albumins
Die Fällung wird erneut in Wasser gelöst, bis eine Volumenmenge von ungefähr 280 Liter gebildet ist; die Protein-Ausbeute
beträgt zu diesem Zeitpunkt 5 s/kg·
Nach einer Dialyse gegen destilliertes Wasser zwecks Eliminierung des Alkohols stellt man den Protein-Anteil
auf 20 g/Liter ein, versetzt die Lösung mit einer Natriumcaprylatlösung
bis^iner Konzentration von 2,41 χ 10
Mol/Liter (4 g/Liter), und man stellt z.B. mit einem Acetatpuffer das pH auf einen Wert zwischen 5*0 und 5,05.
Diese Lösung wird ungefähr 1 Stunde auf 60°C gehalten.
Die verbliebenen Proteine - außer dem Albumin - sind so koaguliert worden, und sie werden verworfen als Fällung
mit den letzten Hämoglobin-Spuren und ebenso der denaturierten Albuminfraktion. Es bleibt allein das praktisch
reine Albumin in Lösung.
Die überstehende Flüssigkeit, auf ungefähr 1 750 Liter aufgefüllt, wird dann filtriert. Die verdünnte Albumin-Lösung
wird danach konzentriert durch Versetzen mit Alkohol bis zu 40 %, das pH auf 4,8 bis 4,9 und die Temperatur
auf etwa -8°C eingestellt. Es bildet sich dann ein
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Niederschlag, der zunächst gesammelt und dann wieder in Lösung gebracht wird, und diese neue Lösung wird danach
dialysiert und dann mit Aluminiumoxyd-Gel behandelt. Es erfolgt dann ein Konzentrieren im Vakuum, danach eine
sterilisierende Filtration, die letztlich ungefähr 95 Liter einer konzentrierten Lösung von praktisch reinem
Albumin von 200 g Albumin/Liter liefert. In dieser Endstufe beträgt die Protein-Ausbeute größenordnungsmäßig
2,7 g/kg. Die Farbe der Lösung gleicht derjenigen der meisten hochwertigen Lösungen, die aus Plasma
gewonnen wurden.
Die anhand dieses Beispiels beschriebene Erfindung kann selbstverständlich in verschiedener Hinsicht mehrfach
variiert werden. So können z.B. gewisse Vorstufen fortgelassen oder noch durch ähnliche, an sich bekannte Stufen
ersetzt werden. Darüber hinaus kann die Reihenfolge, in der die vorangehend beschriebenen Stufen durchgeführt
werden, modifiziert werden.
Das auf diese Weise hergestellte Humanalbumin ist von den Gruppensubstanzen und den alkalischen Plazenta-Phosphatasen
befreit und verursacht beim perfundierten Hund keinen hypotensiven Effekt. Durch seinen niedrigen
Hämoglobin-Gehalt ist es den meisten aus Plasma stammenden Albuminen gleichwertig, ja sogar überlegen.
Dieses Albumin kann für therapeutische Zwecke bei menschlichen Patienten ohne jede Nachteile verwendet werden,
und es entspricht allen Kriterien, die man zur Kontrolle des Albumins anzuwenden pflegt.
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Claims (21)
1. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Albumin,
insbesondere Humanalbumin, aus gefrorener Plazenta, Plazentarblut oder jeder anderen Art von hämolysiertem
Blut, gekennzeichnet durch die Kombination von Stufen, die darin bestehen, das Hämoglobin zu eliminieren,
ferner die Enzyme, wie die alkalischen Phosphatasen, durch Fällen der Proteine mittels einer
Säure, wie Trichloressigsäure oder einer Polyphosphorsäuren zu eliminieren, und die Blutgruppensubstanzen
zu entfernen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Fällung der Proteine mittels Trichloressigsäure herbeigeführt und die überstehende Flüssigkeit
verworfen wird,
3- Verfahren gemäß Ar sprach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Fällung der Proteine mittels einer Polyphosphorsäure herbeigeführt und die überstehende Flüssigkeit
verworfen wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Fällung der Proteine durch Zusatz von Trichloressigsäure in Gegenwart einer Äthanol-Konzentration
von unter 60 # herbeigeführt wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Konzentration der Säure größenordnungsroäßig
3 bis 10 χ 10"2 Mol/Liter beträgt.
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6. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur auf unter
0° C, vorzugsweise zwischen -5 und -10 C, gehalten wird.
7. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die Eliminierung des Hämoglobins in Gegenwart von Äthanol bei einer Konzentration
von unter 60 % durch Zusatz eines Halogenkohlenwasserstoffes,
vornehmlieh Chloroform, erfolgt.
8. Verfahren gemäß Anspruch J, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chloroform bei einer Konzentration von etwa 0,6 % und einem p„ zwischen 6 und 6,1 bei einer Temperatur
von etwa + 22° C verwendet wird.
9. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß zwecks Eliminierung der Gruppensubstanzen die Xthanol-Konzentration auf einen
Wert Über 55 % eingestellt und Trichloressigsäure zugesetzt
wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, daß die Xthanol-Konzentration annähernd 75 % beträgt.
11. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Protein-Konzentration
von weniger als 10 g/Liter arbeitet.
12. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppensubstanzen bei einer Temperatur von unter 00C, vorzugsweise bei -5°
bis -10° C, eliminiert werden.
309885/0988
13. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der TrI-Chloressigsäure
ungefähr 5 bis 8 χ 10 Mol/Liter beträgt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 1 und irgendeinem der Ansprüche
9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Eliminierung
der Enzyme und die Eliminierung der Gruppensubstanzen gleichzeitig durchgeführt werden.
15· Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ferner eine Thermokoagulation
in Gegenwart eines Caprylats, vornehmlich Natriumeaprylat,
durchgeführt wird.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Thermokoagulation durchgeführt wird, nachdem
die Protein-Konzentration auf einen Wert von höchstens 50 g/Liter eingestellt worden ist, wobei das ρ», 4,5 bis
5,5 beträgt und die Temperatur der Thermokoagulation zwischen 52° C und 64° C, vorzugsweise zwischen 56° C
und 60° C, liegt.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Natriumcaprylät-Konzentration 2 bis 12 g/Liter
beträgt.
18. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17,
dadurch gekennzeichnet, daß die Dauer der Thermokoagulation mehr als 1/2 Stunde beträgt.
309885/0988
19. Verfahren gemäß Irgendeinem der Ansprüche 1 bis l8,
dadurch gekennzeichnet, daß eine Klärung durch Zugabe eines Siliciumdioxyd-Qels durchgeführt wird.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19« dadurch gekennzeichnet,
daß man "Aerosll" bis zu einer Konzentration von ungefähr
0,2 % zugibt.
21. Gereinigtes Albuminpräparat, dadurch gekennzeichnet,
daß es nach irgendeinem der Verfahren, wie sie In den Ansprüchen 1 bis 20 beansprucht werden, erhalten
worden ist, wobei das genannte Präparat im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, denaturiertem
Albumin und Hämoglobin.
309885/0988
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