DE2143816A1

DE2143816A1 - Verfahren zur Gewinnung von Urokinase

Info

Publication number: DE2143816A1
Application number: DE19712143816
Authority: DE
Inventors: Nobuhisa Dr. pharm. Omiya; Koji Nobuhiko; Murayama Yukio; Urawa Saitama; Ogawa (Japan). P
Original assignee: Mochida Seiyaku K.K., Tokio
Priority date: 1970-09-04
Filing date: 1971-09-01
Publication date: 1972-03-09
Also published as: NL7112068A; SE372538B; US3723251A; DE2143816B2; DK128568B; FR2105243B1; JPS4810232B1; BR7105833D0; DE2143816C3; GB1305510A; NL164091B; NL164091C; FR2105243A1; CA952457A

Description

Verfahren zur Gewinnung von Urokinase

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigter Urokinase aus menschlichem Harn in industriellem Massstab. Urokinase ist bekanntlich ein Enzym, das in kleinen Mengen in menschlichem Harn vorkommt und sich als wirksam zur Behandlung verschiedener Formen von Thrombosen erwiesen hat, da es, wenn es intravenös in den menschlichen Körper injiziert wird, pathologisch gebildetes Fibrin oder fibrinöse Koagulationen, die die Blutgefässe verstopfen, lösen kann.

Zur Extraktion von Urokinase aus menschlichem Harn sind verschiedene verfügbare Materialien bekannt, wie beispielsweise Schwermetalle, Bariumsulfat, Kieselsäure und deren Salze und verschiedene Ionenaustauscher.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, das wirksamer als die bisherigen ist. Es wurde nun ein Verfahren gefunden,däs wirksamer als alle bekannten Verfahren und einfach durchzuführen ist.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Urokinase des menschlichen Harns an ein bisher zur Extraktion von Urokinase noch nicht verwendetes Material, nämlich an synthe-

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tische Acrylnitrilfaser oder Stoffen daraus, wie beispielsweise "Bonnel" (Handelsname der Mitsubishi Bonnel), "Exlan" (Handelsname der Japan Exlan) oder "Kashimiron" (Handelsname der Asahi Kasei), adsorbiert wird. Im folgenden wird die Paser beschrieben, doch treffen die Ausführungen auch für Stoffe aus dieser Paser zu.

Die erfindungsgemäss zu verwendende synthetische Acrylnitrilfaser ist so billig und so leicht zugänglich, dass sie nach dem Gebrauch weggeworfen werden kann, und sie erfordert keine Vorbehandlung vor der Verwendung. Wenn es jedoch erwünscht ist, kleine Flecken von der Paser zu entfernen, so kann dieser Zweck einfach durch vorher- * gehendes Eintauchen der Faser in Wasser und Bewegen in diesem erreicht werden. Wenn Luftblasen, die zwischen den Fasern eingeschlossen sind, vor dem Inkontaktbringen der Fasern mit dem Harn entfernt werden sollen, so kann dies mit einer ähnlichen Behandlung erreicht werden.

Da die Pasern in kleinen Mengen ausreichend wirksam sind und die an diesen Pasern adsorbierte Urokinase leicht abgetrennt werden kann, ist das erfindungsgemässe Verfahren wirtschaftlich jedem der bekannten Verfahren überlegen.

Ein weiteres Merkmal des erfindungsgeraässen Verfahrens liegt darin, dass der Arbeitsaufwand für das Sammeln von Harn herabgesetzt wird P oder wegfallen kann.

So kann insbesondere die grosse Arbeit, die zum Sammeln von Harn erforderlich ist, durch das einfache Sammeln kleiner leichter Acrylnitrilfasern, die in den Urinalen liegen oder einen Teil der Abflussleitung, die mit dem Boden eines Urinais verbunden ist, füllen, ersetzt werden. Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich somit ausserordentlich gut für die industrielle Extraktion von Urokinase.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist im wesentlichen das folgende ι Menschlicher Harn wird in Kontakt mit synthetischen Acrylnitrilfasern gebracht, um Urokinase aus dem Harn an den Fasern zu ad-

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sorbieren, die herausgenommen werden, um zur Entfernung des restlichen Harns mit Wasser gewaschen zu werden. Die Elution erfolgt dann unter Verwendung einer alkalischen Lösung. Da die Harnzusammensetzung durch die Aufnahme von Nahrung oder Wasser, die Bewegung, die Zeit oder klimatische Einflüsse stark beeinflusst wird, ist es schwierig, einen normalen pH-Wert für den Harn festzulegen, doch kann angenommen werden, dass dieser im allgemeinen zwischen 4,8 und 7,5 liegt (Hidenobu MAJIMA, "Physiology", Bunkodo, 1968). In diesem pH-Bereich von 4,8 bis 7,5 kann Urokinase an synthetische Acrylnitrilfasern adsorbiert werden, doch ist für höhere Ausbeuten ein pH-Bereich von 5,5 bis 6,5 zu bevorzugen. Wenn beispielsweise zur Elution der adsorbierten Urokinase eine wässrige 4 #ige Ammoniaklösung verwendet wird, so wird eine EIutionsrate von 94 % erreicht. _N

Der Kontakt des Harns mit den synthetischen Acrylnitrilfasern wird wirksamer gemacht, indem das obige Verfahren nach Behandlung des Harns bei Zimmertemperatur durch Einstellung seines pH-Wertes auf 7,5 bis 9,5 oder vorzugsweise auf 8,5 und somit Entfernung der gebildeten Sedimente durchgeführt wird.

Die erhaltene Urokinase enthaltende Lösung wird dann zu einem für medizinische Zwecke geeigneten Präparat konzentriert oder gereinigt. Es ist bekannt, dass zur Konzentrierung die folgenden Methoden zur Verfügung stehen: Aussalzen mittels Ammoniumsulfat, Sedimentation mittels eines organischen Lösungsmittels, "Diaflo" (Handelsname der U.S. Amicon). Zur Reinigung können verschiedene Ionenaustauscher verwendet werden, doch wird eine Urokinase hoher Reinheit durch einen weiteren Kontakt mit synthetischen Acrylnitrilfasern erhalten.

Im folgenden soll die selektive Adsorption von Urokinase an synthetische Acrylnitrilfasern im einzelnen gezeigt werden. Die nachfolgende Tabelle I zeigt die Ausbeuten an Urokinase aus verschiedenen Fasern, die durch Inkontaktbringen von 2 g Pasern mit 3 1 Harn mit einem pH-Wert von 6,0 erhalten wurden. Die Pasern wurden mit Wasser gewaschen, und die Urokinase wurde dann unter Verwendung einer

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wässrigen 4 $igen Ammoniaklösung eluiert,

Tabelle I

Ausbeuten an Urokinase

Pasern	Hauptbestandteil	Ausbeute ($>)
adsorbierende Baumwolle	Cellulose	8
"TEVIRON" (Handelsname der Teijin, synthetische Vinylchloridfaser)	Vinylchlorid	15
"Bonne1"	Acrylnitril	89

Die Tabelle I zeigt die Überlegenheit des erfindungsgemässen Verfahrens bezüglich der Ausbeute an Urokinase.

Die folgende Tabelle II zeigt einen Vergleich zwischen üblichen Verfahren und dem erfindungsgemässen Verfahren.

Tabelle II Vergleich zwischen üblichen Verfahren und dem erfindungsgemässen

Verfahren

Adsorptionsmedium	Ausbeute ($>) Spezifische Aktivität (E/mg)	800
Bariumsulfat	70	525
Silicagel	54	310
Phosphorcellulose	79	297 508 3800
Carboxymethylcellulose 35 "Amberlite" lRC-50 (Handels name der Rohm & Haas Co.) 88 ' "Bonne1" 91

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Aus Tabelle II ist klar ersichtlich, dass das erfindungsgemässe Verfahren eine höhere Ausbeute an Urokinase als die üblichen Verfahren ergibt. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die bisher bekannten sogenannten Adsorbentien nicht nur Urokinase sondern auch grosse Mengen an Verunreinigungen adsorbieren, so dass die Reinheit des Elutionsprodukte' gering ist, und die Bedeutung dieser Adsorbentienlediglich in dem Herausholen der Urokinase aus · dem Harn zu sehen ist.

Aus den Tabellen I und II ist ersichtlich, dass das erfindungsgemässe Verfahren ein ausgezeichnetes.Verfahren ist, das sich nicht nur durch die Möglichkeit der Elution in konzentriertem Zustand, sondern auch durch eine hohe Selektivität bezüglich der Urokinaseadsorption auszeichnet.

Die Urokinaseeinheiten wurden durch die Fibrinplattenmethode nach Ploug u. Mitarb, [j. Ploug, Biochem. Biophys. Aota, Band 24, Seite 278 (1957)] bestimmt.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung .

Beispiel 1

Ein gesammeltes grosses Volumen von frischem Harn von vielen gesunden Personen wurde unter Rühren unter Verwendung einer 10 #igen Natriumhydroxydlösung auf pH 8,5 eingestellt. Das erhaltene Sediment wurde abfiltriert oder durch Abzentrifugieren entfernt. Dann wurde unter kräftigem Rühren 6n-Salzsäure allmählich zur Einstellung auf pH 5j5 zugegeben. Unmittelbar anschliessend wurde "Bonnel" in einer Menge von 70 g/100 1 Harn unter kräftigem Rühren eingebracht. Das "Bonnel", das so in Kontakt mit dem Harn gebracht wurde, wurde in einen grossen Trichter überführt und mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser farblos und klar war. Dann wurde das Waschwasser durch Abpressen entfernt. Anschliessend wurde die an den Pasern adsorbierte Urokinase unter Verwendung von 2 1 einer wässrigen 4 #igen Ammoniaklösung durch Elution abgetrennt. Ammo-

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niumsulfat wurde zu dem Eluat unter Rühren bis zu einer Sättigung von 60 % zugegeben. Nach PortSetzung des Rührens für eine weitere Stunde wurde der Niederschlag durch 30-minütiges Abzentrifugieren bei 20 000 g abgetrennt, in 500 ml Wasser gelöst und dann über Nacht einer Dialyse unter Verwendung der 100-fachen Menge Wasser unterzogen. Die so erhaltene Lösung enthielt etwa 85 % der Urokinase in dem ursprünglichen Harn. Ihre spezifische Aktivität betrug etwa 4000 E/mg.

Beispiel 2

Unter kräftigem Rühren wurde 6n-Salzsäure allmählich zu einer rohen Urokinaselösung, die wie in Beispiel 1 erhalten war, zur Einstellung auf pH 5>5 zugegeben. Unmittelbar danach wurde "Bonnel" " in die rohe Urokinaselösung in einer Menge von 100 g/l Lösung eingebracht, und es wurde kräftig gerührt. Die anschliessende Behandlung war die gleiche wie in Beispiel 1, und die Elution wurde unter Verwendung von 1 1 einer wässrigen 4 $igen Ammoniaklösung durchgeführt. Anschliessend wurde wie in Beispiel 1 aufgearbeitet.

Die schliesslich erhaltene Lösung enthielt etwa 80 % der Urokinase in der rohen Urokinaselösung. Ihre spezifische Aktivität betrug über 13 000 E/mg.

Beispiel 3

100 g Kaolin wurden zu 100 1 frischem Harn, aus dem das Sediment durch Filtrieren abgetrennt worden war, zugegeben, und das Gemisch wurde dann gründlich gerührt. Das Kaolin wurde durch Abzentrifugieren gewonnen und gewaschen, bis die Waschflüssigkeit farblos und klar war. Anschliessend wurde die an dem Kaolin adsorbierte Urokinase durch Elution unter Verwendung von 3 1 einer wässrigen 4 #igen Ammoniaklösung abgetrennt und dann über Nacht einer Dialyse unterzogen. Die so erhaltene rohe Urokinaselösung wurde mit 6n-Salzsäure auf pH 5,5 eingestellt. 45 g "Exlan" (Handelsname der Japan Exlan) Textilstücke wurden dann unter gutem Rühren zugegeben. Anschliessend wurde die gleiche Arbeitsweise wie

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in Beispiel 1 durchgeführt. Die Elution wurde unter Verwendung von 1 1 einer wässrigen 4 $igen Ammoniaklösung vorgenommen. Die anschliessende Behandlung war die gleiche wie in Beispiel 1.

Die so erhaltene Lösung enthielt etwa 75 % der Urokinase in der rohen Lösung oder etwa 40 % der Urokinase in dem ursprünglichen Harn, wobei ihre spezifische Aktivität über 10 000 E/mg betrug.

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Claims

- 8 Patentansprüche

1 * Verfahren zur Gewinnung von Urokinase aus einer Urokinase enthaltenden Flüssigkeit durch Extraktion, dadurch gekennzeichnet, dass ein synthetische Acrylnitrilfasern enthaltendes Material mit der Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, bis ein merklicher An-

teil der Urokinase durch das Material adsorbiert ist, und die adsorbierte Urokinase dann aus dem Material durch Elution abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch-1, dadurch gekennzeichnet, dass die Urokinase mit einer alkalischen Lösung eluiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit auf 5*5 bis 6,5 eingestellt wird, bevor die Urokinase adsorbiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fasern in Form eines Stoffs vorliegen.

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