CN111647587A - 一种尿激酶中间体的纯化方法 - Google Patents

一种尿激酶中间体的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种尿激酶中间体的纯化方法，涉及生物工程、化学工程领域。具体包括以下步骤：(1)取尿液、吸附，洗脱，收集洗脱液；(2)洗脱液进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；(3)取人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；(4)取尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。实施过程中采用亲和琼脂糖凝胶层析，结合其他工艺条件的优化，如平衡缓冲液配方、洗脱缓冲液配方、洗脱方法、pH、电导等，使最终得到的尿激酶的活性收率提高到90％以上，纯度提高到85％以上。

Description

一种尿激酶中间体的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物工程、化学工程领域，具体而言，本发明涉及尿激酶中间体的纯化方法。
背景技术
尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物。它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶,纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽,从而使血栓溶解。因此,临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时,由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白,使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞,从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以,尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂,而且它是无抗原性问题,可长时间使用。
尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH8.7左右，为白色非结晶状粉末,易溶于水。稀溶液性状不稳定,必须新鲜配用，且不得用酸性溶液稀释。冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似,也有酯酶的活力。无抗原性，不使体内产生抗体，体内半衰期为(14±6)min。
尿激酶中间体的纯化过去一直采用D-160吸附树脂，吸附树脂存在的主要问题是处理步骤繁琐，大量使用强酸强碱，环保压力大，且大体积强酸的使用对工作环境和人的伤害也比较大，并且纯度提升也很有限。
例如，中国专利申请200910186618.0中公开了一种制备尿激酶的方法，其特征在于采用了D-160阳离子树脂交换法、亲和膜色谱法及亲和层析法相结合，以尿激酶粗品为原料制备尿激酶。所得到的尿激酶质量优于现有国内水平，尿激酶比活可达到150,000IU/mg·pr以上，高分子尿激酶相对含量可达到96％以上，尿激酶生物活性回收率可达到65％。该方法中采用D-160吸附树脂，吸附树脂存在的主要问题是处理步骤繁琐，大量使用强酸强碱，环保压力大，且大体积强酸的使用对工作环境和人的伤害也比较大，并且得到的尿激酶的含量和纯度均不能满足要求。
又如，中国专利申请201611197428.5中公开了一种亲和层析纯化尿激酶的方法。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的尿激酶，可以将总收率提高到80％以上，总效价不低于40000iu/mg，但该方法操作比较复杂，其活性收率和纯度依然不能满足需求。
因此，急需一种在保证尿激酶中间体纯化过程中活性回收率的前提下，通过优化各项工艺参数如平衡缓冲液配方、洗脱缓冲液配方、洗脱方法、pH、电导等，实现了尿激酶中间体的高纯度，高活性收率，满足量产经济效益要求的尿激酶纯化方法。
发明内容
基于现有技术中存在的缺点与不足，本发明旨在提供一种尿激酶中间体的纯化方法，本发明的目的在保证尿激酶中间体纯化过程中活性回收率的前提下，采用亲和琼脂糖凝胶层析，结合其他工艺条件的优化，如平衡缓冲液配方、洗脱缓冲液配方、洗脱方法、pH、电导等条件的优化，可以明显提高尿激酶中间体的纯度和活性收率，满足量产经济效益要求。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种尿激酶中间体的纯化方法，本发明采用亲和琼脂糖凝胶对尿激酶中间体进行纯化，可以使尿激酶中间体的纯度提高到85％以上，活性收率提高到90％以上。
一种尿激酶中间体的纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)取新鲜的男性尿液，加入硅胶进行吸附，过滤后，用水冲洗硅胶，然后加氨水洗脱，收集洗脱液；
(2)向步骤(1)中得到的洗脱液加入硫酸铵进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；
(3)取步骤(2)中得到的人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；
(4)取步骤(3)中得到的尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。
上述步骤(1)中所述的硅胶与尿液的含量比为1-5：100(Kg/L)；所用氨水的浓度0.01-0.05％。
上述步骤(2)中所述的硫酸铵与洗脱液的含量比为350-430：1(g/L)；pH值为6.0-8.0。
优选地，上述步骤(3)包括如下步骤：
(31)用pH为5.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液将人尿激酶粗品溶解后过滤，得到滤液；
(32)使用缓冲液平衡葡聚糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为1-30ms/cm；优选地，pH值为7.0-8.0，电导为10-20ms/cm；再优选地，pH值为7.0，电导为15ms/cm；
(33)将步骤(31)中得到的滤液以0.5-5mL/min速度经葡聚糖凝胶层析柱，然后加缓冲液进行洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为30-90ms/cm，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；
优选地，所述的洗脱过程中缓冲液的pH值为6.5-7.5，电导为50-90ms/cm；再优选地，所述的洗脱过程中缓冲液的pH值为7.0，电导为60-80ms/cm；进一步优选地，所述的洗脱过程中缓冲液的pH值为7.0，电导为80ms/cm。
上述步骤(33)中所述的滤液的pH值与电导和平衡缓冲液的相同。
上述步骤(32)中所述的平衡缓冲液为醋酸盐、磷酸盐、Tris-HCl缓冲液中的一种；优选为磷酸盐缓冲液；
在一些优选实施方案中，所述的平衡缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁中的一种，优选为氯化钠。
上述步骤(33)中所述的洗脱缓冲液为醋酸盐、磷酸盐、Tris-HCl缓冲液中的一种；优选为磷酸盐缓冲液；
在一些优选实施方案中，所述的洗脱缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁；优选为氯化钠。
优选地，上述步骤(4)包括以下步骤：
(41)用pH为5.0-8.0的缓冲液将尿激酶中间体粗品溶解后过滤，得到滤液；
(42)使用缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为20-60ms/cm；优选地，pH值为7.0-8.0，电导为30-50ms/cm；再优选地，pH值为7.0，电导为50ms/cm；
(43)将步骤(41)中得到的滤液以0.5-5mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为2.0-4.0，电导为30-90ms/cm，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体；
优选地，所述的洗脱过程中缓冲液的pH值为3.0-4.0，电导为50-90ms/cm；再优选地，所述的洗脱过程中缓冲液的pH值为3.0，电导为60-80ms/cm；；进一步优选地，所述的洗脱过程中缓冲液的pH值为3.0，电导为80ms/cm。
上述步骤(42)中所述的平衡缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的一种；优选为Tris—HCl缓冲液；
在一些优选实施方案中，所述的平衡缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁中的一种，优选为氯化钠。
上述步骤(43)中所述的洗脱缓冲液为Tris-HCl缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或盐酸缓冲液中的一种，优选为Tris-HCl缓冲液和醋酸缓冲液；
在一些优选实施方案中，所述的洗脱缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁；优选为氯化钠。
上述步骤(4)中所述的亲和琼脂糖凝胶层析柱的填料为对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶、Benzamidine Sepharose 4FF(HS)/GE和Benzamidine Sepharose 6B/GE中的一种，优选为自产对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶。
上述步骤(4)中所述的洗脱采用梯度洗脱的方式，具体操作步骤为：
固定相：对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶、Benzamidine Sepharose 4FF(HS)/GE或Benzamidine Sepharose 6B/GE；
流动相：流动相A：Tris-HCl缓冲液，流动相B：醋酸缓冲液；
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0-15min 100％Tris-HCl缓冲液 -
15-50min 100％→0％Tris-HCl缓冲液 0％→100％醋酸缓冲液
本发明中所述的尿激酶中间体是指：对尿液进行吸附、洗脱、硫酸铵沉淀，硅藻土过滤后得到的固体经过第一步层析以后得到的目标产物，浓度和纯度有一定程度提高，但仍需后续纯化的物质。
与现有技术相比，本发明的有益效果在：
(1)本发明在实施过程中使用琼脂糖凝胶工艺对尿激酶进行纯化，明显提高了尿激酶的活性收率和纯度，并且该方法操作简便，环保压力小，不使用强酸，工作环境和人员安全都有保障；
(2)本发明实施过程中采用亲和琼脂糖凝胶层析，结合其他工艺条件的优化，如平衡缓冲液配方、洗脱缓冲液配方、洗脱方法(阶梯梯度优化)、pH、电导等条件的优化，可以明显提高尿激酶中间体的纯度和活性收率，满足量产经济效益要求；
(3)本发明提供的纯化方法，最终得到的尿激酶的活性收率提高到90％以上，纯度提高到85％以上。
具体实施方式
基础实施例1一种尿激酶中间体粗品的制备
(1)取新鲜的男性尿液500L，加入5g硅胶进行吸附，过滤后，用水冲洗硅胶，然后加0.01％氨水洗脱，收集洗脱液；
(2)向步骤(1)中得到的pH＝6.0的洗脱液0.1L加入35g硫酸铵进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；
(3)取步骤(2)中得到的人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；
(31)用pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液将人尿激酶粗品溶解后过滤，得到滤液；
(32)使用含有150mM氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为6.0，电导为5ms/cm；
(33)将步骤(31)中得到的滤液以0.5mL/min速度经葡聚糖凝胶层析柱，然后加含有150mM氯化钠的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为6.0，电导为30ms/cm，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品。
粗品收率85.6％，纯度28.2％，比活性18万IU/mg。
基础实施例2一种尿激酶中间体粗品的制备
(1)取新鲜的男性尿液500L，加入20g硅胶进行吸附，过滤后，用水冲洗硅胶，然后加0.03％氨水洗脱，收集洗脱液；
(2)向步骤(1)中得到的pH＝7.0的洗脱液0.1L加入40g硫酸铵进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；
(3)取步骤(2)中得到的人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；
(31)用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液将人尿激酶粗品溶解后过滤，得到滤液；
(32)使用含有500mM氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为7.0，电导为15ms/cm；
(33)将步骤(31)中得到的滤液以3.5mL/min速度经葡聚糖凝胶层析柱，然后加含有500mM氯化钠的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为7.0，电导为80ms/cm，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品。
粗品收率90.5％，纯度39.6％，比活性20万IU/mg。
基础实施例3一种尿激酶中间体粗品的制备
(1)取新鲜的男性尿液500L，加入25g硅胶进行吸附，过滤后，用水冲洗硅胶，然后加0.05％氨水洗脱，收集洗脱液；
(2)向步骤(1)中得到的pH＝7.0的洗脱液0.1L加入43g硫酸铵进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；
(3)取步骤(2)中得到的人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；
(31)用pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液将人尿激酶粗品溶解后过滤，得到滤液；
(32)使用含有1000mM氯化镁的Tris-HCl缓冲液平衡葡聚糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为8.0，电导为30ms/cm；
(33)将步骤(31)中得到的滤液以5mL/min速度经葡聚糖凝胶层析柱，然后加含有1000mM氯化镁的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为8.0，电导为90ms/cm，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品。
粗品收率82.4％，纯度25.8％，比活性16万IU/mg。
基础实施例4一种尿激酶中间体粗品的制备
(1)取新鲜的男性尿液500L，加入22g硅胶进行吸附，过滤后，用水冲洗硅胶，然后加0.05％氨水洗脱，收集洗脱液；
(2)向步骤(1)中得到的pH＝7.0的洗脱液0.1L加入38g硫酸铵进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；
(3)取步骤(2)中得到的人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；
(31)用pH为8.0的醋酸盐缓冲溶液将人尿激酶粗品溶解后过滤，得到滤液；
(32)使用含有800mM硫酸钠的醋酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为8.0，电导为25ms/cm；
(33)将步骤(31)中得到的滤液以4mL/min速度经葡聚糖凝胶层析柱，然后加含有800mM硫酸钠的醋酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为6.5，电导为50ms/cm，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品。
粗品收率84.9％，纯度23.8％，比活性17万IU/mg。
实施例1一种尿激酶中间体的纯化方法
取基础实施例1中得到的尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。
(41)用pH为5.0的磷酸盐缓冲液将尿激酶中间体粗品溶解后过滤，得到滤液；
(42)使用含150mM氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为6.0，电导为20ms/cm，填料为对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶，直至UV280nm<0.1；
(43)将步骤(41)中得到的滤液以0.5mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，使用含150mM氯化钠的缓冲液洗脱柱子，洗脱过程中缓冲液的pH值为2.0，电导为30ms/cm，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体；
上述步骤(4)中所述的洗脱采用梯度洗脱的方式，具体操作步骤为：
固定相：对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶；
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0-15min 100％Tris-HCl缓冲液 -
15-50min 100％→0％Tris-HCl缓冲液 0％→100％醋酸缓冲液
实施例2一种尿激酶中间体的纯化方法
取基础实施例2中得到的尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。
(41)用pH为7.0的磷酸盐缓冲液将尿激酶中间体粗品溶解后过滤，得到滤液；
(42)使用含500mM氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为7.0，电导为50ms/cm，填料为对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶，直至UV280nm<0.1；
(43)将步骤(41)中得到的滤液以3.5mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，使用含500mM氯化钠的缓冲液洗脱柱子，洗脱过程中缓冲液的pH值为3.0，电导为80ms/cm，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体；
上述步骤(4)中所述的洗脱采用梯度洗脱的方式，具体操作步骤为：
固定相：对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶；
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0-15min 100％Tris-HCl缓冲液 -
15-50min 100％→0％Tris-HCl缓冲液 0％→100％醋酸缓冲液
实施例3一种尿激酶中间体的纯化方法
取基础实施例2中得到的尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。
(41)用pH为8.0的磷酸盐缓冲液将尿激酶中间体粗品溶解后过滤，得到滤液；
(42)使用含800mM氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为8.0，电导为60ms/cm，填料为Benzamidine Sepharose 4FF(HS)/GE，直至UV280nm<0.1；
(43)将步骤(41)中得到的滤液以5mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，使用含800mM氯化钠的缓冲液洗脱柱子，洗脱过程中缓冲液的pH值为4.0，电导为90ms/cm，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体；
上述步骤(4)中所述的洗脱采用梯度洗脱的方式，具体操作步骤为：
固定相：Benzamidine Sepharose 4FF(HS)/GE；
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0-15min 100％Tris-HCl缓冲液 -
15-50min 100％→0％Tris-HCl缓冲液 0％→100％醋酸缓冲液
实施例4一种尿激酶中间体的纯化方法
取基础实施例3中得到的尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。
(41)用pH为7.0的磷酸盐缓冲液将尿激酶中间体粗品溶解后过滤，得到滤液；
(42)使用含500mM氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为7.0，电导为50ms/cm，填料为对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶，直至UV280nm<0.1；
(43)将步骤(41)中得到的滤液以3.5mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，使用含500mM氯化钠的缓冲液洗脱柱子，洗脱过程中缓冲液的pH值为3.0，电导为80ms/cm，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体；
上述步骤(4)中所述的洗脱采用梯度洗脱的方式，具体操作步骤为：
固定相：对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶；
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0-15min 100％Tris-HCl缓冲液 -
15-50min 100％→0％Tris-HCl缓冲液 0％→100％醋酸缓冲液
实施例5一种尿激酶中间体的纯化方法
取基础实施例4中得到的尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。
(41)用pH为8.0的磷酸盐缓冲液将尿激酶中间体粗品溶解后过滤，得到滤液；
(42)使用含800mM氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为8.0，电导为60ms/cm，填料为Benzamidine Sepharose 6B/GE，直至UV280nm<0.1；
(43)将步骤(41)中得到的滤液以5mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，使用含800mM氯化钠的缓冲液洗脱柱子，洗脱过程中缓冲液的pH值为4.0，电导为90ms/cm，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体；
上述步骤(4)中所述的洗脱采用梯度洗脱的方式，具体操作步骤为：
固定相：Benzamidine Sepharose 6B/GE；
梯度洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0-15min 100％Tris-HCl缓冲液 -
15-50min 100％→0％Tris-HCl缓冲液 0％→100％醋酸缓冲液
对比例1
与实施例2的区别在步骤(43)中洗脱过程中缓冲液的pH值为6.0，电导为20ms/cm，其他操作与步骤与实施例2相同。
对比例2
与实施例2的区别在步骤(43)中洗脱过程中缓冲液的pH值为1.0，电导为100ms/cm，，其他操作与步骤与实施例2相同。
对比例3
与实施例3的区别在于：步骤(42)中使用pH值为3.0，电导为80ms/cm含800mM氯化钠磷酸盐缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，其他操作与步骤与实施例3相同。
对比例4
与实施例3的区别在于：步骤(42)中使用pH值为9.0，电导为10ms/cm含800mM氯化钠磷酸盐缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，其他操作与步骤与实施例3相同。
对比例5
与实施例3的区别在于：步骤(42)中使用pH值为8.0，电导为60ms/cm磷酸盐缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，其他操作与步骤与实施例3相同。
对比例6
与实施例3的区别在于：步骤(43)以0.2mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，其他操作与步骤与实施例3相同。
试验例上述实施例1-5以及对比例1-6中得到的高纯度尿激酶中间体的纯度、收率以及比活值检测，具体数据见下表1。
表1
Figure BDA0002575965810000101
Figure BDA0002575965810000111
注：-表示没有检测到尿激酶
根据上表1的检测数据可以看出，本发明在实施过程中采用亲和琼脂糖凝胶层析，结合其他工艺条件的优化，如平衡缓冲液(醋酸盐、磷酸盐、Tris-HCl)、洗脱缓冲液配方(Tris-HCl、甘氨酸、醋酸、盐酸)、洗脱方法(阶梯梯度优化)、pH(平衡5.0-8.0、洗脱2.0-4.0)、电导(平衡20-60ms/cm、洗脱30-90ms/cm)等条件的优化，可以明显提高尿激酶中间体的纯度和活性收率，最终得到的尿激酶的活性收率提高到90％以上，纯度提高到85％以上，满足量产经济效益要求，本发明实施例2中通过进一步优化各种参数，平衡缓冲液为磷酸盐、洗脱缓冲液为醋酸、洗脱方法(阶梯梯度优化)、平衡过程中pH＝6.0、洗脱过程中pH为3.0、平衡过程中电导50ms/cm、洗脱过程中电导80ms/cm，得到的尿激酶中间体的纯度为89.2％，收率为95.8％，对比例1-4改变洗脱过程和平衡过程中的pH值和电导值会使尿激酶无法吸附或洗脱不掉，因此明显降低尿激酶的收率和纯度。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种尿激酶中间体的纯化方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)取新鲜的男性尿液，加入硅胶进行吸附，过滤后，用水冲洗硅胶，然后加氨水洗脱，收集洗脱液；
(2)向步骤(1)中得到的洗脱液加入硫酸铵进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；
(3)取步骤(2)中得到的人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；
(4)取步骤(3)中得到的尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的硅胶与尿液的含量比为1-5:100Kg/L；所用氨水的浓度为0.01-0.05％。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的硫酸铵与洗脱液的含量比为350-430：1g/L；pH值为6.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(3)包括如下步骤：
(31)用pH为5.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液将人尿激酶粗品溶解后过滤，得到滤液；
(32)使用缓冲液平衡葡聚糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为1-30ms/cm；
(33)将步骤(31)中得到的滤液以0.5-5mL/min速度经葡聚糖凝胶层析柱，然后加缓冲液进行洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为30-90ms/cm，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品。
5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：步骤(32)中所述的平衡缓冲液为醋酸盐、磷酸盐、Tris-HCl缓冲液中的一种；
所述的平衡缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁中的一种。
6.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：步骤(33)中所述的洗脱缓冲液为醋酸盐、磷酸盐、Tris-HCl缓冲液中的一种；
所述的洗脱缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(4)包括以下步骤：
(41)用pH为5.0-8.0的缓冲液将尿激酶中间体粗品溶解后过滤，得到滤液；
(42)使用缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为20-60ms/cm；优选地，pH值为7.0-8.0，电导为30-50ms/cm；再优选地，pH值为7.0，电导为50ms/cm；
(43)将步骤(41)中得到的滤液以0.5-5mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为2.0-4.0，电导为30-90ms/cm，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于：步骤(42)中所述的平衡缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的一种；
所述的平衡缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁中的一种。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(43)中所述的洗脱缓冲液为Tris-HCl缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或盐酸缓冲液中的一种；
所述的洗脱缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(4)中所述的亲和琼脂糖凝胶层析柱的填料为对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶、Benzamidine Sepharose 4FFHS/GE和Benzamidine Sepharose 6B/GE中的一种。
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