CN101701215A - 一种制备尿激酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备尿激酶的方法，其特征在于采用了D160阳离子树脂交换法、亲和膜色谱法及亲和层析法相结合，以尿激酶粗品为原料制备尿激酶。所得到的尿激酶质量优于现有国内水平，尿激酶比活可达到150,000IU/mg.pr以上，高分子尿激酶相对含量可达到96％以上，尿激酶生物活性回收率可达到65％。本方法解决了现有尿激酶制备方法普遍存在的操作繁琐、产品质量差，收率低和生产成本高等问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备尿激酶的方法，尤其涉及一种亲和膜色谱技术和亲和层析技术制备尿激酶的方法。
背景技术
尿激酶，简称UK，是人体肾细胞产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是酶活性中心的必需氨基酸。其主要存在于人及哺乳动物的尿中，人尿源尿激酶主要有天然高分子量尿激酶(54000Dal)和低分子量尿激酶(33000Dal)两种，高分子量尿激酶溶解血栓的临床效果比低分子量的尿激酶约高3倍，国际上把尿激酶的相对分子量作为质量标准的重要指标之一。临床上主要用于治疗急性心肌梗塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞、血栓性闭塞性疾病、肺栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。
尿激酶制备方法目前主要有离子交换层析法，凝胶分子筛法、免疫亲和层析和对氨基苯甲脒-Sepharose亲和层析等。如：陈祥胜等报道了采用苯甲脒琼脂糖凝胶亲和层析从尿激酶粗品中精制尿激酶，比活27938IU/mg·pr，活性回收率62.96％，纯化倍数4.03倍；祝一锋等报道了采用SephadexG-50凝胶过滤、CM-Sephadex C-50、硫酸铵沉淀以及Bio-Gel P-30凝胶过滤等制备尿激酶精品，比活34080IU/mg·pr，活性回收率60％左右，纯化倍数50倍。沈金玉等报道了采用免疫亲和层析从尿激酶粗品精制尿激酶。离子交换和凝胶过滤纯化效率低下，难以获得高纯度的尿激酶精品；免疫亲和层析纯化尿激酶可获得较高纯度的尿激酶精品，但由于免疫亲和层析需使用生物配基，价格昂贵，很难获得工业化生产使用的配基；对氨基苯甲脒-Sepharose作为一种较好的尿激酶精品精制方法，但也必须同其他方法一起使用，而且必须在提取过程中多次使用才能获得高质量的尿激酶，多次使用造成生产成本极高、收率低，生产周期长。
发明内容
本发明的目的是提供一种以尿激酶粗品为原料制备尿激酶的方法，该方法生产工艺时间短，易于工业化生产，产品质量高，生产成本低。
本发明是这样来实现的，首先尿激酶粗品经溶解、离心或过滤，体积较大时超滤浓缩等步骤获得的澄清溶液，调电导率，使其与D160阳离子树脂层析柱使用的平衡液电导率一致，再上装有D160阳离子树脂层析柱吸附，再洗涤、洗脱，得到的洗脱液上亲和膜纯化柱，经洗涤、洗脱得到的洗脱液上亲和层析柱，经洗涤、洗脱、过滤得到的滤液进行冷冻干燥，最后得到尿激酶。其具体制备方法如下：
(1)取一定量的尿激酶粗品(生物效价30000～50000IU/g，比活300～600IU/g·pr)，用8～10倍尿激酶粗品量(体积与重量比)的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液分2～3次加入溶解，每次搅拌溶解0.5～1.0小时，然后离心或过滤，合并上清或滤液，体积较大时进行超滤浓缩，得到的澄清溶液备用；
(2)将步骤(1)得到的澄清溶液调节电导率，使其与D160阳离子树脂层析柱使用的平衡液电导率一致，再上用含0.15～0.30mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液平衡的D160阳离子树脂层析柱，然后用含0.15～0.30mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤；最后用pH10，1～3％氨水进行洗脱，收集洗脱活性峰；
(3)将步骤(2)收集得到的洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和膜纯化柱，用含0.45～0.60mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.25～0.35mol/L氯化钠的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；
(4)将步骤(3)收集得到的洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和层析柱，用含1.0～2.0mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.35～0.45mol/L氯化钠的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰，过滤，最后进行冷冻干燥，得到尿激酶。
本发明利用D160阳离子树脂吸附法，亲和膜色谱法与亲和层析法等结合使用，以尿激酶粗品为原料制备尿激酶，所得到的尿激酶质量优于现有国内水平，尿激酶比活可达到150,000IU/mg·pr以上，高分子尿激酶相对含量可达到96％以上，尿激酶生物活性回收率可达到65％。本方法解决了现有尿激酶制备方法普遍存在的操作繁琐、产品质量差，收率低和生产成本高等问题。
具体实施方式
实施例1：
(1)取100g尿激酶粗品，用pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液400ml溶解，搅拌50分钟，离心，沉淀再用pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液400ml溶解，搅拌30分钟，离心，合并两次上清，得到820ml澄清溶液，取样检测，总生物效价0.042亿单位；
(2)将步骤(1)得到的820ml澄清溶液调节电导率，使其与D160阳离子树脂层析柱使用的平衡液电导率一致，再上用含0.15mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液平衡的D160阳离子树脂层析柱，然后用含0.15mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤；最后用pH10，1％氨水进行洗脱，收集得到190ml洗脱活性峰，总生物效价0.039亿单位；
(3)将步骤(2)收集得到的190ml洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和膜纯化柱，用含0.45mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.25mol/L氯化钠的pH3.5，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集得到90ml洗脱活性峰，总生物效价0.035亿单位；
(4)将步骤(3)收集得到的90ml洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和层析柱，用含1.0mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.35mol/L氯化钠的pH3.5，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰，过滤，得到85ml滤液，进行冷冻干燥，得到34.1mg尿激酶，总生物效价0.028亿单位，比活167000IU/mg.pr，高分子尿激酶相对含量97.0％，活性总回收率66.7％。
实施例2：
(1)取200g尿激酶粗品，用pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液1000ml溶解，搅拌60分钟，离心，沉淀再用pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液1000ml溶解，搅拌30分钟，过滤，合并两次上清，超滤浓缩，得到320ml浓缩液，取样检测，总生物效价0.080亿单位；
(2)将步骤(1)得到的320ml浓缩液调节电导率，使其与D160阳离子树脂层析柱使用的平衡液电导率一致，再上用含0.20mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液平衡的D160阳离子树脂层析柱，然后用含0.20mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤；最后用pH10，2％氨水进行洗脱，收集得到260ml洗脱活性峰，总生物效价0.074亿单位；
(3)将步骤(2)收集得到的260ml洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和膜纯化柱，用含0.50mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.30mol/L氯化钠的pH4.0，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集得到100ml洗脱活性峰，总生物效价0.068亿单位；
(4)将步骤(3)收集得到的100ml洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和层析柱，用含0.50mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.40mol/L氯化钠的pH4.0，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰，过滤，得到105ml滤液，进行冷冻干燥，得到62.8mg尿激酶，总生物效价0.054亿单位，比活176000IU/mg·pr，高分子尿激酶相对含量97.2％，活性总回收率67.5％。
实施例3
(1)取500g尿激酶粗品，用pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液2000ml溶解，搅拌60分钟，离心；沉淀用pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液2000ml溶解，搅拌50分钟，离心；第二次沉淀用pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液1500ml溶解，搅拌30分钟，离心；合并三次上清，超滤浓缩，得到400ml浓缩液，取样检测，总生物效价0.22亿单位；
(2)将步骤(1)得到的400ml浓缩液调节电导率，使其与D160阳离子树脂层析柱使用的平衡液电导率一致，再上用含0.30mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液平衡的D160阳离子树脂层析柱，然后用含0.30mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤；最后用pH10，3％氨水进行洗脱，收集得到450ml洗脱活性峰，总生物效价0.20亿单位；
(3)将步骤(2)收集得到的450ml洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和膜纯化柱，用含0.6mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.35mol/L氯化钠的pH4.5，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集得到120ml洗脱活性峰，总生物效价0.18亿单位；
(4)将步骤(3)收集得到的120ml洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和层析柱，用含2.0mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.45mol/L氯化钠的pH4.5，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰，过滤，得到110ml滤液，进行冷冻干燥，得到162.9mg尿激酶，总生物效价0.145亿单位，比活182000IU/mg·pr，高分子尿激酶相对含量98.0％，活性总回收率65.9％。
Claims (2)
1.一种制备尿激酶的方法，其特征在于该方法依次包括如下步骤：
(1)取一定量的尿激酶粗品，用8～10倍尿激酶粗品量的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液分2～3次加入溶解，每次搅拌溶解0.5～1.0小时，然后离心或过滤，合并上清或滤液，体积较大时进行超滤浓缩，得到的澄清溶液备用；
(2)将步骤(1)得到的澄清溶液调电导率，使其与D160阳离子树脂层析柱使用的平衡液电导率一致，再上用含0.15～0.30mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液平衡的D160阳离子树脂层析柱，然后用含0.15～0.30mol/L氯化钠的pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤；最后用pH10，1～3％氨水进行洗脱，收集洗脱活性峰；
(3)将步骤(2)收集得到的洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和膜纯化柱，用含0.45～0.60mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.25～0.35mol/L氯化钠的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；
(4)将步骤(3)收集得到的洗脱活性峰用醋酸调pH7.2，然后上亲和层析柱，用含1.0～2.0mol/L氯化钠的pH7.2，0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤，再用含0.35～0.45mol/L氯化钠的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰，过滤，最后进行冷冻干燥，得到尿激酶。
2.根据权利要求1所述的制备尿激酶的方法，其特征在于步骤(3)使用的亲和膜纯化介质是以聚砜为载体，对氨基苯甲脒为亲和配基，采用干喷-湿法纺丝制膜技术制备成的中空纤维亲和膜；步骤(4)使用的亲和层析介质是以琼脂糖为载体，对氨基苯甲脒亲和配基偶联制备的。
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