CN103614359B - 一种单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种修饰草酸脱羧酶的方法，属于生物化工技术领域，具体来讲涉及一种单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的方法，包括重组草酸脱羧酶的制备、单甲氧基聚乙二醇（mPEG）的活化、草酸脱羧酶的修饰等工艺。经修饰后，草酸脱羧酶的热稳定性、pH适应性、耐热性及对胰蛋白酶的耐受性都有所增强。解决了目前草酸脱羧酶使用中存在受胃酸，蛋白酶消化的影响，容易被消化而失去其活性的现实问题。可用于制备预防和治疗草酸盐结晶引起结石病的酶制剂。

Description

一种单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体来讲涉及一种单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的方法，包括重组草酸脱羧酶的制备、单甲氧基聚乙二醇（mPEG）的活化、草酸脱羧酶的修饰等工艺。
背景技术
草酸以草酸盐的形式广泛的分布在植物、微生物和人在内的生物体内。人体内没有降解草酸盐的相关酶，人们在食用某些高草酸含量的食物如菠菜，苋菜，草莓，橘子，李子，花生酱，高粱和茶叶等会容易造成草酸盐在人体内积累，从而引发如尿结石、肾结石、高草酸尿、低血钙症等多种病理状态。董婷婷等在2011年《中国微生态学》杂志的《利用乳酸菌降解草酸预防结石的研究进展》文中提出泌尿性系统结石病严重影响着人类的健康，根据地理环境的不同其发病率在3%～15%，而且还呈上升到趋势，结石病治疗后易复发，治愈后复发率高达60%～80%。FredricL.Coe等对部分病人的结石成分进行分析，发现难溶的草酸钙高达80%，可见草酸盐是导致结石症的重要原因。目前对高草酸盐水平引起结石症的治疗方法都不是非常理想，主要通过限制草酸的摄入量来预防结石，而且许多原发性的高草酸尿患者需要密集的透析和器官移植，这大大增加了患者的痛苦和经济压力，因此需要寻求一种安全的从体内去除草酸盐的方法。通过服用某种酶制剂降解摄入体内的草酸盐，是缓解泌尿性系统草酸盐结石病症，降低患者痛苦的有效方法。
草酸脱羧酶(EC4.1.1.2)催化转化草酸为甲酸和CO2，是生物体内催化降解草酸及草酸盐的主要催化酶之一，对底物草酸具有较强的专一性。草酸脱羧酶主要存在于木材腐败真菌中，如漆斑菌(MyrotheciumVerrucari)、金针菇(Flammulinavelutipes)、黑曲霉(Aspergillusniger)、双孢蘑菇（Agaricusbisporus）等，细菌中枯草杆菌(Bacillussubtilis)的草酸脱羧酶研究报道较多。草酸脱羧酶在医疗、食品、工业生产和生物监测等领域都有非常大的应用潜力。针对草酸盐结晶引起的结石症，目前已有一些使用草酸脱羧酶进行预防与治疗的研究报道。PatrickW.Mufarrij利用体外实验设置不同pH以模拟消化道环境，研究了草酸脱羧酶制剂Oxazyme对菠菜中草酸的降解能力。GrujicD等使用基因敲除小鼠为模型，通过口服交联草酸脱羧酶晶体(OxDc-CLEC)，使尿草酸及粪草酸分别降低44%和72%。研究表明，使用草酸脱羧酶可以有效的降解动物消化道中草酸，对防止了肾钙质沉着症及尿石症的发生具有良好效果。然而，酶作为一种蛋白质，也存在容易受环境因素作用而变性失活的问题。草酸脱羧酶用于消化道内草酸降解时，将经受胃酸，蛋白酶消化的影响，容易被消化而失去其活性。为了改善草酸脱羧酶的使用性能，对其进行化学修饰是一种有效手段。
发明内容
在上述背景下，本发明提供一种可以解决目前草酸脱羧酶使用中受胃酸，蛋白酶消化的影响，容易被消化而失去其活性的现实问题，具体提供了一种单甲氧基聚乙二醇修饰改善草酸脱羧酶性能的方法。经修饰后，草酸脱羧酶的热稳定性、pH适应性、耐热性及对胰蛋白酶的耐受性都有所增强。可用于制备预防和治疗草酸盐结晶引起结石病的酶制剂。
本发明采用如下技术制取本发明的技术方案：一种单甲氧基聚乙二醇修饰改善草酸脱羧酶性能的方法。包括重组草酸脱羧酶的制备，单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的制备两部分。工艺步骤如下：
（1）重组草酸脱羧酶的制备
将产草酸脱羧酶基因工程菌E．coliBL21(DE3)/pET32a/YvrK进行发酵培养。当细菌生长至OD600为0.8时，加入MnCl2及IPTG诱导草酸脱羧酶表达，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液重悬菌体后进行超声破碎细菌，离心收集上清为粗酶液。
使用AKTA-FPLC系统进行酶纯化。粗酶液过0.2μm孔径膜后上柱(5mLHisTraPHP离子交换色谱柱)，调节洗脱液中咪唑浓度进行洗脱，将草酸脱羧酶与其他杂质分离。分级分离酶液经超滤浓缩、脱盐，获得纯化的草酸脱羧酶。
（2）单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的制备
称取适量mPEG5000溶解于少量氯仿，按醋酸酐/mPEG一定摩尔比加入醋酸酐，并加入适量经干燥处理后的二甲基亚砜（DMSO），室温下搅拌反应3～12h后，将反应溶液逐滴加入4倍体积的冰乙醚，高速搅拌。过滤收集沉淀并用氯仿重溶，使用冰乙醚再次沉淀，重复2～3次,以去除产物mPEG醛中的杂质。将沉淀于室温真空干燥24h，去除残留有机溶剂和水分，即可获得活化的单甲氧基聚乙二醇（单甲氧基聚乙二醇-醛）。mPEG醛化率的测定根据Schiff试剂能与醛发生显色反应，在560nm处有特征光吸收，测定560nm处测定吸光度值，制得吸光度值与戊二醛浓度的标准曲线，根据标准曲线可计算得到产品的醛化率。
将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按10:1～150:1的摩尔比例置于4～45℃和pH4～9条件下搅拌反应2-24h，加入过量甘氨酸终止反应。将反应产物装入8000-14000的透析袋，先使用磷酸盐缓冲液透析除去甘氨酸、残余单甲氧基聚乙二醇等杂质，然后使用30%（w/v）的PEG20000溶液浓缩处理。
修饰率的测定：采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）法测定，根据TNBS与蛋白质分子上的游离氨基发生显色反应，在420nm处有特征光吸收。取1mL待测蛋白溶液（0-1mg/mL），加入1mL4%NaHCO3（pH8.5），1mL10%SDS,静置20min后添加1mL0.1%TNBS并将混合溶液置于40℃水浴2h。反应完成后取出反应液在420nm波长下测定吸收值，修饰前原酶蛋白的光吸收值记为A0，修饰酶的光吸收值记为A1，按下式计算修饰率：MR=1-（A1*C0）/（A0*C1）。其中C0、C1分别为修饰反应前后酶浓度及修饰反应后经透析浓缩所得酶的浓度。
草酸脱羧酶的活力检测：反应液含76mmol/L草酸钾，50mmol/LpH4.0柠檬酸缓冲液，37℃水浴2min，加入草酸脱羧酶液开始反应，10min后加入等体积的0.2mol/L磷酸氢二钾使体系pH上升至中性终止反应。终止反应液体系加入辅酶NAD+以及甲酸脱氢酶，分光光度法340nm检测分析甲酸脱羧酶催化反应速度，计算甲酸的生成量。酶活力单位定义为：每分钟催化转化草酸产生1μmol甲酸的酶量。
本发明的优点：
本发明采用活化mPEG5000-醛和Oxdc直接进行修饰反应，条件温和、操作简单、成本较低；经修饰后，草酸脱羧酶的热稳定性、耐热性、pH适应性及对胰蛋白酶的耐受性都有所增强。
附图说明
图1a为实施例1中草酸脱羧酶修饰前后的热稳定性，图中为将修饰酶与游离酶分别置于65℃水浴，每隔半小时测酶活所得结果。
图1b为实施例1中草酸脱羧酶修饰前后的耐热性，图中为分别在45、50、55、60、65、70、75℃条件下处理游离及修饰的草酸脱羧酶30min，检测残余酶活所得结果。
图2为实施例1中草酸脱羧酶修饰前后对胰蛋白酶的耐受性。
图3为实施例1中草酸脱羧酶修饰前后的pH适应性，图中为分别测定修饰前和修饰后的草酸脱羧酶在pH为2、2.5、3、3.5、4、5、6、7时柠檬酸缓冲溶液体系下的酶活所得结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些是实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
（1）草酸脱羧酶的制备
发酵培养基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a/YvrK，加入0.4mmol/LIPTG诱导表达草酸脱羧酶，收获菌体以50mmol/LpH8.0磷酸盐缓冲液提取获得粗酶液，使用快速蛋白液相色谱系统AKTA-FPLC进行酶纯化。
（2）mPEG的活化
称取mPEG1g溶解于1.5mL氯仿，按醋酸酐/mPEG摩尔比为20:1的比例加入醋酸酐，同时加入6mL经氢化钙干燥的DMSO，室温下搅拌反应9h后，将混合溶液逐滴加入4倍体积的冰浴乙醚，高速搅拌。沉淀用氯仿2mL溶解，再沉淀，重复3次，沉淀于室温真空干燥24h，保存待用。
（3）mPEG修饰草酸脱羧酶
将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按50:1的摩尔比例置于37℃、pH5.0条件下搅拌反应12h后加入20倍摩尔比于酶蛋白的甘氨酸终止反应。将反应液装入8000-14000的透析袋，PEG20000中透析12h。最后的溶液离心。
采用TNBS法测定修饰率为50.69%，酶活回收率为67.52%。
经修饰后，草酸脱羧酶的热稳定性、耐热性、对胰蛋白酶的耐受性及pH适应性都有所增强。
1、测定修饰酶和游离酶的热稳定性和耐热性：
a、将修饰酶与游离酶分别置于65℃水浴，每隔半小时测酶活结果结果如图1a。水浴3h后两种酶酶活损失都在80%以上，说明两种酶均不能长时间耐受高温，但是在2h内修饰酶酶活残留在50%以上，而游离酶酶活回收不足10%。
b、分别在45、50、55、60、65、70、75℃条件下处理游离及修饰的草酸脱羧酶30min，检测残余酶活，结果如图1b。在65℃时游离酶完全失活，而修饰酶仍残余15%以上的酶活。
综上，说明经mPEG修饰后的草酸脱羧酶热稳定性及耐热性均高于修饰前的草酸脱羧酶。
2、经胰蛋白酶处理24h后，如附图2所示，修饰的草酸脱羧酶残余酶活达47%，而游离草酸脱羧酶残余酶活低于20%。
3、在不同pH柠檬酸缓冲溶液体系下，分别测定修饰前和修饰后的草酸脱羧酶的酶活，结果如附图3所示，在pH2.0~pH7.0范围内修饰酶的相对酶活均高于游离酶，说明经mPEG修饰的草酸脱羧酶的耐酸性比修饰前略有增强。
实施例2
（1）草酸脱羧酶的制备
同实施例中（1）操作
（2）mPEG的活化
同实施例1中（2）操作。
（3）mPEG修饰草酸脱羧酶
将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按10:1～150:1的摩尔比例置于37℃、pH5.0条件下搅拌反应12h后加入20倍摩尔比于酶蛋白的甘氨酸终止反应。将反应液装入8000-14000的透析袋，PEG20000中透析12h。最后的溶液离心。采用TNBS法测定修饰率及酶活回收率如下表所示。
醛/酶（摩尔比） 10:1 20:1 30:1 40:1 50:1 100:1 150:1
修饰率（%） 7.54 11.96 18.17 25.30 39.12 25.13 10.25
酶活回收 97.67 94.57 87.60 83.72 78.29 40.31 12.40
当mPEG/酶摩尔比低于50:1时，修饰率随mPEG/酶摩尔比的增加而增加，酶活回收保留80%以上。但当mPEG/酶摩尔比到达50:1之后，修饰率及酶活回收都随之增加而显著降低。因此选择50:1的mpeg/酶摩尔比进行修饰反应较适宜。
实施例3
（1）草酸脱羧酶的制备
同实施例中（1）操作
（2）mPEG的活化
同实施例1中（2）操作。
（3）mPEG修饰草酸脱羧酶
将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按50:1的摩尔比例置于4～45℃、pH5.0条件下搅拌反应12h后加入20倍摩尔比于酶蛋白的甘氨酸终止反应。将反应液装入8000-14000的透析袋，PEG20000中透析12h。最后的溶液离心。采用TNBS法测定修饰率及酶活回收率如下表所示。
温度℃ 4 25 37 45
修饰率（%） 14.88 24.31 39.02 56.98
酶活回收 92.71 89.77 67.21 35.12
在不同温度中比较mPEG修饰草酸脱羧酶的效果，结果如上表。随着温度的升高，修饰率不同程度的提高，同时酶活回收也相应有部分损失。当温度到达45℃时，酶活损失将近60%，因此应当选择具有较高修饰率且酶活回收率相对较高的37℃进行修饰反应。
实施例4
（1）草酸脱羧酶的制备
同实施例中（1）操作
（2）mPEG的活化
同实施例1中（2）操作。
（3）mPEG修饰草酸脱羧酶
将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按50:1的摩尔比例置于37℃、pH4～9条件下搅拌反应12h后加入20倍摩尔比于酶蛋白的甘氨酸终止反应。将反应液装入8000-14000的透析袋，PEG20000中透析12h。最后的溶液离心。采用TNBS法测定修饰率及酶活回收率如下表所示。
pH 4 5 6 7 8 9
修饰率（%） 25.70 49.30 36.01 13.20 7.00 5.07
酶活回收 47.20 67.12 69.50 78.47 80.03 58.30
在磷酸盐缓冲液pH为5.0条件下获得最高酶修饰率为49.3%。在pH为8.0时虽然有较高酶活回收但修饰率却只有7%，因此选择相对较低酶活而高修饰率的pH5.0。
实施例5
（1）草酸脱羧酶的制备
同实施例中（1）操作
（2）mPEG的活化
同实施例1中（2）操作。
（3）mPEG修饰草酸脱羧酶
将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按50:1的摩尔比例置于37℃、pH5.0条件下搅拌反应2~24h后加入20倍摩尔比于酶蛋白的甘氨酸终止反应。将反应液装入8000-14000的透析袋，PEG20000中透析12h。最后的溶液离心。采用TNBS法测定修饰率及酶活回收率如下表所示。
时间（h） 2 4 6 8 12 24
修饰率（%） 7.56 9.11 15.70 18.80 27.33 42.95
酶活回收 92.87 92.56 84.94 82.91 61.47 27.52
在24h反应时间内，酶的修饰率随着修饰时间的增加而增加，但酶活回收率随之下降。可见，修饰反应过度反而会大幅度降低修饰酶酶活回收，因此确定12h为适宜的修饰反应时间。

Claims (1)

1.一种单甲氧基聚乙二醇修饰草酸脱羧酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）单甲氧基聚乙二醇（mPEG）的活化：称取适量mPEG5000溶解于少量氯仿，加入醋酸酐，并加入经干燥处理后的二甲基亚砜，室温下搅拌反应3～12h后，将反应溶液逐滴加入4倍体积的冰乙醚，高速搅拌，过滤收集沉淀并用氯仿重溶，使用冰乙醚再次沉淀，重复2～3次，将沉淀于室温真空干燥24h，即可获得活化的单甲氧基聚乙二醇,即mPEG-醛；
（2）修饰重组草酸脱羧酶：将mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按10:1～150:1的摩尔比置于4～45℃和pH4～9条件下搅拌反应2-24h，加入过量甘氨酸终止反应，将反应产物装入8000-14000的透析袋，先使用磷酸盐缓冲液透析除去甘氨酸、残余单甲氧基聚乙二醇等杂质，然后进行浓缩处理；
步骤（1）中加入的醋酸酐与mPEG摩尔比为10:1～30:1；
步骤（2）中使用磷酸盐缓冲液透析除去甘氨酸、残余单甲氧基聚乙二醇等杂质后用30%（w/v）的PEG20000溶液进行浓缩处理。
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