CN102146360A - 一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，包括如下步骤：(1)番薯清洁后取皮，加入pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，0-15℃均浆抽提，抽提后过滤，得滤液；(2)取滤液边搅拌边加入双水相萃取剂固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为20-30％，PEG6000的质量百分比浓度为6-8％，充分搅拌溶解后，0-15℃静置分层，取下层溶液即为粗酶液；(3)由步骤(2)得到的粗酶液直接经Phenyl Sepharose6 fast flow疏水层析，上样后用0-1mol/L的硫酸铵水溶液梯度洗脱，收集呈酶活性的洗脱液后冻干；(4)冻干粉经凝胶层析和离子层析得到所述的过氧化物酶。本发明更好地解决材料来源的问题并可以提高效率和酶活。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种过氧化物酶的制备技术，具体涉及提取番薯中过氧化物酶的方法。
(二)背景技术
过氧化物酶(Peroxidase，POD)在自然界中分布广泛，资源丰富，是临床检测和诊断的常用标记酶。过氧化物酶与各种抗体的标记物，结合酶联免疫分析技术(Enzyme-linked immunosorbent asssay，ELISA)作为常规手段可用于多种疾病的定位、定量检测，操作简便。
辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HR)是迄今为止在酶联免疫分析中应用最广泛的标记用酶，但是作为原料需要专门种植辣根，辣根作为非种植植物，原料来源受到限制，相对成本投资提高。
(三)发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一个从番薯皮中提取过氧化物酶的方法，更好地解决材料来源的问题和成本问题并可以获得高纯度高活性的过氧化物酶。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，包括如下步骤：
(1)番薯清洁后取皮，加入pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，0-15℃均浆抽提，抽提后过滤，得滤液；
(2)取滤液边搅拌边加入双水相萃取剂固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为20-30％，PEG6000的质量百分比浓度为6-8％，充分搅拌溶解后，0-15℃静置分层，取下层溶液即为粗酶液；冷冻干燥后可得到过氧化物酶粗品。
(3)由步骤(2)得到的粗酶液直接经Phenyl Sepharose6fast flow疏水层析，上样后用0-1mol/L的硫酸铵水溶液梯度洗脱，收集呈酶活性的洗脱液后冻干；
(4)步骤(3)所得冻干粉通过下列a或者b的方法处理，得到过氧化物酶制品；
a.冻干粉溶于生理盐水，经Sepharose CL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于pH 7.1-8.5的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品；
b.冻干粉溶解于pH 7.1-8.5的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶于生理盐水，经SepharoseCL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品。
本发明所述步骤(1)中，pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液的体积用量以番薯皮的质量计为5-10mL/g。优选磷酸盐缓冲液的pH为8.0。
本发明步骤(1)过滤所得滤液，优选进一步进行离心处理，以去除淀粉和小颗粒组织颗粒，取离心上清液进行步骤(2)的处理。所述离心处理优选在0-15℃进行。
本发明所述步骤(2)中，优选加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％。
本发明所述步骤(3)中，优选上样后依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸铵水溶液分步洗脱。
本发明所述步骤(4)中，所述离子层析中，优选控制Tris-HCl缓冲液的pH为8.3。
进一步，本发明具体推荐所述的方法按照如下步骤进行：
(1)取番薯，清洗，收集番薯皮，先加pH 8.0磷酸盐缓冲液绞碎，绞碎过程中保持温度在4℃，然后搅拌均匀后，于4℃浸提，充分浸提后过滤收集滤液，残渣重复提取，合并滤液；滤液于4℃离心去除淀粉和小颗粒组织颗粒，收集上清液；所述pH 8.0的磷酸盐缓冲液的体积用量以番薯皮的质量计为5-10mL/g；
(2)取步骤(1)所得上清液，边搅拌边加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％，1h内加完，然后静置，静置过程中保持温度在4℃，静置分层后取下层溶液，即为粗酶液；
(3)粗酶液经Phenyl Sepharose6fast flow疏水层析，依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸铵水溶液分步洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；
(4)步骤(3)所得冻干粉通过下列a或者b的方法处理，得到过氧化物酶制品；
a.冻干粉经Sepharose CL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于pH 8.3的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品；
b.冻干粉溶解于pH 8.3的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉经Sepharose CL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品。
本发明所述的疏水层析、凝胶层析以及离子层析均采用常规操作。
通过上述步骤制备的番薯过氧化物酶，经产品的纯度检验、分子量的测定等实验检验，具有纯度高、活性高的特点。
本发明的原材料是常见的本地番薯，原料来源广泛而廉价，生产过程中的肥料、残渣等可以作为肥料还田。
本方法使用双水相萃取结合几种层析分离的技术，可以降低成本，关键是保证过氧化物酶的高活性，收率高。双水相萃取后直接过疏水柱省除了除盐的步骤，减少了中间过程，节约了成本，保持了酶的高活性，提高了效率。凝胶层析和离子层析步骤可以互换顺序，并没有增加中间步骤，对整体实验和结果影响不大。疏水柱、凝胶柱和离子交换柱可多次使用，也能有效地降低了样品的制备成本，适于工业扩大生产。而且，层析技术可以选取适于酶活性稳定的缓冲液作为洗脱缓冲液，对于酶的活性保持有很好的作用。
所以，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：操作步骤对酶活性具稳定作用，因此减少了制备过程中的活性下降，可以得到纯度和活性都高的目的化合物；原料来源广泛且廉价，双水相试剂可以回收再使用，层析用填料可以重复使用，降低了成本；容易工业放大。
(四)附图说明
图1为实施例1中纯化番薯过氧化物酶的SDS-PAGE图，条带1为分子量标准物，条带2为番薯过氧化物酶。
图2为实施例1中纯化番薯过氧化物酶的Sephacryl S-200凝胶层析图。
(五)具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
(1)番薯过氧化物酶的制备和纯化
取番薯，清洗，收集番薯皮500g，先加0.5L的10mM、pH 8.0磷酸盐缓冲液绞碎，绞碎过程中保持温度在4℃，然后加入2L的10mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，置于4℃冰箱，浸提过夜。过滤收集滤液，残渣重复提取一次，合并滤液。滤液于4℃、5000rpm离心30min，去除淀粉和小颗粒组织颗粒，收集上清，边搅拌边加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％，约1h内加完，转入分液漏斗中静置，保持温度在4℃，静置分层后上相液主要是色素，下层溶液为粗酶液。粗酶液经Phenyl Sepharose6fast flow(GE Healthcare)疏水层析，分别用1.0M、0.5M、0M的硫酸铵分步洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉经Sepharose CL-6B(GE Healthcare)凝胶层析，用生理盐水洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于Tris-HCl，pH 8.3缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M(H&E Co.，Ltd)离子层析，0-1M氯化钠线性洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为纯酶制品。
(2)番薯过氧化物酶产品的检验
1.纯度检验
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定酶的纯度。垂直板电泳：12％分离胶，5％的浓缩胶，SDS-不连续系统，电泳条件：恒流，开始10mA，进入分离胶，改为30mA，电泳约3h。考马斯亮兰R250染色。电泳图谱如图一。显示一条蛋白带。
2.分子量的测定
垂直板电泳：12％分离胶，5％的浓缩胶，SDS-不连续系统，电泳条件：恒流，开始10mA，进入分离胶，改为30mA，电泳约3h考马斯亮兰R250染色。电泳图谱如图一。显示一条蛋白带。分子量约为34000。
用Sephacryl S-200凝胶过滤，生理盐水洗脱，自动部分收集器收集。从标准蛋白质分子量曲线求得的酶分子量，见图2。根据酶蛋白从Sephacryl S-200的洗脱体积求得酶蛋白的分子量为34000。
3.番薯过氧化物酶活力的测定
以愈创木酚为底物，每个酶活单位定义是25℃下1min催化1μmol/L愈创木酚转化。反应体系为：2.0mL的0.05mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液中含45mmol/L愈创木酚和5mmol/L过氧化氢，50μL酶液，25℃下检测470nm处的吸光度变化(ΔA470/min)。结果表明，此法获得的酶RZ＞2.5，其比活力为2650U/mg。
实施例2
(1)番薯过氧化物酶的制备和纯化
取番薯，清洗，收集番薯皮500g，先加0.5L的10mM pH 8.0磷酸盐缓冲液绞碎，绞碎过程中保持温度在4℃，然后加入2L的10mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，置于4℃冰箱，浸提过夜。过滤收集滤液，残渣重复提取两次，合并滤液。滤液于4℃、5000rpm离心30min，去除淀粉和小颗粒组织颗粒，收集上清，边搅拌边加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％，约1h内加完，转入分液漏斗中静置，保持温度在4℃，静置分层后上相液主要是色素，下层溶液为粗酶液。粗酶液经PhenylSepharose6fast flow(GE Healthcare)疏水层析，流出液反复上样3次后分别用1.0M、0.5M、0M的硫酸铵分步洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于Tris-HCl，pH 8.3缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M(H&ECo.，Ltd)离子层析，0-1M氯化钠线性洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉经Sepharose CL-6B(GEHealthcare)凝胶层析，用生理盐水洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为纯酶制品。
(2)番薯过氧化物酶产品的检验
检测方法同实施例1，结果表明，此法获得的酶分子量为34000，RZ＞2.5，其比活力为2530U/mg。
对比实施例
(1)番薯过氧化物酶的制备和纯化
取番薯，清洗，收集番薯皮500g，先加0.5L的10mM pH 8.0磷酸盐缓冲液常温绞碎，然后加入2L的10mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，常温浸提过夜。过滤收集滤液，残渣重复提取一次，合并滤液。滤液5000rpm离心30min，去除淀粉和小颗粒组织颗粒，收集上清，边搅拌边加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为20％，PEG6000的质量百分比浓度为6％，约1h内加完，转入分液漏斗中静置，静置分层后上相液主要是色素，下层溶液为粗酶液。粗酶液透析后冻干。冻干粉用pH 8.3Tris-HCl缓冲液溶解，对pH 8.3Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M(H&E Co.，Ltd)离子层析，0-1M氯化钠线性洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉经Sepharose CL-6B(GE Healthcare)凝胶层析，用生理盐水洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干。冻干粉经Phenyl Sepharose6fast flow(GEHealthcare)疏水层析，分别用1.0M、0.5M、0M的硫酸铵分步洗脱，自动部分收集器收集，检测每个收集管中的酶活，收集呈酶活性的洗脱液，冻干即为纯酶制品。
(2)番薯过氧化物酶产品的检验
检测方法同实施例1，结果表明，此法获得的酶分子量为34000，RZ＞2.0，其比活力为1610U/mg。
Claims (8)
1.一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，包括如下步骤：
(1)番薯清洁后取皮，加入pH 7.0-8.0磷酸盐缓冲液，0-15℃均浆抽提，抽提后过滤，得滤液；
(2)取滤液边搅拌边加入双水相萃取剂固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为20-30％，PEG6000的质量百分比浓度为6-8％，充分搅拌溶解后，0-15℃静置分层，取下层溶液即为粗酶液；
(3)由步骤(2)得到的粗酶液直接经Phenyl Sepharose6fast flow疏水层析，上样后用0-1mol/L的硫酸铵水溶液梯度洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；
(4)步骤(3)所得冻干粉通过下列a或者b的方法处理，得到过氧化物酶制品；
a.冻干粉溶于生理盐水，经Sepharose CL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于pH 7.1-8.5的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品；
b.冻干粉溶解于pH 7.1-8.5的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶于生理盐水，经SepharoseCL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品。
2.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中，pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液的体积用量以番薯皮的质量计为5-10∶1。
3.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中，使用的磷酸盐缓冲液的pH为8.0。
4.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所得滤液进行离心处理，取离心上清液进行步骤(2)的处理，所述离心处理在0-15℃进行。
5.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中，加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％。
6.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(3)中，上样后依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸铵水溶液分步洗脱。
7.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(4)中，所述离子层析中使用的Tris-HCl缓冲液的pH为8.3。
8.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述的方法具体按照如下步骤进行：
(1)取番薯，清洗，收集番薯皮，先加pH 8.0磷酸盐缓冲液绞碎，绞碎过程中保持温度在4℃，然后搅拌均匀后，于4℃浸提，充分浸提后过滤收集滤液，残渣重复提取，合并滤液；滤液于4℃离心去除淀粉和小颗粒组织颗粒，收集上清液；所述pH 8.0的磷酸盐缓冲液的体积用量以番薯皮的质量计为5-10mL/g；
(2)取步骤(1)所得上清液，边搅拌边加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％，1h内加完，然后静置，静置过程中保持温度在4℃，静置分层后取下层溶液，即为粗酶液；
(3)粗酶液经Phenyl Sepharose6fast flow疏水层析，依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸铵分步洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；
(4)步骤(3)所得冻干粉通过下列a或者b的方法处理，得到过氧化物酶制品；
a.冻干粉溶于生理盐水，经Sepharose CL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于pH 8.3的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品；
b.冻干粉溶解于pH 8.3的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶于生理盐水，经SepharoseCL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品。
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