CN111139227A - 一种过氧化物酶的提取与纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及过氧化物酶提取与纯化技术领域，尤其涉及一种过氧化物酶的提取与纯化方法。本发明公开了一种过氧化物酶的提取与纯化方法，本发明首次以五爪金龙为提取过氧化物酶的原料，经提取与浓缩，再用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法提纯得到RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0不同等级的过氧化物酶的溶液，检测RZ值及活力合格后冷冻干燥得到RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0不同等级的过氧化物酶冻干粉。本发明的过氧化物酶活力高，且较市场上的辣根过氧化物酶的热稳定性和pH稳定性好。

Description

一种过氧化物酶的提取与纯化方法

技术领域

本发明涉及过氧化物酶提取与纯化技术领域，尤其涉及一种过氧化物酶的提取与纯化方法。

背景技术

过氧化物酶(Peroxidase，简称POD)目前主要用于临床诊断试剂、酶联免疫诊断试剂的生产及生化实验等，目前生产上主要是从辣根中提取。

五爪金龙(学名：Ipomoea cairica(L.)Sweet)在自然界分布广泛，取材容易，而且该物种是外来入侵有害物种，蔓生，常常攀附并覆盖于其它植物体上，生长特别旺盛，影响、危害甚至破坏被攀附植物体的正常生长发育，破坏生态环境和危害其它作物生长。清除五爪金龙并用来提取过氧化物酶有利于生态保护，利于环保，利于农林业生产，产生良好的生态效益和经济效益，化害为宝，一举两得。目前还未有从五爪金龙中提取过氧化物酶的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种过氧化物酶的提取与纯化方法，本发明首次以五爪金龙为提取过氧化物酶的原料，提取、纯化得到的过氧化物酶的活力高，且热稳定性和pH稳定性好。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种过氧化物酶的提取与纯化方法，包括以下步骤：

将五爪金龙破碎后，加入提取液进行提取后进行超滤浓缩，得到待纯化的浓缩液后采用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法进行提纯，进行第一离心，取沉淀物溶于水并除去残留的所述有机溶剂或/和无机盐和不溶物后得到RZ<1.0的过氧化物酶溶液。

本发明中，所述五爪金龙为五爪金龙的任意部分或任意部分的组合，包括但不限于五爪金龙的全株或根、茎、干、枝、茎枝、蔓、叶、花、果和种子中的一种或多种，优选为新鲜的。

本发明五爪金龙破碎前，还包括：五爪金龙的前处理；所述前处理具体为：将采集的新鲜五爪金龙植物体剔除杂质和枯枝；

所述破碎优选在自然空气或水中切割、压榨或碾磨，更优选在自然空气或水中进行切割成2cm以下的碎片；

所述提取液的溶质包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、锌盐和镁盐中的一种或多种，优选为NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂、K₂SO₄、MgSO₄、ZnSO₄、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、Ca(NO₃)₂和Mg(NO₃)₂中的一种或多种；

所述提取液的质量浓度为0～10％，优选为0.5～5％；

所述提取具体为：采用1000～2000rpm打浆提取1min～30min，优选3～10min后进行离心；所述离心优选采用三足离心机套布袋离心，进行液渣分离后，收集滤液，得到的滤渣重复所述提取的操作1～2次，合并滤液；所述打浆为水中切割、压榨或碾磨，优选水中切割。

将所述滤液进行离心，除去悬浮状的杂质后，得到澄清液；所述离心使用的离心机优选为管式离心机。

将所述澄清液进行超滤浓缩；所述超滤浓缩具体为：将所述澄清液采用分子量为1000～40000，优选为3000～30000的中空纤维超滤柱进行超滤浓缩并除掉其中的色素、各种无机盐及小分子杂质，得到浓缩液。所述五爪金龙原料与所述浓缩液的质量体积比为1kg：(3～100)ml，优选为1kg：(10～80)ml。

本发明进行所述提纯前，还包括：将所述浓缩液优选采用高速冷冻离心机进行离心，除去浓缩液中的的悬浮物，得到待纯化的浓缩液；所述离心的速率为1000～20000rpm，时间为5～80min，优选为2000～10000rpm，时间为15～45min，更优选为3000～5000rpm，时间为20～35分钟；

所述提纯具体为：采用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法，优选采用有机溶剂沉淀分离法进行提纯，即向除去悬浮物的所述待纯化的浓缩液中首次加入所述有机溶剂后进行离心，取上清再次加入所述有机溶剂后进行第一离心；

本发明所述提纯中，所述除去悬浮物的浓缩液优选冷却至0～10℃，更优选冷却至2～5℃，然后加入所述有机溶剂进行离心；所述有机溶剂为乙醇、丙酮、甲醇和异丙酮中的一种或多种，优选为乙醇或丙酮；所述有机溶剂的温度为0～-20℃，优选为-10～-18℃；所述待纯化的浓缩液与首次加入的所述有机溶剂体积比优选为1：(0.5～1.5)，更优选为1：(0.9～1.1)；所述待纯化的浓缩液与再次加入的所述有机溶剂体积比为1：(0.8～1.5)；

所述离心后取上清液，再次加入所述有机溶剂，优选进行静置分层，取下层沉降物进行第一离心；

接着，将第一离心得到的沉淀物溶于水，进行离心，除去不溶物，取上清采用透析法或超滤法除去所述上清液中的残留的有机溶剂并浓缩，得到浓缩液再离心除去不溶物，得到RZ<1.0的过氧化物酶溶液，检测RZ值及活力合格后冷冻干燥可以制备得到RZ<1.0的棕红色过氧化物酶冻干粉。

所述第一离心得到的沉淀物与所述水的质量体积比为1g:(1～15)ml，优选为1g:(1.5～5.0)ml；所述第一离心得到的沉淀物质量与所述浓缩液最终体积比为1g：(1～3)ml。

本发明中，RZ为1.0～2.0的过氧化物酶的所述提取与纯化具体包括以下步骤：

将所述第一离心后得到的沉淀物溶于水或者将制备得到的所述RZ<1.0的过氧化物酶溶液加水稀释得到待纯化的过氧化物酶溶液，上述任意一种方法均可，本发明不做具体限定。上述两种方法加水后的溶液总体积均按所述第一离心得到的所述沉淀物湿重与所述待纯化的过氧化物酶溶液总体积比为1g︰(1～15)ml计算；

然后采用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法进行离心来分离提纯。需要说明的是，本发明中，所述有机溶剂沉淀分离法分两次加入有机溶剂，第一次加入有机溶剂后离心得到的沉淀物主要是杂质，要弃除，第二次加入有机溶剂后离心得到的沉淀物是经过纯化的过氧化物酶；所述无机盐沉淀分离法也分两次加入无机盐，第一次加入无机盐后离心的沉淀物主要是杂质，要弃除，第二次加入无机盐离心得到的沉淀物是经过纯化的过氧化物酶。所述RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0各等级的过氧化物酶的提纯过程均遵循这一原则，后续不再赘述。当采用无机盐沉淀分离法时，所述第一次加入的无机盐和所述第二次加入的无机盐均选自(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、MgSO₄和Na₂HPO₄中的一种或多种，优选为(NH₄)₂SO₄，所述无机盐为粉末状或晶体状，优选为粉末状；所述待纯化的过氧化物酶溶液与所述第一次加入的无机盐的体积质量比优选为1升：(180～230)克；所述待纯化的过氧化物酶溶液与所述第二次加入的无机盐的体积质量比优选为1升：(200～250)克；

所述第二次加入无机盐后静置分层，取下沉部分进行第二离心，取沉淀物溶于水；所述第二离心得到的沉淀物与所述水的质量体积比为1g︰(1～15)ml；

需要说明的是，本发明发现，若在制备RZ为1.0～2.0的过氧化物酶的过程中采用了无机盐沉淀分离法，则在制备RZ为2.0～3.0的过氧化物酶的过程中需预先将第二离心后得到的沉淀物中残留的无机盐除去后再采用有机溶剂沉淀分离法或无机盐沉淀分离法进行分离；若在制备RZ为1.0～2.0的过氧化物酶的过程中采用了有机溶剂沉淀分离法，则在制备RZ为2.0～3.0的过氧化物酶的过程中可以不用预先除去残留的有机溶剂即可直接采用有机溶剂沉淀分离法或无机盐沉淀分离法进行分离。制备其它等级RZ值的过氧化物酶过程中也遵循上述原理，本发明不再赘述。

因此，所述第二离心得到的沉淀物溶于水并离心去除不溶物后，采用透析法或超滤法去除所述无机盐，并优选采用5％氯化钡检查去除程度；

去除所有所述无机盐之后进行浓缩，浓缩液还需再次离心，去除不溶物，取上清得到RZ为1.0～2.0的过氧化物酶溶液；所述第二离心得到的沉淀物克数与所述浓缩液最终体积比为1g：(0.6～3)ml。

本发明中，经检测RZ值及活力合格后将所述RZ为1.0～2.0的过氧化物酶溶液冻干成RZ为1.0～2.0棕红色的过氧化物酶冻干粉。

本发明中，RZ为2.0～3.0的过氧化物酶的提取与纯化具体包括以下步骤：

将所述第二离心后得到的沉淀物溶于水或制备得到的所述RZ为1.0～2.0的过氧化物酶溶液加水稀释得到待纯化的过氧化物酶溶液。上述两种方法均可，本发明不做具体限定，但若所述沉淀物中含有无机盐，则必须用超滤法或透析法先除去这些残留的所述无机盐后再进行下一步提纯操作。上述两种方法加水后的溶液总体积均按所述第二离心得到的沉淀物湿重与所述待纯化的过氧化物酶溶液总体积比为1g︰(1～15)ml计算加水量。

接着采用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法进行提纯。本发明优选采用有机溶剂沉淀分离法进行提纯。

所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、甲醇或异丙酮，优选为乙醇或丙酮；所述待纯化的过氧化物酶溶液与第一次加入的所述有机溶剂的体积比优选为1：(1.0～1.5)；所述待纯化的过氧化物酶溶液与第二次加入的所述有机溶剂的体积比优选为1：(0.9～1.5)；所述第二次加入所述有机溶剂后，静置分层取下沉部分进行第三离心。

接着，所述第三离心后取沉淀物溶于水并离心，取上清液用透析法或超滤法除去残留的所述有机溶剂；所述第三离心得到的沉淀物与所述水的质量体积比为1g︰(1～15)ml；

所述除去有机溶剂后，还包括：进行浓缩，浓缩液离心除去不溶物，取上清得到RZ为2.0～3.0的过氧化物酶溶液；所述第三离心得到的沉淀物质量与所述浓缩液最终体积比为1g：(1～3)ml。

本发明中，经检测RZ值及活力合格后将所述RZ为2.0～3.0的过氧化物酶溶液直接冻干成RZ为2.0～3.0棕红色的过氧化物酶冻干粉。

本发明中，RZ≥3.0的过氧化物酶的提取与纯化具体包括以下步骤：

将所述第三离心后得到的沉淀物溶于水或制备得到的所述RZ为2.0～3.0的过氧化物酶溶液用水稀释得到待纯化的过氧化物酶溶液，采用任意一种方法均可，本发明不做具体限定，但若所述沉淀物中含有无机盐，则必须用超滤法或透析法先除去这些残留的所述无机盐后再进行下一步的提纯操作。上述两种方法加水后的溶液总体积均按所述第三离心后得到的沉淀物湿重与所述待纯化的过氧化物酶溶液总体积比为1g︰(1～15)ml计算加水量；

接着加入锌盐和有机溶剂后进行第四离心。所述锌盐优选为硫酸锌或乙酸锌；所述锌盐的浓度为1M；加入所述锌盐后所得到的酶溶液中锌离子的浓度约为0.005M；所述有机溶剂为乙醇、丙酮、甲醇或异丙酮，优选为乙醇或丙酮；所述有机溶剂的温度为0～-20℃，优选为-10～-18℃；进行所述第四离心前加所述有机溶剂，所述待纯化的过氧化物酶溶液与所述有机溶剂的体积比优选为1：(1.1～1.5)。

接着，所述第四离心并取上清液后加入所述有机溶剂静置分层，取下层沉降物进行第五离心；所述有机溶剂为乙醇、丙酮、甲醇或异丙酮，优选为乙醇或丙酮；进行所述第五离心前加所述有机溶剂，按所述待纯化的过氧化物酶溶液与所述有机溶剂的体积比优选为1：(0.8～1.5)计算所述有机溶剂加于所述上清液；

所述静置分层后取下层沉淀进行第五离心得到沉淀物，取沉淀物溶于水，采用透析法或超滤法除去残留的所述有机溶剂和所述无机盐后进行浓缩，浓缩液进行第六离心，去除不溶物后，取上清液得到RZ≥3.0的过氧化物酶溶液；所述第五离心得到的沉淀物与所述水的质量体积比为1g︰(1～15)ml；所述第五离心得到的沉淀物克数与所述浓缩液最终体积比为1g：(1～3)ml。

本发明中，经检测RZ值及活力合格后将所述RZ为≥3.0的过氧化物酶溶液直接冻干成RZ为≥3.0棕红色的过氧化物酶冻干粉。

本发明RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0各等级的过氧化物酶的提取与纯化过程中，环境温度为-1～40℃，优选0～25℃。

本发明RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0各等级的过氧化物酶的纯化过程中，无特别说明，所述离心均指高速冷冻离心，所述离心的速率为1000～20000rpm，时间为5～80min，优选为3000～8000rpm，时间为20～35min；

本发明RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0各等级的过氧化物酶的纯化过程中，所述静置分层的时间为5～10小时，温度为0～10℃，优选为时间为5～6小时，温度为2～6℃；

本发明RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0各等级的过氧化物酶的纯化过程中，当采用有机溶剂沉淀分离法进行纯化时，优选将所述待纯化的浓缩液或所述待纯化的过氧化物酶溶液预先冷却至0～10℃，更优选为预先冷却至2～5℃；

本发明RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0各等级的过氧化物酶的纯化过程中，所述有机溶剂的温度为0～-20℃，优选为-10～-18℃；

本发明RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0各等级的过氧化物酶的纯化过程中，有机溶剂沉淀分离法与无机盐沉淀分离法可根据具体情况调整使用顺序及使用次数：例如在制备RZ<1.0产品时也可用所述无机盐分离法，在制备RZ为1.0～2.0产品时也可用两次有机溶剂沉淀分离法，而在制备RZ为2.0～3.0产品时也可先用两次有机溶剂沉淀分离法，最后一次用无机盐沉淀分离法；若某等级产品的RZ值及活力达不到要求，可在所述的技术范围内重复或更改上述分离方法组合后重做相应的分离提纯步骤，直到合格为止，此处不做具体限定。本发明中，无论是所述有机溶剂沉淀分离法还是所述无机盐沉淀分离法，在进行分离纯化前均要预先将待处理对象中的不溶物及悬浮物离心除去后才进行下一步操作。

本发明中RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0的过氧化物酶的纯化过程中，静置分层处理弃上清的步骤可视溶液体积而定，体积小时可省略此步骤，直接进行下一步的离心。

本发明中，打浆提取时可选用自来水、井水或去离子水配制提取液，其它步骤使用的水均优选为去离子水。

本发明中，除另有说明的外，纯化分离离心均为高速冷冻离心，高速冷冻离心的温度为为-10～10℃，优选为0～5℃，所使用的设备均为冷冻离心机。

本发明中，各等级过氧化物酶溶液制备步骤中最后一次高速冷冻离心前，可结合去除有机溶剂和/或无机盐进行适当的所述浓缩。

本发明中，在RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0的过氧化物酶的提取与纯化过程中第一次冷冻离心沉淀物中若残留较多的过氧化物酶，可重复处理回收，以提高产品得率。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种过氧化物酶的提取与纯化方法，本发明首次以五爪金龙为提取过氧化物酶的原料，经提取与浓缩，再用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法纯化得到RZ<1.0、1.0～2.0、2.0～3.0、≥3.0不同等级的过氧化物酶溶液。本发明的过氧化物酶活力高，且较市场上的辣根过氧化物酶的热稳定性和pH稳定性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例制备得到的过氧化物酶冻干粉与市场上的辣根过氧化物酶冻干粉的热稳定性比较图；

图2为本发明实施例制备得到的过氧化物酶冻干粉与市场上的辣根过氧化物酶冻干粉的pH稳定性比较图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例为RZ<1.0过氧化物酶冻干粉的制备

⑴过氧化物酶提取液的制备：将采集的新鲜五爪金龙植物体全株剔除杂质、枯枝等后，称取100kg，用切碎机切成长度2cm以下的碎片，分5批打浆，每次20kg植物材料加入1.5％氯化钠提取液60kg于1000～2000rpm打浆机中打5分钟，用三足离心机套布袋离心，进行液渣分离，收集滤液，滤渣重复一次上述提取操作，合并滤液，弃其滤渣。全部5批打浆提取共得约600升提取液。

⑵超滤浓缩：用管式离心机除去步骤(1)提取液中的悬浮物，得澄清的提取液，用10000分子量的超滤浓缩分离膜浓缩至6升左右时往浓缩液中持续加入纯水，加入纯水的速度与超滤液流出的速度基本一致，直至将浓缩液中的无机盐离子、小分子色素等杂质除净，放出浓缩液，用纯水冲洗超滤柱2次，每次用纯水约500ml，将洗液与浓缩液合并，得约7升浓缩液。

(3)提纯：浓缩液用高速冷冻离心机3500rpm离心30分钟，弃其不溶物，取其上清液定容至7升，于冰箱冷藏层预冷至4℃左右，加入冰冻(约-15℃)无水乙醇7升，轻轻搅匀，用高速冷冻离心机进行离心(3500rpm，30分钟)，弃其沉淀物，取其上清液再加入7.7升冰冻(约-15℃)无水乙醇，搅匀，于冰箱冷藏层(4℃)静置6小时，分层后吸除上清液，下层沉降物用高速冷冻离心机进行第一离心(3500rpm，30分钟)，弃其上清液，沉淀物称重得约50克，用100ml纯水溶解该沉淀物后，再用高速冷冻离心机离心(7000rpm离心30分钟)，弃其不溶物，上清液用超滤法除去其中残留的乙醇并浓缩至约60ml，高速冷冻离心机离心(7000rpm离心30分钟)，去除不溶物，得到过氧化物酶溶液，检测RZ值为0.78，冷冻干燥得棕红色过氧化物酶冻干粉4.8克。

实施例2

本实施例为RZ为1.0～2.0过氧化物酶冻干粉的制备

将采集的新鲜的五爪金龙植株的根、蔓等剔除杂质、枯枝等后，称取100kg，用切碎机切碎，以1.5％氯化钙为提取液，按实施例1的制备方法得到RZ<1.0过氧化物酶溶液，然后将该过氧化物酶溶液用水稀释至600ml(按实施例1方法第一离心后得到的沉淀物湿重81.5克计算加水后的溶液总体积)，加入126克硫酸铵粉(化学纯)，轻轻搅拌至完全溶解后用高速冷冻离心机离心(3500rpm，30分钟)，取其上清液，再加入132克硫酸铵粉(化学纯)，轻轻搅拌至完全溶解后于冰箱冷藏层(4℃)静置分层6小时，分层后吸除上清，下层沉降物用高速冷冻离心机进行第二离心(3500rpm，30分钟)，去其上清液，沉淀物称重得75克，用100ml去离子水溶解该沉淀物后，再用高速冷冻离心机离心(7000rpm，30分钟)，弃其不溶物，上清液通过超滤除去硫酸铵(用5％氯化钡检查去除程度)并浓缩至约50ml，高速冷冻离心机7000rpm离心30分钟，去其不溶物，得到过氧化物酶溶液，检测RZ为1.60，冷冻干燥，得棕红色过氧化物酶冻干粉3.1克。

实施例3

本实施例为RZ为2.0～3.0过氧化物酶冻干粉的制备

将采集的新鲜的五爪金龙植株的根、蔓等剔除杂质、枯枝等后，称取200kg，用切碎机切碎，以1.5％氯化钙为提取液，按实施例1的制备方法得到RZ<1.0过氧化物酶溶液，按实施例2的制备方法得到RZ为1.0～2.0过氧化物酶溶液。

将RZ为1.0～2.0过氧化物酶溶液用超滤法除去无机盐后加水稀释至600ml(按实施例2方法第二离心所得沉淀物湿重130克计算加水后的溶液总体积)，置于冰箱冷却至4℃后加入660ml冰冻(约-15℃)无水乙醇，轻轻搅匀后用高速冷冻离心机离心(3500rpm，30分钟)，取其上清液，再加入600ml冰冻(约-15℃)无水乙醇，轻轻搅匀后于冰箱冷藏层(4℃)静置分层6小时，分层后吸除上清，下层沉降物用高速冷冻离心机进行第三离心(3500rpm，30分钟)，去其上清液，取其沉淀物称重得35.5克，用50ml去离子水溶解该沉淀物后，再用高速冷冻离心机离心(7000rpm，30分钟)，弃其不溶物，上清液通过超滤除去残留的乙醇并浓缩至约40ml，高速冷冻离心机7000rpm离心30分钟，去其不溶物，得到过氧化物酶溶液，检测RZ值为2.62，冷冻干燥得棕红色过氧化物酶冻干粉3.6克。

实施例4

本实施例为RZ≥3.0过氧化物酶冻干粉的制备

将采集的新鲜的五爪金龙植株的根、蔓等剔除杂质、枯枝等后，称取300kg，用切碎机切碎，以1.5％氯化钙为提取液，按实施例1的制备方法得到RZ<1.0过氧化物酶溶液，按实施例2的制备方法得到RZ为1.0～2.0过氧化物酶溶液，按照实施例3的制备方法得到RZ为2.0～3.0过氧化物酶溶液，将RZ为2.0～3.0过氧化物酶溶液加水稀释至500ml(按实施例3方法第三离心所得沉淀物湿重60.5克计算加水后的溶液总体积)，置于冰箱冷却至4℃后加入1M硫酸锌2.5ml，冰冻(约-15℃)无水乙醇625ml(1.25倍)，轻轻搅匀后用高速冷冻离心机进行第四离心(3500rpm，30分钟)，取上清液，再加入450ml冰冻(约-15℃)无水乙醇，轻轻搅匀后于冰箱冷藏层(4℃)静置分层6小时，分层后吸除上清，下层沉降物用高速冷冻离心机进行第五离心(3500rpm离心30分钟)，去其上清液，取其沉淀物称重得约10.5克，用30ml去离子水溶解该沉淀物后，通过透析除去残留的乙醇、Zn²⁺、SO₄ ^2-等并浓缩至约20ml，高速冷冻离心机进行第六离心(7000rpm，30分钟)，去其不溶物，得到过氧化物酶溶液，检测RZ值为3.14，冷冻干燥后得棕红色过氧化物酶冻干粉1.2克。

实施例5

对实施例1～4制备得到的过氧化物酶RZ值的测定

RZ值表示过氧化物酶的纯度，403nm是血红素辅基的吸收峰，275nm是蛋白质的吸收峰，将过氧化物酶冻干粉配成1mg/ml的溶液，或将浓缩液稀释至大约1mg/ml的浓度，用紫外分光光度计测定其A403及A275值,RZ＝A403/A275。

表1实施例1～4制备得到的过氧化物酶RZ值测定结果

实施例6

本实施例对1～4制备得到的过氧化物酶活力测定

1、活性定义：一个过氧化物酶单位相当于在规定条件下，每分钟分解1μmol过氧化氢所需的酶量。

2、原理：过氧化物酶催化过氧化氢的还原反应。这时，4-氨基安替比林可用作氢供体。用分光光度计(510nm)测定吸光度的增大值，以此跟踪4-氨基安替比林的氧化反应。

3、试剂：

(1)0.2M pH7.0的磷酸缓冲液：取61ml 0.2M磷酸氢二钠与39ml 0.2M磷酸二氢钠混合即可。

(2)过氧化氢溶液：用蒸馏水将1.0ml过氧化氢(30％)定溶至100ml。取出1.0ml，并用磷酸缓冲液将它稀释至50ml。

(3)4-氨基安替比林溶液：取810mg苯酚溶于大约40ml蒸馏水中，加25mg4-氨基安替比林，溶解后用蒸馏水定容至50ml。

(4)酶溶液：用磷酸缓冲液将酶溶解，使浓度达1mg/ml，接着用蒸馏水稀释，使浓度达0.05～0.25U/ml。

4、操作步骤：用移液管将1.4ml4-氨基安替比林溶液与1.5ml过氧化氢溶液加入一只1cm比色皿，并调温至20℃。加0.1ml酶液混合，按动秒表。用分光光度计(510nm)以蒸馏水为参比测定吸光度，5分钟内每隔一分钟测一次，直至每分钟内吸光度增大值达到稳定为止。

5、计算：

E₅₁₀ X 3/(6.58X E_W)＝U/mg式中：

E₅₁₀—510nm处每分钟吸光度的增大值

3—反应液的总体积(ml)

E_W—每0.1ml所用酶液中含酶的重量(mg)

6.58—1个单位能在1分钟内使吸光度增大6.58

表2实施例1～4制备得到的过氧化物酶活力测定结果

实施例7

本实施例为实施例4制备得到的过氧化物酶冻干粉与市场上上海伯奥生物科技有限公司生产的同级别RZ值的辣根过氧化物酶冻干粉的热稳定性、pH稳定性和活力比较。

1、热稳定性测试：将实施例4制备得到的过氧化物酶冻干粉与辣根过氧化物酶冻干粉在70℃条件下放置8小时，每隔1小时测定一次酶活力，结果如图1所示。

图1为实施例4制备得到的过氧化物酶冻干粉与市场上的辣根过氧化物酶冻干粉的热稳定性比较图。如图1所示，实施例4制备得到的过氧化物酶冻干粉在70℃条件下放置5小时活性基本不变，热稳定性好。

2、pH稳定性测试：将实施例4制备得到的过氧化物酶冻干粉与市场上的辣根过氧化物酶冻干粉，分别用pH为4、4.6、5、6、7、8、9、10的缓冲液配成1mg/ml酶液，在10℃的条件下放置48小时后测定酶活力，结果如图2所示。

图2为实施例4制备得到的过氧化物酶与市场上的辣根过氧化物酶的pH稳定性比较图。如图2所示，实施例4制备得到的过氧化物酶在pH值为5～10条件下放置48小时，活性基本保持不变，在pH值为4条件下放置48小时可保持70％的活性。

3、活力比较

从表3可知，实施例4制备得到的过氧化物酶比市场上辣根过氧化物酶的活力高15.8％，具有显著性差异。

表3实施例4过氧化物酶与市场上辣根过氧化物酶活力比较

以上所述，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种过氧化物酶的提取与纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

将五爪金龙破碎后，加入提取液进行提取后进行超滤浓缩，得到待纯化的浓缩液后采用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法进行提纯，进行第一离心，取沉淀物溶于水并除去残留的有机溶剂或/和无机盐和不溶物后得到RZ<1.0的过氧化物酶的溶液。

2.根据权利要求1所述的提取与纯化方法，其特征在于，所述五爪金龙为五爪金龙的任意部分或任意部分的组合。

3.根据权利要求1所述的提取与纯化方法，其特征在于，所述提取液的溶质包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、锌盐和镁盐中的一种或多种；

所述提取液的质量浓度为0～10％；

所述超滤浓缩采用分子量为1000～40000的中空纤维超滤柱。

4.根据权利要求1所述的提取与纯化方法，其特征在于，所述五爪金龙与所述提取液的质量体积比为1g：(0.1～30)ml。

5.一种过氧化物酶的提取与纯化方法，其特征在于，将权利要求1所述第一离心得到的沉淀物溶于水或将权利要求1所述RZ<1.0的过氧化物酶的溶液加水稀释，采用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法进行提纯，进行第二离心，取所述第二离心得到的沉淀物溶于水并除去残留的有机溶剂或/和无机盐和不溶物后得到RZ为1.0～2.0的过氧化物酶的溶液。

6.一种过氧化物酶的提取与纯化方法，其特征在于，将权利要求5所述第二离心得到的沉淀物溶于水或权利要求5所述的RZ为1.0～2.0的过氧化物酶的溶液加水稀释，采用有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法进行提纯，进行第三离心，取所述第三离心得到的沉淀物溶于水并除去残留的有机溶剂或/和无机盐和不溶物后得到RZ为2.0～3.0的过氧化物酶的溶液。

7.一种过氧化物酶的提取与纯化方法，其特征在于，将权利要求6所述第三离心得到的沉淀物溶于水或权利要求6所述的RZ为2.0～3.0的过氧化物酶的溶液加水稀释，加入锌盐和有机溶剂后进行第四离心，取上清液加入所述有机溶剂进行第五离心，取所述第五离心得到的沉淀物溶于水并除去残留的有机溶剂或/和无机盐和不溶物后得到RZ≥3.0的过氧化物酶的溶液。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的提取与纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂沉淀分离法中的有机溶剂为乙醇、丙酮、甲醇和异丙酮中的一种或多种；

所述有机溶剂的温度为为0～-20℃；

所述待纯化的浓缩液或待纯化的过氧化物酶溶液与所述有机溶剂的体积比为1：(0.5～3.0)。

9.根据权利要求1～7任意一项所述的提取与纯化方法，其特征在于，所述无机盐沉淀分离法中的无机盐为(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、MgSO₄和Na₂HPO₄中的一种或多种；

所述待纯化的浓缩液或待纯化的过氧化物酶溶液与所述无机盐的质量体积比为1升：(150～500)克；所述有机溶剂沉淀分离法或/和无机盐沉淀分离法采用的离心为冷冻离心；

所述冷冻离心速率为1000～20000rpm，时间为5～80min，温度为-10～10℃。

10.一种过氧化物酶冻干粉，其特征在于，将权利要求1至7任意一项所述的提取与纯化方法得到的过氧化物酶的溶液冷冻干燥后得到。

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