Изобретение относитс к способу получени ферментных препаратов, в частности к способу получени гиалуронидазы (КФ 3,2.1.35)-фермента, регулирующего катаболизм гликозамингпиканов в живом организме. Этот фермент находит широкое применение в животноводстве, рыбном хоз йстве , кожевенно-меховой промышлен ности , а также в медицине и в лабораторной практике. Гиалуронидаза содержитс во многих ткан х и жидкост х животных. Наиболее богатыми источниками гиалуронидазы животного происхождени вл ютс тестикулы и сперма ij . Известно несколько способов выделени гиалуронидазы из тео тикул крупного рогатого скота ij . Все они основаны на том, что экстракцию тка ни провод т в кислой среде (разбавленна уксусна кислота или ее смесь с разбавленной сол ной кислотой) с последующим фракционированием сульфатом аммони или органическими растворител ми и хроматографией . Известен, в частности, способ получени гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота 2J . Способ заключаетс в следующем: все операции ведут при О - 5 С. Замороженные сухим льдом ткани тести кул гомогенизируют в равном количестве воды. К суспензии добавл ют лед ную уксусную кислоту до рН 4,0. Оставл ют при температуре 4 - 5 С на 15ч. Центрифугируют. Осадок реэкстрагируют водой. Недосадочные фракции объедин ют. Фильтруют. Повод т рН до 4,5. Побавп ют сульфат аммони до 1О-12%-ного насыщени . Осадок удал ют центрифугированием . Палее добавл ют сульфат аммони до ЗО-4О%-ного насыщени . Белок, содержащий ферментативную активность, собирают центрифугированием и диализуют против холодной проточной воды в течение 27 ч. Огдиализованный раствор лиофилизуют . Выход 2,5 г из 1 кг исходного материала . Активность 54,5 МЕ/мг. Однако этот способ получени гиалуронидазы имеет р д недостатков. Так, ферJ63 мент получают с низким выходом (2,5 г из 1 кг сырь ), так как в качестве исходного сырь используют семенники крупного рогатого скота, из которых получают малоконцентрированные экстракты; щэичем имеютс потери фермента в процессе экстракции , где при рН 4,0 часть фермента осаждаетс вместе с баластными веществами . Часть фермента тер етс при осаждении сульфатом аммони 10-12%-ного насыщени . Часть активности тер етс в процессе фильтровани . Кроме того, полученный препарат фермента характеризуетс сравнительно низкой активностью (54,5 МЕ/мг). Целью изобретени вл етс повышение активности и выхода целевого продукта. Указанна цель достигаетс за счет того, что в качестве исходного -. сырь используют сперму крупного рогатого скота, забракованную дл искусственного осеменени экстракцию провод т не кислым буфером, а раствором хлористого натри при рН 5,8 - 6,3, поскольку, начина с рН 5,6 и ниже, наблюдаетс выпадение осадка, в который вовлекаетс часть фермента, что приводит к значительной его потере. Фракционирование сульфатом аммони провод т в два этапа, причем 1-ое фракционирование ведут 6О-65%-ным насыщением сульфата аммони , 2-ое фракционирование провод т на стадии после диализа последовательным добавлением сульфата аммони , до 38-45%-кого насыщени и 65-70%-ного насыщени и конечный продукт выдел ют известным способом. Из спермы можно получить концентрированные экстракты без дополнительной обработки сырь . Это позвол ет выделить фермент с минимальными потер ми активности . На первом этапе осаждени 6О-65%-но го насыщени сульфатом аммони получают фракцию, содержащую практически весь фермент, .содержащийс в экстракте и низ комолекул рные примеси. Эта операци позвол ет сохранить всю активность фермента без потерь. При помощи диализа освобождаютс от ионов сульфата и аммони и части низкомолекул рных примесей. После диализа - насыщением диализата до 38-45% сульфатом аммони -полностью от дел ют все баластные белки. Доведением до насыщени сульфата аммони до 65-7О% осаждают гиалуронидазу. Фракционирование в три этапа позвол ет выделить весь фермент с высоким выхо дом и активностью. Согласно изобретению описываетс спооб получени гиалуронидазы с высоким ыходом и удельной активностью посредсром экстракции раствором хлористого нати с рН 5,,3 спермы крупного рогатого скота, забракованной дл искусственого осеменени , затем экстракт подверают фракционированию сульфатом аммони , причем 1-ое фракционирование провод т 60-65%-ным насыщением сульфата аммои , 2-ое фракционирование провод т на стадии после диализа последовательным обавлением сульфата аммони до 38-45%ого насыщени и 65-70%-ного насыщени и конечный продукт выдел ют известным способом. Предпочтительно процесс выделени провод т следующим образом: Сперму оттаивают, разбавл ют в п ть раз 0,15 М раствором хлористого натри в дистиллированной воде; рН смеси 5,86 .3. Смесь медленно перемешивают в т&чёние 4 ч при температуре 4-5 С, центрифугируют . Добавл ют сульфат аммони до 60-65%-ного насыщени . Оставл ют при температуре 4-5°С в течение 4 ч. Центрифугируют. Осадок раствор ют в дистиллированной воде, диализуют в течение 24 ч против проточной дистиллированной воды. При выпадении осадка в диализате центрифугируют . Добавл ют сульфат аммони до 38-45%-ного нас ццени . Оставл ют при температуре 4-5 С в течение 2 ч, центрифугируют. В на посадочную жидкость добавл ют сульфат аммони до 65-7О%-кого насыщени . Оставл ют при температуре 4-5 С в течение 1О ч. Центрифугируют. Осадок раствор ют в дистиллированной воде. Диализуют 24 ч против проточной дистиллированной воды. При выпадении осадка в диализате - центрифугируют. Диализат лиофилизуют .. Пример получени гиалуронидазы. К 10О мл оттаенной спермы добавл ют 400 мл 0,15 М раствора хлористого нагт ри в дистиллированной воде. Устанавливают рН 6,0. Смесь медленно перемешивают при температуре 4-5 С в течение 4 ч. Центрифугируют. Прибавл ют 195 г (6О%) сульфата аммони . Оставл ют при темп эатуре 4-5 С в течение 4 ч. Центрифугируют . Осадок раствор ют в 7О мл дистиллированной воды. Диализуют в течение 24 ч против проточной дистиллированной воды. Удал ют выпавший осадок центрифугированием.
К 75 мл диализата добавл ют 450 мл О,15 М раствора хлористого натри (концентраци белка 1 мг/мл по Lonrs ) Объем 525 мл. Добавл ют 127,6 г сульфата аммони (40%). Оставл ют при гемпературе 4-5 С в течение 2 ч. Центрифугируют .
К недостаточной жидкости добавл ют 88,1 г сульфата аммони (65%). Оставл ют при температуре 4-5 С в течение 10ч. Центрифугируют, Осадок раствор ют в 50 мл дистиллированной воды. Пиал зуют 24 ч против проточной дистиллированной воды. Удал ют выпавший осадок цент рифугированием. Диализат - 5О мл лиофилизуют . Выход - 2,5 г, активность 680 МЕУмг.