CN104109204A - 一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从转基因水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的层析方法，包括以下步骤：（1）以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，采用提取缓冲液制备rLF粗提液；（2）用阳离子交换层析分离纯化rLF粗提液，获得纯化的rLF目标物。所述层析方法还进一步包括填料再生的步骤。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离纯化重组人乳铁蛋白的方法。
背景技术
乳铁蛋白（LF）是一种铁结合蛋白，广泛存在于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中，具有多种生理功能如抗菌、抗炎以及提高免疫力等。许多体外试验和动物实验都表明乳铁蛋白对肠内微生物感染，如轮状病毒、贾弟虫、志贺氏菌、沙门氏菌感染，都具有预防作用。乳铁蛋白对肠道病原菌的抑制作用主要通过两种途径来实现：抑制细菌的生长；破坏细菌表面的毒力因子功能从而减弱病毒粘附或者侵入哺乳动物细胞的能力。众多的研究成果和试验表明，在婴幼儿配方食品中添加乳铁蛋白具有重大意义，既可满足婴儿生长发育的需要，同时又对婴儿的健康起到保护作用。在全球的农业发达国家像新西兰、瑞士、澳大利亚、荷兰拥有着全球最优质的奶源，在这些国家的高端婴幼儿配方奶粉当中，多数有添加乳铁蛋白这一重要的母乳成分。
受到奶源的限定，乳铁蛋白的供给远远不能满足市场的需求，有必要为获得乳铁蛋白另辟蹊径。因此，许多研究人员在多种不同的表达系统中进行了乳铁蛋白的表达，获得重组乳铁蛋白。然而依然存在产量低，纯化难度大等一系列问题。申请人致力于研究水稻表达系统，成功地在水稻种子中表达了重组人乳铁蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种从转基因水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的层析方法，所述层析方法包括以下步骤：
1）从转基因水稻种子中提取重组人乳铁蛋白，获得含重组人乳铁蛋白的粗提液；
2）将含重组人乳铁蛋白的粗提液经过阳离子交换层析，进行初级分离纯化，获得含重组人乳铁蛋白的洗脱液；其中，所述阳离子交换层析介质为弱阳离子交换填料，层析步骤为：
2A)采用5-15倍柱体积的pH为6.0-7.5的10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；
2B）以步骤1)的粗提取液作为上样样品，其中样品电导为2-25ms/cm，pH为6.0-7.5；用洗杂缓冲液洗脱杂质，洗杂缓冲液含3-10mMNaH2PO4，3-10mMNa2HPO4，200-300mMNaCl，pH6.5-8.0，洗脱流速为50-200cm/小时；
2C)用3-10mMNaH2PO4，3-10mMNa2HPO4，400-650mMNaCl，pH6.5-8.0洗脱缓冲液以50-200cm/小时的流速洗脱样品，得洗脱液；
3）收集步骤2）所述洗脱液，获得含重组人乳铁蛋白的溶液。
优选地，上述步骤2）所述弱阳离子交换树脂为CMsepharose FF。
本发明所述的层析方法，进一步包括下述层析柱填料再生的步骤：
a)以3-10倍柱体积1-2MNaCl，pH6.5-10.0的高盐溶液以50-200cm/小时的流速冲洗柱子至UV280无明显变化；
b)以3-10倍柱体积5-25mM柠檬酸钠，pH2.0-4.0的缓冲溶液以50-200cm/小时的流速冲洗柱子；
c)以2-5倍柱体积的0.5-1.0MNaOH溶液以30-100cm/小时的流速反冲层析柱；
d)以8-15倍柱体积的超纯水冲洗柱子至pH小于10.0，将填料保存在20%的乙醇溶液中。
具体地，本发明所述的层析方法，其中步骤1）所述的提取重组人乳铁蛋白包括下述步骤：
（1）以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉；
（2)）将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得混合物；所述提取缓冲液为：10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl，pH6.0-7.5；
（3）将混合物过滤，得到含重组人乳铁蛋白的粗提液。
本发明所述的层析方法，其中步骤2）中所述层析步骤为：
2a)以10倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，平衡缓冲液组成为：25mMTris、20mMNaAC，200mMNaCl，pH6.5，流速为150cm/小时；
2b)将步骤1)的粗提取液作为上样样品，其中样品电导为22.5ms/cm，pH为6.5，用洗杂缓冲液洗脱杂质，洗杂缓冲液组成为4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，300mMNaCl，pH7.5，流速为150cm/小时；
2c)用洗脱缓冲液洗脱样品，洗脱缓冲液组成为4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，600mMNaCl，pH7.5，洗脱流速为150cm/小时，收集含有重组人乳铁蛋白的洗脱液。
本发明的另一个目的是提供一种从转基因水稻种子中制备重组人乳铁蛋白的提取方法，依次包括以下步骤：
（1）以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉；
（2)）将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得混合物；所述提取缓冲液为：10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl，pH6.0-7.5；
（3）将混合物过滤，得到含重组人乳铁蛋白的粗提液。
附图说明
图1是利用CM sepharose Fast Flow进行阳离子交换层析的电泳图谱；
其中，M：分子量标记，S：上样样品，FT：穿透峰，Elu：rLF洗脱峰，Wash：杂质洗脱峰。
图2是利用UNO Sphere S进行阳离子交换层析的电泳图谱；
其中，S：上样样品，FT：穿透峰，CIP：在位清洗，20%、40%、60%、100%分别为1.5MNaCl的百分比。
图3是CM sepharose Fast Flow实际载量的测定电泳图谱；
其中，M：分子量标记，Elu：rLF洗脱峰，Wash：杂质洗脱峰，100、150、200、250、300、350、400、430、450为粗提液的穿透体积（ml），L：上样样品。
图4是利用CM sepharose Fast Flow进行Step洗脱的电泳图谱；
其中，M：分子量标记，L：上样样品，FT：穿透峰，10%、20%、40%分别为洗脱盐浓度。
图5是利用CM sepharose Fast Flow进行洗杂条件摸索的电泳图谱；
其中，M：分子量标记，L：上样样品，FT：穿透峰，10%、20%、40%分别为洗杂的盐浓度，Elu：rLF洗脱峰。
图6是纯化后获得的rLF产品的HPLC纯度图谱（RP-HPLC）；
其中，纯度高于95%。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例中使用的试剂和仪器，除特别说明以外，均为普通市售。
【实施例1】重组人乳铁蛋白（rLF）粗提液的制备
将重组人乳铁蛋白转基因稻谷脱壳成半精米，研磨成80-100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1：10（重量/体积，kg/l）的比例混合，于常温提取1小时。提取缓冲液的成分为：25mMTris-HCl,20mM无水醋酸钠(NaAC)、200mMNaCl，pH6.5。将上述得到的混合物经滤布式板框压滤机压滤，得到澄清的rLF粗提液。
【实施例2】阳离子交换层析中层析介质和洗脱条件的筛选
阳离子交换层析中层析介质的筛选
由于水稻种子中具有较高含量的色素和多糖类物质，使用阳离子填料可避免造成色素等在层析介质上的沉积，从而提高填料的利用度并且保证样品的纯度。本实施例将层析填料选定为具有较高工作流速的阳离子交换树脂，包括伯乐公司生产的UNO Sphere S以及GE公司生产的CM sepharose Fast Flow（简称CMsepharose FF）等填料。以实施例1中获得的澄清的rLF粗提液作为阳离子交换层层析上样样品。
1、利用CM sepharose Fast Flow进行阳离子交换层析
将CM sepharose Fast Flow填料约18ml装于Econo-column15/20层析柱上，用200ml缓冲液（25mMTris-HCl,20mM无水醋酸钠，200mMNaCl，pH6.5）以150cm/h的流速平衡柱子，直到其pH值、电导值无变化。样品电导为22.5ms/cm，pH为6.5。上样结束后，用缓冲液（4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，300mMNaCl，pH7.5）以150cm/h的流速洗脱杂质，杂质峰洗脱完毕后，再用洗脱液（4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，600mMNaCl，pH7.5）以150cm/h的流速洗脱样品，收集洗脱液，得到含有rLF的组分。电泳图谱如图1所示。
2．利用UNO Sphere S进行阳离子交换层析
将UNO Sphere S填料约18ml装于Econo-column15/20层析柱上，用200ml缓冲液（25mMTris-HCl,20mM无水醋酸钠，200mMNaCl，pH8.0）以150cm/h的流速平衡柱子，直到其pH值、电导值无变化。样品电导为22.5ms/cm，pH为6.5。上样结束后，分别用含300mMNaCl、600mMNaCl、900mMNaCl、1.5MNaCl的4mMNaH2PO4和6mMNa2HPO4，pH7.5的洗脱液以150cm/h的流速进行分步洗脱并收集洗脱液。电泳图谱如图2所示，附图中显示20%、40%、60%、100%为1.5MNaCl的百分比，分别对应300mMNaCl、600mMNaCl、900mMNaCl、1.5MNaCl。
3．CM sepharose Fast Flow实际载量的测定
将CM sepharose Fast Flow填料约18ml装于Econo-column15/20层析柱上，用200ml缓冲液（25mMTris-HCl,20mM无水醋酸钠、200mMNaCl，pH6.5）以150cm/h的流速平衡柱子，直到其pH值、电导值无变化。实施例1中样品电导为22.5ms/cm，pH为6.5，总体积为450ml将该样品以150cm/h的流速上到CM sepharose Fast Flow上，记录上样过程中的UV280，直到UV280超过平台期得10%为止，记录上样量，计算出该流速下每毫升CM sepharose Fast Flow对提取液的实际载量；结束并再生树脂。电泳图谱如图3所示。
通过上述实验发现，在相同的上样条件下，弱阳离子交换填料CM Fast Flow表现出了较强阳离子交换填料更高的分辨率和分离效果；同时CM sepharose Fast Flow开发时间较早，工艺成熟，还具有极佳的化学稳定性，使用寿命长且成本相对低廉。综合各种因素，将CM sepharose Fast Flow作为优选的阳离子层析介质。
洗脱条件的筛选
将含有rLF的提取液上样于装有CM sepharose Fast Flow的层析柱上，采用加盐的方式进行梯度洗脱（图4）。结果发现，在10%的1.5MNaCl梯度下有明显杂带被洗脱下来，无目的蛋白损失；20%的1.5MNaCl梯度下有少量杂带被洗脱下来，目的蛋白损失较少；目的蛋白集中在40%1.5MNaCl下被洗脱下来；60%以及更大的盐浓度下无洗脱峰，意味着40%的1.5MNaCl浓度下能将目的蛋白完全洗脱下来。继续对洗脱浓度进行摸索，发现盐浓度低于40%时，洗脱蛋白纯度无影响，洗脱峰拖尾严重，且回收率有所下降，最终选取40%的1.5MNaCl为确定的洗脱条件。
洗杂条件的筛选
在相同的平衡条件和洗脱条件下，分别对10%、15%和20%的洗杂条件进行比较（图5）。随着洗杂盐浓度的升高，目的蛋白的损失量增大，但杂质的去除效果明显增加，而三种条件蛋白回收率差别不大，为了保证目的蛋白的纯度，最终选取20%的1.5MNaCl作为确定的洗杂条件。
综合考虑纯化效果和回收率，以4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，300mMNaCl，pH7.5作为优选的洗杂条件，以4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，600mMNaCl，pH7.5作为优选的目的蛋白的洗脱条件。
【实施例3】纯化rLF后CM sepharose FF填料的再生条件筛选
在使用阳离子交换纯化rLF后，CIP（在位清洗）的过程中发现色谱柱发生严重的褐色色素沉积，经过常规的水、30%异丙醇、70%乙醇、0.01MHCl、1MNaOH以及8M尿素再生都无法去除。通过分析，原因为rLF中结合的铁在强碱的作用下生成了氢氧化铁沉淀，由于填料不能耐受高浓度的酸，最终通过柠檬酸钠在酸性条件下较强的铁离子螯合特性将沉积的色素成功去除。
在对柠檬酸钠用于CM sepharose FF再生的过程中，发现柠檬酸钠需在低pH值的条件下才能螯合色谱柱上的铁，综合考虑填料所能承受的pH范围，最终选定为pH3.0；并在填料再生溶液的正常用量（约5倍柱体积）下，对柠檬酸浓度进行确定，如果该浓度下铁离子去除不完全，后续的NaOH再生过程中，色谱柱会出现褐色色素沉积，反之色谱柱颜色正常，实验结果如下表所示：
| 柠檬酸钠浓度 | 色谱柱颜色 | 用量 |
| 10mM | 褐色沉积 | 100ml |
| 20mM | 正常 | 100ml |
| 50mM | 正常 | 100ml |
| 100mM | 正常 | 100ml |
结果表明：20mM柠檬酸钠，100ml可将色谱柱中的铁离子螯合完全，该浓度为确定的柠檬酸钠用量。
综上所述，根据目的蛋白的特殊性，将CM sepharose Fast Flow的再生过程先从普通的高盐再用NaOH洗改为如下步骤：先高盐（2MNaCl，pH7.0）尽量去除未被洗脱下来的rLF，然后用酸性柠檬酸钠（20mM柠檬酸钠，pH3.0）去除残余rLF中的铁，再用1MNaOH进行正常的清洗程序。
将实施例1中利用CM sepharose Fast Flow进行阳离子交换层析时使用过的装有18mlCM sepharose FF填料的层析柱,先用100ml高盐溶液（2MNaCl，pH7.0）以150cm/h的流速冲洗柱子至UV280无明显变化；再用100ml缓冲溶液（20mM柠檬酸钠，pH3.0）以150cm/h的流速冲洗柱子至pH将至4.0以下；然后用100ml0.5MNaOH溶液以50cm/h的流速反冲层析柱；随即用200ml超纯水冲洗柱子至pH小于10.0，最后将填料长期保存在20%的乙醇溶液中。
【实施例4】重组人乳铁蛋白的分离纯化及层析填料的再生
使用阳离子交换进行一步纯化法
将CM sepharose Fast Flow填料约150ml装于XK50层析柱上，用2000ml缓冲液（25mMTris-HCl,20mM无水醋酸钠，200mMNaCl，pH6.5）以150cm/h的流速平衡柱子，直到其pH值、电导值无变化。以实施例1获得的粗提液为样品，所述样品电导为22.5ms/cm，pH为6.46。上样结束后，用洗脱杂质缓冲液（4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，300mMNaCl，pH7.5）以150cm/h的流速洗脱杂质，收集洗杂液；再用洗脱缓冲液（4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，600mMNaCl，pH7.5）以150cm/h的流速洗脱样品，收集洗脱液，得到含有rLF的组分。
进一步地，通过如下步骤进行填料再生：先用500ml高盐溶液（2MNaCl，pH7.0）以150cm/h的流速冲洗柱子至UV280无明显变化；再用500ml缓冲溶液（20mM柠檬酸钠，pH3.0）以150cm/h的流速冲洗柱子至pH将至4.0以下；然后用500ml0.5MNaOH溶液以50cm/h的流速反冲层析柱；随即用1500ml超纯水冲洗柱子至pH小于10.0，最后将填料长期保存在20%的乙醇溶液中。
将上述分离纯化获得的rLF经HPLC检测，表明rLF的HPLC纯度为98%，如图6所示；且rLF的收率可达27.24±0.77%，相当于每公斤的粗米可产2.25g的rLF，具体如下表所示。
Claims (9)
1.一种从转基因水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的层析方法，依次包括以下步骤：
1）从转基因水稻种子中提取重组人乳铁蛋白，获得含重组人乳铁蛋白的粗提液；
2）将含重组人乳铁蛋白的粗提液经过阳离子交换层析，进行初级分离纯化，获得含重组人乳铁蛋白的洗脱液；其中：
所述阳离子交换层析介质为弱阳离子交换填料，层析步骤为：
2A)采用5-15倍柱体积的pH为6.0-7.5的10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；
2B）以步骤1)的粗提取液作为上样样品，其中样品电导为2-25ms/cm，pH为6.0-7.5；用洗杂缓冲液洗脱杂质，洗杂缓冲液含3-10mMNaH2PO4，3-10mMNa2HPO4，200-300mMNaCl，pH6.5-8.0，洗脱流速为50-200cm/小时；
2C)用3-10mMNaH2PO4，3-10mMNa2HPO4，400-650mMNaCl，pH6.5-8.0洗脱缓冲液以50-200cm/小时的流速洗脱样品，得洗脱液；
3）收集步骤2）所述洗脱液，获得含重组人乳铁蛋白的溶液。
2.权利要求1所述的层析方法，其中步骤2）所述弱阳离子交换树脂为CMsepharoseFF。
3.权利要求1所述的层析方法，其中进一步包括下述层析柱填料再生的步骤：
a)以3-10倍柱体积1-2MNaCl，pH6.5-10.0的高盐溶液以50-200cm/小时的流速冲洗柱子至UV280无明显变化；
b)以3-10倍柱体积5-25mM柠檬酸钠，pH2.0-4.0的缓冲溶液以50-200cm/小时的流速冲洗柱子；
c)以2-5倍柱体积的0.5-1.0MNaOH溶液以30-100cm/小时的流速反冲层析柱；
d)以8-15倍柱体积的超纯水冲洗柱子至pH小于10.0，将填料保存在20%的乙醇溶液中。
4.权利要求1所述的层析方法，其中步骤1）所述的提取重组人乳铁蛋白包括下述步骤：
（1）以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉；
（2）将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得混合物；所述提取缓冲液为：10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl，pH6.0-7.5；
（3）将混合物过滤，得到含重组人乳铁蛋白的粗提液。
5.权利要求1所述的层析方法，其中步骤2）中所述层析步骤为：
2a)以10倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，平衡缓冲液组成为：25mMTris、20mMNaAC，200mMNaCl，pH6.5，流速为150cm/小时；
2b)将步骤1)的粗提取液作为上样样品，其中样品电导为22.5ms/cm，pH为6.5，用洗杂缓冲液洗脱杂质，洗杂缓冲液组成为4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，300mMNaCl，pH7.5，流速为150cm/小时；
2c)用洗脱缓冲液洗脱样品，洗脱缓冲液组成为4mMNaH2PO4，6mMNa2HPO4，600mMNaCl，pH7.5，洗脱流速为150cm/小时，收集含有重组人乳铁蛋白的洗脱液。
6.权利要求3所述的层析方法，其中层析柱填料再生步骤包括：
a1)以5倍柱体积2MNaCl，pH7.5的高盐溶液以150cm/小时的流速冲洗柱子至UV280无明显变化；
b1)以5倍柱体积20mM柠檬酸钠，pH3.0的缓冲溶液以150cm/小时的流速冲洗柱子；
c1)以3倍柱体积的0.5MNaOH溶液以50cm/小时的流速反冲层析柱；
d1)以10倍柱体积的超纯水冲洗柱子至pH小于10.0，将填料保存在20%的乙醇溶液中。
7.权利要求4所述的层析方法，其中提取重组人乳铁蛋白包括下述步骤：
（1a）以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉；
（2a）将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:10的比例混合，常温下提取1小时，获得混合物；所述提取缓冲液为：25mMTris、20mMNaAC，200mMNaCl，pH6.5；
（3a）将混合物过滤，得到含重组人乳铁蛋白的粗提液。
8.一种从转基因水稻种子中制备重组人乳铁蛋白的提取方法，依次包括以下步骤：
（1）以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉；
（2)）将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得混合物；所述提取缓冲液为：10-25mMTris、10-25mMNaAC，0-250mMNaCl，pH6.0-7.5；
（3）将混合物过滤，得到含重组人乳铁蛋白的粗提液。
9.权利要求8所述的提取方法，包括下述步骤：
（1a）以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉；
（2a）将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:10的比例混合，常温下提取1小时，获得混合物；所述提取缓冲液为：25mMTris、20mMNaAC，200mMNaCl，pH6.5；
（3a）将混合物过滤，得到含重组人乳铁蛋白的粗提液。
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Date of cancellation: 20221027 Granted publication date: 20171107 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN HEALTHGEN BIOTECHNOLOGY Corp. Registration number: Y2022420000242 |