JPH10323137A

JPH10323137A - ラクトフェリン機能を食用植物に付与する方法、及びラクトフェリン機能を有する食用植物

Info

Publication number: JPH10323137A
Application number: JP10093949A
Authority: JP
Inventors: Kazuko Katsumata; 和子勝俣; Chuhei Nojiri; 宙平野尻; Hiroyuki Anzai; 弘行安西
Original assignee: ALLERGEN FREE TECHNOL KENKYUSHO KK
Current assignee: ALLERGEN FREE TECHNOL KENKYUSHO KK
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1998-03-23
Publication date: 1998-12-08

Abstract

(57)【要約】【課題】ラクトフェリン機能を食用植物に付与する方
法、及びラクトフェリン機能を有する食用植物を提供す
る。【解決手段】付与方法は、植物で機能することのでき
るプロモーターと、植物で機能することのできるターミ
ネーターと、ラクトフェリン遺伝子とを連結した発現プ
ラスミドを食用植物の細胞に導入してラクトフェリン発
現食用植物を作出することにより、ラクトフェリンに基
づく生理機能を前記食用植物に付与する。植物は、前記
発現プラスミドで形質転換した細胞を含み、ラクトフェ
リンに基づく生理機能を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ラクトフェリン
（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）に基づく生理機能を食用植
物に付与する方法、及びラクトフェリンに基づく生理機
能を有する食用植物に関する。本発明方法によって得ら
れるラクトフェリン発現組換え食用植物は、そのラクト
フェリン発現食用植物それ自体（若しくはその一部分）
又はそれから得られる食品（若しくは飼料）を動物が直
接に摂取すると、ラクトフェリンに基づく生理機能を、
その動物が享受することができる。

【０００２】

【従来の技術】食品にはこれまで一般に２つの機能があ
ると考えられてきた。第１の機能は生命を維持する機能
であり、栄養機能と呼ばれる。第２の機能は感覚に訴え
る機能、すなわち、おいしさを感じさせる感覚機能であ
る。そして、近年、新たな機能として注目されるように
なったのが、第３の機能、すなわち高次の生命活動に対
する調節機能である。この第３の機能は、カロリーや栄
養価などの面だけで食品成分に備わっている機能を利用
するのではなく、より積極的に食品成分の機能を活用し
ようとする考え方から「機能性食品」あるいは「食品の
機能性」という考え方が生まれた。

【０００３】この「機能性食品」あるいは「食品の機能
性」という考え方は、２１世紀における高齢化社会への
対応において重要な意味を秘めている。すなわち、毎年
の高齢者増加による医療費はウナギ登りで今世紀中に２
０兆円を越えると推測がなされており、加えて、食生活
の欧米化による成人病の発症はますます低年齢化してい
る現状を考えると、食品の持つ機能を疾病予防あるいは
その改善に活用していくことが、今後ますます重要とな
ってくる。前記の機能性食品が有する第３の機能の具体
例としては、例えば、微生物感染に対する防御機能、ア
レルギーの低減化や免疫能力を高める生体防御機能、高
血圧や糖尿病、腫瘍、若しくは先天的代謝異常等を防止
し、回復する機能、神経活動や消化作用を調節する機
能、過酸化脂質生成を抑制して老化を防御する機能等が
ある。

【０００４】このような第３次機能の発現を担う素材の
一つにラクトフェリンがある。ラクトフェリンは哺乳動
物（ヒト、牛、羊、又は鼠等）の主としてミルク中に存
在する鉄結合性の糖タンパク質であり、抗菌作用、抗ウ
イルス作用、免疫賦活作用、細胞増殖調節作用、又は鉄
吸収調節作用などを有することが報告されている〔Ｊａ
ｐａｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌＤａｉｒｙａｎｄ
ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．４
（１９９６）〕。特に、ヒトの初乳（出産後はじめて出
てくる母乳）においては、ラクトフェリンが初乳中のタ
ンパク質の約７割を占めており、母乳栄養児に感染症が
少ないのは、ラクトフェリンなどの免疫作用物質が乳児
に移行するためと考えられている。

【０００５】一方、遺伝子工学的技術を用いた植物への
有用遺伝子の導入の試みが、近年、数多く進められてい
る。植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウ
ムを用いる方法とエレクトロポレーション法が知られて
いる。また、近年、イネやコムギなどの単子葉植物の形
質転換にパーティクルガン法が広く利用され、多くの植
物で有用遺伝子の導入に成功した例が報告されている。

【０００６】ヒト由来のラクトフェリン（ヒトラクトフ
ェリン）については、これまでにカビや酵母などの微生
物や、鼠などの高等動物で生産させた例が報告されてい
る〔Ｇ．Ｊ．Ｐｌａｔｅｎｂｕｒｇ，Ｔｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃＲｅｓ．ｖｏｌ３，９９−１０８（１９９４
年）〕。しかしながら、ヒトラクトフェリン遺伝子の高
等植物への導入については、タバコでの報告が下記の２
例あるのみであった。まず、Ａ．Ｍｉｔｒａ等（プラン
トフィジオロジー，第１０６巻，第９７７〜９８１
頁，１９９４年）は、タバコにヒトラクトフェリン遺伝
子を導入したが、ヒトラクトフェリンとは分子量が異な
ったかなり小さなタンパク質を生産させたにすぎず、ヒ
トラクトフェリンの生産には至っていなかった。また、
ＷＯ９６−３７０９４では、形質転換したタバコ植物細
胞からヒトラクトフェリンと同一の大きさと推定される
タンパク質を検出し、植物病原ウイルスに対する抵抗性
が形質転換植物自身に付与されたことを報告している。
しかしながら、ヒトラクトフェリンが有している前記の
機能、すなわち、抗菌作用、免疫賦活作用、細胞増殖調
節作用、又は鉄吸収調節作用等の機能性の向上について
は言及していなかった。また、この形質転換タバコが産
生するヒトラクトフェリンを利用する場合には、形質転
換タバコからヒトラクトフェリンを抽出する必要があ
る。すなわち、ヒトラクトフェリン発現植物を動物に直
接摂取させて、ヒトラクトフェリンに基づく機能をその
動物に付与することは、前記のＷＯ９６−３７０９４に
は示唆されていない。更に、組換えラクトフェリンを加
熱処理しても活性が維持されるとの報告は、従来全くな
かった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、ラクトフ
ェリン遺伝子を食用植物に導入して発現させることがで
き、しかも発現されるラクトフェリンの活性が高く、加
熱処理後にも活性を維持することができること、及びそ
の形質転換食用植物から、優れた「機能性食品」及び
「機能性飼料」を得ることができることを見出した。本
発明はこうした知見に基づくものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、植物
で機能することのできるプロモーターと、植物で機能す
ることのできるターミネーターと、ラクトフェリン遺伝
子とを連結した発現プラスミドを食用植物の細胞に導入
してラクトフェリン発現食用植物を作出することによ
り、ラクトフェリンに基づく生理機能を前記食用植物に
付与する方法に関する。また、本発明は、植物で機能す
ることのできるプロモーターと植物で機能することので
きるターミネーターとの間にラクトフェリン遺伝子を連
結した発現プラスミドによって形質転換された食用植物
細胞にも関する。

【０００９】更に、本発明は、前記の形質転換細胞を含
み、ラクトフェリンに基づく生理機能を有する食用植物
にも関する。更にまた、本発明は、前記の食用植物の少
なくとも一部分から得られ、ラクトフェリンに基づく生
理機能を有する機能性食品、又は機能性飼料にも関す
る。

【００１０】本明細書において、「食用植物」とは、そ
れ自体の一部若しくは全部を直接、ヒトを含む動物の食
用とすることのできる植物、又はそれ自体の一部若しく
は全部を食品（又は飼料）の原料とすることのできる植
物を意味する。前記の食用植物は、一般的に「作物」と
称されている。「作物」は、農作物と園芸作物の総称で
あって、農作物とは農耕による生産物あるいは田畑に栽
培される植物であり、園芸作物とは蔬菜、果樹、庭樹、
又は花卉等の植物であり、ヒト用の作物に限らず、ヒト
以外の動物用の作物（例えば、牧草や飼料用作物）も含
まれる。前記植物には、コケ、シダ、裸子植物及び被子
植物等が含まれ、被子植物は更に単子葉植物及び双子葉
植物よりなる。また、その食用植物の「細胞」とは、植
物に由来する任意の細胞を意味し、例えば、プロトプラ
スト、未分化組織（例えば、カルス）、種子、胎芽、花
粉、植物胚、不定胚、又は人工種子などを含む。

【００１１】本明細書において、「ラクトフェリンに基
づく生理機能」とは、本発明方法によって得られるラク
トフェリン発現食用植物の少なくとも一部分（又はラク
トフェリン発現食用植物の少なくとも一部分から得られ
る食品若しくは飼料）を摂取する動物に対して、ラクト
フェリンが及ぼす生理機能を意味する。具体的には、抗
菌作用（殺菌作用若しくは静菌作用）、免疫賦活作用、
細胞増殖調節作用、鉄吸収調節作用、アレルギーの低減
化や免疫能力を高める生体防御機能、あるいは高血圧、
糖尿病、腫瘍、若しくは先天的代謝異常等を防止し回復
する機能、神経活動や消化作用を調節する機能、過酸化
脂質生成を抑制して老化を防御する機能等の高次の生命
活動に対する調節機能を挙げることができる。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明で用いるプラスミドは、少
なくとも、（１）植物で機能することのできるプロモーターを含む
配列（２）ラクトフェリン遺伝子（３）植物で機能することのできるターミネーターを含
む配列をそのプラスミド上に含む。このプラスミドは、植物で
機能することのできるプロモーターを含む配列と、植物
で機能することのできるターミネーターを含む配列との
間にラクトフェリン遺伝子を含んでいることが好まし
い。

【００１３】ラクトフェリン遺伝子は、任意の哺乳類の
ラクトフェリンをコードする遺伝子であることができ
る。前記の哺乳類としては、ヒト、牛、緬山羊（羊や山
羊など）、豚、犬、猫又は鼠などを挙げることができ
る。これら哺乳類のラクトフェリンのアミノ酸配列、及
びそれらラクトフェリンをコードする遺伝子の塩基配列
は各種の文献に記載されている〔例えば、Ｐｏｗｅｌｌ
等，ヌクレイック・アシッド・リサーチ，第１８巻，第
４０１３頁（１９９０年）；Ｍｅａｄ等，ヌクレイック
・アシッド・リサーチ，第１８巻，第７１６７頁（１９
９０年）〕。本発明においては、ラクトフェリン遺伝子
として、ラクトフェリン発現食用植物を摂取させる動物
に対応させて選択するのが好ましい。例えば、ラクトフ
ェリン発現食用植物をヒトに摂取させる場合には、ヒト
ラクトフェリン遺伝子を用い、牛に摂取させる場合に
は、ウシラクトフェリン遺伝子を用いるのが好ましい。

【００１４】ラクトフェリン遺伝子としては、ラクトフ
ェリンｃＤＮＡ又はラクトフェリン類似体をコードする
塩基配列を含むＤＮＡを用いることができる。ここでラ
クトフェリン類似体とは、ラクトフェリンのアミノ酸配
列において１個若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠
失、若しくは置換されたアミノ酸配列を有し、しかも前
記のラクトフェリンに基づく生理機能を有するポリペプ
チドを意味する。また、ラクトフェリンｃＤＮＡ又はラ
クトフェリン類似体をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
は、ラクトフェリン若しくはラクトフェリン類似体の前
駆体又は成熟体をコードするＤＮＡであることができ
る。

【００１５】本発明で用いる「植物で機能することので
きるプロモーター」とは、そのプロモーターを植物内に
導入した場合に、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し
てその下流方向に転写をはじめることができるプロモー
ターを意味する。前記プロモーターとしては、例えば、
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔ザ
・エンボジャーナル，第６巻，第３９０１〜３９０７頁
（１９８７年）〕、イネアクチンプロモーター〔Ｒ．Ｗ
ｕ等，ザ・プラントセル，第２巻，第１６３〜１７１頁
（１９９０年）〕、イネグルテリンプロモーター〔高岩
等，プラント・モレキュラー・バイオロジー，第３０
巻，第１２０７〜１２２１頁（１９９６年）〕、トウモ
ロコシ・ユビキチンプロモーター〔滝本等，プラント
モレキュラーバイオロジー，第２６巻，第１００７〜
１０１２頁（１９９４年）〕等を使用することができ
る。前記のプロモーターとしては、宿主となる食用植物
の主食部においてラクトフェリン又はラクトフェリン類
似体を高発現させることのできるプロモーターを用いる
のが好ましい。例えば、イネを用いて種子特異的に高発
現させる場合には、イネグルテリンプロモーターが好ま
しい。

【００１６】本発明で用いる「植物で機能することので
きるターミネーター」とは、そのターミネーターを植物
内に導入した場合に、その上流方向からの転写を終結さ
せ、ポリＡを付加させることのできるターミネーターを
意味する。前記ターミネーターとしては、例えば、ノパ
リンシンターゼターミネーター、又はカリフラワーモザ
イクウイルス３５Ｓターミネーター等を用いることがで
きる。前記のターミネーターとしては、宿主となる食用
植物の主食部においてラクトフェリン又はラクトフェリ
ン類似体を高発現させることのできるターミネーターを
用いるのが好ましい。

【００１７】本発明で用いるプラスミドにおいて、前記
プロモーターを含む配列内の、プロモーターの制御配列
を含む配列の３’末端と、前記ターミネーターを含む配
列内の、ターミネーターの制御配列を含む配列の５’末
端との間に、植物で機能することのできるイントロンを
更に設けると、遺伝子の発現効率を向上させることがで
きたり、あるいは、ｍＲＮＡの安定性を向上させること
ができるので好ましい。ここで「植物で機能することの
できるイントロン」とは、そのイントロンを植物に導入
した場合に、ｍＲＮＡの核外への移行又はスプライシン
グに際し、取り除くことのできるイントロンを意味す
る。前記イントロンとしては、例えば、ヒマカタラーゼ
イントロン〔田中等，ヌクレイックアシッドリサー
チ，第１８巻，第６７６７〜６７７０頁（１９９０
年）〕、又はトウモロコシユビキチンイントロン〔滝本
等，プラントモレキュラーバイオロジー，第２６
巻，第１００７〜１０１２頁（１９９４年）〕を使用す
ることができるが、トウモロコシユビキチンイントロン
が特に好ましい。なお、ラクトフェリンｃＤＮＡ中へ前
記イントロンが挿入される部分は特に限定されない。

【００１８】本発明で、パーティクルガン法などの直接
的な遺伝子導入法を利用する場合には、植物内で発現可
能なラクトフェリンｃＤＮＡを含むカセットと、植物内
で発現可能な選抜マーカー遺伝子のカセットとを、大腸
菌で一般的に用いられる多コピープラスミド〔例えば、
ｐＵＣ１９（宝酒造製）〕にクローン化して植物に導入
することができる。この際、選択マーカー遺伝子は、
（１）同一プラスミド上に保持させて導入することもで
き、あるいは（２）別々のプラスミド上に保持させ混合
して導入する（コトランスフォーメーション）こともで
きる。例えば、ビアラホス耐性（ｂａｒ）遺伝子〔村上
等，モレキュラー・ジェネラル・ジェネティクス，第２
０５巻，第４２〜５０頁（１９８６年）〕が、イネアク
チンプロモーターとノパリンシンターゼターミネーター
との間に含まれているプラスミドｐＤＭ３０２〔Ｒ．Ｗ
ｕ等，プラント・セル・レポーツ，第１１巻，第５８６
〜５９１頁（１９９２年）〕と、ラクトフェリン遺伝子
を有するプラスミドとを混合してコトランスフォームさ
せることにより、植物に遺伝子を導入することができ
る。

【００１９】また、本発明で、アグロバクテリウムを介
した導入法を用いる場合には、植物内で発現可能なラク
トフェリンｃＤＮＡを含むカセットと植物内で発現可能
な選抜マーカー遺伝子のカセットとを含むアグロバクテ
リウム用のバイナリープラスミドを作成し、植物に導入
することができる。例えば、ラクトフェリンｃＤＮＡを
バイナリーベクターｐＢＩ１２１（クローンテック社
製）の３５Ｓプロモーターとノパリンシンターゼターミ
ネーターとの間にクローン化し、このラクトフェリンｃ
ＤＮＡを含むバイナリープラスミドを有するアグロバク
テリウムを植物に感染させ、カナマイシン耐性により選
抜して形質転換細胞を得ることができ、更にその形質転
換細胞から植物体を得ることができる。

【００２０】選抜マーカー遺伝子としては、ハイグロマ
イシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、又はｂａ
ｒ遺伝子などを用いることができる。なお、導入する植
物が単子葉植物であるイネ科植物などの場合は、ｂａｒ
遺伝子が特に好ましい〔滝本等，プラントモレキュラ
ーバイオロジー，第２６巻，第１００７〜１０１２頁
（１９９４年）〕。

【００２１】構築したプラスミドを高等植物に導入する
方法としては、植物の形質転換法として確立されている
任意の方法を利用することができる。例えば、エレクト
ロポレーションやポリエチレングリコールによる植物プ
ロトプラストへの直接導入法やミクロプロジェクタイル
を利用して植物細胞に直接導入するパーティクルガン
法、又はアグロバクテリウムを介した導入方法を用いる
ことができる。イネの場合には、パーティクルガン法あ
るいはアグロバクテリウムを介した導入方法が好まし
い。また、形質転換する細胞としては導入方法に適した
細胞や組織を用いることができる。イネの場合は、例え
ば、適切な組織として未熟種子あるいは完熟種子より摘
出した胚あるいは誘導したカルスを用いることができ
る。

【００２２】上記方法により得られた遺伝子を導入した
細胞又は組織を選抜し、任意の方法により植物体を再生
させることができる。イネの場合には、例えば、遺伝子
を導入した組織を選択マーカーに対応した選択薬剤及び
植物ホルモンを含む培地に移植して数週間培養すれば、
形質転換した細胞（カルス）を得ることができる。その
後、得られた細胞（カルス）を適切な増殖培地に移し、
更に、適切な再分化培地で培養すれば、形質転換したイ
ネ植物体を得ることができる。なお、ラクトフェリンの
発現は、免疫学的な解析により確認することができる。

【００２３】本発明において、ラクトフェリン遺伝子を
導入する食用植物は特に限定されないが、高等植物を用
いることが好ましい。なお、前記の食用植物には、ヒト
用食用植物だけでなく、牧草及び飼料用作物が含まれ
る。これらの食用植物としては、例えば、単子葉植物で
は、ユリ科（タマネギ、ネギ、ニンニク、アスパラガス
等）、イネ科（イネ、コムギ、トウモロコシ等）、サト
イモ科（サトイモ、コンニャク等）等、双子葉植物で
は、アカザ科（ホウレンソウ等）、アブラナ科（ハクサ
イ、カブ、キャベツ、ダイコン、シロイヌナズナ等）、
マメ科（ダイズ、エンドウ、インゲンマメ等）、セリ科
（ニンジン、セロリ、パセリ等）、ナス科（タバコ、ト
マト、ジャガイモ、ナス等）、ウリ科（キュウリ、メロ
ン、スイカ等）、又はキク科（レタス等）等の各植物を
挙げることができる。なお、牧草及び飼料用作物として
は、例えば、単子葉植物ではイネ科（オーチャードグラ
ス、チモシー、トウモロコシ、ソルガム、えん麦等）、
又はマメ科（クローバー、アルファルファ、ダイズ等）
等の植物を挙げることができる。

【００２４】本発明方法によって得られたラクトフェリ
ン発現形質転換食用植物は、その植物体からラクトフェ
リンを抽出せずに、その形質転換植物体それ自体（又は
その少なくとも一部分）を、動物に直接摂取させること
により、その動物に、ラクトフェリンに基づく生理機能
を付与することができる。すなわち、前記の形質転換植
物体の全体が食用部である場合には、その形質転換植物
体の全体あるいはその一部分（例えば、果実、葉、茎、
地下茎、根、又は花弁）、あるいは、前記の形質転換植
物体の一部分が食用部である場合には、その形質転換植
物体の一部分を、機能性食品又は機能性飼料として動物
に直接摂取させることができる。

【００２５】前記のラクトフェリン発現形質転換食用植
物を摂取させる動物は、特に限定されるものではない
が、哺乳類（ヒトを含む）、鳥類、又は水産動物（魚
類、又は貝類）が含まれる。前記の動物としては、特に
はヒトが対象となる他、ヒト以外の有用な哺乳類や鳥
類、例えば、家畜（例えば、牛、馬、豚、緬山羊、ウサ
ギ、鶏、七面鳥、又はウズラなど）、又はコンパニオン
アニマル（例えば、犬、猫又は鳥などの小動物）、ある
いは養殖水産動物、特には養殖魚介類、例えば、スズキ
目、フグ目、カレイ目、エビ目、又はアコヤ貝など、例
えば、タイ、ブリ、ウナギ、ギンザケ、コイ、ニジマ
ス、又はアユなどを挙げることができる。

【００２６】動物に摂取させる形態も特に限定されるも
のではなく、対象となる食用植物の通常の形態で摂取さ
せることができる。特に、本発明方法によって得られた
ラクトフェリン発現形質転換食用植物においては、後述
する実施例に示すとおり、天然ラクトフェリン標準品よ
りも高活性の組換えラクトフェリンが得られるので、生
食の形態で効果的に摂取させることができる。例えば、
ヒトに摂取させる場合には、生食の形態（例えば、サラ
ダ、ジュース又は漬物等）、あるいは家畜などの動物に
対しては、牧草や配合飼料の形態、小動物に対してはフ
ード（例えば、ドッグフードやキャットフードなど）の
形態、また、養殖魚介類に対しては配合飼料の形態であ
ることができる。

【００２７】更に、本発明方法によって得られたラクト
フェリン発現形質転換食用植物においては、後述する実
施例に示すとおり、加熱処理後においても高いラクトフ
ェリン活性が維持されるので、加熱処理を伴う調理・加
工食品の形態で機能性食品又は機能性飼料として動物に
効果的に摂取させることもできる。例えば、イネの場合
には、その種子である米を用いた調理品（炊飯されたご
飯やおにぎり等）、あるいは米関連食品（餅、煎餅、団
子等）の形態で摂取させることができる。また、トマト
などの場合には、果実部から加熱処理を経て製造するト
マトケチャップなどに好適に利用することができる。更
に、ヒト以外の動物に対しても、加熱処理を伴う調理・
加工飼料の形態で効果的に摂取させることができる。な
お、加熱処理後においても前記のラクトフェリン活性が
維持される理由は必ずしも明確ではないが、本発明は、
その理由によって限定されるものではない。すなわち、
ラクトフェリン自体が耐熱性を有しているために、その
活性が維持される場合、あるいはラクトフェリン自体は
分解されるが、その分解産物がラクトフェリン活性を有
している場合のいずれであっても、前記の組換えラクト
フェリンを含有しているラクトフェリン発現形質転換食
用植物（又はその一部分）を加熱処理し、そのラクトフ
ェリン活性を維持した状態で、前記のように有効に利用
することができる。また、加熱処理工程を含まない加工
機能性食品（例えば、菓子、缶詰、レトルト食品あるい
は冷凍食品等）あるいは加工機能性飼料として摂取させ
ることができる。

【００２８】これらの機能性食品又は機能性飼料には、
ラクトフェリンが及ぼす生理機能、例えば、抗菌作用
（殺菌作用若しくは静菌作用）、免疫賦活作用、細胞増
殖調節作用、鉄吸収調節作用、アレルギーの低減化や免
疫能力を高める生体防御機能、あるいは高血圧、糖尿
病、腫瘍、若しくは先天的代謝異常等を防止し回復する
機能、神経活動や消化作用を調節する機能、過酸化脂質
生成を抑制して老化を防御する機能等の高次の生命活動
に対する調節機能の付与を期待することができる。

【００２９】本発明方法によって得られたラクトフェリ
ン発現形質転換食用植物あるいは形質転換細胞から、公
知の方法を用いることにより、組換えラクトフェリンを
抽出することもできる。例えば、適切な抽出液〔例え
ば、０．１Ｍ食塩を含む５０ｍＭＴｒｉｓバッファー
（ｐＨ７．０）など〕を入れて植物組織を破砕し、その
後遠心によりラクトフェリン抽出液を得る。この抽出液
に７０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、遠心により沈
殿を回収する。この沈殿を適切な抽出液〔例えば、０．
１Ｍ食塩を含む５０ｍＭＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．
０）など〕に溶解し、透析し、適切なイオン交換クロマ
トグラフィーに供する。例えばＣＭ−セファデックスカ
ラムに吸着させ、１．１Ｍ食塩を含む適切なバッファー
で組換えラクトフェリンを溶出することができる。溶出
した後、透析を行って脱塩し、このタンパク質溶液を凍
結乾燥することにより、部分精製の組換えラクトフェリ
ン画分を得ることができる。

【００３０】こうして得られた部分精製組換えラクトフ
ェリン分画に対して、例えば、その抗菌活性を調べるこ
とができる。抗菌試験の検定菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ６６
３３）ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｖｉｓＪＣＭ−５
６７２ＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＩＤ
Ｆ−１ｂＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＩＩＤ−８６１などを用いることができる。

【００３１】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】《ヒトラクトフェリンｃＤＮＡの取得と発現用プラスミ
ドの構築》ヒトラクトフェリンｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢ
ａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ５３９６１）よ
りデザインした一対のプライマー、すなわち、配列表の
配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーＬＴ
Ｆ１、及び配列表の配列番号２で表される塩基配列から
なるプライマーＬＴＦ２をそれぞれ合成した。

【００３２】ヒト乳腺ポリＡ⁺ＲＮＡ（クローンテック
社）よりｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社）を用い
てｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、前述
の２本のプライマーＬＴＦ１及びプライマーＬＴＦ２を
用いて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン
社）によるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐ
ＣＲ）を行った。

【００３３】増幅したＰＣＲ断片をプローブに用いて、
ヒト乳腺ｃＤＮＡファージライブラリー（クローンテッ
ク社）からプラークハイブリダイゼーションにより、ラ
クトフェリンｃＤＮＡを有するクローンのスクリーニン
グを行った。得られた陽性クローンを前記ファージライ
ブラリーに添付のプロトコールに記載の方法により、フ
ァージからプラスミドに変換し、ヒトラクトフェリンｃ
ＤＮＡを有するプラスミドｐＤＲ−ＬＴＦＤＮＡを調
製した。このプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ（宝酒造
製）及びＸｂａＩ（宝酒造製）で２重切断し、市販ベク
ターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（東洋紡製）
の同部位にサブクローニングした。得られたプラスミド
をｐＢＳ−ＬＴＦと命名した。更に、このプラスミドＤ
ＮＡをＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ（宝酒造製）で２重切断
して得られるヒトラクトフェリン遺伝子を含む約２．４
ＫｂのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＢＡ〔滝本等，プ
ラントモレキュラーバイオロジー，第２６巻，第１
００７〜１０１２頁（１９９４年）〕のＢａｍＨＩ及び
ＳａｃＩとの間に存在するビアラホス耐性遺伝子と置換
する形でサブクローニングし、プラスミドｐＵＬＴＦを
得た。こうして得られたプラスミドｐＵＬＴＦの構造を
図１に示す。このプラスミドｐＵＬＴＦは、トウモロコ
シユビキチンプロモーター（図１のＵｂｉｐｒｏｍｏ
ｔｅｒ）、エクソン（図１のｅｘｏｎＩ）、イントロ
ン（図１のｉｎｔｒｏｎＩ）、ヒトラクトフェリンｃ
ＤＮＡ（図１のＬＴＦ）、ノパリンシンターゼのターミ
ネーター（図１のｎｏｓ３’）、そしてアンピシリン
耐性遺伝子（ａｍｐ）を有しており、後述する実施例に
おいて、イネへの形質転換に用いた。

【００３４】

【実施例２】《イネの形質転換》（１）完熟種子よりの胚組織摘出イネ品種コシヒカリの完熟種子を脱籾した後、３．５％
次亜塩素酸カルシュウム溶液中で、脱気撹拌しながら殺
菌を３０分間行った。その後、滅菌水で充分洗浄してか
ら滅菌濾紙上で水分を除き、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸（２，４−Ｄ）３ｐｐｍを含む、Ｎ６培地〔Ｃ．
Ｃ．Ｃｈｕ等，サイエンス・シニカ，第１８巻，第６５
９頁（１９７５年）〕にジェランガム０．４％を添加し
たカルス誘導培地（特開平５−２９２９５５号公報）に
置床し、２５℃にて暗所で培養した。培養開始から６日
後に、肥大してきた胚組織のみを摘出した。摘出した組
織は胚盤側を上にして、前記と同じ組成のカルス誘導培
地（特開平５−２９２９５５号公報）の入った６ｃｍシ
ャーレに並べた。並べ方は半径１ｃｍの円周上に沿って
１０〜２０個を並べてショット用シャーレとした。

【００３５】（２）パ−ティクルガンによる遺伝子導入パ−ティクルガン装置は、空気圧式のレ−ボック商工モ
デル２６０を用いた。実施例１で構築したプラスミドｐ
ＵＬＴＦと、実施例１で用いたプラスミドｐＵＢＡとを
１：１に混合したＤＮＡ液１６μｌを、森川らの方法
〔植物細胞工学，第４巻，第４３頁〜第４８頁（１９９
２年）〕に準じて、１ミクロン金粒子にコ−ティング
し、専用プロジェクタイル（弾）に乗せて、自然乾燥し
た。１弾当たり０．１ｍｇ金粒子及び０．４μｇＤＮＡ
を含む弾を、ショット用シャ−レに２弾ショットして
（発射圧力＝ポンピング８回；試料間距離＝６ｃｍ）、
２種類の遺伝子を導入した。

【００３６】（３）形質転換カルスの選択培養及び植物
体への再分化前記実施例２（２）でショットしたシャ−レより胚組織
を、ビアラホス１０ｐｐｍを含むカルス誘導培地（２，
４−Ｄの３ｐｐｍ及びジェランガム０．４％を添加した
Ｎ６培地）に移植し、２５℃暗所で７日間培養した後、
明所で培養を継続した。培養４〜８週間で遺伝子導入に
よりビアラホス耐性となったカルスが胚盤上に形成され
るので、そのカルス部分を切り出し、ビアラホス１０ｐ
ｐｍを含んだカルス誘導培地に移植した。

【００３７】こうして、ｐＵＬＴＦとｐＵＢＡとで形質
転換されたイネ由来のカルスを１５系統得た。このカル
スより沖井等の方法（特開平５−２９２９５５号公報）
に準じて植物体へ再分化させた。

【００３８】

【実施例３】《ウエスタン解析によるラクトフェリンタンパク質の検
出》実施例２で得られた１５系統の形質転換イネカルス
についてウエスタン解析を行ない、ラクトフェリンの発
現を調べた。カルスからのタンパク質試料の抽出は、カ
ルス０．１ｇに５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．０）２
００μｌと海砂を加えハンドホモゲナイザーで抽出し
た。得られた抽出液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心
し、その上澄液をタンパク質濃度測定して試料とした。
１ウェルあたりタンパク質５０μｇの量の試料を１０−
２０％グラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲル（第
一化学製，マルチゲル）電気泳動で展開し、ＰＶＤＦ膜
に転写した後、ウサギ抗ラクトフェリン血清を一次抗体
に、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体にして、
反応するバンドをコニカ発色キット（コニカ社）で、免
疫化学的に検出した。その結果の一部を図２に模式的に
示す。図２において、レーン１〜レーン４はそれぞれ形
質転換カルスの結果、レーンＣは非形質転換カルスの結
果、そしてレーンＬＴＦは標準品ラクトフェリンの結果
を示し、Ｍは分子量マーカーである。また、各形質転換
カルス及び天然ヒトラクトフェリン（標準品ラクトフェ
リン）では、矢印で示すほぼ同じ位置に、抗ヒトラクト
フェリン血清と反応する太いバンドが認められ、形質転
換カルスの発現量は強い物（レーン１、レーン２及びレ
ーン４）から弱いもの（レーン３）までばらついた。更
に、低分子量域にも数本の薄いバンド（図２では破線で
示す）が認められた。非形質転換イネカルスには、反応
するバンドが無いことも確認した。

【００３９】

【実施例４】《組換えラクトフェリンの精製》ラクトフェリン導入イ
ネカルス１５系統のうち、前記実施例３のウエスタン解
析において最も強い発現を示した系統をＫＬ−８と命名
した。このＫＬ−８系統由来のカルス４０ｇを、乳鉢と
乳棒を用いて破砕し、０．１Ｍ−ＮａＣｌを含む５０ｍ
Ｍ−Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）８０ｍｌ
で抽出し、遠心後の上清を回収して粗抽出液とした。こ
の粗抽出液に７０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、遠
心により沈殿を回収した。この沈殿を０．１Ｍ−ＮａＣ
ｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ
７．０）１０ｍｌに溶解し、同バッファーに透析した。
次いで、Ｓｔｏｗｅｌｌらの記載〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，第２７６巻，３４９〜３５９頁（１９９１年）〕
に従い、ＣＭ−セファデックスカラムに吸着させ、１．
１Ｍ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．０）により溶出させた。これを、再度
０．１Ｍ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−塩酸バ
ッファー（ｐＨ７．０）に透析した後、凍結乾燥し、部
分精製ラクトフェリン分画を得た。

【００４０】非形質転換カルス４０ｇからも同様な方法
によりネガティブコントロールとする部分精製画分を得
た。

【００４１】

【実施例５】《組換えラクトフェリン画分の抗菌活性》実施例４にお
いて部分精製した組換えラクトフェリン画分を用いて抗
菌試験を実施した。検定菌としてはバチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ；ＡＴＣＣ６
６３３株）を用いた。ネガティブコントロールとする非
形質転換カルス部分精製画分、ポジティブコントロール
とするヒトラクトフェリン（シグマ社製）、そして形質
転換イネカルスからの組換えラクトフェリン部分精製画
分を、それぞれ適当量の水に溶解し、４ｍｍシリンジフ
ィルター（ワットマン社製）により無菌濾過した。一
方、ＬＢ液体培地にて一晩培養したバチルス・ズブチリ
スＡＴＣＣ６６３３菌液を２倍濃度の前記ＬＢ液体培地
で希釈し、菌数を１×１０⁶／ｍｌ程度に調整した。こ
の菌液１００μｌと、前記の無菌濾過したラクトフェリ
ン又はコントロール溶液１００μｌとを混ぜて混合培養
液とし、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにて、３７
℃で２時間あるいは２４時間振とう培養し、その時点で
の生菌数を測定した。混合培養液における供試試料の最
終濃度は、標準ラクトフェリンではラクトフェリン量と
して０．５ｍｇ／ｍｌ、非形質転換カルス画分では全タ
ンパク質として０．２５ｍｇ／ｍｌである。また、組換
えラクトフェリン画分では全タンパク質として非形質転
換カルスと同じ０．２５ｍｇ／ｍｌであり、これをＥＬ
ＩＳＡよりラクトフェリン量として概算すると０．０５
ｍｇ／ｍｌである。なお、ブランク試験では、前記菌液
１００μｌと無菌水１００μｌと混ぜた混合培養液を使
用した。更に、前記のヒトラクトフェリン、又は組換え
ラクトフェリン部分精製画分については、それらを１０
０℃にて５分間煮沸処理した後に、前記と同様に混合培
養液として抗菌試験を行った。それらの結果を表１に示
す。

【００４２】

【表１】熱処理２時間後の生菌数２４時間後の生菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）（ｃｆｕ／ｍｌ）無添加（ブランクテスト）なし６．３×１０⁶ １．０×１０⁸ ラクトフェリン（標準品）なし９．６×１０⁵ ４．０×１０⁷ ラクトフェリン（標準品）あり７．６×１０⁶ ２．４×１０⁸ 非形質転換イネ精製画分なし５．８×１０⁶ ６．０×１０⁸ ラクトフェリン導入なし１．０×１０⁴ ＜１．０×１０⁶ イネ精製画分ラクトフェリン導入あり１．０×１０⁴ ＜１．０×１０⁵ イネ精製画分

【００４３】表１に示すように、ラクトフェリン導入イ
ネカルスより精製したラクトフェリン画分は、ヒトラク
トフェリン標準品よりも強い抗菌活性を示した。また、
沸騰処理を行うと、ヒトラクトフェリン標準品では抗菌
活性が消失するのに対して、イネ由来組換えラクトフェ
リン画分では非加熱処理体と同様の強い抗菌活性を保持
していた。

【００４４】

【実施例６】《イネにおける種子特異的発現》（１）イネグルテリンプロモーターによるイネ発現用プ
ラスミドの構築イネＧｌｕＢ１遺伝子の塩基配列〔高岩等，プラント・
モレキュラー・バイオロジー，第１７巻，第８７５〜８
８５頁（１９９１年）〕より、イネグルテリンプロモー
ターに対して、それぞれ配列表の配列番号３及び配列番
号４で表される一対のプライマーを合成した。また、同
様にイネグルテリンターミネーターに対して、それぞれ
配列表の配列番号５及び配列番号６で表される一対のプ
ライマーを合成した。また、イネＧｌｕＢ１遺伝子を有
するラムダＩＮＥ９ＤＮＡ〔高岩等，プラント・モレ
キュラー・バイオロジー，第１７巻，第８７５〜８８５
頁（１９９１年）〕を鋳型ＤＮＡとして、前記実施例１
と同様にＰＣＲ法により、各々対応するプライマー対を
用いてプロモーター断片及びターミネーター断片を増幅
した。増幅されたＧｌｕＢ−１プロモーター断片を制限
酵素ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩの２重切断を行い、同
様にＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩの２重切断した市販ベ
クターｐＵＣ１８（宝酒造）の同部位にクローニングし
た。このプラスミドをＳａｃｌ及びＥｃｏＲｌで２重切
断し、ＰＣＲ法により増幅した前記のＧｌｕＢ−１ター
ミネーター断片も同様にＳａｃｌ及びＥｃｏＲｌで２重
切断し、同部位にクローン化した。こうして図３に示す
イネ発現用プラスミドｐＲＰＢ１を取得した。こうして
得られたプラスミドｐＲＰＢ１の構造を図３に示す。こ
のプラスミドは、イネグルテリンプロモーター（図３の
ＰＧｌｕＢ−１）及びイネグルテリンターミネーター
（図３の３’ＧｌｕＢ−１）と、アンピシリン耐性遺伝
子（ａｍｐ^r）を含んでいる。前記プラスミドｐＲＰＢ
１のＢａｍＨＩ及びＳａｃｌとの間に、実施例１で作成
したヒトラクトフェリンｃＤＮＡを有する断片をサブク
ローニングし、ｐＡＦＴ１００を得た。このプラスミド
ｐＡＦＴ１００は、図４に示すように、イネグルテリン
プロモーターとイネグルテリンターミネーターとの間
に、ヒトラクトフェリンシグナルペプチド（図４のＬＦ
ｓｉｇｎａｌ）と成熟ヒトラクトフェリン（図４のｍ
ａｔｕｒｅＬＦ）とからなる前駆体ヒトラクトフェリ
ンｃＤＮＡを有している。

【００４５】（２）イネへの遺伝子導入と形質転換植物
の作成前記のプラスミドｐＡＦＴ１００と選抜マーカー・ビア
ラホス耐性遺伝子を有するｐＤＭ３０２〔ＪｕｎＣａ
ｏ等，プラント・セル・レポーツ，第１１巻，第５８６
〜５９１頁（１９９２年）〕とを１：１で混合して得た
ＤＮＡ溶液を用い、実施例２（１）及び（２）と同様に
処理することによってイネ完熟胚に遺伝子を導入した。
続いて、実施例２（３）と同様に、ビアラホスを含むカ
ルス誘導培地において形質転換カルスの選抜を行い、そ
の後、再分化させて、ｐＡＦＴ１００とｐＤＭ３０２と
で形質転換されたイネ植物体５系統（ＡＦＴ１００−
３、ＡＦＴ１００−３５、ＡＦＴ１００−４３、ＡＦＴ
１００−５４、及びＡＦＴ１００−５５）を得た。これ
らのイネ植物体を、培養土に鉢上げし、順化した後に閉
鎖系温室で栽培した。

【００４６】（３）ＥＩＡによるヒトラクトフェリンタ
ンパク質の検出前記の実施例６（２）で得られた５系統のｐＡＦＴ１０
０導入イネ（ＡＦＴ１００−３、ＡＦＴ１００−３５、
ＡＦＴ１００−４３、ＡＦＴ１００−５４、及びＡＦＴ
１００−５５）の葉、根、及び種子（以下、コメ粒と称
することもある）におけるラクトフェリンの発現を調べ
た。各々の籾を除いた玄米３粒ずつをろ紙に包んでペン
チでつぶし、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入
れ、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．０）性０．５Ｍ塩
化ナトリウム溶液５００μｌを加えた。超音波処理（ハ
ンディーソニック；株式会社トミー精工）によって抽出
し、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清をＥＩＡ
（ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ）の試料と
した。葉と根については、葉又は根１００ｍｇを１．５
ｍｌエッペンドルフチューブに入れ、５０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．０）性０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液２０
０μｌを加え、ハンドホモゲナイザーを用いて抽出し
た。１２０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清をＥＩＡ
の試料とした。

【００４７】ウサギで作成した抗ヒトラクトフェリンＩ
ｇＧ抗体（２μｇ／ｍｌ）１００μｌを、９６穴タイタ
ープレートに分注し、７℃で一晩固定した。続いて、ブ
ロッキング溶液〔１％Ｎｏｎｆａｔｄｒｙｍｉｌｋ
（バイオラッド社），０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，０．５
％Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（シグマ社），１４０ｍＭ−
ＮａＣｌ，２．７ｍＭ−ＫＣｌ，８ｍＭ−Ｎａ₂ＨＰＯ
₄・１２Ｈ₂Ｏ，１．５ｍＭ−ＫＨ₂ＰＯ₄〕を用い
て、７℃で一晩マスキングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶
液（１４０ｍＭ−ＮａＣｌ，２．７ｍＭ−ＫＣｌ，８ｍ
Ｍ−Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ，１．５ｍＭ−ＫＨ₂
ＰＯ₄，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３〜５回洗浄し
た。標準ヒトラクトフェリンあるいは測定したい抽出液
サンプルを倍々希釈系列で１００μｌ分注し、３７℃で
６０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液３００μｌ
で３〜５回洗浄した。抗ヒトラクトフェリンＩｇＧ（Ｆ
ａｂ’）−ＨＲＰ（西洋わさびパーオキシダーゼ）２次
抗体１００μｌを加え、３７℃で６０分間静置した。Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液３００μｌで３〜５回洗浄した。
オルトフェニレンジアミンジヒドロクロライド（ＯＰ
Ｄ）溶液〔ＯＰＤ５ｍｇを０．０３％過ホウ酸ナトリウ
ム含有０．０５Ｍクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ
５．０：シグマ社製：Ｐ−４９２２）１０ｍｌに溶解さ
せたもの〕１００μｌを加え、発色を見ながら、１Ｍ硫
酸１００μｌによって反応を停止した。マイクロプレー
トリーダーにより４９２ｎｍの吸光度を測定した。組換
えイネにおけるヒトラクトフェリンの発現量は、標準ヒ
トラクトフェリンの標準曲線から計算した。また、タン
パク質量は、プロテインアッセイキット（バイオラッド
社）により、添付のプロトコールに従って測定した。結
果を表２に示す。

【００４８】

【表２】個体名米粒（μｇ／粒）葉根ＡＦＴ１００−３１．５ＮＤＮＤＡＦＴ１００−３５０．０６ＮＤＮＤＡＦＴ１００−４３２．５ＮＤＮＤＡＦＴ１００−５４０．０５ＮＤＮＤＡＦＴ１００−５５０．０３ＮＤＮＤＮＤ：検出できず（検出限界＝０．０１μｇ／ｍｇ全タ
ンパク質）ラクトフェリンは組換えイネの葉及び根からの試料では
検出されず、コメ粒からの試料においてのみラクトフェ
リンの発現が認められた。

【００４９】

【実施例７】《トマトにおける発現》（１）トマト用発現ベクターの構築農林水産省生物資源研究所において作成されたバイナリ
ーベクターｐＢＥ２１１３〔光原等，ＰｌａｎｔＣｅ
ｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．，第３７巻，第４９〜５９頁
（１９９６年）〕を用いた。すなわち、ｐＢＥ２１１３
のＢａｍＨＩとＳａｃｌとの間のβ−グルクロニターゼ
と、実施例１で作成したヒトラクトフェリンｃＤＮＡと
を置換する形でサブクローニングし、ｐＡＦＴ１０９を
得た。図５に、前記プラスミドｐＡＦＴ１０９の制限酵
素地図を示す。このプラスミドは、右ボーダー配列（図
５のＲＢ）と左ボーダー配列（図５のＬＢ）との間に、
カリフラワーモザイクウイルスのエンハンサー（図５の
Ｅ）、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモー
ター（図５のＰ３５Ｓ）、タバコモザイクウイルスのオ
メガ配列（図５のΩ）、ヒトラクトフェリンｃＤＮＡ
（図５のＬＦｓｉｇｎａｌ及びｍａｔｕｒｅＬＦ）、
及びノパリンシンターゼのターミネーター（図５の３’
ｎｏｓ）を有し、更にカナマイシン耐性遺伝子（図５の
ｋｍ^r）を有しており、トマトをはじめとして多くの植
物において目的とするタンパク質の高発現を期待するこ
とができる。

【００５０】（２）トマトへの遺伝子導入と形質転換植
物の作成ＭＳ培地に無菌播種したトマト品種「秋玉」（農林水産
省野菜茶業試験場）から得られる子葉を約５ｍｍ幅に細
断した。一方、前記実施例７（１）で作成したプラスミ
ドを有するアグロバクテリウムをＬＢ培地中で一晩培養
し、そのアグロバクテリウム懸濁液に、前記の細断子葉
を５分間浸漬した。余分な菌液を無菌紙片で吸い取り、
１ｍｇ／リットルのトランス−ゼアチン（和光純薬）を
含むＭＳ培地（以下、ＺＭＳ培地と称することがある）
上に置床し、２８℃で２日間共存培養を行った。その
後、カルベニシリン（和光純薬；２５０μｇ／ｍｌ）を
含むＺＭＳ培地で、１６時間の照明下条件と８時間の暗
下条件とからなるサイクルを繰り返して、２５℃にて１
週間培養した。次に、カルベニシリン（２５０μｇ／ｍ
ｌ）及びカナマイシン（和光純薬；５０μｇ／ｍｌ）を
含むＺＭＳ培地上に移し、前記と同様の１６時間の照明
下条件と８時間の暗下条件とからなるサイクルを繰り返
して、２５℃で、２週間毎にカルベニシリン（２５０μ
ｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む
新鮮なＺＭＳ培地上に移しながら選抜を続けた。生育し
てきたカナマイシン耐性シュートを切り出し、カルベニ
シリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μ
ｇ／ｍｌ）を含むＭＳ培地に置床して、更に前記と同様
の１６時間の照明下条件と８時間の暗下条件とからなる
サイクルを繰り返して、２５℃で培養し、発根させた。
発根した形質転換トマトを培養土に鉢上げし、徐々に湿
度を落として順化させた後、閉鎖系温室で栽培し、カナ
マイシン形質転換体４系統（ＡＦＴ１０９−３、ＡＦＴ
１０９−６、ＡＦＴ１０９−７、及びＡＦＴ１０９−
８）を得た。

【００５１】（３）ＥＩＡによるヒトラクトフェリンタ
ンパク質の検出前記実施例７（２）で得られたｐＡＦＴ１０９導入トマ
ト植物体におけるラクトフェリンの発現を調べた。得ら
れた４系統について、その果実１０ｇを包丁で細かく切
り、ワーリングブレンダーに入れた。５０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．０）−０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液２０
ｍｌを加え、前記ワーリングブレンダーにより破砕し
て、抽出した。５０ｍｌディスポチューブ（ファルコン
社）に移し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心した。そ
の上清を試料として、実施例６（３）と同様にＥＩＡを
実施して、トマト果実におけるヒトラクトフェリンの発
現を確認した。結果を表２に示す。トマト果実におい
て、ヒトラクトフェリンの発現が認められた。

【００５２】

【表２】個体名全タンパク質当たりの発現量（％）ＡＦＴ１０９−３１．７ＡＦＴ１０９−６１．４ＡＦＴ１０９−７２．１ＡＦＴ１０９−８１．５

【００５３】

【発明の効果】本発明方法によって得られたラクトフェ
リン発現形質転換食用植物は、ラクトフェリンに基づく
生理機能を高活性で発現するので、その植物体からラク
トフェリンを抽出せずに、その形質転換植物体それ自体
（又はその少なくとも一部分）を、例えば、機能性食品
又は機能性飼料として動物（ヒト、家畜、コンパニオン
アニマルあるいは養殖動物）に直接摂取させることによ
り、その動物に、ラクトフェリンに基づく生理機能を効
果的に付与することができる。また、本発明方法によっ
て得られたラクトフェリン発現形質転換食用植物におい
ては、加熱処理後においても高いラクトフェリン活性が
維持されるので、加熱処理を伴う調理・加工食品又は飼
料の形態で効果的に摂取させることもできる。これらの
機能性食品又は機能性飼料には、抗菌活性、又は免疫増
強等の機能性付与を期待することができる。

【００５４】

【配列表】

【００５５】配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｎｏ配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 ACTTGTCTTC CTCGTCCTGC 20

【００５６】配列番号：２配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCGTCCAATT CAAGAATGG 19

【００５７】配列番号：３配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｎｏ配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CGGAAGCTTG ATCTCGATTT TTGAGGAATT 30

【００５８】配列番号：４配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 GGCGGATCCC TTAAGCTAAT TGATGTG 27

【００５９】配列番号：５配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｎｏ配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CGGGAGCTCT GTAATTGAGA ACTAGTG 27

【００６０】配列番号：６配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 GGCGAATTCT CTTAACTTTA CCTATGA 27

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＵＬＴＦの構造を模式的に示す説
明図である。

【図２】ウエスタン解析の結果を示す説明図である。

【図３】プラスミドｐＲＰＢ１の構造を模式的に示す説
明図である。

【図４】プラスミドｐＡＦＴ１００の構造を模式的に示
す説明図である。

【図５】プラスミドｐＡＦＴ１０９の構造を模式的に示
す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者安西弘行東京都荒川区東尾久８丁目４番１号株式会社アレルゲンフリー・テクノロジー研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物で機能することのできるプロモータ
ーと、植物で機能することのできるターミネーターと、
ラクトフェリン遺伝子とを連結した発現プラスミドを食
用植物の細胞に導入してラクトフェリン発現食用植物を
作出することにより、ラクトフェリンに基づく生理機能
を前記食用植物に付与する方法。
【請求項２】ラクトフェリンに基づく生理機能が、耐
熱性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】ラクトフェリンに基づく生理機能が、抗
菌活性である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】植物がイネ科植物、ナス科植物又はマメ
科植物である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項５】イネ科植物がイネ又はトウモロコシであ
る請求項４に記載の方法。
【請求項６】ナス科植物がトマトである請求項４に記
載の方法。
【請求項７】マメ科植物がダイズである請求項４に記
載の方法。
【請求項８】前記のラクトフェリン発現食用植物の少
なくとも一部分を摂取する動物が、ヒト、家畜、コンパ
ニオンアニマル又は養殖水産動物である請求項１〜７の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項９】植物で機能することのできるプロモータ
ーと植物で機能することのできるターミネーターとの間
にラクトフェリン遺伝子を連結した発現プラスミドによ
って形質転換された食用植物細胞。
【請求項１０】請求項９に記載の形質転換細胞を含
み、ラクトフェリンに基づく生理機能を有する食用植
物。
【請求項１１】請求項１０に記載の食用植物の少なく
とも一部分から得られ、ラクトフェリンに基づく生理機
能を有する機能性食品。
【請求項１２】請求項１０に記載の食用植物の少なく
とも一部分から加熱処理を経由して得られ、ラクトフェ
リンに基づく生理機能を有する食品。
【請求項１３】請求項１０に記載の食用植物の少なく
とも一部分から得られ、ラクトフェリンに基づく生理機
能を有する機能性飼料。