KR20030096319A - 안정한 유전자 전이 식물 제약 조성물들 및 이들의 제조방법들 및 피임약으로서의 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물들에서 발현된 제약 단백질들을 보존하는 처리 방법들을 제공한다. 본 발명에서 원료 식물 조직은 단백질 또는 제약적 효능의 현저한 손실 없이 안정한 동질체로 환원된다. 이 동질체는 제약 단백질을 추가로 추출하거나, 정제하거나 또는 침전시킬 필요 없이 제약적 목적들로 직접적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 동물 및 인간 용도에 효과적인 면역 피임법을 추가로 제공한다. 본 발명에 따라 피임성 단백질들을 발현시키고, 피임약이 타겟 종들에서 효과있게 하기 위해 전체로서, 또는 일부로 또는 가공 전에 동물에 전달될 수 있는 유전자 전이 식물 또는 식물 세포들의 생산 방법들이 개시된다.

Description

안정한 유전자 전이 식물 제약 조성물들 및 이들의 제조 방법들 및 피임약으로서의 이들의 용도{METHODS AND COMPOSITIONS FOR STABLE TRANSGENIC PLANT PHARMACEUTICALS AND THEIR USE AS CONTRACEPTIVES}
식물 베이스 백신들의 생산에 관하여, 유전자 전이 식물들에서 단백질들의 발현에서 현저한 진전들이 이루어져 왔다. 예를 들면, 여러 가지 발현 형태들, 집합체들 또는 융합체들은 미합중국 특허 제5,679,880호, 동 제5,484,719호, 동 제5,686,079호, 및 미합중국 특허 출원 제2002/0006411호에 기재된 바와 같이, 백신 서브유닛들, 항체들 및 치료용 또는 피임성 단백질들의 생산을 증가시키기 위해사용되어 왔다. 그러나, 유전자 전이 식물 백신 기술의 현재 상태는 제약학적 단백질이 유전자 잔이 식물 재료로부터 정제되거나 또는 표준화된 원료 상태의 조잡한 식물 조직이 소비될 것을 여전히 요구한다. 불행하게도, 투여 가능한 식물-유도 제약 물질을 생산하는 옵션들은 고유의 결점을 갖는다.
바람직한 식물-유도된 제약은 경구 투여될 수 있는 표준화된 식물 조직이다. 보다 상세하게는, 식물 재료는 상온에서 저장될 수 있고, 선적될 수 있고, 투여될 수 있는 것이 바람직하다. 그러나, 정제되지 않은 유전자 전이 식물 베이스 백신들은 i) 식물에서 식물로 발견되는 가변 단백질 발현 레벨들 및 ii) 단백질 저하로 인한 부패성의 고유 문제점들을 갖는다. 과일, 구근들, 뿌리들, 잎 또는 임의의 기타 식물 조직 등의 신선하게 수확된 농산물은 종래의 제약 요건들에 비해 비교적 짧은 보존 기간으로 인해 제한된다. 또한, 상이한 식물들, 클론들 또는 식물 조직들 사이에 발견되는 유전자 전이 단백질 축적의 가변 레벨은 제약 용도에 강제적인 복용량 일관성을 달성하는 데 현저한 어려움을 갖는다.
종래의 제약 기술은 제약 단백질들의 추출, 정제 및 농축 방법들을 제공하지만, 이것은 고가이고, 정제된 제품의 냉장을 필요로 하고, 식물 세포 자체에 의한 유전자 전이 단백질의 보호성 캡슐화를 허용하지 않는다. 따라서, 당업계에서는 식물에서 식물로 발견되는 가변 단백질 발현의 결점을 피하고, 원래 식물 재료로부터 추가의 정제를 필요로 하지 않는 안정한 유전자 전이 식물 베이스 제약들의 생산을 필요로 한다. 본 명세서에 기재된 처리 방법들은 매우 광범위한 용도들에 걸쳐 사용될 수 있는 실온에 안정한 동일한 제형을 생산하는 방식을 제공한다. 또한, 환경-안정성의 동질체는 본질적으로 푸울되고, 배치당 배치 기준으로 품질 관리된다. 추가로, 상기 유전자 전이 식물 처리 방법은 광범위한 제약적 제형들을 효율적으로 및 비용 효과적으로 생산할 수 있게 하는 처리 과정에 걸쳐 보조약, 완충액들, 항산화제들, 안정제들 또는 항원성 분말들의 통상의 부가를 허용한다. 안정한 무수 동질체는 백신용 및 병원성 질병들의 치료용으로 사용될 뿐만 아니라, 수정의 예방을 위해 사용될 수 있다.
수정은 정자와 난자의 표면 상의 중요한 조절 분자들 간의 복잡한 상호 작용이다. 이들 분자들이 재생 과정에서 행하는 생명 유지에 필요한 역할은 이들이 많은 종들에서 생식의 조절을 위한 타겟들로 만들기 쉽다.
모든 포유 동물의 난자들은 난자의 정자 수용체를 제공하는 3개의 글리코프로테인(ZP1, ZP2 및 ZP3)으로 구성된 비교적 단순한 코팅의 투명대로 포위되어 있다. 일부 포유 동물 이외의 종들의 투명대는 또한 제4의 글리코프로테인, ZP4을 포함한다. 투명대의 글리코프로테인 성분들은 수정하는 동안 및 발육 초기에 특이적 기능들을 수행하며, 이는 생쥐에서 잘 정의된다. ZP1은 ZP2 및 ZP3의 필라멘트들을 가교하는 구조 단백질이다. 수정 중에 정자는 초기에 ZP3에 결합되어, 정자의 선체(acrosome) 반응을 유도한다. 선체의 도입 후, ZP2는 투명대를 통해 정자의 침투에 필요한 제2 정자 수용체로서 작용한다. 수정 후, ZP2의 단백질 분해성 분열 및 ZP3의 변형은 다정자 수정의 예방에 포함되는 것으로 생각되었다.
수정하는 동안 투명대의 중요한 역할, 성장하는 난모세포들에서 그의 독특한 발현 및 강한 면역원성은 면역 피임 백신들의 개발을 위한 매력적인 타겟이 되게한다(에피파노 및 딘에 의해 검토됨, Reprod Fertil Dev. 1994;6:310). 투명대의 전체 존 또는 성분들에 의한 면역법은 영장류들, 토끼들, 설치류들 및 개들을 포함하는 여러 종들에서 수정을 억제하는 것으로 보여지고 있다(프라사드 등에 의해 검토됨(1996) J Reprod Fertil Suppl. 50:143). 이들 참고 문헌에 기재된 조성물들은 수정을 억제할 수 있는 한편, 이들은 침놓기 또는 주사에 의해 비경구적으로 투여되어야 하고, 따라서 경제적이고 광범위한 용도로는 실시될 수 없다. 본 발명과는 대조적으로 이들 참고 문헌들에 기재된 조성물들은 날것 먹이 또는 음식으로서 또는 소화 소비용으로 가공된 재료로서 효과적으로 투여될 수 없다.
피첸 등((1995) Vaccine 13:1051)은 주사에 의해 타겟 동물 또는 모델 동물 종들로의 정제된 전달을 위한 식물들 내의 피임성 단백질들을 생산하려 시도하였다. 이러한 예에서, 쥐의 ZP3 에피토프는 담배 모자이크 바이러스(TMV) 코트 단백질의 서열 내에서 조작되었고, TMV 감염 동안 담배에서 발현되었다. 바이러스 입자들(바이러스 외부 표면 상의 ZP 에피토프를 디스플레이함)은 비경구 투여를 위해 식물 재료로부터 조잡하게 정제되었다. 그러나, 바이러스 입자들은 생쥐 모델에서 동배 출산군(litter) 크기를 감소시키는 데 효과적이지 못하였다. 피첸 등은 동물에서 피임을 유도하는 방법을 진술하고 있지 않거나, 또는 동물에 유전자 전이 식물을 경구 투여하는 방법에 대해 진술하고 있지 않으며, 여기서 경구 투여는 평균 동배 출산군 크기를 적어도 50% 감소시킨다.
당업계에서는 날것 먹이, 또는 소화 소비용 음식으로서 동물에게 편리하게 경구 투여될 수 있고, 그것이 투여되는 동물들에서 동배 출산군 크기를 현저히 감소시키는 식물 조성물이 필요하다. 당업계에서는 발현을 위해 식물 바이러스들의 사용을 피할 필요가 있다. 따라서, 당업계에서는 식물 세포들 자체에 의해 직접적으로 피임성 단백질들을 발현시키고, 동물에 의한 식물 재료의 소비에 따른 점막의 면역 응답을 제공할 필요가 있다.
추정되는 인구가 60억 한계 너머로 계속 팽창함에 따라, 다른 야생 동물 종들의 인구 분포는 산업화된 인간의 환경 활동들에 의해 계속 심하게 영향을 받을 것이다. 20세기 동안, 인간의 토지 자원이나 수자원의 이용은 동물 종들의 개체수의 동력학들에 점점 심오한 영향을 미쳐 왔다. 세계 야생 동물 기금은 세계의 동물 종들의 1/3 이상이 다음 20년 이내에 멸종될 수 있을 것이라고 예측하고 있다. 특정 동물군 및 식물군 개체수를 멸종 또는 절멸 위기까지 감소시키는 것 외에, 특정 종들의 과잉 역시 현대 인류에 의해 유발되어 왔다. 특정 예로써, 초식 동물들의 생존은 지리적 봉쇄, 천적, 기후 조건들 및 음식의 유용성 등의 자연력에 의해 시대에 걸쳐 정률되어 왔다. 열거하기에는 너무 많은 영향들 중에서, 산업화된 세계는 농업 및 건축을 위해 숲들을 개간하고, 육식 동물들의 개체수 및 천연 범위를 감소시키고, 지리적 장벽들을 가로질러 종들을 도입하고, 기후 양극단에 반하는 자연적이지 못한 은신처를 제공하고, 제안된 동물의 권리들과 인간의 관심사가 종종 대립하는 사회 문화를 일으켜 왔다. 현재 과잉의 초식 동물 개체군들이 인간과의 공존 및 농업 생산량과 직접적으로 충돌하는 많은 예들이 있다. 이유들의 분류로 인해, 많은 이들 종들의 개체수 제어는 달성될 수 없었고, 대안의 방법들이 구해졌다.
따라서, 동물 종들의 체크되지 않은 증식으로 초래되는 손상을, 그 손상이 경제적이거나 환경적이거나 또는 동물의 복지에 대한 것이든지 무관하게, 완화시키기 위해 개체수를 관리하는 인정있는 기술들의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 더욱이, 효율적으로 및 비용 효과적으로 생산될 수 있는 제형들로 이를 행할 필요성이 존재한다.
본 발명은 유전자 전이 식물들로부터 유도되는 백신들, 항체들 또는 기타 치료 화합물들 등의 제약학적 활성 단백질들을 생산하기 위한 처리 기술들 뿐만 아니라 면역 피임법, 병원성 질병들에 대한 백신, 또는 기타 면역 반응성 화합물들의 염증에 반하는 치료 처치를 위해 인간들 및 동물들에 이들을 투여하는 것에 관한 것이다. 식물 베이스 백신들의 개발은 인간들 및 동물들의 백신에 유효한 접근법들을 현저히 진전시켰다. 백신들, 항체들 및 기타 인간 및 수의용 치료제들의 개발을 위한 유전자 전이 식물들의 사용은 치료 단백질 생산 효능을 증가시킬 뿐만 아니라, 주 생산 단가들을 실질적으로 감소시켰다.
도 1a는 Elisa에 의해 결정된 바의 T0식물들로부터 얻은 잎 및 과일 시료들 중의 LTB 함량.
도 1b는 Elisa에 의해 결정된 바의 T1식물들로부터 얻은 잎 및 과일 시료들 중의 LTB 함량.
도 1c는 Elisa에 의해 결정된 바의 LTB 함량에 관한 잎 및 과일 등위 매김들의 비교.
도 2a는 시험된 생쥐들에서 안티-LTB 항체들의 희석을 위한 평균 종말점. 막대들은 OD450판독치가 동일하게 처치된 6마리의 동물들의 0.1과 동일할 때 평균 혈청 희석을 나타낸다. 치료법은 비유전자 전이 토마토 페이스트(대조군)를 급식받은 생쥐들, 유전자 전이된 토마토 페이스트를 급식받은 생쥐들(시험) 및 퀼라자 추출물 분말(가루다) 10mg과 혼합된 유전자 전이 토마토 페이스트를 급식받은 생쥐들을 포함한다. 에러 막대들은 표준 에러를 나타낸다.
도 2b는 쥐의 ZP3 에피토프에 융합된 LT-B로 구성된 융합 단백질을 발현시키는 원상의 토마토 재료의 경구 투여후, 증가하는 안티-LTB 적정 농도들(시리즈 1)과 감소하는 생식력(시리즈 2) 간의 관계를 나타낸다. 제3의 데이터 세트는 토마토 재료에 혼합된 추가의 보조약을 수용한 실험군을 나타낸다.
도 3은 생쥐들의 수정률에 대한 시험된 재료들의 경구 전달 효과. 각각의 막대는 대조군이 비유전자 전이 토마토 페이스트를 급식받은 동물들로부터의 결과를 나타내고, 시험군이 유전자 전이 토마토페이스트를 급식받은 동물들로부터의 결과를 나타내고 시험군 + adj는 보조제 분말(가루다) 10mg과 혼합된 유전자 전이 토마토 페이스트를 급식받은 동물들로부터의 결과를 나타내는 특정 치료법에서 6마리 동물들의 평균을 나타낸다. 에러 막대들은 표준 에러를 나타낸다.
도 4는 들쥐들의 수정률에 대한 시험된 재료들의 경구 전달 효과. 각각의 막대는 대조군이 비유전자 전이 토마토 페이스트를 급식받은 동물들로부터의 결과를 나타내고, 시험군이 유전자 전이 토마토페이스트를 급식받은 동물들로부터의 결과를 나타내고 시험군 + adj는 퀼라자 추출 분말(가루다) 10mg과 혼합된 유전자 전이 토마토 페이스트를 급식받은 동물들로부터의 결과를 나타내는 특정 치료법에서 6마리 동물들의 평균을 나타낸다. 에러 막대들은 표준 에러를 나타낸다.
도 5a는 LTB 융합 구축물들.
도 5b는 추가의 LTB 융합 구축물들.
도 5c는 N-말단 융합 카세튼
도 6은 유전자 전이 담배(NT-1) 세포 현탁 배양액들 중에 발현된 3개의 면역 피임 융합체들에 대한 평균 및 "엘리트 라인" 발현 데이터를 예시한다. 에피토프 검출은 샌드위치 ELISA에 기초하고, 여기서 1차 포획은 LT-B에 대해 특이적이고, 2차 반응은 융합된 피임 에피토프(사용된 구축물에 따라 생쥐 ZP3 에피토프, 또는 GnRH 데카펩티드)에 대해 특이적이다. LTB-GnRH2에 대한 데이터는 융합 단백질의 구조물이 천연 올리고머화에 의해 간섭받고, 따라서 완전히 형성된 펜타머들의 검출은 현저히 감소되고, 샌드위치 ELISA에 의해 융합 에피토프를 검출하는 능력도 마찬가지이다.
표 1. 가공된 재료들의 개선된 동질성. 가공되거나 또는 가공되지 않은 유전자 전이 식물 재료의 항원 함량은 함께 푸울된 식물들의 "배치들" 내에 또는 특이적 식물 라인들로부터의 미혼합 시료들 중에 존재한다.
도 7은 상이한 절개 방법들에 의한 건조 시간의 효과를 보여주는 그래프도.
표 2는 상이한 조직들 내의 항원의 회수 및 상이한 방법들에 의해 얻어진 항원의 농도. 퓌레화 및 동결-건조에 의한 감자 생약들의 가공은 검출 가능한 항원의 농도를 평균 4.2배로 허용한다. 동일한 재료들이 동결-건조에 이어 입방 썰기 또는 4등분하기로 가공될 때, 검출 가능한 항원의 농도는 평균 15.2배 증가된다. 유전자 전이 토마토 등의 다른 재료들은 퓌레화가 동결에 앞서 재료 균질화 방법으로서 사용될 때 항원에 대한 유사한 파괴 효과를 보여준다. 유전자 전이 당근 재료들이 동결 건조에 의해 (퓌레화나 슬라이싱 없이) 가공될 때, 원료 물질에 비교되는 항원의 농도는 질량의 감소에 직접적으로 비례하고, 추가로 이러한 공정에 의해 검출될 수 있는 항원의 보존을 지시한다.
도 8은 분류된 재료들에서 시간 경과에 따른 습기 재흡수를 나타내는 그래프도.
도 9는 항원 안정성을 나타내는 그래프도.
도 10은 T2 과일 재료 내의 LTB 함량에 대한 가공 효과. 굵은 박대들은 푸울된 과일의 평균 LTB 농도를 나타내고, 에러 막대들은 평균의 표준 에러를 나타낸다.
도 11은 성체의 혈청 시료들의 안티-LTB 종말점 희석들. 대조군 막대는 야생형 토마토 분말을 급식받은 생쥐들의 평균 종말점 혈청 희석을 나타내고, 유전자 전이 막대는 유전자 전이 토마토 분말을 급식받은 생쥐들의 평균 종말점 혈청 희석을 나타내며, 유전자 전이 + 보조약 막대는 퀼라자 추출 분말과 함께 유전자 전이 토마토 분말을 급식받은 생쥐들의 평균 종말점 희석을 나타낸다. 종말점 희석은 0.1의 OD 450nm 판독치를 수용한 혈청의 제1 희석인 것으로 결정된다. 대조군n=3, 유전자 전이 n=4, 및 유전자 전이 + Adj n=2. 에러 막대들은 평균의 표준 에러를 나타낸다.
도 12는 새끼의 혈청 시료들의 안티-LTB 종말점 희석들. 대조군 막대는 야생형 토마토 분말을 급식받은 생쥐들로부터 새끼들의 평균 종말점 희석을 나타내고, 유전자 전이 막대는 유전자 전이 토마토 분말을 급식받은 생쥐들로부터 새끼들의 평균 종말점 혈청 희석을 나타내며, 유전자 전이 + 보조약 막대는 퀼라자 추출 분말과 함께 유전자 전이 토마토 분말을 급식받은 생쥐들로부터 새끼들의 평균 종말점 희석을 나타낸다. 종말점 희석은 0.1의 OD 450nm 판독치를 수용한 혈청의 제1 희석인 것으로 결정된다. 대조군 n=18, 유전자 전이 n=17, 및 유전자 전이 + 보조제 n=13. * 최소 희석(25중 1)이 사용된 0.1 미만의 OD를 수용한 혈청 시료들을 함유함. 에러 막대들은 평균의 표준 에러를 나타낸다.
도 13은 댐과 새끼 역가들 간의 관계. 댐 종말점 희석은 대응하는 동배 출산군의 출생에 근접하게 취한 혈청 시료의 종말점이고, 새끼의 종말점 희석은 동배 출산군의 평균 종말점을 나타낸다. 종말점 희석은 0.1의 OD 450nm 판독치를 수용한 혈청의 제1 희석인 것으로 결정된다. 댐 n=7, 동배 출산군 n=9, 및 새끼 n=41
도 14a는 동결 건조된 LT-B 감자의 안정성 연구 차트.
도 14b는 동결 건조된 LT-B 감자의 안정성 연구 그래프도
도 15는 동결 건조된 HAO NT 세포들의 안정성 연구.
도 16은 동결 건조된 HA11O-A11 감자의 안정성 연구.
도 17은 동결 건조된 SLT 102 세포들의 안정성 연구.
상세한 설명
본 발명은 유전자 전이 식물 생약들의 생산 방법들을 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법들은 실온에서 안정하고, 균질하고 제약학적으로 잠재적인 무수 유전자 전이 식물 재료의 생산을 허용한다. 일반적으로 생약을 생산하는 원상 그대로 또는 분배된 유전자 전이 식물은 당업계에 공지된 음식물 가공 기술들을 통해 건조되거나 또는 동결/건조된다. 이어서, 무수 동질체 생성물은 제약 단백질을 추가로 추출하거나, 정제하거나 또는 침전시킬 필요 없이 치료학적으로 사용될 수 있다.
결과의 유전자 전이 식물 재료들은 용이하게 다루어질 수 있고, 12개월까지 저장될 때 주변 온도들에서 안정한 제형화된 분말들을 포함한다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 배치 가공은 식물들 또는 식물 조직들 간의 검출 가능한 항원에서 일치도를 현저히 증가시키고, 개선된 효능을 위해 항원을 농축시킨다.
유전자 전이 식물 종들
본 발명을 위해 사용될 수 있는 식물들로는 쌍떡잎 식물 타입 및 외떡잎 식물 타입 모두를 들 수 있다. 이들은 당근, 시금치, 후추, 감자, 토마토, 사과, 밀, 호밀, 대두, 쌀, 옥수수, 콘 옥수수, 딸기, 나무 딸기 등의 딸기류, 알팔파 및 바나나를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 음식물로서 인간들이 사용하거나 동물 먹이의 성분들로서 사용되는 식용 식물들은 쌍떡잎 식물들이기 때문에, 외떡잎 식물들이 동물 먹이로서 유용하더라도, 쌍떡잎 식물이 전형적으로 사용된다. 이들 식물 백신들로부터 유도된 세포들 및 종자들은 또한 본 발명에 따라 유용하다.
유전자 전이 식물은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 일 실시 형태에서, 토마토, 감자 및 당근을 포함하는 유전자 전이 식물 종들의 범위는 임의의 살충제나 제초제를 도포하지 않는 생체 안정성 레벨 1의 온실 봉쇄 조건들 하에 성장하고, 성숙기까지 성장하게 한다.
본 발명에 유용한 유전자 전이 식물들은 이질성 단백질들을 발현시킨다. 적절한 이질성 단백질들의 예로는 노르워크 바이러스 캡시드 단백질(NVCP), 조류 인플루엔자 혈구 응집 항원(AIV-HA), 뉴캐슬병 바이러스 휴라미니다제(NDV-HN), 투명대 글리코프로테인 3(ZP3), B 형 간염 표면 항원(HBsAg), 식물들에서 제조된 항체들(예, "플랜티바디즈") 및 기타 치료용 단백질들(예, 엔도스타틴 및 안지오스타틴)을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
수확
유전자 전이 식물 재료는 손이나 기계에 의해서 또는 당업계에 공지된 임의의 수단들에 의해 수확될 수 있다. 수확 방법은 식물 종들에 따라 변화할 수 있다. 일 실시 형태에서, 유전자 전이 토마토 또는 당근은 전체 배치로서 수확될 수 있고, 가공 전에 4℃에서 저장될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 중간 정도 익거나 잘 익은 것으로 보이는 유전자 전이 토마토 열매는 6주간에 걸쳐 2주마다 수확하고, 수확 일에 가공하였다. 추가의 실시 형태에서, 잎 또는 줄기 재료들은 토양 및 생체 적재물을 제거하기 위해 0.1% 염소 용액(1% 클로락스) 중에서 토마토 열매, 감자 구근들 또는 당근 뿌리를 세정하기 전에 손으로 토마토 열매, 감자 구근들, 또는 당근 뿌리를 제거한 것이다. 기록 유지의 목적으로, 각각의 배치를 계수하고, 칭량하고, 하베스트 앤 처리 레코드 시트들이 수반되었다.
균질화
유전자 전이 식물의 균질화는 건조 전후에 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, 균질화는 건조 전에 수행되고, 신선하게 수확된 식물 재료들의 조잡한 펄핑 및 혼합을 포함하고, 블렌딩된 재료들의 동결 및 후속 동결 건조가 이어진다. 슬라이싱, 블렌딩 또는 분쇄의 제1 공정은 원료 식물 조직들(과일, 구근들, 잎, 종자 등)을 펄프 혼합물로 감소시킨다. 이러한 혼합물은 원상 그대로의 식물 세포들 및 분쇄된 세포 파편들을 모두 함유하는 것으로 추정된다. 이러한 공정의 장점은 과일 또는 구근들 등의 보다 큰 식물 기관들의 관리 가능한 혼합물로의 감소이고, 그에 따라 조직들 간의 균질한 단백질 함량의 편차는 재료의 보다 균일한 배치로 조합된다. 모든 식물 세포 통합성을 완전히 붕쇄시킴 없이 균일한 배치를 제공하는 능력은 후속 처리 단계 동안 균질한 단백질 저장을 위한 안정한 환경을 제공한다. 다른 실시 형태에서, 균질화는 가공 전에 식물 재료들에 대한 최소 가공을 필요로 한다. 균질화는 슬라이스되거나, 4등분되거나 또는 원상 그대로의 재료들의 동결 건조 후에 수행된다. 결과의 재료들은 미세한 분말로 으깨지고, 단일 배치 용기 내로 조합되고, 균질한 혼합물을 얻기 위해 진탕 또는 무수 블렌딩 등의 기계적 수단에 의해 철저히 혼합되었다.
분배
분배를 위해, 전체 식물 또는 원상 그대로의 식물 부분들은 당업계에 공지된수단에 의해 크기가 감소될 수 있다. 분배 수단으로는 입방 썰기, 4등분하기, 저미기, 슬라이싱, 다지기, 퓌레로 만들기, 펄핑, 분쇄, 으깨기, 압착 또는 크래킹을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
퓌레로 만들기가 바람직한 경우, 신선하게 수확된 과일, 구근들 또는 뿌리들은 약 1분 동안 스테판 공업용 버티칼 믹서/슬라이서를 사용하여 퓌레로 만든다. 최대 부피가 약 20lbs인 재료가 단 일회에 퓌레로 되는 것이 바람직하다. 토마토를 퓌레로 만들 때, 일정량의 물(500ml 이하)이 퓌레화 공정을 보조하기 위해 부가될 수 있다. 퓌레로 만들어진 재료들의 온도는 2℃를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 일 실시 형태에서, 동질체는 분명하게 라벨링된 냉동기 트레이들에 부어져 -40℃에서 저장된다. 임의의 유전학적으로 변형된 펄프 또는 종자의 손실을 피하기 위해, 믹서/슬라이서는 종이 타월로 닦여질 수 있다.
재료들은 또한 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 4등분되거나, 껍질 벗겨지거나 또는 슬라이스될 수 있다.
탈수
일 실시 형태에서, 4등분되거나, 껍질 벗겨지거나 또는 슬라이스된 유전자 전이 식물 재료는 냉동기 트레이들로 옮겨지고 공업용 동결 건조기 내에 위치되고 25℃의 최대 선반 온도와 함께 30℃의 온도에서 2-6일 동안 동결-건조되었다. 이어서, 결과의 재료들은 라벨링된 용기들 내로 조합되고, 완성된 하베스트 앤드 프로세싱 레코드 시트들로 보고되었다. 다른 실시 형태에서, 유전자 전이 식물 재료는 1-갤런 스테인레스강 워링 블렌더 내에서 슬라이스되고 재료들은 500㎖ 또는 1ℓ들이 플라스크 내로 옮겨지고, 실험실용 동결 건조기를 사용하여 동결 건조되었다. 이 경우에, 재료들은 30℃의 온도에서 1-6일 동안 건조되었다.
항원 농도의 결정
관심있는 항원들의 농도를 결정하기 위한 식물 재료들의 분석은 효소 링크된 면역소르밴드 평가(ELISA) 또는 식물 조직들에 함유된 항원에 적절한 응집 반응 평가를 이용하여 달성될 수 있다. 특이적 항원에 대해 선택된 평가 방법은 원료 재료 및 가공 재료 모두를 평가할 때 일관되게 적용되어야 했다.
안정성 및 부형제 사용
주변 온도에서 가공된 재료들의 안정성을 평가하기 위해, 10-50그램의 재료의 시료들을 동결 건조 직후에 제거하고, 실험실 선반 상에 저장하기 전에 기밀 백 내 및 2차 용기 내에 두었다. 주변 온도는 23℃±2℃로 유지되었다. 가공된 재료들의 나머지는 4℃에서 또는 -20℃에서 저장되었다. 재료는 주변 온도에서 저장된 재료들의 상대적 안정성을 평가하기 위해 적절한 평가에 의해 비교되는 각각의 조건 및 항원 함량 하에 저장된 재료들로부터 주기적으로 취하였다.
피임법
본 발명은 또한 피임을 유도할 수 있는 단백질들을 발현시키는 유전자 전이 식물들이 발생되고, 동물로의 유전자 전이 식물 재료의 투여는 효과적인 피임법이 달성되도록 피임성 단백질에 대한 점막 면역 응답을 유도하기에 충분하다는 발견에 기초한다. 본 발명은 피임성 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 면역 피임법을 제공하고, 여기서, 유전자 전이 식물의 투여는 그것이 투여되는 동물에서 점막 면역 응답을 유도한다. 본 발명은 또한 동물에게 투여하기 위해 본 발명에 유용한 피임성 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물을 제조하는 방법을 제공하고, 추가로 동물로의 투여에 따라 그 동물에서 피임을 유도할 수 있는 유전자 전이 식물을 제공한다.
피임성 단백질들
본 발명은 식물 재료가 투여되는 동물에서 피임을 유도할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 유전자 전이 식물 재료, 그의 세포들을 제공한다. 본 발명에 유용한 피임 단백질들로는 투명대 글리코프로테인들, 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH), 류티나이징 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 류티나이징 호르몬(LH), 락테이트 데히드로게나제(LDH), 및 항정자 항원들을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
투명대 글리코프로테인들
투명대는 난모세포를 발육시키는 거칠고, 굴절성의 세포외 글리코프로테인 매트릭스이다. 그의 특징적인 흠있는 외관은 그것이 관통되는 수많은 미세한 커넬들로부터 기인한다. 난포 세포들로부터의 세포질 공정들은 ZP를 통해 확장하고 때때로 난모세포의 플라즈마 멤브레인을 함입시킨다. 난포 세포들의 세포질 공정들은 난모세포의 표면으로 영양 물질을 수송하기도 한다. 또한, 난모세포의 마이크로 융모는 ZP로 확장하여 난모세포의 표면에서 흡수 용량을 증가시킨다[일반적으로, W.J. 해밀턴, 편집, 해밀턴, 보이드 및 모스맨의 Human Embryology, 27-33 및 54-64페이지(1972); J.B. 워쇼 편집, The Biological Basis of Reproduction andDevelopmental Medicine(1973) 참조]. 본 발명에서 피임성 단백질들로서 유용한 투명대(ZP) 글리코프로테인들은 ZP 글리코프로테인들 1, 2, 3 및 4를 포함하여, ZP에 대한 항체들을 유도할 수 있는 글리코프로테인 매트릭스의 모든 형태들을 포함한다. 이들은 배란전 기간 동안 난모 세포의 발육에서 후기에 나타나는 ZP 에피토프들 뿐만 아니라 배란 후에 발현되는 에피토프들을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 피임성 단백질은 ZP3 글리코프로테인 또는 그의 에피토프이다. 본 발명의 피임성 단백질의 "에피토프"는 적어도 6, 8, 10, 12, 14, 20 및 30에 이르는 아미노산 길이를 갖는다. 본 명세서에 사용된 바의 본 발명에 유용한 피임성 단백질의 "에피토프"는 점막의 면역 응답을 고무시킬 수 있는 피임성 단백질의 일부이다. 피임성 단백질의 에피토프가 점막의 면역 응답을 고무시키는 능력은 피임성 에피토프가 당업계의 숙련자들에게 공지된 기술을 사용하여 투여된 동물에 존재하는 분비선 IgA의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 피임성 에피토프가 투여된 동물에 존재하는 분비선 IgA의 양의 측정은 안티-IgA 항체들을 사용하여 ELISA에 의해 측정될 수 있고, 에피토프가 투여되지 않은 동물에서의 IgA 레벨들에 비교될 수 있다. 당업계에 공지된 통계학적 시험을 사용하여 측정된, 2마리의 동물들에서 sIgA 레벨들 간의 통계학적으로 현저한 차이는 에피토프에 의한 점막의 면역 응답의 자극을 나타낸다. 본 발명에 유용한 통계학적 시험들을 위한 P 값은 적어도 <0.1, <0.05, <0.01, <0.005, <0.001, <0.0005 및 바람직하게는 <0.0001이다.
상이한 종들의 ZP의 통상의 형태학적 특성들에 불구하고, 상이한 동물 종들의 ZPs는 면역학적으로 독특한 영역들 또는 "에피토프들"을 갖는다(티몬스 등, In: Perspectives in Immunoreproduction: Conception and Contraception(매써 등, 편집) Hemisphere Publ. 242-260페이지(1988)). 많은 ZP 단백질들이 독특한 동물 종들로부터 단리되었고, 본 발명의 피임성 단백질들로서 유용하다.
돼지로부터 단리된 투명대 단백질들은 다음을 포함한다: PZI, 던바 등, Biol. Reprod. 24:1111(1981)에 의해 단리된 40-110kD 단백질; PZII, 70-110kD 단백질, PZIII, 95-118kD 단백질 및 PZIV, 18-25kD 단백질, 모두 던바 등에 의해 단리됨(Biol. Reprod. 32:619(1985)); 90K, 89-119kD 단백질, 65K, 61-83kD 단백질, 55K, 47-66kD 단백질, 및 25K, 18-26kD 단백질, 모두 헤드릭스, J.L. 및 워드립, N.J.에 의해 단리됨(Biochem. 157:63(1986)); ZP1, 82-118kD 단백질, ZP2, 58-96kD 단백질, ZP3(PPZA), 40-74kD 단백질, 및 ZP4, 21kD 단백질, 모두 수브라마니언 등에 의해 단리됨(Biol. Reprod. 24:933(1981)); 87K (ZP1/ZP2), 77-97kD 단백질, 58K, 40-70kD 단백질, 모두 유레위쯔 등에 의해 단리됨(Biol. Reprod. 29:511(1983)); 데글리코실화된 ZPI, 35kD 단백질; PZII, 55kD 단백질; 및 PZIII, kD 단백질, 모두피임법 및 수정의 촉진에 대한 면역학적 접근법들(Immunological Approaches to Contraception and the Promotion of Fertility), G.P. 탈워(편집), 뉴욕: 플레넘 251-268페이지(1986)에 기재된 바와 같이 스키너 및 던바에 의해 단리됨; 사코 등에 의해 단리된 분자량 45kD의 데글리코실화된 ZP3(J. Reprod. Fertil. 76:575(1986)).
단리된 토끼 투명대 단백질들은 다음을 포함한다: 각각 68-125kD, 80-100.5kD, 및 100-132kD의 분자량을 갖는 PZI, PZII 및 PZIII, 모두 던바 등에 의해 단리됨(Biol. Reprod. 24:1111(1986)); 각각 100-118kD, 83-110kD, 및 80-92kD의 분자량을 갖는 PZ1, PZ2 및 PZ3, 모두 싸코 등에 의해 단리됨(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 167:318(1981)); 각각 65kD, 및 80kD의 분자량을 갖는 데글리코실화된 ZPI, 및 PZII, 모두Immunological Approaches to Contraception and the Promotion of Fertility, G.P. 탈워(편집), 뉴욕: 플레넘 251-268페이지(1986)에 기재된 바와 같이 스키너 및 던바에 의해 단리됨; 데글리코실화된 RZIII, 티몬스 및 던바에 의해 단리된 90kD 단백질(Biol. Reprod. 36:1275(1987)).
다음을 포함하는 많은 생쥐의 투명대 단백질들이 단리되었다: 각각 200kD, 120kD, 및 83kD의 분자량을 갖는 PZ1, PZ2 및 PZ3, 모두 블레일 및 워사맨에 의해 단리됨(Dev. Biol. 76:185(1980)); 및 각각 166-122kD, 및 90-92kD의 분자량을 갖는 PZ1, 및 PZ2, 모두 싸코 등에 의해 단리됨(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 167:318(1981)). 블레일 등 및 싸코 등에 의해 보고된 바의 생쥐의 ZP1 및 ZP2의 분자량들의 차이는 블레일은 비환원 조건 하에 2D-PAGE를 사용하는 한편, 싸코는 환원 조건 하에 2D-PAGE를 사용했다는 사실 때문일 것이다.
고양이의 투명대 단백질들 CZI 및 CZII는 매레쉬 및 던바 J.에 의해 단리되었고(Exp. Zool. 244:299(1987)), 각각 50-110kD, 및 90-110kD의 분자량을 갖는다.
매레쉬 및 던바 J.(Exp. Zool. 244:299(1987))는 또한 각각 50-110kD, 70-95kD, 및 90-100kD의 분자량을 갖는 개의 투명대 단백질들 DZI, DZII 및 DZIII을 단리시켰다.
싸코 등(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 167:318(1981))은 각각 63-78kD, 63-70kD, 47-51kD, 및 43-47kD의 분자량을 갖는 다람쥐 원숭이 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4를 기재하였다. 동일한 문헌에서, 싸코 등은 각각 80-120kD, 73kD, 및 59-65kD의 분자량을 갖는 인간의 ZP1, ZP2, 및 ZP3을 기재하였다.
상기 ZP 펩티드들 외에, 많은 종들의 ZP 글리코프로테인들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 명확해졌으며, 따라서 이들이 피임성 단백질들을 인코딩하므로 본 발명에 유용하다. 예를 들면, 링퀴트 등(Dev. Biol., (1988) 127:287-295) 및 리앙 등(Mol. Cell. Biol. (1990) 10:1507-1515)은 각각 투명대 단백질들 ZP3 및 ZP2를 인코딩하는 생쥐 DNA의 클로닝을 보고하였다. 클론들은 안티-ZP3 및 안티-ZP2 항체들과 함께 생쥐 cDNA 라이브러리들을 스크리닝함으로써 얻어졌다. 생쥐의 ZP3과 ZP2 사이에 어떠한 서열 상동성도 발견되지 않았다.
링귀트 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)은 혼성화가 매우 낮은 엄격도로 수행되지 않는 한 그의 클론이 생쥐, 쥐, 개, 소 및 인간의 전체 게놈 DNA에 의해서는 하이브리드되지만 돼지 또는 토끼 게놈 DNA에 의해서는 하이브리드되지 않는 생쥐 ZP3의 부분 cDNA 클론의 단리를 보고하였다. 링귀트(Dev. Biol., (1988) 127:287-295)에 의해 특성화된 완전 길이 ZP3 cDNA는 비교적 짧은 5' 및 3' 미해독 영역들 및 추가의 200-300 뉴클레오티드 폴리-A 테일과 함께 약 1317 뉴클레오티드들의 개방된 판독 프레임을 갖는 생식 세포주 특이적 mRNA를 나타낸다. 링퀴트 등은 또한 쥐, 토끼, 개 및 소의 난소가 생쥐의 ZP3 cDNA에 하이브리드된 mRNA를 전사하고, ZP3 전사물은 유사한 분자량들을 갖는다는 것을 발견하였다. 리앙등(Mil. Cell. Biol. (1990) 10:1507-1515)은 ZP2의 핵산 및 연역된 아미노산 서열은 그것이 동일한 짧은 모티브의 5' 및 3' 미해독 영역들을 갖더라도, ZP3의 그것과 매우 상이한 것을 보여주었다. ZP2 mRNA는 80,217 달톤의 폴리펩티드에 대한 코드들이 713 아미노산들을 나타내는 2,139 뉴클레오티드들의 단일의 개방형 판독 프레임을 갖는 것으로 보고되었다.
챔벌린 및 딘(Dev. Biol., (1989) 131:207-214) 및 킨로치, R.A. 등(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1988) 85:6409-6413)은 생쥐 ZP3 유전자의 클로닝을 보고하였다. 생쥐의 ZP3 유전자는 8.6kbp의 전자 유닛 내에 8 엑손들 및 7 인트론들을 갖는 것으로 보고되었다.
킨로치 등(Dev. Biol., (1990) 142:414-421)은 프로브로서 생쥐 ZP3 DNA에 의해 스크린된 햄스터 게놈 DNA 라이브러리로부터 햄스터 게놈 ZP3 DNA의 클로닝을 보고하였다. 햄스터 ZP3 유전자는 7900 뉴클레오티드의 전사 유닛을 갖고, 7 인트론들 및 8 엑손들을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 햄스터 ZP3 단백질은 생쥐의 ZP3 단백질에 대해 약 81% 동일하였다. 햄스터 전사치는 생쥐 ZP3 mRNA보다 6개 적은 1266 뉴클레오티드들을 함유하였다.
챔벌레인 및 딘(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990) 87:6014-6018)은 프로브로서 생쥐의 ZP3 cDNA를 사용하여 인간의 게놈 DNA 라이브러리로부터 인간의 ZP3의 클로닝을 보고하였다. 인간의 ZP3 유전자는 18.3kbp의 전사 유닛 내에 8개의 엑손들로 구성된다. 엑손들은 생쥐의 ZP3의 8개의 엑손들과 크기가 거의 동일하고, 코딩 영역의 뉴클레오티드 시퀀스는 74% 상동성이다. 인간의 ZP3 전사는 생쥐의 ZP3mRNA와 매우 유사하다. 모두 짧은 5' 및 3' 미전사 영역들을 갖고, 모두 424-아미노산 단백질을 인코딩하는 1272 뉴클레오티드들의 단일의 개방 판독 프레임을 갖는다.
던바의 미합중국 특허 제4,996,297호는 스크리닝 프로브로서 안티-ZP1 및 안티-ZP2 항체들을 사용하여 토끼 ZP1 및 ZP2 단백질들을 인코딩하는 3개의 토끼 투명대 클론들의 단리를 보고하였다. 던바 특허의 도 4에 P2 및 P3으로서 지정된 서열들은 각각 812 및 1705 뉴클레오티드들의 토끼의 ZP cDNAs를 나타낸다.
스츠오벨 등(J. Bio. Chem. (1991) 266:7214-7219)은 교차 종들 친화도 정제된 항혈청을 사용하여 55kD 토끼 투명대 단백질을 인코딩하는 완전 길이 cDNA(rc 55로 지정됨)를 단리시키고 특성화시켰다. 이러한 cDNA에 의해 인코딩된 단백질은 리앙에 의해 기재된 생쥐의 ZP2 단백질과 일부 동일하였다. 그러나, rc 55와 생쥐의 ZP3 단백질의 비교는 어떠한 상동성도 드러내지 못하였다.
본 발명에 유용한 다른 ZP 글리코프로테인 뉴클레오티드 서열들로는 인간의 류테나이징 호르몬-방출 호르몬(LHRH, GenBank 수탁 번호. X01059), 인간의 ZP3A 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. XM004616), 인간의 ZPB 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. XM001779), 송아지 ZPA 및 B 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. AB042653; AB042652), 닭의 ZP1 및 3 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. AJ289697; AB031033), 생쥐의 ZP1, 2 및 3 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. NM11776; NM011775; NM009580), 들쥐의 ZP3 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. AF304487), 던나트 ZPA (GenBank 수탁 번호. AF263025), 브러쉬테일 주머니쥐 ZPA및 B (GenBank 수탁 번호. AF263014; AF263013), 브러쉬테일 주머니쥐 ZP2 및 3 (GenBank 수탁 번호. AF079525; AF079524), 돼지의 ZP1, 2 및 3 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. S74651; E07737; D45064), 쥐의 ZP1, 2, 및 3 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. D78482; AB000929; AB000928), 비단털 원숭이 ZP1 및 2 글리코프로테인 (GenBank 수탁 번호. Y10822; Y10767), 고양이과의 ZP2 및 3(GenBank 수탁 번호. E07930; E06506), 개의 ZP2 및 3 (GenBank 수탁 번호. D45064; D45070), 및 왈라비 ZP3 글리코프로테인 (호주 특허 제AU78554/98)을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바의 "투명대 글리코프로테인"이라는 용어는 완전한 ZP 단백질, ZP의 효소적으로 소화되거나 도는 화학적으로 변성된 형태, 또는 이들의 조합물들을 포함한다. 또한, 투명대 글리코프로테인은 고유하게는 면역원성이 아니지만 이들이 본 명세서에서 아래 기재된 바와 같이 면역원성 담체 분자들(예, LT-B)에 화학적으로 결합될 때 면역원으로서 이용될 수 있는 단리된 ZP 항원성 결정자들을 포함한다. ZP 추출물은 전체 추출물 또는 ZP를 포함하는 3개의 개개의 글리코프로테인 분획들 중의 1개 이상을 포함한다.
기타 피임성 단백질들
상기 ZP 글리코프로테인들 또는 그의 단편들 외에, 다른 단백질들이 본 발명에서 피임성 단백질들로서 유용하다. 예를 들면, 일 실시 형태에서, 피임성 단백질은 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH), 류티나이징 호르몬(LH), 락테이트 데히드로게나제(LDH), 및 항정자 항원를 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 피임성 단백질들 외에, 본 발명에 유용한 피임성 단백질들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로는 인간의 GnRH1(GenBank 수탁 번호. XM005041), 쥐의 GnRH1(GenBank 수탁 번호. M31670), 브러쉬테일 주머니쥐 GnRH(GenBank 수탁 번호. AF193516), 및 뒤쥐 GnRH (GenBank 수탁 번호. AF107315)를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 본 발명에 유용한 LH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들로는 쥐의 LH (GenBank 수탁 번호. D00576), 돼지의 LH (GenBank 수탁 번호. D00579), 코뿔소의 LH (GenBank 수탁 번호. AF024521), 맥의 LH (GenBank 수탁 번호. AF047606), 말의 LH (GenBank 수탁 번호. Y16326; Y16265), 송아지의 LH (GenBank 수탁 번호. 11506), 및 개의 LH (GenBank 수탁 번호. Y00518)를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 피임성 단백질들은 항정자 항원들을 포함한다. 전체 정자의 추출물들에 의한 수컷 및 암컷 동물들의 면역법은 불임을 유발하는 것으로 이미 보여주고 있다(텅 등, (1979), J. Reprod. Immunol. 20:931). 따라서, 본 발명의 피임성 단백질들은 정자-관련 단백질 또는 그러한 단백질들을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 그 예로는 PH30 (미합중국 특허 제5,935,578호), PH34(미합중국 특허 제5,723,305호), SP17 (미합중국 특허 제5,814,456호), SP22 (미합중국 특허 제6,197,940호), SP56 (생쥐 SP56; GenBank 수탁 번호. U17108), LDHC4(인간 LDHC4; GenBank 수탁 번호. J02938; 미합중국 특허 제5,891,992호; 골드버그 "정자-특이적 항원으로서 LDH-X", T. 웨그만 및 T.J.질(편집), Reproductive Immunology, 옥스퍼드 유니버시티 출판, 1981), 퍼틸린(생쥐의 퍼틸린: GenBank 수탁 번호. AF 167406; 인간의 퍼틸린: GenBank 수탁 번호. AJ133005; 3개의 뒤지 퍼틸린: GenBank 수탁 번호. Y15965; 비비 퍼틸린: GenBank 수탁 번호. Y15520; 고릴라 퍼틸린: GenBank 수탁 번호. Y15492; 비단 원숭이 퍼틸린: GenBank 수탁 번호. Y15512; 송아지 퍼틸린: GenBank 수탁 번호. AF086808; 및 쥐의 퍼틸린: GenBank 수탁 번호. Y08616을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
점막의 타겟팅 단백질들
본 발명의 일 실시 형태에서, 유전자 전이 식물이 동물에게 투여되고, 여기서 식물은 1개 이상의 상기 피임성 단백질들의 일부 또는 에피토프를 발현시킨다. 면역원성 기질들의 점막 타겟팅이 M-세포 인식을 보장하기에 충분한 정도의 입자 크기 또는 천연 결합 친화드에 크게 의존한다는 것은 당업계에 잘 인식되어 있다. 또한, 점막의 면역 시스템은 특정 군의 단백질들의 적은 복용량을 급식함으로써 고무될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, 이는 점액질 막 상의 세포들의 표면 사에 위치하는 여러가지 글리코리피드들 및 글리코프로테인들에 특이적으로 결합될 수 있는 특성을 공유하는 단백질들에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 착물 면역 피임 단백질에 또는 필요할 경우 피임성 에피토프의 면역원성을 증진시키기 위해 ZP3 에피토프 또는 GnRH 등의 그의 작은 가용성의 피임성 항원에 융합되는 보조 면역원성 단백질들을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
점막의 면역 응답을 고무시키기 위한 본 발명에 따른 유용한 보조 단백질들은 시가톡신 B(StxB) (GenBank 수탁 번호. AJ132761), 포도상구균 엔테로톡신 B(SEB) (GenBank 수탁 번호. M11118), 대장균 불안정한 톡신 B (LT-B) (GenBank 수탁 번호. AB011677), 대장균 불안정한 톡신 A 서브유닛 (LT-A) (GenBank 수탁 번호. AB011677), 노르워크 바이러스 캡시드 단백질(NVCP) (GenBank 수탁 번호. AF093797), 및 B형 간염 표면 항원(HBsAg) (GenBank 수탁 번호. AF090842) 등의 항원성 단백질들을 포함한다. 그러한 항원성 단백질들은 그에 면역원성을 부여하기 위해 연합이 필요할 때 항원성 입자들 및(또는) 착물들로서 연합하는 것이 바람직하다. 본 발명에 유용한 피임성 단백질들 및 점막 면역원성을 증진시키는 단백질들을 포함하는 융합 단백질의 구축은 아래 기재할 것이다.
B형 간염 표면 항원(HBsAg)
식물들 중에 바이러스형 입자들(VLPs)로서 HBsAg를 발현시키는 가능성은 나타나 있다(매손 등, 1992). VLPs는 비경구적 면역법으로 허가된 재조합 효모-유도 백신과 유사하다. HBsAg 입자들의 형성은 4개의 트랜스멤브레인 도메인들을 엔도플라즘 레티큘럼(ER) 멤브레인 내의 펩티드 삽입을 필요로 하고, ER 루멘으로의 입자들의 아접이 이어진다. 식물 유도된 HBsAg는 생쥐 모델에서 연구된 B- 및 T-세포 에피토프들을 보유한다(타나발라 등, 1995). 식물 세포들이 면역원성 HBsAg VLP를 생산할 수 있다는 발견은 식물들이 착물 구조물들로 조립되는 동물성, 바이러스성 또는 세균성 단백질들에 대해 가능한 발현 시스템임을 나타낸다. 따라서, 면역원성 HBsAg 입자들을 발생시키기 위해 필요한 유전학적 원소들이 식별되었다. 이들 원소들, 예를 들면 조절 및 코딩 영역들은 식물들에서 이러한 항원의 발현을증폭시키는 수단을 제공하기 위해 본 명세서에 기재된 바의 피임성 단백질을 인코딩하는 벡터로 혼입될 수 있다.
노르워크 캡시드 단백질(NVCP)
NVCP의 식물들에서 발현 및 VLP 어셈블리, 및 생쥐에서 그의 경구 면역원성이 보고되어 있다(매슨 등, 1996). NVCP는 전체 단백질의 0.3%에 축적되고, 담배 잎 및 감자 구근 세포들 내에 약 60%의 효율로 VLPs 내로 어셈블되었다. 음의 염색 전자 현미경으로 관찰할 때, 빈 캡시드들은 곤충 세포 시스템에서 생산된 것들과 사실상 구별할 수 없었다. 더욱이, 그 재료는 각각 10㎍ 만큼 적은 4회의 복용량으로 강제 사육에 의해 주어질 때, 또는 각각 50㎍ 만큼 적은 4회의 복용량으로 감자 구근 슬라이스들을 직접 급식함으로써 주어질 때 생쥐들에서 경구 면역원성이었다. 혈청 IgG 및 장 점막의 IgA는 식물 백신에 의해 자극되었다. 따라서, NVCP 항원들의 VLPs의 면역원 량을 발생시키는 수단이 식별되었다. 이들은 본 명세서에 기재된 유전자 증폭 방법들에 따라 식물들 중에 여전히 높은 레벨의 이뮤노겐을 발생시키기 위해 본 발명에 의해 사용될 수 있다.
대장균 열-불안정 엔테로톡신(LT)
LT는 동시-투여된 항원들에 대항하는 면역 응답들을 고무시키는 잠재적인 점막 이뮤노겐 및 보조제이다(클레멘스 등, 1988). 식물들 내에 발현된 LT의 B-서브유닛(LT-B)은 강글리오사이드 GM1결합 용량을 소유한 활성 올리고머들로 어셈블된다(해크 등, 1995). LT-B의 카르복실-말단에 마이크로조멀 리텐션 서열(SEKDEL)을부가하는 것은 식물 조직 내의 그의 축적을 증가시키는 한편, 여전히 GM1결합 및 면역원성을 허용하는 것으로 밝혀졌다. 생쥐에게 주어진 식물-유도된 LT-B에 의한 오랄 테스트들에서, 담배 잎 추출물은 강제 사육에 의해 투여되거나 또는 (슬라이싱 외의) 준비 없이 급식된 감자 구근들은 LT-B에 대항하는 혈청 및 장 점막 항체들을 자극하였다(해크 등, 1995). 이들 동물들로부터 얻은 혈청 안티-LT-B는 LT 활성의 억제를 보여주었으며, 이는 보호성 백신으로서의 그의 잠재적인 값을 나타낸다.
피임성 단백질 발현을 위한 벡터들
본 발명의 용도에 집중되는 것은 피임성 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 임으로 점막의 타겟팅 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구축물의 분비 및(또는) 용도이고, 여기서 구축물은 피임성 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물을 생산하기 위해 관심있는 식물 세포로 도입될 수 있다. 바람직한 실시 형태들에서, 핵산 구축물은 식물 세포들 내에서 제조될 수 있고 성장할 수 있는 플라스미드인 식물 발현 벡터이다. 그 구축물의 핵선 서열들은 당업계에 공지된 바와 같이 DNA, RNA, 합성 핵산, 또는 이들의 조합물을 함유할 수 잇다. 핵산 구축물이 피임성 단백질 및 점막 타겟팅 단백질 모두를 포함하는 실시 형태들에서, 각각의 성분들을 인코딩하는 서열들은 필요할 경우 다른 서열들(예, 조절 서열들)로 산재될 수 있다.
본 발명에 유용한 핵산 구축물들은 본 발명에 따라 식물 세포들 내의 피임성단백질들의 발현을 중재하기 위해 사용될 수 있는 당업계의 숙련자들에게 공지된 플라스미드 골격을 사용하여 발생될 수 있다. 시작 재료들로서 이용될 수 있는 적절한 벡터들은 당업계에 공지되어 있다. 드프라몬드 등(Biotechnology 1983, 263), 앤 등(EMBO 1985, 277) 및 로쓰스타인 등(Gene 1987, 53)이 기재한 식물 조직을 형질 변환시키기에 적절한 벡터들로는 pBluescript(스트래터진, 캘리포니아주 라졸라), pIBT210(해크 등, (1995) Science 268:714), pGEM(프로메가, 위스콘신주 메디슨), pGPTV.kan (베커 등, (1992) Plant Mol. Biol. 20:1195-1197), 아그로박테륨-Ti 플라스미드(화이트 등,Plant Biotechnology쿵 및 아른트젠 편집, 버터워쓰 퍼브. 매사추세츠주 보스톤, 1989)를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 이들 벡터 외에, 본 발명에 사용하기 적절한 많은 다른 것들이 당업계에서 생산되었다.
본 발명에 유용한 벡터 구축물들은 피임성 단백질들을 인코딩하는 DNA 서열들을 함유하는 것이 바람직하다. 피임성 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은 종래의 수단에 의해 얻어지고 식물들의 형질 전환에 적절한 벡터들 내로 삽입된다. 예를 들면, DNA 서열은 게놈 클론들의 유전자 뱅크로부터 단리될 수 있다. 대안으로, DNA 서열은 역 전사에 의해 제조될 수 있다. 이어서, 벡터들은 아래 기재된 각종 공지된 기술들에 의해 식물 세포들 내로 도입되어, 형질 전환된 세포들, 조직들 및 식물들을 야기한다.
피임성 단백질의 아미노산 서열에서 화학적으로 합성될 수 있는 DNA 서열 또는 그의 일부는 공지되어 있다. 피임성 단백질의 아미노산 서열을 결정하기 위해여러가지 선행 기술 방법들이 이용될 수 있다(예를 들면 오스벨 등,Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, 존 윌리 & 선즈, 인크. 1995).
피임성 단백질을 인코딩하는 DNA 서열 또는 그의 일부는 피임성 단백질이 정확히 발현되는 방식으로 적절한 벡터 내에 삽입된다. 다시 말하자면, DNA 서열은 정확한 아미노산 서열이 식물 조직 내의 DNA 서열의 발현에 따라 생산되도록 적절한 배향 및 판독 프레임으로 배치된다. 종래 기술들에 따라, 식물 조직 내에 작동 가능하게 촉진제를 함유하는 키메라 DNA 서열이 일반적으로 구축되고, 이 DNA 서열은 피임성 단백질을 인코딩하는 것이다. DNA 서열은 식물 조직 내에서 작동 가능한 3' 코딩되지 않은 서열을 추가로 함유할 수 있다. 일 실시 형태에서, 키메라 DNA 서열은 융합 단백질이 발현에 따라 생산되도록, 피임성 단백질의 점막의 타겟팅을 증진시킬 수 있는 폴리펩티드, 예를 들면 LT-B에 대한 코딩 서열을 추가로 함유할 수 있다. 키메라 DNA 서열은 피임성 단백질 또는 그의 일부에 대한 DNA 서열 코딩을 공지된 식물 형질 전환 벡터의 제한 부위에 삽입함으로써 적절한 벡터 내에 그대로 제조될 수 있다. 대안으로, 키메라 유전자는 먼저 구축되고, 이어서 식물 형질 전환 벡터를 생산하기 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본 발명에 유용한 벡터들은 일반적으로 대장균 등의 원시핵 숙주 세포 내에 삽입되고, 여기서 벡터들의 수는 복제에 의해 증폭된다. 벡터들은 당업계에 공지된 기술(예를 들면, 오스벨 등, 수프라 참조)을 사용하여, 원시핵 숙주 세포로부터 순차로 단리될 수 있고, 관심있는 숙주 식물 세포를 형질 변환시키기 위해 순차로 사용될 수 있다.
본 발명의 촉진제 서열들은 본 발명에 따라 선택된 식물 숙주 세포에서 작동가능한 촉진제를 포함하지만, 이것으로만 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 DNA 구축물은 관심있는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 작동 가능하게 링크된 식물-기능성 촉진제를 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 촉진제는 CVMV, 감마 세인, 겔빈 촉진제, CaMV 35S, 토마토 E8, 파타틴, 유비퀴틴, 만노핀 합성 효소(mas), 벼 액틴 1, 대두콩 단백질 글리시닌(Gy1), 대두의 비생식적 저장 단백질(vsp); 및 그래뉼-결합된 전분 합성 효소(gbss) 중에서 선택된다. 본 발명의 구축물은 담배 부식 바이러스(TEV) 증진제 등의 해독 증진제 영역을 포함할 수도 있으며, 이는 다른 데 기재되어 있다(캐링턴 등, (1990)). 임의로, 본 발명의 구축물은 관심있는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'말단에 작동 가능하게 링크된, αS 또는 αL 서열(매손 등, 1988) 등의 적어도 하나의 비생식적 저장 단백질(VSP) 신호 펩티드 인코딩 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 피임성 단백질 및 임의로 점막의 타겟팅 단백질을 인코딩하는 DNA 구축물의 서열들은 모두 단일 촉진제 서열의 통제하에 있으며, 3개의 원소들 각각을 함유하는 융합 단백질의 발현을 초래한다. 이는 피임성 단백질 및 점막의 타겟팅 단백질이 화학양론적 비율로 합성될 수 있고, 피임성 단백질 및 점막의 타겟팅 단백질의 유사한 레벨의 발현을 초래할 수 있음을 보장한다. 대안으로, 점막의 타겟팅 단백질의 발현은 쌍방향 방식으로, 또는 점막의 타겟팅 단백질을 인코딩하는 서열의 5'가 아닌 피임성 단백질을 인코딩하는 서열의 3' 구축물로 삽입된 제2 촉진제로부터 구동될 수 있다.
본 발명에 유용한 벡터들은 상기 DNA 구축물들을 휴대하는 것 외에, 추가로선택 가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 마커 유전자들은 선택 가능한 마커를 인코딩하는 유전자, 예를 들면 세균성 테트라사이클린 저항 유전자 등의 항생제 저항 유전자를 포함할 수 있다. 테트라사이클린 저항 유전자의 혼입은 본 발명에 따른 플라스미드 제조 공정에서 선택제로서 테트라사이클린의 사용을 허용한다. 테트라사이클린 저항 유전자를 사용하는 한 가지 장점은 테트라사이클린이 대장균 대에서 저하되지 않고, 따라서 보다 많은 테트라사이클린이 발효 중에 부가되지 않아도 좋다는 것이다. 또한, 테트라사이클린 저항 유전자는 테트라사이클린이 임상적 세팅에서 항생제로서 종종 보다 적게 처방되기 때문에 앰피실린 저항을 인코딩하는 유전자 보다 선호되고, 따라서 플라스미드 저항 유전자로부터의 판독은 임상적 세팅에서 항생제의 사용에 의해 간섭받기가 쉽지 않을 것이다.
본 발명에 따른 유용한 추가의 마커 유전자는 생물독, 특히 항생제, 예를 들면 카나마이신, G418, 블레오마이신, 하이그로마이신, 클로람페니콜 등에 대한 내성을 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 추가의 마커 유전자들은 오르가노포스페이트들 및 비알라포스페이트들 등의 제초제에 대한 내성을 포함한다. 본 발명에 따른 유용한 추가의 마커 유전자들은 베타 글루코리니다제(GUS), 녹색 형광 단백질(GFP) 등의 가시적인 마커 단백질들에 대해 인코딩한 것들을 포함하기도 한다. 사용된 특정 마커는 도입된 핵산이 결여된 세포들에 비교한 바 형질 전환된 세포들의 선택을 허용하는 것일 것이다.
벡터는 또한 복제의 A. tumefaciens 장기를 가질 수 있고, 이를 테면 그것은이러한 시스템에 의한 후기 형질 변환을 위해 A. tumefaciens 내에 그 벡터를 유지하는 것이 바람직할 때이다. 이러한 사실에서, 관심있는 단백질(즉, 피임성 단백질)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 숙주 식물 세포로의 그의 전이를 초래하는 좌측 및 우측 T-DNA 보더 영역들에 의해 측면이 접힌다.
대장균 등의 세균 균주는 당업계에 잘 공지된 방법들에 따른 순간적인 발현 카세트를 성장/증폭시키기 위해 본 발명의 발현 벡터에 의해 형질 감염될 수 있다(오스벨, 수프라). 정제된 발현 카세트는 A. tumefaciens에 부가될 수 있고, 내부에 벡터를 도입하기 위해 전기 펄스 또는 열 쇼크 처리에 적용될 수 있고, 여기서 그것은 셔틀 벡터로서 원상으로 남겨질 수 있다. A. tumefaciens 중의 헬퍼 Ti 플라스미드는 셔틀 벡터로부터 식물 세포로 직접적으로 T-DNA를 전이시키는 데 필요한 vir 유전자를 제공할 수 있다. 대안으로, 벡터는 종양-유도(Ti) 플라스미드와의 동질성 재조합을 수행할 수 있고 Ti 플라스미드의 T-DNA에 대한 순간적 카세트를 교환할 수 있다. 바람직한 실시 형태들에서, 본 발명은 식물 세포로 도입되는 DNA 구축물이 염색체 내로 안정하게 통합되는 것인 식물 세포들을 안정하게 형질 전환시키는 방법들을 제공한다.
유전자 전이 식물들
본 발명은 본 발명에 유용한 1개 이상의 피임성 단백질들을 발현시키는 식물 세포들을 포함하는 유전자 전이 식물들 및 식물 재료(예, 잎들, 과일, 뿌리들 등)를 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 관심있는 식물 세포는 상기 1개 이상의 DNA 구축물들로 형질 전환되고, 여기서, 형질 전환된 식물 세포 내의 구축물의 발현은 식물 세포에 의해 피임성 단백질의 생산을 초래한다.
핵산을 식물 세포들로 유도하는 방법들
식물들로의 유전자 전이 방법들로는 A. tumefaciens -- Ti 플라스미드 시스템의 사용을 포함하지만, 이것으로만 제한되지 않는다. A. tumefaciens의 종양-유도(Ti) 플라스미드들은 트랜스퍼 DNA(T-DNA)라 칭하는 플라스미드 DNA의 단편을 함유하고, 이는 식물 호스트 게놈에 통합된다. 먼저, 대장균에서 복제되는 플라스미드 벡터가 구축된다. 이러한 플라스미드는 관심있는 단백질(즉, 피임성 단백질)을 인코딩하는 DNA를 함유하고, 이러한 DNA는 T-DNA 보더 서열들에 의해 주름 접히고, 이는 그의 한계를 식물 세포 내로 전이되어 식물 게놈 내에 통합되는 DNA의 세그먼트로 제한한다. 통상적으로, 선택성 마커(카나마이신 등의 항생제에 대한 내성을 인코딩하는 유전자 등)를 인코딩하는 유전자 역시 좌측 보더(LB)와 우측 보더(RB) 서열들 사이에 삽입된다. 형질 전환된 식물 세포들에서 이러한 유전자의 발현은 통합된 T-DNA 영역을 갖는 식물들 또는 식물 세포들을 식별하는 포지티브 선택 방법을 제공한다. 둘째, 플라스미드는 아그로박테륨속으로 전이된다. 이는 아그로박테륨속에 의한 플라스미드 DNA의 직접적인 흡수를 통해 수행될 수 있다. 식물들로의 T-DNA의 후속 전이를 위해, 이용된 아그로박테륨속 균주는 유도 가능한 발병력(vir) 유전자들의 세트를 함유해야 하고, 이는 식물 세포들로의 T-DNA 전이에 필수적이다.
상기 A. tumefaciens 유전자 전이 시스템은 광범위한 쌍떡잎 식물들 및 나자 식물의 질병인 크라운 벌레혹의 병인학적 시약이며[데클리느, M. 등, Bot. Rev.42, 389(1976)], 감염 부위의 식물 조직 내에 종양들 또는 벌레혹들의 형성을 초래한다. 아그로박테륨속 시스템은 각종 식물 조직의 상례적인 형질 전환을 허용하도록 개발되었다[슈엘, J. 등, Bio/Technology 1, 175(1983); 칠턴, M-D, Scientific American 248, 50(1983) 참조]. 이러한 방식으로 형질 전환된 대표적인 조직들로는 담배[바르톤, K. 등, Cell 32, 1033(1983)]; 토마토 [필라티, J. 등, Bio/Technology 5, 726(1987)]; 해바라기[에버레트, N. 등, Bio/Technology 5, 1201(1987)]; 면화[움베크, P. 등, Bio/Technology 5, 263(1987)]; 평지씨[푸아, E. 등, Bio/Technology 5, 815(1987)]; 감자[파씨오티 D. 등, Bio/Technology 3, 241(1985)]; 포플러[피토우드, F. 등, Bio/Technology 5, 1323(1987)]; 및 대두콩[힌치, M. 등, Bio/Technology 6, 915(1988)]을 들 수 있다. 다른 식물들은 이들 방법들의 상례적인 확장들 또는 변형들에 의해 형질 전환될 수 있다.
아그로박테륨속 균주들의 다중 선택들 및 플라스미드 구축 전략들은 식물들의 유전학적 형질 변환을 최적화시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, A. tumefaciens 등의 아그로박테륨속 균주들은 일부 용도들에서 보다 적합할 수 있다. 많은 쌍떡잎 식물 종들에서 근모 형성을 자극하는 A. rhizogenes는 Ri(뿌리 포함하는) 플라스미드라 칭하는 큰 외부-염색체 소자를 휴대하고, 이는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드에 유사한 방식으로 기능한다. A. rhizogenes를 사용하는 형질 전환은 A. tumefaciens의 그것과 유사하게 개발되었으며, 예를 들면 알팔파를 형질 전환시키기 위해 성공적으로 이용되었다[수크하핀다, K. 등, Plant Mol. Biol. 8, 209(1987)].
식물 조직의 접종 방법들은 식물 종들 및 아그로박테륨속 전달 시스템에 따라 변화한다. 편리한 접근법은 감자를 형질 전환시키기 위한 잎 디스크 공정이지만, 아그로박테륨속-매개된 형질 전환은 전체 식물 분화 및 재발생의 개시를 위한 양호한 소스를 제공하는 조직 익스플랜트에 의해 수행될 수 있다. 보호 조직의 부가는 특정 조건들 하에 바람직할 수 있다. A. tumefaciens에 의해 재발생하는 원형질체의 시험관내 형질 전환 등의 다른 공정들이 잘 형질 전환된 식물 세포들을 얻기 위해 후속될 수 있다.
여러 가지 이른바 "직접적인" 유전자 전이 공정들은 예를 들면 원형질체로부터의 식물 재발생은 아그로박테륨속 중간체의 사용 없이 식물들 및 식물 조직들을 형질 전환시키기 위해 개발되었다[에반스, D.A. 등,Handbook of Plant Cell Culture1, 124(1983)]. 식물 종들이 원형질체로부터 발생될 수 있을 때, 직접적인 유전자 전이 공정들이 이용될 수 있고, 형질 전환은 A. tumefaciens의 사용에 의존하지 않는다. 원형질체들의 직접적인 형질 전환에서, 원형질체로의 외인성 유전자 물질의 흡수는 화학적 시약 또는 전기장의 사용에 의해 증진될 수 있다. 이어서, 외인성 재료는 핵 게놈으로 통합될 수 있다.
초기 작업은 그것이 이종 DNA가 자손 식물들로 혼입되어 전달된 것을 보여주는 경우 디코트 니코티아나 타바큠(담배)에서 수행되었다[파즈코우스키, J. 등, EMBO J, 3:2717(1984); 포트리커스, I. 등, Mol. Gen. Genet. 199: 169(1985)]. 모노코트 원형질체들은 역시 이러한 공정에 의해 형질 전환되었다: 예를 들면, 트리티쿰 모노코쿰[로쯔 H 등, Mol. Gen. Genet. 199: 178(1985)]; 로리움 멀티플로럼(이탈리아 독보리속) 포트리커스, I. 등, Mol. Gen. Genet. 199: 183(1985)]; 옥수수[로데즈, C. 등, Bio/Technology 5, 56(1988)]; 및 블랙 멕시컨 스위트 콘[프롬, M. 등, Nature 319, 719(1989)]. 원형질체로부터 재발생된 다른 식물들은 벼[아부달라하, R. Bio/Technology 4, 1987(1988)]; 평지씨[칸샤, 등, Plant Cell Reports 5, 101(1986)]; 감자[타바자, R. 등, Plant Cell Reports 5, 243(1986)]; 가지[시하크하키, D. 등, Plant Cell, Tissue, Organ Culture 11, 179(1987)]; 및 오이[지아, S-R, 등, J. Plant Physiol. 124, 393(1986)]을 포함한다. 다른 변종들의 원형질체들을 직접적으로 형성하는 방법들이 분명하다.
식물의 원형질체들로의 DNA의 도입은 일렉트로포레이션이라 칭하는 공정에서 적절한 DNA의 존재 하에 전기 펄스에 의한 원형질체들의 처리에 의해 영향받을 수 있다. 이러한 방법에서, 원형질체들은 단리되고, 만니톨 용액 중에 현탁된다. 슈퍼코일 또는 환상 플라스미드 DNA가 부가된다. 용액은 혼합되고 실온에서 10 내지 100 미만의 마이크로초 동안 약 400V/cm의 펄스에 적용된다. 멤브레인의 가역적 물리적 파괴는 원형질체들로의 DNA 흡수를 허용하도록 발생된다.
리포좀 융합은 식물 세포들의 형질 전환 방법인 것으로 보여지고 있다. 이러한 방법에서, 원형질체들은 목적하는 유전자를 소지하는 리포좀과 함께 초래되었다. 멤브레인들이 합쳐짐에 따라, 이종 유전자는 원형질체로 전이된다[데하이에스, A. 등, EMBO J. 4,2731(1985)].
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개된 형질 전환은 N. tabacum(쌍떡잎) 및 Loliummultiflorum(외떡잎)에서 수행되었다. 그것은 Mg2+, PEG 및 가능하게는 Ca2+간의 상승적인 상호 작용에 기초한 직접적인 유전자 전이의 화학적 공정이다[네그루티, R. 등. Plant Mol. Biol. 8, 363(1987)]. 대안으로, 외인성 DNA는 마이크로주입에 의해 세포들 또는 원형질체들로 도입될 수 있다. 플라스미드 DNA 용액은 미세하게 풀된 유리 바늘로 세포 내로 직접적으로 주입된다.
직접적인 유전자 전이를 위해 개발된 다른 공정은 DNA를 소지하는 마이크로프로젝타일들에 의한 세포들의 충격을 포함한다[클레인, T. M. 등, Nature 327, 70(1987)]. 이러한 "바이로리스틱" 공정에서, 외인성 DNA로 코팅된 텅스텐 또는 금 입자들은 타겟 세포들 쪽으로 가속화된다. 적어도 일시적인 발현이 양파에서 달성되었다. 이러한 공정은 현탁 배양액 중의 블랙 멕시칸 스위트 콘 세포들 및 옥수수 미성숙 배아 및 대두 원형질체들에 DNA를 도입하기 위해 이용되었다[클레인, T. M. 등, Bio/Technology 6, 559(1988)]. 옥수수, 담배, 보리, 귀리, 밀, 벼, 당근, 바나나 및 대두의 안정하게 형질 전환된 배양액들은 마이크로프로젝타일 충격에 의해 얻어졌다. 안정하게 형질 전환된 식물들은 이러한 공정에 의해 재발생되고 회수될 수 있다[맥커브, D.E 등, Bio/Technology 6, 923(1988)].
형질 전환된 종자를 생산하기 위해, 아라비돕시스의 꽃들은 다음 방법에 따라 형질 전환된다. 아그로박테륨은 개화하는 꽃들로 진공-침윤되고, 이어서, 결과의 종자는 마커 내성 및 이종 유전자 발현을 위해 스크린된다. 추측컨대, 수술/화분, 난소/난자, 또는 심지어 수정이 이미 발생한 경우에 개화하는 접합체가 형질전환되었다. 이러한 방법(클로프&벤트, 1998,Plant, J.16:735)은 At2S-2 종자 촉진제의 전사 조절 하에 대표 유전자를 포함하는 구축물로 아라비돕시스를 형질 전환시키기 위해 사용된다.
형질 전환에 따라, 형질 전환된 세포 또는 식물 조직은 종래 기술들에 의해 선택되고 스크린된다. 이어서, 상기 고찰한 키메라 DNA를 함유하는 식물 조직의 형질 전환된 세포는 상기 고찰한 참고 문헌에 기재된 것들을 포함하는 공지된 공정들을 사용하여 재발생된다. 이들 기술에 의해 가장 용이하게 재발생될 수 있고, 본 발명에서 바람직한 식물의 종들로는 옥수수, 해바라기, 평지씨, 클로버, 담배, 면화, 알팔파, 벼, 감자, 가지, 오이 및 대두를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 재발생된 식물들은 하기 표준 방법들에 의한 형질 전환을 위해 스크린된다. 재발생된 식물들의 자손은 개선된 식물 및 종자 라인들을 개발하기 위해 통합된 DNA 서열의 연속되는 존재 하에 스크린되고 선택된다. DNA 서열은 고전적인 브리딩, 원형질 융합, 핵 전이 및 염색체 전이를 포함하는 각종 기술들에 의해 다른 유전자 라인들로 이동될 수 있다.
본 발명에 따라 유용한 식물들, 세포들 및 종자들
본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 식물들은 쌍떡잎식물 및 외떡잎식물을 포함한다. 이들로는 담배, 당근, 시금치, 후추, 감자, 토마토, 사과, 밀, 호밀, 대두, 벼, 옥수수, 콘 옥수수, 딸기, 나무 딸기 등의 딸기류, 알팔파 및 바나나를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 음식물로서 인간들이 사용하거나 동물 먹이의 성분들로서 사용되는 많은 식용 식물들은 쌍떡잎 식물들이기 때문에, 외떡잎 식물 형질 전환이 동물 먹이로서 유용한 특정 곡물들의 생산에 특별히 적용될 수 있더라도, 쌍떡잎 식물이 전형적으로 사용된다. 인간의 면역 피임법에서 토마토, 대두 및 당근의 주스 또는 우유 등의 인간들에게 투여하기 용이한 주스 내에 피임성 단백질을 생산하는 것이 특히 유리하다. 이들 식물 백신들로부터 유도된 세포들 및 종자들은 본 발명에 따라 역시 유용하다.
상기된 벡터에 의해 형질 전환된 유전자 전이 식물은 본 발명의 다른 국면이다. 그 벡터를 위해 특히 바람직한 식물 호스트들로는 바나나, 토마토, 감자, 당근, 알팔파, 개자리, 옥수수 및 담배를 들 수 있다.
감자 변종들 FL 1607("프리토 레이 1607") 및 데지리, 및 토마토 변종 탱크슬레이 TA234TM2R은 본 명세서에 기재된 방법들을 사용하여 2진 벡터들로 형질 전환된 특히 바람직한 변종들이다. 이들 형질 전환된 변종들 중에서, 데지리는 유일하게 상용화된 변종이고; 나머지 변종들은 프리토-레이(위스콘신주 라인랜더) 및 스티브 탱크슬레이(코넬 유니버시티, 플랜트 브리딩 디파트먼트)로부터 얻을 수 있다. 토마토는 그의 유전자 형질 전환의 용이성 때문에, 또한 열매-특이적, 숙성 의존형 촉진제들은 조절된 발현을 위해 유효할 수 있기 때문에(지오반노니 등, 1989), 이종 단백질들의 발현을 위한 모델 시스템으로서 바람직하다. E8 촉진제는 성숙한 토마토 열매(지오반노니 등, 1989)에서 폴리랄락투로나제 단백질 및 야생형 토마토 열매(페나루비아 등, 1992)에서 모넬린의 높은 레벨의 생산을 매개하기 위해 사용되었다.
식물 세포 현탁 배양액들은 널리 공지되어 있고, 당업계의 사람들에게 유용하다. 식물 세포 배양액은 이들이 전체 식물 시스템들보다 신속한 형질 전환, 성장 및 단백질 생산을 허용하기 때문에 이종 단백질들을 발현시키기 위한 모델 시스템으로서 바람직하다. 식물 세포 현탁 배양액들은 액체 중에서 성장될 수 있거나, 또는 유합 조직 생산을 위한 고체 매질로 전이될 수 있다. 본 발명에 기재된 목적들로 사용될 수 있는 세포 현탁 배양액들의 통상의 예들로는 당근, 담배(예, NT-1 또는 BY-1 세포주들), 옥수수를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
형질 전환된 식물 재료의 검출
본 발명은 써던 및 노던 블롯 분석, PCR-베이스 검출 방법들 뿐만 아니라 본 발명에 따라 관심있는 단백질을 검출하는 면역학적 방법들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는, 피임성 단백질들을 인코딩하는 핵산 서열들, 및 피임성 단백질 자체의 검출 방법들을 제공한다. 이들 기술들은 피임성 단백질들을 인코딩하는 핵산 서열들 및 임의로 점막의 타겟팅 단백질들의 존재를 확인하기 위해서 및 피임약 및 점막의 타겟팅 단백질들 자체의 발현을 확인하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
관심있는 뉴클레오티드 서열의 검출
1. 써던 블롯 분석
써던 블롯 분석은 비-PCR 베이스 평가를 통해 PCR 증폭된 제품으로부터 또는 전체 게놈 DNA 시험 시료로부터 관심있는 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 써던 블롯 분석 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(아우스벨 등, 수프라, 샘브룩 등, 1989,Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2판, 뉴욕주 콜드 스프링 하버, 콜드 스프링 하버 러버리토리스 프레스). 이 기술은 전기 영동 겔로부터 멤브레인 지지체로 DNA 단편들을 전이시켜 DNA 단편들의 고정을 초래하는 것을 포함한다. 결과의 멤브레인은 겔의 결합 패턴의 반영구적인 재생을 소지한다.
써던 블롯 분석은 다음 방법에 따라 수행된다. 본 발명의 방법들에 따라 핵산으로 형질 전환된 식물로부터 얻어진 게놈 DNA(5-20㎍)는 적절한 제한 효소로 소화되고, TAE 완충액 중의 1.6-1.0% 아가로스겔 상에서 분리된다. DNA는 당업계에 잘 공지된 방법들(아우스벨 등, 수프라, 샘브룩 등, 수프라)에 의해 상업적으로 입수할 수 있는 나일론 또는 니트로셀룰로스 멤브레인(예, 하이본드-N 멤브레인, 애머샴, 알링턴 하이츠, 일리노이주)로 전이된다. 전이 및 UV 가교 결합 후, 멤브레인은 65℃에서 혼성화 용액(예, 5X SSC, 5X 덴하르트 용액, 1%SDS 중의 엄격한 조건 하에) 중의 라벨링된 프로브로 혼성화된다. 대안으로, 고도로 엄격한 혼성화는 68℃에서 또는 감소된 농도의 염, 예를 들면 0.1X SSC를 함유하는 혼성화 완충액 중에서 수행될 수 있다. 혼성화 조건들은 당업계에 공지된 파라메터들에 따라 필요에 따라 변화할 수 있다. 혼성화 후, 멤브레인은 2X SSC/0.1%SDS 중에서 실온에서 및 0.2X SSC/0.1%SDS 중에서 65℃에서 세척되고, 필름에 노출된다. 세척 완충액의 엄격성은 배경 신호의 양에 따라 변화될 수도 있다(아우스벨 등, 수프라).
핵산 프로브-타겟 핵산 하이브리드의 검출은 DNA 타겟에 핵산 프로브를 혼성화시키는 단계를 포함할 것이고, 여기서 프로브는 상기 DNA 구축물의 핵산 서열의 일부에 상보적이다. 이러한 프로브는 공유 결합이 혼성화의 특이성으로 간섭받지않도록 방사선 활성에 의해 라벨링되거나 효소에 공유 결합될 수 있다. 식물 DNA와 프로브 간의 결과의 하이브리드가 검출될 수 있다. 프로브를 라벨링하는 방법들은 랜덤 올리고뉴클레오티드 프라임드 합성, 닉 해독, 키나제 반응들, 또는 폴리머라제 사슬 반응을 포함한다(아우스벨 등, 수프라). 대안으로, 비등방성 방법들을 통해 하이브리드가 검출될 수 있다. 비등방성으로 라벨링된 프로브들은 비오틴 또는 디그옥시게닌, 형광 기들, 화학 발광 기들(예, 디옥세탄들, 특히 트리거된 디옥세탄들), 효소들 또는 항체들의 부가에 의해 생산될 수 있다. 전형적으로, 비등방성 프로브들은 형광 또는 효소적 방법들에 의해 검출된다. 방사선 표지된 프로브-타겟 핵산 착물의 검출은 착물을 유리 프로브로부터 분리시키고, 방사선 사진법에 의해 또는 소결 카운팅에 의해 착물의 레벨을 측정함으로써 수행될 수 있다. 프로브가 효소에 공유 결합되는 경우, 효소-프로브-콘쥬게이트-타겟 핵산 착물은 유리 프로브 효소 콘쥬게이트로부터 벗어나 단리될 것이고, 효소 검출을 위해 기질이 부가될 것이다. 효소 활성은 감지도의 103-106증가를 초래하는 컬러 전개 또는 발광 출력의 변화로서 관찰될 것이다. 혼성화 프로브들(여기서 효소는 알칼리 포스파타제임)로서 핵산 프로브-효소 콘쥬게이트들의 제법 및 용도의 예는 문헌(자블론스키 등, 1986,Nuc. Acids Res., 14:6115)에 기재되어 있다.
2단계 라벨 증폭 방법론들은 당업계에 공지되어 있다. 이들 평가들은 작은 리간드(디그옥시게닌, 비오틴 등)가 관심있는 유전자(피임성 단백질 또는 그의 일부를 인코딩하는 유전자)에 특히 결합될 수 있는 핵산 프로브에 부착된다는 원리에기초한다.
2단계 라벨 증폭 방법에 따라, 핵산 프로브에 부착된 작은 리간드는 항체-효소 콘쥬게이트에 의해 특별히 인식될 것이다. 예를 들면, 디그옥시게닌은 핵산 프로브에 부착될 것이고, 혼성화는 항체-알칼리 포스파타제 콘쥬게이트에 의해 검출될 것이고, 여기서 알칼리 포스파타제는 화학 발광 기질과 반응한다. 핵산 프로브-작은 리간드 콘쥬게이트들의 제조 방법들에 대해, (마틴 등, 1990, BioTechniques, 9:762) 참조. 대안으로, 작은 리간드는 제1 리간드에 특별히 착물화될 수 있는 제2 리간드-효소 콘쥬게이트에 의해 인식될 것이다. 이러한 방식의 작은 리간드 상호 작용의 잘 공지된 예는 비오틴 아비딘 상호 작용이다. 핵산 프로브들을 라벨링시키는 방법들 및 비오틴-아비딘 베이스 평가들에서 이들의 용도는 문헌(릭비 등, 1977,J. Mol. Biol.113:237 및 니구엔 등, 1992,BioTechniques,13:116)에 기재되어 있다.
기본적인 하이브리드 검출 프로토콜의 변종들은 당업계에 공지되어 있으며, 외인성 재료들로부터 검출되어야 하는 하이브리드들의 분리를 고무시키고(시키거나) 라벨링된 잔기로부터 신호를 사용하는 변형들을 포함한다. 많은 이들 변형은 예를 들면 매튜스&크리카, 1988, Anal. Biochem., 169:1; 랜드그렌 등, 1988, Science, 242:229; 미트린, 1989, Clinical Chem. 35:1819; 미합중국 특허 제4,868,105호 및 EPO 공개 제225,807호에서 검토되었다.
2. 노던 블롯 분석
노던 블로팅 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이 기술은 RNA 제제들에서특정 서열들의 검출을 허용하기 위해 전기 영동 겔로부터 멤브레인 지지체로 RNA를 전이시키는 것을 포함한다.
노던 블롯 분석은 다음 방법에 따라 수행된다. 상기 DNA 구축물에 의해 형질 전환된 식물 조직으로부터 얻어진 RNA 시료는 (MOPS 완충액, 포름알데히드 및 포름아미드의 부가에 의해 제조됨) 1X MOPS 완충액 중의 아가로스/포름알데히드 겔 상에서 분리된다. 에티듐 브로마이드에 의한 염색 및 RNA의 통합성을 결정하기 위한 자외선 하의 가시화에 따라, RNA는 0.5M 트리스-Cl(pH7.4)/1.5M NaCl과의 접종에 이어 0.05M NaOH/1.5M NaCl로 처리함으로써 가수분해된다. RNA는 당업계에 잘 공지된 방법들(아우스벨 등, 수프라, 샘브룩 등, 수프라)에 의해 상업적으로 입수할 수 있는 나일론 또는 니트로셀룰로스 멤브레인(예, 하이본드-N 멤브레인, 애머샴, 알링턴 하이츠, 일리노이주)로 전이된다. 전이 및 UV 가교 결합 후, 멤브레인은 42℃에서 혼성화 용액(예, 50% 포름아미드/2.5% 덴하르트 용액/변성된 연어 정자 DNA 100-200mg/0.1%SDS/5X SSPE) 중의 라벨링된 프로브로 혼성화된다. 혼성화 조건들은 아우스벨 등, 수프라 및 샘브룩 등, 수프라에 기재된 바와 같이 필요에 따라 변화할 수 있다. 혼성화 후, 멤브레인은 2X SSC/0.1%SDS 중에서 실온에서 및 1X SSC/0.1%SDS 중에서 42℃에서, 0.2X SSC/0.1%SDS 중에서 65℃에서 세척되고, 필름에 노출된다. 세척 완충액의 엄격성은 배경 신호의 양에 따라 변화될 수도 있다(아우스벨 등, 수프라).
3. PCR
본 발명의 관심있는 핵산 서열들(즉, 피임성 단백질을 인코딩한 것들)은 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 게놈 DNA 또는 다른 천연 자원들로부터 증폭된다. PCR 방법들은 당업계의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다.
PCR은 관심있는 타겟 서열을 증폭시키기 위해 열안정성의 DNA-의존형 DNA 폴리머라제에 의해 촉매된 DNA 복제의 다중 주기를 사용함으로써 특정한 DNA 서열을 신속히 증폭시키는 방법을 제공한다. PCR은 증폭될 핵산, 증폭될 서열을 주름 잡는 2개의 단일 스트랜드된 올리고뉴클레오티드 프라이머들, DNA 폴리머라제, 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트들, 완충액 및 염들의 존재를 필요로 한다.
PCR 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. PCR은 뮬리스 및 팔루나, 1987,Methods Enzymol.155: 335에 기재된 바와 같이 수행되고, 본 명세서에 참조 문헌으로서 인용한다.
PCR은 템플레이트 DNA(적어도 1fg; 보다 보편적으로는 1-1000ng)를 사용하고, 적어도 25pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머들에서 수행된다. 전형적인 반응 혼합물은 2㎕의 DNA, 25pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2.5㎕의 10X PCR 완충액 1(퍼킨-엘머, 캘리포니아주 포스터시), 0.4㎕의 1.25μM dNTP, 0.15㎕(또는 2.5 유닛)의 Taq DNA 폴리머라제(퍼킨-엘머, 캘리포니아주 포스터시) 및 전체 부피 25㎕까지의 탈이온수를 포함한다. PCR은 프로그램가능한 열적 사이클러를 사용하여 수행된다.
PCR 사이클의 각각의 단계의 길이 및 온도, 뿐만 아니라 사이클들의 수는 효과에 있어서 엄격한 요건들에 따라 조정된다. 어니일링 온도 및 타이밍은 모두 프라이머가 템플레이트에 어니일링될 것으로 기재되는 효능 및 참아내야 하는 부정합의 정도에 의해 결정된다. 프라이머 어니일링 조건들의 엄격성을 최적화시키는 능력은 당업계의 통상의 기술을 가진자의 지식에 속한다. 30℃ 내지 72℃의 어니일링 온도가 사용된다. 템플레이트 분자들의 초기 변성은 92℃ 내지 99℃에서 4분 동안 보편적으로 발생하고, 이어서 변성으로 구성된 20-40사이클들(94-99℃, 15초 내지 1분), 어니일링(상기 고찰한 바와 같이 결정된 온도; 1-2분), 및 확장(72℃에서 1분 동안)이 후속한다. 최종 확장 단계는 일반적으로 72℃에서 4분 동안 수행되고, 4℃에서 부정확한 단계가 (0-24시간) 이어질 수 있다.
전기 영동 없이 PCR 생성물들을 정량적으로 검출하는 여러 기술들은 본 발명에 따라 유용할 수 있다. TaqmanTM(퍼킨 엘머, 캘리포니아주 포스터시) 등의 상용 키트들이 존재하는 이들 기술 중의 하나는 전사-특이적 안티센스 프로브에 의해 수행된다. 이러한 프로브는 PCR 제품(예, 관심있는 유전자로부터 유도된 핵산 단편)에 대해 특이적이고, 퀸처 및 올리고뉴클레오티드의 5'단부에 착물화딘 형광 리포터 프로브에 의해 제조된다. 상이한 형광 마커들은 상이한 리포터들에 부착될 수 있고, 하나의 반응에서 2개의 제품들의 측정을 허용한다. Taq DNA 폴리머라제가 활성화될 때, 그것은 그의 5'-대-3' 뉴클레오라이틱 활성에 의해 템플레이트에 결합된 프로브의 형광 리포터들을 분열시킨다. 퀸처들의 부재 하에, 리포터들이 형광된다. 리포터들에서 컬러 변화는 각각의 특정 제품의 양에 비례하고, 형광계에 의해 측정되며; 따라서, 각각의 컬러의 양이 측정될 수 있고, PCR 제품이 정량될 수 있다. PCR 반응들은 다수의 시료들이 동시에 처리 및 측정될 수 있도록 96웰플레이트들에서 수행될 수 있다. TaqmanTM시스템은 겔 전기 영동을 필요로 하지 않는 추가의 장점을 갖고, 표준 곡선과 사용될 때 정량화를 허용한다.
관심있는 단백질 서열의 검출
1. 항체들의 제조
본 발명의 피임성 단백질들에 특이적인 항체들은 단백질 정제 및 검출에 유용하다. 항체에 의해, 본 발명자들은 그러한 항체의 결합(가변) 영역을 사용하는 구축물들 또는 다른 항체 변형물들을 포함시켰다. 따라서, 본 발명에 유용한 항체는 전체 항체, 항체 단편, 다기능성 항체 집합체, 또는 일반적으로 항체로부터 1개 이상의 특이적 결합 부위들을 포함하는 기질을 포함할 수 있다. 항체 단편은 Fv, Fav 또는 F(ab')2단편 등의 단편 또는 단일 사슬 Fv 단편 등의 그의 유도체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 재조합되지 않거나, 재조합되거나, 또는 인체화될 수 있다. 항체는 면역글로불린 이소타입, 예를 들면 IgG, IgM 등일 수 있다. 또한, 면역글로불린 또는 그의 단편의 집합체, 중합체, 유도체 및 콘쥬게이트는 적절한 경우에 사용될 수 있다.
항체 생산에 유용할 수 있는 본 발명의 관심있는 유전자의 단백질 제품(또는 그의 단편 또는 올리고펩티드)은 생물학적 활성을 필요로 하지 않더라도, 그것은 항원성이어야 한다. 특이적 항체들을 유도하기 위해 사용된 펩티드들은 적어도 5개의 아미노산들, 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 이들은 천연 단백질의 영역과 동일해야 하고, 작은 천연적으로 발생하는 분자의 전체 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 본 발명의 피임성 단백질들의 종들 특이적 에피토프들에 대응하는 아미노산들의 짧은 스트레치들은 LT-B 등의 다른 단백질(즉, 점막 타겟팅 단백질)로부터 아미노산들과 융합될 수 있고, 항체는 키메라 분자에 대항하여 생산될 것이다. 당업계에 공지된 공정들은 본 발명의 관심있는 단백질들에 대한 항체들의 생산을 위해 사용될 수 있다.
항체들의 생산을 위해, 염소들, 토끼들, 쥐들, 생쥐들 등을 포함하는 여러가지 숙주들은 본 발명의 관심있는 유전자들의 단백질 제품들(또는 이뮤노겐 특성들을 보유하는 부분, 단편 또는 그의 올리고뉴클레오티드)을 주입함으로서 면역될 수 있다. 숙주 종들에 따라, 면역학적 응답을 증가시키기 위해 여러 가지 보조제들이 사용될 수 있다. 그러한 보조제들로는 프레운트 용액, 무기 겔들, 예를 들면 수산화알루미늄, 및 표면 활성 기질들, 예를 들면 리소레시틴, 풀루로닉 폴리올들, 폴리애니온들, 펩티드들, 오일 에멀전들, 키홀 림페트 헤모시아닌, 및 디니트로페놀을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. BCG(바실리 카메트-구에린) 및 코린박테륨 파븀은 잠재적으로 유용한 인간 보조제들이다.
a. 폴리클로날 항체들
항체 단백질은 그의 면역원성을 증가시키기 위해 통상의 담체에 콘쥬게이트될 수 있고, 펩티드-담체 콘쥬게이트에 대한 항혈청은 증가할 것이다. 담체 단백질에 대한 펩티드의 결합 및 면역법은 상기한 바와 같이 수행될 수 있다(디메키 등, 1992,J. Biol. Chem.167: 4815). 항체는 ELISA(하기)에 의해 또는 대안으로도트 또는 스폿트 블로팅(보에스마 및 밴 리우웬, 1994,J. Neurosci. Methods,51; 317)에 의해 단백질 항원에 대항하여 적정될 수 있다. 동시에, 항혈청은 상기한 바와 같이 제조된 조직 섹션들에서 사용될 수 있다. 유용한 혈청은 ELISA에 의해 예를 들면 그린 등, 1982,Cell,28:277의 공정들에 따라 적절한 펩티드들과 강하게 반응할 것이다.
b. 모노클로날 항체들
모노클로날 항체들을 제조하는 기술들은 잘 공지되어 있으며, 모노클로날 항체들은 그의 레벨이 측정되어야 하거나, 또는 불활성화되거나 또는 친화도-정제되거나, 바람직하게는 아르헤이터 등이, 1981,Nature, 294; 278에 개시한 바와 같이 담체에 결합된 후보 항원을 사용하여 제조될 수 있다.
모노클로날 항체들은 전형적으로 하이브리도마 조직 배양액들로부터 또는 하이브리도마 조직이 도입된 동물들로부터 얻어진 복수 체액으로부터 얻어진다.
모노클로날 항체-생산 하이브로도마들(또는 폴리클로날 혈청)은 타겟 단백질에 결합하는 항체에 대해 스크린될 수 있다.
2. 항체 검출 방법들
특히 바람직한 면역학적 시험들은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체들의 사용에 의존하고, 효소-링크된 면역 평가(ELISA), 면역 블로팅, 면역 조직 화학 및 면역 침전법(휴매손, G.L., 1979, Animal Tissue Techniques, 제4판, W.H. 프리맨&코,. 캘리포니아주 샌프랜시스코; 볼러, 1978, Diagnostic Horizons, 2:1, Microbiological Associates Quarterly Publication, 매사추세츠주 워커스빌; 볼러등, 1978, J. Clin. Pathol. 31; 507; 미합중국 Reissue 특허 제31,006호; 영국 특허 제2,019,408호; 버틀러, 1981,Methods Enzymol., 73: 482; 매지오, E. (편집), 1980,Enzyme Immunoassay, CRC 프레스, 플로리다 포카 레이톤) 또는 방사선 면역 평가(RIA)(웨인트라웁, B.,Principles of radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radiolgand Assay Techniques, The Endocrine Society, 1986년 3월, 1-5, 46-49 및 68-78페이지)를 포함한다. 본 발명에 따른 관심있는 단백질의 존재 또는 부재에 대한 식물들을 분석하기 위해, 면역 조직 화학 기술들이 사용될 수 있다. 항체 분자가 타겟 단백질의 용이한 검출을 고무시키기 위해 라벨링될 수 있어야 한다는 것은 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다. 항체 분자들을 라벨링하는 기술들은 당업계의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다(할로우 및 레인, 1989, Antibodies, 콜드 스프링 하버 러버러토리스).
유전자 전이 식물 재료의 복용량 및 투여
본 발명은 피임성 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여함으로써, 동물에서 피임을 유도하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 전이 식물 재료의 투여는 피임성 단백질에 대한 점막 면역 응답을 유도한다. 하나의 특정 이론에 결합시킴 없이, 본 발명은 동물로의 유전자 전이 식물 재료의 투여에 의존함으로써, 유전자 전이 식물 세포들에 의해 발현된 피임성 단백질들은 그것이 투여되는 동물의 1개 이상의 점막 표면과 접촉한다. 피임성 단백질(항원)이 GALT 및 BALT에 중첩하는 M 세포들에 의해 취해질 때, 일반화된 점막 면역성은 항체의 모든 분비 조직들에 의해 생산되고 있는 피임성 단백질에 대항하는 분비 IgA로초래된다(세브라 등, 수프라; 비에넨스톡 등, 수프라; 웨인즈-캐링톤 등, 수프라; 맥코한 등, 수프라). 따라서 경구 투여는 일반화된 점막의 면역 응답을 고무시키고, 또한 구강 및 위장관 트랙에서 분비 면역 응답의 국소 자극을 유도하는 바람직한 경로이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 방법들에 의해 생산된 피임성 단백질은 피임성 단백질을 생산하는 유전자 전이 식물 또는 식물 세포 배양액으로부터 생산된 음식물의 경구 소비에 의해 투여된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 전이 식물의 식용 부분은 피임성 단백질이 프로세스에서 투여되는 동안 식이 성분으로서 투여된다.
일 실시 형태에서, 유전자 전이 식물 재료는 원료 형태로 동물에게 투여되지만, 그 식물 재료는 절단, 다지기, 으깨기, 입방썰기, 퓌레로 만들기 또는 그렇지 않으면 가축에 의한 소화를 위해 사일로에 저장하기 위해 유전자 전이 목초들을 감소시킴으로써 동물에 의한 소화를 고무시키도록 유전자 전이 식물 재료를 작은 조각들로 감소시킴으로써 가공될 수 있다. 원료 형태로 투여될 수 있는 유전자 전이 식물 재료로는 과일, 잎들, 줄기들, 뿌리들, 구군들 또는 종자들을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다. 추가의 실시 형태에서, 유전자 전이 식물 재료가 목초 또는 곡물들의 형태인 경우, 그 식물은 피임성 단백질이 투여되어야 하는 동물에게 그 식물이 생장하는 환경에서 그 식물 재료를 경구 소비하게 허용함으로써 동물에게 투여될 수 있다(예, 유전자 전이 목초는 소들이 방목되는 들판에서 생장함으로써 피임성 단백질을 소들에게 투여함).
대안의 실시 형태에서, 유전자 전이 식물 재료는 동물에게 투여하기 앞서 추가의 처리(즉, 다지기 또는 절단 이외)를 수행할 수 있다. 유전자 전이 식물 재료는 본 발명의 유전자 전이 식물 재료를 경구, 비내 또는 흡입 용도로 정제시킴으로써 당업계의 숙련자들에게 공지된 기술에 의해 처리될 수 있다. 식물 재료는 제약학상 허용되고 항원과 호환될 수 있는 부형제들에 의한 유화에 의해 처리될 수 있다. 적절한 부형제들로는 보조제, 완충액들, 설탕들, 항산화제들, 안정제들 또는 항원성 분말들; 예를 들면 아스코르브산나트륨, 퀼라자 추출물, 물, 염수, 덱스트로스, 글루코스, 자당, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합물을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 또한, 필요할 경우, 백신은 특정량의 보조 기질들, 예를 들면 보습제 또는 유화제들, pH 완충제들, 또는 백신들의 효과를 증진시키는 보조제들을 함유할 수 있다. 더욱이, 이 식물 재료는 동물에 의한 소화를 고무시키기 위해 비유전자 전이 식물 또는 비식물 재료와 혼합될 수 있다. 예를 들면, 유전자 전이 옥수수는 다른 채소류들과 혼합될 수 있거나, 또는 유전자 전이 대두 식물들은 예를 들면 대두 버거, 대두 쉐이크 또는 두유를 생산하기 위해 양념 또는 다른 풍미제들 등의 다른 성분들과 혼합될 수 있다. 추가의 실시예에 대해, 유전자 전이 담배 배양액들은 여과되고 혼합, 분무 또는 탑-코팅 등의 수단(이들로만 제한되지 않음)에 의해 일반적인 음식 재료들에 부가될 수 있다. 또한, 유전자 전이 식물 재료는 건조될 수 있고, 분말화된 형태 단독으로, 또는 주스나 물 등의 허용되는 액체 중의 현탁액으로서 투여될 수 있다.
추가의 실시 형태에서, 이 식물 재료는 제약학상 허용되는 크림제, 연고제들, 고약 또는 좌약들에 이 식물 재료 및(또는) 세포들을 혼입시키도록 가공될 수 있다. 따라서, 제약적 수단들을 소지하는 유전자 전이 식물 재료는 경구, 비내, 직장 도는 질내를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 점막 표면에 제약학적으로 수반되는 식물 재료를 접촉시킴으로써 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 전이 식물 재료와 접촉할 수 있는 추가의 점막 포면들로는 기관지의 내부 코트. 고실의 점액층, 결장의 내부 점액질 코트, 소관 배설관들의 내부층, 식도의 내부 코트, 소장의 점액질 코트, 후두의 점액질 코트, 혀의 점액질 멤브레인, 뇌하수체막, 구강의 점액질막, 인두의 점액질막, 기관의 내부 점액층, 청각관의 라이닝, 자궁관의 점액층, 뇨관의 내부층, 요도의 내부층, 자궁내막, 질의 점액질막, 위의 점액층, 방광의 내부 코트, 및 저정낭의 점액질막을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
복용량
본 발명의 유전자 전이 식물 재료는 상기한 바와 같이 많은 상이한 형태(예, 원료, 분말화됨, 등)로 동물에 투여될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 유용한 유전자 전이 식물 재료는 무수 식물 재료 그램당 적어도 8㎍의 피임성 단백질, 또는 피임성 단백질/점막 타겟팅 단백질, 바람직하게는 무수 식물 재료 그램당 적어도 10㎍, 가장 바람직하게는 적어도 20㎍의 피임성 단백질을 발현시킬 것이다.
일 실시 형태에서, 실험실, 오두막집 또는 별장 등의 조절된 환경에 수용된 동물들 및 옥외에 기거하지만 그의 음식물 섭취는 조절되는 동물들(예, 가축)은 적어도 12주 동안 1주일 간격으로 유전자 전이 식물 재료를 급식받았다(즉, 0, 7, 14, 21, 28, 35,42, 49, 56, 63, 70, 77일). 각각의 급식에서, 동물들은 치료받아야 하는 동물의 크기 및 평균 음식 섭취에 따라 4 내지 100,000 그램의 유전자 전이 식물 재료를 받는다(예, 평균적인 소는 1일 약 90파운드의 음식을 소비한다).
대안의 실시 형태에서, 상기한 바와 같이 감금된 동물 개체군들은 제1의 피임 백신화를 달성하기 위해 1일 단위(예, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6일째)로 유전자 전이 식물 재료를 급식받고, 이어서 충분한 피임 면역 상태를 유지하기 위해 규칙적인 부스팅 스케줄(예, 1단 단위)로 유전자 전이 식물 재료를 급식받는다.
대안의 실시 형태에서, 유전자 전이 식물 재료의 전달은 피임성 제제들의 경피 전달을 증대시키기 위해 사용된다. 예를 들면, 피임성 제제(식물들, 세균성 효모, 또는 포유동물 세포들 등의 시스템들을 통해 생산됨)는 교배 적령기의 시작시에 수의사에 의해 동료 동물에 전달될 수 있고, 본 명세서에 기재된 유전자 전이 식물 재료들로부터 유도된 규정된 피임성 급식으로 규칙적인 스케줄(예, 한달 단위)로 후원받는다.
인간 적용을 위한 대안의 실시 형태에서, 유전자 전이 식물 재료는 캡슐제 또는 정제로 제형화될 수 있고, 자체-투여된 식이 요법에 혼입됨으로써 피임성 및 비피임성 정제들 또는 캡슐제들은 복용 및 비복용이 격일 째에 발생하도록 패키지화된다.
대안의 실시 형태에서, 야생 동물들은 그 동물들의 자연 환경에 놓인 음식물 먹이의 형태로 유전자 전이 식물 재료를 투여받을 수 있다. 먹이를 전달하는 최상의 방법들, 및 하나의 용도당 개체군 효과의 모델링은 야생 개체군을 통제하는 당업계의 숙련자들에게 유용하고, 각각의 타겟 종들에 대한 최상의 특이적 먹이 규정식을 결정할 것이다. 대안으로, 본 발명의 피임성 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물들은 피임성 단백질이 투여되어야 하는 동물들이 서식하는 야생 영역들에서 성장하도록 허용될 수 있다. 식물들은 이 식물에 의해 발현되는 피임성 단백질의 양을 측정하기 위해 본 명세서에 기재된 기술들을 사용하여 조사될 수 있다. 바람직한 실시 형태들에서, 야생에서 생장하는 유전자 전이 식물은 무수 식물 재료 그램당 적어도 8㎍의 피임성 단백질, 또는 피임성 단백질/점막 타겟팅 단백질 융합물, 바람직하게는 무수 식물 재료 그램당 적어도 10㎍, 가장 바람직하게는 적어도 20㎍의 피임성 단백질을 발현시킬 것이다. 이들 조건들 하에, 야생 동물들은 유전자 전이 식물 재료를 임의로 급식받는 것이 허용될 수 있다.
보조제
항원 응답을 증가시키기 위해 면역학적 항원과 함께 보조제가 부가될 수 있다는 것은 잘 공지되어 있다(콜리건 LG 등, 편집, Current Protocols in Immunology, 뉴욕; 존 윌리 & 선즈, 1995). 프라운트의 완전 보조제는 수십년 동안 면역학적 보조제의 대들보였다. 통상적으로 효과적이지만, 보조제는 그의 용도의 순화 및 대체물의 개발을 유도하는 목적하지 않는 부작용들을 유도할 수 있다.
다른 대체 보조물들로는 2% 스쿠알렌 중에 독성 제거된 엔도톡신(MPL) 및 미코세균성 세포벽 성분들(TDW, CWS)을 함유하는 수중 오일 에멀젼인 Ribi 보조제 시스템(RAS)(Ribi 이뮤노켐 리써치, 인크. 몬나타주 해밀턴); 안정한 대사성 오일중물 보조제인 TiterMax(CytRx 코포레이션, 조지아주 아틀란타 노르크로스); 트윈 80 및 플루로닉 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 L121에 의해 안정되는 예비 형성된 수중 오일 현탁액인 신택스 보조제 제형(SAF)3(키론 코포레이션, 캘리포니아주 에머리빌); 프라운드 완전 보조제의 보다 적은 염증성 대체물인 프라운드의 불완전 보조제(FIA)(노바백스 인크, 매릴랜드주 컬럼비아); 백신 등의 상용 제품들 중에 특히 널리 사용되는 보조제인 ALUM - 수산화 알루미늄(알히드로겔로서 상업적으로 입수할 수 있음, 애큐레이트 케미컬&싸이언티픽 코., 뉴욕 웨스트버리); SuperCarrier(신텍스 리써치, 캘리포니아주 팔로 알토); Elvax 40W(듀퐁 케미컬 코. 델레웨어주 윌밍톤); 만니드-올레이트 화합물인 몬타니드(ISA 세픽 페이필드, 뉴저지); 니트로셀룰로스-흡수 단백질(닐손 BO, 라르손 A. Inert carriers for immunization. Res. Immunol. 143:553-557, 1992); 거부 보조제(C-C 바이오테크, 캘리포니아주 포웨이); 면역-자극 착물들(ISCOMS)(콜리건 LG 등, 편집, Current Protocols in Immunology, 뉴욕: 존 윌리 & 선즈, 1995)을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
사포닌 보조제들은 경구용 백신으로 수년 동안 사용되어 왔다(제품들로는 "Quil A" 또는 "QS-21"을 들 수 있다). 사포닌은 2차 대사물로서 생산되는 글리코시드 화합물들이다. 이들은 고등 식물들에 및 극피 동물문의 일부 해양 무척추 동물에 널리 분포되어 있다(앱사이몬 등, Stud. Org. Chem. 17:273-286(1984)). 이들의 항미생물 활성 때문에, 식물 사포닌들은 미생물, 특히 진균에 대항하는 효과적인 화학적 방어물들이다(프라이스 등, CRC Crit, Rev. Food Sci. Nutr. 26:27-135(1987)). 사포닌들은 많은 해양의 무척추 동물들의 독성 특성들에 대한 책임이 있다(앱사이몬 등, Stud. Org. Chem. 17:273-286(1984)). 사포닌들의 화학적 구조는 일부 잠재적이고 유효한 면역학적 활성을 포함하여 광범위한 범위의 약물학적 및 생물학적 활성들을 부여한다. 또한, 이러한 화합물과의 멤버들은 거품 형성 활성(식별되는 활성), 표면 활성제 활성(이들의 용혈 활성에 대한 책임이 있음), 콜레스테롤-결합, 진균 독성, 살연체동물성, 피임성, 성장-지연성, 거담제, 항염증성, 진통성, 항바이러스성, 심장 혈관성, 효소-억제 및 항종양 활성을 갖는다[호스테트맨, K. 등, Methods Plant Biochem. 7:435-471(1991); 라카일-듀보이스, M.A. & 바그너, H. Phytomedicine 2: 363-386(1996); 프라이스, K. R. 등, CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26:27-135(1987)].
또한, 사포닌 용액들은 점액질 멤브레인들을 가로질러 폴리펩티드들의 전달을 증가시키는 세제들로서 사용되어 왔다. 예를 들면, 필리온, D.J. 등, Invest. Opthal. Vis. Sci. 32:3021-27(1991)은 1% 용액으로서 집소필라로부터 정제되지 않은 사포닌을 함유하는 점안액 중의 인슐린의 투여는 쥐들에서 D-글루코스의 혈중 레벨의 신속하고 재생 가능한 감소를 유발한다고 개시하고 있다. 사포닌이 결핍된 인슐린 점안액들은 효과적이지 못하다. 일본국 초록 제JP62126135(1987)호는 스테로이드성 도는 트리테르펜 구조를 갖는 사포닌을 사용하는 성장 호르몬 방출 인자의 비내 투여를 개시한다. 치오우, G.C.Y. 등, J. Pharm. Sci. 78:815-818(1989); 및 치오우, G.C.Y. 등, J. Ocul. Pharm. 5:81-91(1989)는 사포닌을 함유하는 점안액들(시그마 케미컬 컴퍼니로부터 입수함)의 성분으로서 그의 투여에 의한 인슐린의 전신 전달을 개시하고 있다. 사포닌의 이러한 세정성은 바이오멤브레인의 침투성을 고무시킬 수 있고, 따라서 면역 응답을 증가시킬 수 있다.
퀼라자 사포나리아 몰리나 나무의 껍질로부터 얻은 사포닌 보조제(퀼라자사포닌류)는 화학적으로 및 면역학적으로 잘 특성화된 제품들이다(달스가아드, K. Arch. Gesamte Virusforsch. 44:243(1974); 달스가아드, K. Acta Vet. Scand. 19(Suppl. 69):1 (1978); 히구찌, R 등, Phytochemistry 26:229(1987); ibid. 26: 2357(1987); ibid 27: 1168(1988); 켄실, C, 등. J. Immunol. 146:431(1991); 켄실, C, 등. 미합중국 특허 제5,057,540호(1991); 켄실, C, 등. Vaccines 92:35(1992); 봄포드, R. 등, Vaccine 10:572(1992); 및 켄실, C, 등. 미합중국 특허 제5,273,965호(1993)).
사포닌은 또한 대두콩 등의 다른 식물에 존재한다(안드르제유스카 E. 1984, Rocz Panstw Zakl Hig, 35:135-8).
퀼라자 사포닌들은 약 20개의 구조적으로 치밀하게 관련된 트레테르페노이드 글리코시드들의 혼합물로서 발견되었으며(히구치, R. 등, Phytochemistry 26:229(1987); ibid. 26: 2357(1987); ibid 27: 1169(1988); 켄실, C, 등. 미합중국 특허 제5,057,540호(1991); 켄실, C, 등. Vaccines 92:35(1992)), 이들 간의 차이는 적고, 따라서 이들의 분리를 어렵게 만든다. 퀼라자 사포나리아 추출물들은 시판되고 있다(예, 가루다 인터내셔널, 인크. 레몬 코브, CA93244). 미합중국 특허 제5,273,965호 및 동 제5,650,398호는 조잡한 사포닌 추출물을 개시하고 있고,미합중국 특허 제5,057,540호는 실질적으로 순수한 사포닌 추출물을 개시하고 있다. 조잡한 사포닌 및 순수한 사포닌 모두에 대한 추출 공정들은 크로마토그래피를 통해 화합물을 정제시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 유용한 사포닌은 조잡하고 순수한 사포닌 추출물을 포함한다(가루다 인터내셔널, 인크. 레몬 코브, CA93244). 유용한 사포닌 보조제는 사포닌을 함유하는 가공 식물의 일부(예, 잎, 뿌리, 과일 또는 기타 부분들)를 또한 포함한다. "가공"이라는 용어는 동물에 의한 소화를 고무시키도록 절단, 으깨기, 다지기, 입방썰기, 또는 그렇지 않으면 사포닌-함유 식물들의 작은 조각들로 감소시키는 것을 의미한다.
바람직한 실시 형태에서, 사포닌 보조제는 유전자 전이 식물 재료와 함께 경구 투여된다.
면역법 검출하기
본 발명은 점막 면역 응답이 증가되도록 피임성 단백질을 투여함으로써 동물에서 피임을 유도하는 수단들을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 피임성 단백질을 낳은 유전자 전이 식물 재료의 투여에 이어, 동물들은 피임성 단백질에 대한 면역 응답이 상승되는지 여부를 결정하기 위해 조사되었다. 동물들은 식물 재료의 투여에 이어지는 일 시점에서 피임성 단백질에 대한 면역 응답에 대해 조사될 수 있다.
그러나, 다음은 ZP 항원들의 평가를 기재하고, 기재된 기술들은 본 명세서에 기재된 피임성 단백질들에 관한 동물들의 면역 상태에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 당업계의 숙련자는 동물이 ZP 항원에 관한 동물의 면역 상태를 결정함으로써 면역되었는지 여부를 결정할 수 있다. 이러한 평가는 예를 들면 혈액, 혈청, 소변, 타액, 눈물 등의 시료에서 ZP-결합 항체의 역가를 평가함으로써 행해질 수 있다. 가장 바람직하게는, ZP 이뮤노겐 또는 그의 등가물에 대한 항체를 검출할 수 있는 효소-링크된 면역소르벤트 분석("ELISA")이 이러한 목적으로 사용될 수 있다(드렐 등, Biol. Reprod. 30:445(1984); ELISA and Other Solid Phase Immunoassays(케메니, D.M. 등, 편집), 존 윌리&선즈, 뉴욕(1988), 본 명세서에 참고 문헌으로 인용함).
면역 평가의 잘 공지된 원리들로부터 이해할 수 있듯이, "순방향", "동시" 및 "역방향" 평가 모두를 포함하는 이뮤노메트릭 평가들(또한 "2-사이트" 또는 "샌드위치" 평가로서 공지됨) 등의 대안의 포맷들이 사용될 수 있다(패크렐, J. Clin. Immunolassay 8:213-219(1985); 욜켄, R.H. Rev. Infect. Dis. 4:35(1982); 콜린스, W. P. In: Alternative Immunoassays. 존 윌리 & 선즈, 뉴욕(1985); Ngo, T.T. 등, In: Enzyme Mediated Immunoassay, Plenum 프레스, 뉴욕(1985)).
예를 들면, "순방향" 평가에서, ZP 항원들은 고체 지지체(마이크로적정 플레이트, 시험관, 딥스틱 등)에 결합되고, 이어서 2진 고체상 ZP-항체 착물의 형성을 허용하는 조건들 하에 안티-ZP 항체의 존재에 대해 평가되는 시료와 접촉하게 된다. 접종 및 세척 후, 지지체는 일정량의 라벨링된 ZP 항원("리포터 분자"로서 기능함)고 접촉하도록 배치된다. 라벨링되지 않은 항체를 통해 고정된 ZP와 라벨링된 ZP 항원의 착물화를 허용하는 제2 인큐베이션 기간 후, 고체 지지체는 미반응된라벨링 ZP 항원을 제거하기 위해 두번째로 희석된다. 이러한 유형의 순방향 샌드위치 평가는 안티-ZP 항체들이 존재하는지 여부를 결정하기 위해 단순히 "예/아니오"로 평가될 수 있거나, 또는 보유된 라벨링된 ZP 항원의 양을 공지된 양의 안티-ZP 항체를 함유하는 표준에 대해 얻어진 것과 비교함으로써 정량화될 수 있다. "2-사이트" 또는 "샌드위치" 평가는 문헌(와이드, In/\: Radioimmune Assay Method,(커크햄 등, 편집), E. & S. Livingstone, Edinburgh, 199-206페이지(1970), 참고 문헌으로 인용함)에 기재되어 있다.
바람직한 실시 형태에서, 순방향 ELISA 평가는 점막 면역 응답을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 그 평가는 상기한 바와 같이 수행되며, 단, 시료와의 접종에 이어지는 변형은 점막의 면역글로불린들에 대해 평가되는 것이고, 지지체는 동물로부터 얻어진 시료에서 IgA의 존재의 리포터들로서 기능하는 라벨링된 안티-IgA 항체들과 접촉하게 배치된다.
"동시" 평가에서, 바운드된 ZP 및 라벨링된 ZP 모두가 동시에 시험되는 시료에 부가되는 단일 인큐베이션 단계가 사용된다. 인큐베이션이 완료된 후, 고체 지지체는 유체 시료 및 미착물화된 라벨링된 항체의 잔기를 제거하기 위해 세척된다. 이어서, 고체 지지체와 연관된 라벨링된 항체의 존재는 그것이 종래의 "순방향" 샌드위치 평가에서와 같이 결정된다.
"역방향" 평가에서, 라벨링된 ZP의 용액은 시료와 함께 인큐베이션되고, 이어서, 반응은 라벨링되지 않은 ZP가 이미 바운드된 고체 지지체와 접촉하도록 이루어진다. 제2 접종 후, 고체상은 시험된 시료의 잔기 및 미반응된 라벨링된 ZP의용액으로부터 그것을 유리화시키기 위해 통상의 방식으로 세척된다. 항체 적정의 결정은 "동시" 및 "순방향" 평가에서와 같이 결정된다.
대부분의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 ELISA는 모노클로날 항체를 사용한다. 가장 바람직하게는, 그러한 항체들은 이질성 동물(생쥐, 쥐, 토끼 등)을 ZP 항원으로 면역시키고, 이어서, 동물의 비장의 백혈구들을 수확하고, 이들을 상기한 방식으로 적절한 골수 세포와 융합시킴으로써 상기한 바와 같이 발생된다.
면역 평가는 특정 바람직한 고체 지지체에 관련하여 기재하였지만, 각종 대안의 고체 지지체들이 사용될 수 있다. 적절한 고체 지지체들은 예를 들면, 유리, 종이, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제들, 천연 및 변형된 셀룰로스들, 폴리아크릴아미드들, 아카로스들 또는 자철광 등의 재료들로 구성될 수 있다. 지지체의 특성은 본 발명의 목적을 위해 어느 정도는 가용성이거나 또는 불용성일 수 있다. 지지체 재료는 ZP 분자들이 항체에 결합할 수 있는 한 사실상 가능한 구조적 형태를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드에서와 같이 구형, 시험관 내부 표면 또는 막대의 외부 표면에서와 같이 원통형일 수 있다. 대안으로, 그 표면은 시트, 테스트 스트립 등과 같이 평평할 수 있다. 당업계의 숙련자들은 모노클로날 항체를 결합시키기 위한 많은 적절한 담체들을 주지할 것이고, 판에 박힌 실험의 사용에 의해 동일물을 얻을 수 있을 것이다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 전이 식물 재료가 투여된 동물의 면역 상태는 면역 조직 화학 기술들에 의해 평가될 수 있다. 간단히 말하자면, 상기 투여 경로에 의한 유전자 전이 식물 재료의 투여 후, 암컷 동물들은 희생될 수있고 난소가 제거될 수 있다. 수정은 난소로부터 난자를 방출한 후 나팔관에서 발생하기 때문에, 본 발명의 피임성 단백질들에 대항하는 항체들의 존재는 난소의 난자들 상에서 검출되는 것이 바람직하다. 동물로부터 제거 후, 난소들은 저온 분할되어 냉동된다. 섹션들은 포름알데히드, 아세톤, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 당업계에 공지된 고정액 중에 고정된다. 섹션들은 순차로 세척되고, 피임성 단백질에 대한 응답에서 동물에 의해 상승되는 항체들에 대해 결합하는 항체들과 인큐베이션된다. 섹션들은 리포터 분자(예, 형광 염료)를 포함하는 제2 항체와 함께 추가로 인큐베이션되고, 현미경으로 조사되었다. 투여된 유전자 전이 식물에 의해 발현된 피임성 단백질에 대항하여 지향된 항체들의 식별은 피임성 단백질에 대항하여 동물에 의해 증가된 면역 응답을 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 유전자 전이 식물 재료가 생쥐에게 투여되는 경우, 식물에 의해 발현된 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답은 생쥐 난소의 조직 섹션들을 얻음으로써 및 생쥐 면역글로불린의 카파 사슬에 대항하여 지향된 항체들로 조직을 처리함으로써 측정될 수 있다. 안티-쥐 카파 사슬 항체 편재화는 형광 염료 등과 같이 리포터에 콘쥬게이트된 제2 항체로 조직을 처리함으로써 가시화될 수 있다. 이어서, 조직은 라벨링된 항체들을 시각적으로 편재화시키기 위해 현미경으로 조사될 수 있고, 항체 라벨링의 이미지는 NIH 이미지 등의 당업계의 숙련자들에게 공지된 형태 측정 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정량화된다(National Institutes of Health, 매사추세츠주 베데스다). 이어서, 정량적인 데이터는 본 발명의 피임성 단백질로 치리되지 않은 생쥐로부터 얻은 유사한 항체 라벨링 데이터에 통계학적으로 비교된다. 동물들 간의 통계학적으로 현저한 차이는 피임성 단백질에 의한 생쥐의 면역을 나타내고, 여기서, 통계학적 시험을 위한 P 값은 적어도 <0.1, <0.05, <0.01, <0.005, <0.001, <0.0005, 및 바람직하게는 <0.0001이다.
피임 효과 검출하기
대부분의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 투여된 피임성 단백질들의 피임 효과는 본 발명의 방법들에 따라 유전자 전이 식물 재료가 투여된 암컷 동물에 의해 사육 주기당 생산된 새끼의 수를 평가함으로서 결정된다. 예를 들면, 유전자 전이 식물 재료를 생쥐에게 투여한지 5 내지 6주 후, 개개의 암컷 생쥐들은 수컷 생쥐와 우리 안에 넣었다. 이어서, 수컷 생쥐는 10 내지 20일 후에 옮겼다. 이어서, 암컷 생쥐들은 새끼들의 출산에 대해 매일 관찰되었다. 투여된 피임성 단백질의 피임 효과는 투여 후 동배 출산군의 감소에 의해 결정된다. 예를 들면, 3마리 이상의 새끼의 평균 동배 출산군을 생산하는 동물 종들에 대해, 피임성 단백질은 10% 내지 100%, 30% 내지 90%, 60% 내지 80%로 동배 출산군 크기가 감소되는 경우에 효과적인 것으로 고려될 수 있다. 한 두 마리의 새끼의 평균 동배 출산군을 생산하는 동물 종들에 대해(예, 흰 꼬리 사슴), 피임성 단백질은 적어도 50%, 바람직하게는 100%로 동배 출산군 크기가 감소되는 경우에 효과적인 것으로 고려될 수 있다.
대안으로, 본 발명의 피임성 단백질들의 효과는 상기한 바와 같이 혈액, 혈청, 점막 분비선, 배설물 등 내의 피임성 단백질에 대항하는 항체들의 레벨들을 측정함으로서 결정될 수 있다. 피임성 단백질들의 효과는 상기한 바의 면역 조직 화학적 기술들에 의해 난소에 결합된 피임성 단백질에 대항하는 항체들을 가시화시킴으로써 평가될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 피임성 단백질의 효과를 정확히 결정하기 위해, 피임성 단백질에 대항하는 항체들의 측정 및 가시화는 동배 출산군 크기의 관찰된 감소와 관련하여 평가되어야 한다. 예를 들면, 피임성 단백질은 생식력의 감소가 없는 경우 동물의 혈청 내의 단백질에 대항하는 항체들의 검출과 무관하게 효과적이지 않은 것으로 고려될 수 있다.
본 발명은 유전자 전이 식물 생약들의 생산 방법들을 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법들은 실온에서 안정하고, 동질성이고, 제약학적으로 잠재성있는 무수 유전자 전이 식물 재료의 생산을 허용한다. 일반적으로, 원상 그대로의 또는 분배된 유전자 전이 식물들 모두는 당업계에 공지된 음식물 가공 기술들을 통해 건조되거나 또는 동결 건조된다. 이어서, 생약 농산물을 함유하는 무수 동질체는 추가로 추출하거나, 정제하거나 또는 제약 단백질을 침전시킬 필요 없이 치료학적으로 사용될 수 있다. 안정한 무수 동질체들은 백신 주사용, 병원성 질병들의 치료용, 및 피임약으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 수정률 및 다산을 위한 안정하고 효과적인 백신을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 안정한 식물-베이스 제약들의 효율적인 생산 방법들에 대한 당업계의 필요성 및 가금 동물들, 도살용 종들, 동물학상의 감금된 표본들, 엽조수 보호 구역 개체군들 및 인간들의 개체수 조절을 위한 편리하고 비용 효율적인 방법들에 대한 필요성을 만족시킨다.
여기서, 식물 베이스 제약들의 생산 방법들 및 용도가 개시된다.
본 발명은 i) 원상 그대로 또는 분배된 식물 재료를 얻는 단계, ii) 상기 유전자 전이 식물 재료를 탈수시키는 단계, 및 iii) 상기 탈수 단계 전후에 상기 유전자 전이 식물 재료를 동질체 내로 혼합하는 단계를 포함함으로써, 이질성 제약 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물의 안정한 무수 동질체를 생산하는, 이질성 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물의 안정한 무수 동질체의 생산 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 탈수 반응은 상기 재료를 동결 건조시키거나, 공기중 건조시키거나 또는 분무 건조시킴으로써 달성된다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 상기 혼합 단계 전에 탈수된 재료를 분배하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 부형제의 부가를 추가로 포함한다.
본 발명은 상기 방법들에 의해 생산되는 안정한 무수 동질체를 추가로 제공한다.
일 실시 형태에서, 안정한 무수 동질체는 항원 또는 항체를 함유한다.
본 발명은 유전자 전이 단백질을 함유하는 탈수된 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 안정한 무수 동질체를 제공한다.
본 발명은 임의로 제약학상 허용되는 담체와 혼합된, 유전자 전이 단백질을 함유하는 탈수된 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 안정한 무수 동질체를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 임의로 제약학상 허용되는 담체와 혼합된, 유전자 전이 단백질을함유하는 탈수된 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 안정한 무수 동질체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 병원성 질병의 예방 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 임의로 제약학상 허용되는 담체와 혼합된, 유전자 전이 단백질을 함유하는 탈수된 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 안정한 무수 동질체를 포함하는 제약 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 동물에게 유전자 전이 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 안정한 무수 동질체 중의 상기 유전자 전이 단백질은 백신이다.
본 발명은 유전자 전이 식물 베이스 제약들을 사용하는 피임 방법들을 추가로 제공한다.
본 발명은 바이러스성 중간체의 부재 하에 피임성 단백질의 식물 염색체 발현을 이용한다.
본 발명은
피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 단계를 포함하고;
상기 투여 단계는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 피임 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 피임을 유도하기에 효과적인 양으로 동물에게 투여하는 단계를 포함하고;
상기 투여 단계는 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하는 것인, 피임 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 단계(여기서, 상기 핵산은 식물 염색체 내로 통합됨)를 포함하는 것으로;
상기 유전자 전이 식물 재료가 투여된 상기 동물에 의해 생산되는 사육 주기당 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 피임 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 피임을 유도하기에 효과적인 양으로 동물에게 투여하는 단계(여기서, 상기 핵산은 식물 염색체 내로 통합됨)를 포함하는 것으로;
상기 유전자 전이 식물 재료가 투여된 상기 동물에 의해 생산되는 사육 주기당 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 피임 방법을 제공한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 잎, 뿌리, 새싹, 가지, 과일, 구근, 꽃 및 종자로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 식용성이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵산에 의해 인코딩된 상기 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된군으로부터 선택된다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP3이다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 피임성 단백질은 종들-특이적이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 피임성 단백질을 인코딩하는 상기 핵산은 점막의 타겟팅 단백질을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 전체 식물로서 투여된다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 점막의 전달에 의해 투여된다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 점막 투여는 경구, 코의 또는 눈의 전달이다.
본 발명은 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 여기서, 상기 투여 단계는 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하는 것이고, 상기 투여 단계는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 점막의 면역 응답 유도 방법을 제공한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 잎, 뿌리, 새싹, 가지, 과일, 구근, 꽃 및 종자로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 식용성 식물의 형태이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 핵산에 의해 인코딩된 상기 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP3이다.
다른 실시 형태에서, 상기 피임성 단백질은 종들-특이적이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 핵산은 점막의 타겟팅 단백질을 추가로 인코딩한다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B이다.
본 발명은 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 것으로, 여기서, 상기 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 것은 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하고, 상기 투여는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 유전자 전이 식물을 제공한다.
본 발명은 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 것으로, 여기서, 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 핵산은 바이러스 입자 상에 발현되지 않는 것이고, 상기 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 것은 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하는, 유전자 전이 식물을 제공한다.
본 발명은 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 것으로, 여기서, 투여는 상기 유전자 전이 식물 재료가 투여되는 상기 동물에 의해 생산되는 사육 주기당 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 유전자 전이 식물을 추가로 제공한다.
본 발명은 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 것으로, 여기서, 상기 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 것은 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하고, 상기 핵산은 식물 염색체 내로 통합되는 것인, 식용 유전자 전이 식물을 추가로 제공한다.
일 실시 형태에서, 상기 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인 또는 그의 단편은 종들-특이적이다.
다른 보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP3 또는 그의 단편이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 핵산은 점막의 타겟팅 단백질을 추가로 인코딩한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B이다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 식물은 외떡잎 식물이다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 식물은 쌍떡잎 식물이다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 식물은 토마토 작물들, 벼 작물들, 밀 작물들. 옥수수 작물들, 당근 작물들, 감자 작물들, 사과 작물들, 대두 작물들, 알팔파 작물들, 개자리과 작물들, 채소류 작물들, 및 과일류 작물들로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 핵산 벡터를 포함하는 것으로, 여기서 상기 핵산 벡터는 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 것이고, 이 핵산 벡터는 식물 세포의 염색체 내로 혼입되고 그로부터 발현되는 것이고, 상기 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 것은 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 식물 세포를 제공한다.
일 실시 형태에서, 상기 핵산 벡터에 의해 인코딩된 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 피임성 폴리펩티드는 종들-특이적이다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP3이다.
일 실시 형태에서, 상기 핵산 벡터는 점막의 타겟팅 단백질을 추가로 인코딩한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B이다.
일 실시 형태에서, 상기 식물 세포는 외떡잎 식물로부터 얻어진다.
일 실시 형태에서, 상기 식물 세포는 쌍떡잎 식물로부터 얻어진다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 식물 세포는 토마토 작물 세포들, 벼 작물 세포들, 밀 작물 세포들. 옥수수 작물 세포들, 당근 작물 세포들, 감자 작물 세포들, 사과 작물 세포들, 대두 작물 세포들, 채소류 작물 세포들, 및 과일류 작물 세포들로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 식물 세포에서 피임성 폴리펩티드의 합성을 지향시킬 수 있는 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 링크된 식물-기능성 프로모터를 포함하는 것으로, 여기서, 플라스미드 벡터를 포함하는 식물 세포를 동물에게 투여하는 것은 동물에서 점막의 면역 응답을 유도하고, 그 투여는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 식물 세포를 형질 전환시키는 플라스미드벡터를 추가로 제공한다.
일 실시 형태에서, 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 상기 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 식물 세포는 식용 식물로부터 얻어진다.
일 실시 형태에서, 상기 플라스미드 벡터는 점막의 타겟팅 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B이다.
본 발명은 동물에 의해 소화될 수 있는 상기 유전자 전이 식물의 적어도 일부를 포함하는 것으로, 여기서 유전자 전이 식물의 소화는 동물에서 점막의 면역 응답을 유도하고, 그 소화는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 음식 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 상기 유전자 전이 식물의 적어도 일부를 제약학상 허용되는 담체와 함께 포함하는 것으로, 여기서 제약 조성물을 동물에 투여하는 것은 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 제약 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 가공된 유전자 전이 식물 재료와의 혼합물로서 사포닌 보조제를포함하는 것으로, 여기서, 조성물의 투여는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 동물에게 경구 투여하기 위한 조성물을 추가로 제공한다.
본 명세서에 사용된 바의, "피임약"은 피임을 위해 사용된 시약을 의미한다. "피임"은 단일 사육 주기의 동물에 의해 생산되는 새끼의 수를 감소시키거나, 또는 유성 생식에서 정충에 의한 난모 세포의 수정을 방지하는 것을 의미한다. 수정의 "방지"는 "피임약"이 아래 기재되는 바와 같이 투여되는 암컷 동물에 의해 생산되는 새끼의 수의 감소에 의해 확인될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바의 "피임약"은 하나의 사육 주기의 포유 동물에 대해, 수정의 상기 감소 또는 방지, 또는 수정란 착상의 방지를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바의, "유성 생식"은 포유 동물을 위한 생식의 배타적 형태를 의미한다. 이는 하나의 성 타입 세포가 다른 타입과 수정하여(배우자: 암배우자는 난자이고 수배우자는 정자), 새로운 세포(수정란이라 칭함)를 생성하는 것을 포함하고. 이는 새로운 기관으로 발육된다. 난자들(난자의 복수형) 또는 정자들은 여성 또는 남성의 생식기들에서 생성된다. 단일 유성 생식 과정에서, 정자가 난자와 수정한 후, 수정된 난자를 보유한 여성은 보편적으로 새끼가 생산될(태어날) 때까지 보다 성숙한 난자를 생산할 수 없다.
본 명세서에 시용된 바의 "사육 주기"는 성숙한 난자의 수정 및 다음 생식이 발생하기 전의 새끼의 생산을 포함하는 유성 생식의 단일 과정을 의미한다. 본 발명의 따른 일회의 "사육 주기"는 그렇지 않으면 발생할지도 모르는 피임에 의해 차단되는 잠재적인 단일 생식 과정을 의미하기도 한다.
본 명세서에 사용된 바의 "피임성 단백질"은 사육 주기당 동물에 의해 생산된 새끼의 수를 감소시키는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 단편을 의미한다. 3마리 이상의 새끼의 평균 동배 출산군을 생산하는 동물 종들에 대해, "피임성 단백질"은 동배 출산군 크기를 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 및 심지어 100%까지 감소시키는 폴리펩티드이다. 한두 마리의 새끼의 평균 동배 출산군을 생산하는 동물 종들에 대해, "피임성 단백질"은 동배 출산군 크기를 적어도 50%(즉, 2마리에서 1마리의 새끼), 및 100%까지(즉, 1 또는 2마리 새끼에서 새끼 없음까지) 감소시키는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 대안으로, "피임성 단백질"은 정충에 의한 난모 세포의 수정을 방지하거나, 또는 동물의 자궁 내의 수정된 난자의 착상을 방지하고, 그에 따라 상기한 바와 같이 평균 동배 출산군 크기를 감소시키는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 대안으로, "피임성 단백질"은 동물에서 점막의 면역 응답을 자극할 수 있고, 여기서 면역 응답은 "피임성 단백질"에 항체들을 증가시키는 것인 폴리펩티드를 의미한다. 항체들은 성 호르몬들에 따른 부위들인, 난모 세포 또는 정모세포에 결합할 수 있고, 난모세포의 성적인 성숙, 수정 및(또는) 동물의 자궁 내의 수정된 난모세포의 착상을 방지하고, 그에 따라 동배 출산군 크기를 감소시킬 수 있다. 본 발명에 유용한 "피임성 단백질"의 예들로는 투명대 글리코프로테인들, 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH), 류티나이징 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 류티나이징 호르몬(LH), 락테이트 데히드로게나제(LDH), 및 항정자 항원들을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. "항정자 항원들"로는 SP5,SP56, 퍼틸린, PH30, LDH-C4 및 P10을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바의 "피임을 유도하기에 효과적인 양"은 피임을 유도하는 유전자 전이 식물 재료의 양을 의미한다. 바람직하게는, "피임을 유도하기에 효과적인 양"의 유전자 전이 식물 재료는 10%, 30%, 60%, 80% 및 100%까지 동배 출산군 크기를 감소시키는 식물 재료의 양이다. 사육 주기당 1 또는 2마리의 새끼의 평균 동배 출산군을 생산하는 동물 종들에 대해, "피임을 유도하기에 효과적인 양"은 적어도 50% 및 100%까지 동배 출산군 크기를 감소시키는 식물 재료의 양이다. 본 명세서에 사용된 바의 "피임을 유도하기에 효과적인 양"은 피임을 유도하는 유전자 전이 식물 재료의 양이 무수 유전자 전이 식물 재료의 중량 그램당 적어도 약 5㎍의 피임성 단백질, 바람직하게는 무수 유전자 전이 식물 중량 그램당 적어도 10㎍, 20㎍, 40㎍, 60㎍, 80㎍, 100㎍, 120㎍, 140㎍, 150㎍ 이상을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바의 "유전자 전이 식물"은 그의 세포들이 "이질성의" 이종 유전자를 안정하게 발현시키는 식물을 의미하고, 여기서 이종 유전자는 식물 세포 염색체 내로 통합되고, 바이러스에 대해 독특한 바이러스 벡터 서열을 갖지 않고, 이종 유전자는 다음 식물 세대 상으로 통과되며, 숙주 식물 세포 염색체로부터 발현될 수 있다. "유전자 전이 식물"은 "복수개의 유전자 전이 식물 세포들"을 포함한다. "유전자 전이 식물"은 부리들, 가지들, 잎들, 줄기들, 종자들, 과일, 구근들, 꽃들, 꽃가루 등을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 전체 식물 또는 그의 일부를 의미한다. 이질성 이종 유전자들의 예로는 놀워크 바이러스 캡시드 프로테인(NVCP), 조류 인플루엔자 혈구 응집 항원(AIV-HA), 뉴캐슬병 바이러스 휴라미니다제(NDV-HN), 투명대 글리코프로테인 3(ZP3), B 형 간염 표면 항원(HBsAg)을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바의 "이질성 단백질"은 "이질성 유전자"로부터 발현된 단백질을 의미한다. "이질성 유전자"는 그것이 궁극적으로 발현되는 식물의 종들의 게놈 이외의 1개 이상의 소스들로부터 얻어진 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 유전자 단편이다. 그 소스는 자연적일 수 있고, 예를 들면, 유전자는 박테리아, 바이러스, 효모, 곰팡이 등, 또는 상이한 식물 종들 등의 다른 생명체 소스로부터 얻어질 수 있다. 그 소스는 합성될 수도 있으며, 예를 들면 유전자 또는 유전자 단편은 화학적 합성에 의해 시험관 내에서 제조될 수 있다. "이질성"은 유전자 단편의 소스가 그것이 궁극적으로 발현되는 식물의 게놈 외의 다른 곳에 있는 상황들에서도 사용될 수 있다. "이질성 단백질"은 항원일 수 있거나 또는 엔도스타틴 또는 안지오스타틴 등의 다른 치료용 단백질일 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. "이질성 단백질"은 항체 또는 예를 들면 "플랜티바디들"과 같은 항체 착물일 수도 있다. "플랜티바디들"은 식물들에서 만들어지는 항체들이다.
본 명세서에 사용된 바의 "유전자 전이 식물 재료"는 본 명세서에 정의된 바와 같이 가공되거나 또는 가공되지 않은 유전자 전이 식물을 의미한다. 본 발명에 따른 "유전자 전이 식물 재료"는 "유전자 전이 잎", "유전자 전이 뿌리", "유전자 전이 새싹", "유전자 전이 가지", "유전자 전이 열매", "유전자 전이 구근", "유전자 전이 꽃", 및 "유전자 전이 종자"를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 전체 유전자 전이 식물, 또는 유전자 전이 식물의 일부일 수 있다. "유전자 전이 식물재료"는 한개 또는 복수개의 "유전자 전이 식물 세포들"이라 칭하기도 한다. "유전자 전이 식물 세포"는 이종 유전자를 안정하게 발현시키는 식물 세포를 의미하고, 여기서 이종 유전자는 식물 세포 염색체 내로 통합되고, 바이러스에 대해 독특한 바이러스성 벡터 서열을 갖지 않으며, 여기서, 이종 유전자는 다음 세포 세대 상으로 통과되며, 숙주 식물 세포 염색체로부터 발현될 수 있다. 또한, "유전자 전이 식물 재료"는 잘 공지된 세포 배양 기술들(스트리트, HE, 1973, 식물 조직 및 세포 배양: botanical monographs. 제II권, 버클리, 캘리포니아 주립대학)에 의해 얻어진 한개 또는 복수개의 "유전자 전이 식물 세포들"을 포함하는 "유전자 전이 세포 현탁액"을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바의 "원상 그대로의" 유전자 전이 식물 재료는 예를 들면 슬라이싱, 깍뚝썰기, 절단 또는 퓌레로 만들기에 의해 이들의 크기를 감소시키기 위해 추가로 처리되지 않은 전체 식물 또는 식물 일부를 의미한다. 일반적으로, 식물 재료는 수확한 바의 "원상 그대로" 또는 "전체"이지만, 단순히 유전자 전이 식물의 일부일 수 있다. 예를 들면, 원상 그대로의 "유전자 전이 잎", "유전자 전이 뿌리", "유전자 전이 새싹", "유전자 전이 가지", "유전자 전이 열매", "유전자 전이 구근", "유전자 전이 꽃", 및 "유전자 전이 종자"가 사용된다.
본 명세서에 사용된 바의 "분배된" 유전자 전이 식물 재료는 당업계에 공지된 수단에 의해 크기가 감소된 "전체" 식물 또는 "원상 그대로의" 식물 일부를 의미한다. "분배하는" 수단으로는 입방으로 자르기, 4등분하기, 다지기, 슬라이싱, 깍둑썰기, 퓌레로 만들기 또는 펄프화하기, 제분, 분쇄, 누르기, 또는 크래킹을 들수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 절단되거나 또는 절단되지 않고, 조리되거나 또는 조리되지 않은 유전자 전이 식물 재료는 실온에서 20분 동안 키친 블렌더에서 주스로 만들기, 블렌딩 또는 퓌레로 만들기를 포함하는 당업계의 숙련자들에게 공지된 임의의 공정에 의해 펄프화될 수 있다. 펄프화된 식물 재료는 제약학상 허용될 수 있고 유전자 전이 단백질과 호환될 수 있는 적절한 부형제들과 혼합될 수 있다. 유전자 전이 식물 재료는 미세 분말로 "분배"될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "균질화"는 균일한 혼합물로의 대량의 식물 기관들의 감소를 의미하고, 그에 따라 조직에서 조직으로의 동질체 단백질의 양의 변화는 재료의 균일한 배치로 조합된다. 따라서, "균질한" 또는 "동질체"는 조직에서 조직으로 특정한 상이한 양들의 식물 단백질들 및(또는) 유전자 전이 단백질을 함유할 수 있는 식물 조직들이 균일한 양의 그러한 단백질을 함유하는 재료의 배치 내에 조합되도록 분배되거나 도는 감소된 식물 재료를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바의 "식용 식물"은 동물들에 의해 소비될 수 있는 것으로, 영양가를 갖고, 독성이 없는 식물을 의미한다. "식용 식물"은 인간들 또는 기타 동물들에 의해 소화되는 식물이거나 도는 식물로부터 얻는 재료인 "음식"일 수 있다. "음식"이라는 용어는 인간들 또는 다른 동물들에게 급식될 수 있는 식물 재료 또는 인간들 및 다른 동물들에게 급식되는 가공된 식물 재료를 포함하도록 의도된다. 식물로부터 얻어진 재료들은 결과적으로 인간 또는 다른 동물에 의해 소화되는 식물의 성분을 포함하도록 의도된다. "식용 식물"의 예들로는 토마토 작물들, 벼 작물들, 밀 작물들. 옥수수 작물들, 당근 작물들, 감자 작물들, 사과 작물들, 대두 작물들, 알팔파 작물들, 개자리과 작물들, 채소류 작물들, 및 과일류 작물들을 들 수 있으며, 이들로만 제한되지 않는다.
일부 경우들에서, "식용 식물"은 "그의 영양가를 위해 소화될 수 있는" 것이고, 이는 대사 가능한 에너지의 소스, 보충적인 또는 필수 비타민들 또는 보조-인자들, 비소화성 물질 또는 그렇지 않으면 동물에 의한 소화에 따른 유익한 효과를 제공하는 식물 또는 그의 일부를 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법들에 의해 처치되어야 하는 동물이 셀룰로스를 세균-보조 소화시킬 수 있는 초식 동물인 경우, 그러한 음식은 유전자 전이 목초 작물로 나타낼 수 있을지도 모른다. 기타 식용 식물들은 채소류 및 과일류를 포함한다. 마찬가지로, 예를 들면 유전자 전이 상추 작물들은 에너지 소스들, 단백질들, 탄수화물들 또는 지방들 등의 빌딩 차단 분자들로서 실질적으로 기여하지 못할 뿐만 아니라, 다른 필수 또는 보조 비타민들 또는 보조 인자들로서도 기여하지 못하더라도, 동물을 위한 음식으로서 본 명세서에 기재된 핵산 분자들을 위해 유전자 전이된 상추 작물은 상추의 소화가 동물에게 유익한 비소화성 물질에 기여하는 경우, 심지어 동물이 상추의 셀룰로스 성분을 소화시킬 수 없는 경우에 사용되는 바의 음식의 정의 하에 속할 수 있었다. 따라서, "식용 식물"은 담배를 배제한다.
본 명세서에 사용된 바의 "가공된" 유전자 전이 식물 재료는 "절단"된 식물 재료를 의미하고, 여기서 "절단"은 "저미기", "다지기", "깍둑썰기"를 의미하거나, 또는 그렇지 않으면 식물 재료를 약 1mm2의 최소 크기의 작은 조각들로 감소시키는것을 의미한다. "절단되거나" 또는 "절단되지 않은" 유전자 전이 식물 재료는 삶기, 굽기 및 튀기기를 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 식물 재료를 "조리"함으로써 추가로 가공될 수 있고, 여기서, 식물 재료의 온도는 적어도 약 5분, 및 30분까지 동안 적어도 140℃, 160℃, 180℃ 및 200℃까지로 증가되었다. 본 발명에 유용한 "조리된" 유전자 전이 식물 재료는 "조리된" 식물 재료가 붕괴된 식물 세포들을 포함할 수 있기 때문에, 피임성 단백질의 정제 없이 투여된다 "절단"되거나 또는 절단되지 않고, "조리되거나" 또는 조리되지 않은 유전자 전이 식물 재료는 예를 들면 혼합에 의해 식물 재료를 비유전자 전이 식물 또는 비식물 재료와 "조합"함으로써 추가로 가공될 수 있고, 여기서 유전자 전이 식물 재료는 유전자 전이 식물 재료와 비유전자 전이 또는 비식물 재료와의 조합의 적어도 50중량%를 포함한다. 예를 들면, 유전자 전이 옥수수는 옥수수 낟알들을 다른 식물들과 "조합"함으로써 가공될 수 있거나, 또는 대두 작물들은 식물 재료를 예를 들면 대두 버거, 대두 쉐이크 또는 두유를 생산하기 위해 양념들 및(또는) 다른 풍미제들 등의 다른 성분들과 "조합"함으로써 가공될 수 있다.
대안으로, 본 발명에 유용한 유전자 전이 식물 재료는 절단되거나 또는 절단되지 않고, 20분 동안 실온의 키친 블렌더에서 주스화 하기, 블렌딩 또는 퓌레로 만들기를 포함하는 당업계의 숙련자들에게 공지된 임의의 공정에 의해 조리되거나 또는 조리되지 않은 유전자 전이 식물 재료를 "액화"시킴으로써 가공될 수 있다. 이어서, "액화된" 식물 재료는 동물에 직접적으로 투여될 수 있거나, 또는 "액화된" 식물 재료를 제약학상 안정하고 피임성 단백질과 호환될 수 있는 적절한 부형제들과 혼합함으로써 추가로 가공될 수 있다. "액화된" 식물 재료는 액체 식물 재료를 제약학상 허용되는 크림제, 연고제 또는 고약과 혼합함으로써 추가로 "가공"될 수 있다. 유전자 전이 식물 재료를 "액화"시키는 동안, 유전자 전이 식물 세포들은 붕괴될 수 있고, 그에 따라 이들의 성분들을 "액화된" 혼합물로 해리시킬 수 있다. 이러한 특성의 "액화된" 혼합물은 본 발명에 유용하고, 단 유전자 전이 식물 세포들에 의해 발현된 피임성 단백질들은 "액화된" 식물 재료로부터 정제되지 않는다.
대안으로, 본 발명에 유용한 절단되거나 또는 절단되지 않고, 조리되거나 또는 조리되지 않은 유전자 전이 식물 재료는 수분을 제거하기 위해 식물 재료를 "동결 건조"시키거나 또는 "탈수"시킴으로써 "가공"될 수 있다. "탈수"는 공기중 건조 또는 분무 건조에 의해서 또는 "동결 건조"에 의해 수행될 수 있고, 여기서 "동결 건조"는 냉동 상태에서 신속한 동결 및 탈수에 의해 무수 상태의 식물 조성물의 제조를 의미한다(때때로 승화라 칭함). 이러한 공정은 거의 실온에서 용기의 주변 온도로 냉동된 제품을 유지하기에 충분한 압력, 바람직하게는 약 500mTorr 미만, 보다 바람직하게는 약 200mTorr 미만, 더욱 바람직하게는 약 1mTorr 미만의 압력에서 약 1 내지 72시간 동안 진공하에 수행될 수 있다. 식물 재료는 약 60℃ 내지 약 200℃의 온도의 오븐 내에 식물 재료를 약 1 내지 72시간 동안 놓음으로써 "탈수"될 수 있다. 식물 재료는 이 식물 재료의 중량이 시간이 지남에 따라 변화를 멈출 때 충분히 "동결 건조"되거나 또는 "탈수"된 것으로 보인다. 예를 들면, 상기 온도의 오븐에 넣은 식물 재료의 중량은 수분이 증발하면서 시간이 지남에 따라 감소할 것이다. 중량이 변화를 멈출 때, 모든 수분은 증발되었으며, 식물 재료는 "탈수"되었다고 말할 수 있다. 바람직하게는, 사용된 어떠한 건조 방법에 의해서든 지, 최종 재료는 모든 수분 한량의 적어도 90중량%를 제거하기에 충분히 탈수 된다. "동결 건조된" 또는 "탈수된" 식물 재료는 "동결 건조된" 또는 "탈수된" 식물 재료를 제약학상 허용되고, 피임성 단백질과 호환될 수 있는 부형제들로 유화시킴으로써 추가로 "가공"될 수 있다. 적절한 부형제들로는 예를 들면 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합물들을 들 수 있으며, 여기서 "동결 건조된" 또는 "탈수된" 식물 재료는 부형제 혼합물의 적어도 40중량%, 바람직하게는 적어도 50중량%를 포함한다. 또한, 필요할 경우, "동결 건조된" 또는 "탈수된" 식물 재료는 이 식물 재료의 효과를 증진시키는 보습제 또는 유화제, pH 완충제 또는 보조제들 등의 보조 기질들을 소량 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바의 "동결 건조된" 또는 "탈수된" 식물 재료는 이 식물 재료를 제약학상 허용되는 크림제, 연고제, 고약 또는 좌약들과 혼합함으로써 추가로 가공될 수 있으며, 여기서 식물 재료는 혼합물의 적어도 40중량%, 바람직하게는 적어도 50중량%를 포함한다. 대안으로, "탈수된" 식물 재료는 다가 또는 다중 성분 백신들을 형성하기 위해 이 식물 재료를 과일 주스, 채소 주스, 우유, 물 또는 다른 백신 제형들 등의 액체로 재구성함으로써 추가로 가공될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "부형제"는 임의의 가공 단계에 부가되는 외래 물질을 의미한다. 예를 들면, 부형제들은 유전자 전이 식물 재료를 분배할 때 부가될 수 있거나, 또는 탈수하는 동안 부가될 수 있거나, 또는 탈수 전 후의 혼합 중에 부가될 수 있다. 적절한 부형제들로는 보조약, 완충액, 설탕, 항산화제, 안정제 또는 항원성 분말들을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바의 "폴리펩티드"는 하나의 아미노산 잔기의 α-카르복실 탄소와 다음 잔기의 α-질소 간의 펩티드 결합들을 통해 링크된 일련의 아미노산 잔기들을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바의 "폴리펩티드"는 전체 단백질, 단백질의 단편 또는 단백질의 면역 에피토프를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "투명대 글리코프로테인"은 포유 동물의 투명대를 포함하는 3개의 항산화된 글리코프로테인들의 일 군을 의미한다. 투명대는 난모 세포의 마이크로 융모들로 구성된 층 및 난포 세포들의 세포 공정들을 추가로 포함한다. 특히 하나의 "투명대 글리코프로테인", ZP3은 포유 동물 정자에 대한 주요 결합 부위로서 기능한다. 투명대, 및 특히 투명대 글리코프로테인 ZP3은 ZP3 특이적 항체들 및 당업계에 잘 개시된 표준 면역 화학 기술들을 사용하여 식별될 수 있다(이스트 등, 1985, Dev. Biol. 109:268). ZP 글리코프로테인들을 개시하기 위해 당업계에 사용된 명명법은 가변적이다. ZP 글리코프로테인들의 예로는 돼지로부터 단리된 ZP 단백질들: PZI, PZIII, 90K, 65K, 55K, 25K, ZP1, ZP2, ZP3(PPZA), ZP4, 87K(ZP1/ZP2), 58K; 토끼로부터 단리된 ZP 단백질들: RZI, RZII, RZIII, ZP1, ZP2, ZP3, RZII; 생쥐들로부터 단리된 ZP 단백질들: ZP1, ZP2, ZP3; 고양이로부터 단리된 ZP 단백질들: CZI 및 CZII; 개로부터 단리된 ZP 단백질들: DZI, DZII 및 DZIII; 다람쥐 원숭이로부터 단리된 ZP 단백질들: ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4; 인간으로부터 단리된 ZP 단백질들: ZP1, ZP2 및 ZP3을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 상기 ZP 펩티드들 외에, 많은 종들(예, 생쥐, 인간, 햄스터, 토끼)의 ZP 글리코프로테인들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 밝혀졌고, 따라서 이들이 피임성 단백질들을 인코딩하기 때문에 본 발명에 유용하다. 본 발명은 3개의 ZP 글리코프로테인들에 대한 ZP1, 2 또는 3의 지정을 이용한다. 그러나, 당업계의 다른 것들은 ZP 글리코프로테인들을 ZPA, B 및 C로 그룹화시키고, 여기서 ZPA는 ZP1 및 ZP2로서 기재된 펩티드들을 포함하고, ZPB는 ZP3∝ 및 rc55로서 기재된 펩티드들을 포함하고, ZPC는 ZP3β 및 ZP3로서 기재된 펩티드들을 포함한다(예를 들면, 미합중국 특허 제5,989,550 참조).
본 명세서에 사용된 바의 "면역 피임법"은 일시적인 가역적 피임법을 의미하고, 또한 피임성 단백질에 대한 면역 응답을 초래하는 영구적인 비가역적 피임 또는 살균을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바의 "면역 피임법"은 "면역 피임법"에 적용된 동물에 의해 생산된 사육 주기당 평균 새끼수가 3마리 이상의 새끼의 평균 동배 출산군 크기를 생산하는 동물 종들에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 및 심지어 100%까지 감소되는 경우에 효과적인 것으로 보인다. 3마리 미만의 새끼의 평균 동배 출산군을 생산하는 동물 종들에 대해, "효과적인" 면역 피임법은 적어도 50%, 및 100%까지의 동배 출산군 크기의 감소를 초래할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "면역 응답"은 이종 단백질 또는 자체 단백질들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 기질에 대한 유기체의 면역 시스템에 의해 이루어지는 응답을 의미한다. 점막의, 체액의 및 세포의 "면역 응답들"을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 3가지 일반적 유형의 "면역 응답"이 존재한다. "점막의 면역 응답"은 호흡기, 위장관 및 비뇨 생식기의 모든 점막 표면들을 적시는 분비액에서 및 모든 문비선들로부터의 분비액에서 분비선 IgA(sIgA) 항체들의 생산을 초래한다(맥기, J.R. 등, 1983, Annals NY Acad. Sci. 409). 이들 sIgA 항체들은 점막 표면 상의 병원균들의 콜론화를 방지하는 작용을 하고(윌리엄스, R.C. 등, Science 177, 697(1972); 맥내브, P.C. 등, Ann. Rev. Microbiol. 35, 477(1981)), 따라서, 점막 표면을 통한 콜론화 또는 침임을 방지하기 위한 제1 방어선으로서 작용한다. sIgA의 생산은 분비선 또는 조직의 국소 면역에 의해서 또는 장기-관련 유임파구 조직(GALT 또는 페이어의 패치) 또는 기관지-관련 유임파구 조직(BALT; 세브라, J.J. 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 41, 210(1976); 비에넨스톡, J.M., Adv. Exp. Med. Biol. 107, 53(1978); 위즈-캐링턴, P. 등, J. Immunol 123, 1705(1979); 맥코한, G. 등, Internal Rev. Physiol 28, 131(1983))으로의 항원의 제공에 의해 고무될 수 있다. 다르게는 M 세포들로서 공지된 멤브레인성 마이크로폴드 세포들은 GALT 및 BALT의 표면을 커버하고, 다른 분비선 점막 표면들과 관련될 수 있다. M 세포들은 점막 표면에 인접한 루미날 공간으로부터 항원들을 샘플링하고 그러한 항원들을 항원-표시 세포들(수지상 세포들 및 매크로파지들)로 전달하도록 작용하고, 다시 항원을 (T-의존성 항원들의 경우에) T 임파구에 제공하고, 커미티드 B 세포에 대해 표시하는 항원들을 처리한다. 이어서, B 세포들은 증식, 이동되도록 고무되고, 제공된 항원에 반하여 항체-분비 플라즈마 세포 생산 IgA로 궁극적으로 형질 전환된다. 항원이 GALT 및 BALT를 중첩하는 M세포들에 의해 취해질 때, 일반화된 점막 면역성은 신체의 모든 분비 조직들에 의해 생산되고 있는 항원에 반하는 sIgA를 초래한다(세브라 등, supra; 비에넨스톡 등, supra; 웨인즈-캐링턴 등, supra; 맥코헌 등, supra). 따라서, 경구 면역법은 일반화된 점막의 면역 응답을 자극하는 중요한 경로이고, 구강에서 및 위장관에서 분비선 면역 응답을 고무시키는 중요한 경로이다.
"면역 응답"은 당업계의 숙련자들에게 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 혈청, 혈액 또는 기타 분비액들은 "면역 응답"이 존재하는 것으로 의심되는 유기체로부터 얻어질 수 있고, 효소-관련 면역-흡수제 평가(ELISA; 미합중국 특허 제5,951,988호; DHTMQPF 등,Short Protocols in Molecular Biology3판, 존 윌리 & 선스 인크. 1995)를 사용하여 상기 면역글로불린들의 존재에 대해 평가할 수 있다. 본 발명에 따라, 본 발명의 피임성 단백질은 ELISA에 의해 검출된 피임성 단백질로 처리한 동물들에서 면역글로불린들의 정량적 측정치가 피임성 단백질로 처리하지 않은 동물에서 검출되는 면역글로불린들의 측정치와 통계학적으로 상이한 경우 "면역 응답"을 고무시키는 것으로 말할 수 있고, 여기서 면역글로불린들은 피임성 단백질에 특이적이다. 당업계에 공지된 통계학적 테스트는 ANOVA, 학생들의 T-테스트 등을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 측정된 면역글로불린 레벨들의 차이를 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 P 값은 적어도 <0.1, <0.05, <0.01, <0.005, <0.001 및 심지어 <0.0001이다.
"면역 응답"은 이 "면역 응답" 동안 제기되는 면역글로불린들의 일부들에 대해 특이적인 라벨된 항체들을 사용하는 면역 조직 화학 등의 다른 기술들을 사용하여 측정될 수 있다. 피임성 단백질이 본 발명에 따라 투여되는 동물로부터의 조직(예, 난소 조직)은 당업계에 잘 공지된 기술들을 사용하여 얻을 수 있고, 면역 조직 화학에 대해 처리될 수 있다(오스벨 등,Short Protocols in Molecular Biology3판, 존 윌리 & 선스 인크. 1995). 면역 조직 화학에 의해 얻어진 현미경 데이터는 면역 조직 화학적으로 염색된 조직 시료를 스캐닝하고, NIH 이미지(National Institutes of Health, 매사추세츠주 베데스다)를 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 당업계의 숙련자들에게 공지된 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 염색 레벨을 정량화함으로써 정량화될 수 있다. 본 발명에 따라, 본 발명의 피임성 단백질은 피임성 단백질로 처치된 동물에서 면역 조직 화학적 염색의 정량적 측정치가 피임성 단백질로 처치하지 않은 동물에서 검출된 면역 조직 화학적 염색의 측정치와 통계학적으로 상이한 경우 "면역 응답"을 고무시킨다고 말할 수 있으며, 여기서 상기 조직 화학적 염색은 그러한 피임성 단백질에 대해 특이적인 결합을 필요로 한다. 당업계에 공지된 통계학적 테스트는 ANOVA, 학생들의 T-테스트 등을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 측정된 면역글로불린 레벨들의 차이를 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 P 값은 적어도 <0.1, <0.05, <0.01, <0.005, <0.001 및 심지어 <0.0001이다.
"점막의 면역 응답"은 상기 참조된 기술들을 사용하여 "검출"될 수 있다. 예를 들면, ELISA 평가는 점막의-특이적 면역글로불린들을 검출하고 측정하기 위해 안티-IgA 항체들을 사용하여 이루어질 수 있다(디킨슨, B.L. & 클레멘츠, J.D. ADP-리보실트랜스퍼라제 활성으로부터 대장균 열-불안정 엔테로톡신 애주번트성의해리. Infect Immun 63, 1617-1623(1995)).
본 명세서에 사용된 바의 "보조제"는 항원과 관련하여 투여될 때 항원에 대한 면역 응답을 증진시키는 화합물이다[(콜리건 lg 등, 편집, 면역학의 현행 프로토콜, 뉴욕; 존 윌리 & 선즈, 1995)]. 보조제는 항원의 파괴를 지연시켜 조직내 항원의 낮지만 효과적인 레벨들의 지속을 허용함으로써 또는 염증 응답 또는 강화된 면역 감수성을 제공하는 다른 면역 반응을 일으킴으로써 면역 시스템을 비특이적으로 활성화시킴으로써 효과적일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "종들-특이적"이라는 용어는 그것이 유도되는 종들에 대해 독특한 핵산 또는 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들면, 투명대 글리코프로테인을 인코딩하는 "종들-특이적" 핵산 서열은 상이한 종들로부터 대응하는 투명대 글리코프로테인을 인코딩하는 핵산과 적어도 95-70%이하의 서열 일치성, 80-50% 이하의 서열 일치성, 및 60-40% 이하의 서열 일치성을 공유하는 핵선 서열을 의미한다. 특정 핵산 또는 아미노산 서열의 "종들-특이성"은 BLAST 분석을 포함하여 당업계의 숙련자들에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "점막 타겟팅 단백질"은 제2 펩티드에 결합될 때 또는 그와의 융합 단백질로서 발현될 때 점막의 면역 응답을 끌어내는 펩티드들의 조합에 대한 잠재성을 증가시키는 폴리펩티드를 의미한다. "점막의 타겟팅 단백질"은 그것이 도입되는 유기체에 내인성이 아닌 폴리펩티드일 수 있다. 증거(블랙 등, Infect. Immunol. 55:1116(1987))는 항원(예, ZP 글리코프로테인)과 경구 투여될 때 "점막의 타겟팅 단백질들"이 보호성 면역 응답을 증진시키는 보조제로서 작용하는 것을 지시한다. 따라서, 이는 "점막의 타겟팅 단백질"이 적어도 10㎍ 복용량, 1㎍ 복용량, 500ng 복용량, 심지어 1ng 복용량으로 투여될 때 점막 상패에 대한 강글리오시드 결합 친화도를 갖고, 따라서 점막의 상피막을 가로질러 단백질의 위치 전이를 유발시키는 단백질이고, 따라서 "점막의 타겟팅 단백질들"은 제2 면역 응답을 이끌어내는 데 중요할 수 있다. 이어서, 피임성 단백질 및 "점막의 타겟팅 단백질"의 유전자 융합 산물은 점막의 세포들에 보다 용이하게 수송될 것이고, 증진된 국소 분비선 면역 응답들을 유도할 것이다. "점막의 타겟팅 단백질들"의 예로는 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B 및 A, 클로렐라 독소, 시가톡신 B(StxB), 포도상구균 엔테로톡신 B(SEB), 노르워크 바이러스 캡시드 단백질(NVCP), 및 B형 간염 표면 항체를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 제2 펩티드의 면역원성을 점막에 대해 타겟화시키는 폴리펩티드의 능력은 예를 들면 펩티드들의 조합물을 투여함으로써 시뮬레이션되는 ELISA 또는 면역 조직 화학에 의해 "점막의 면역 응답"(즉, sIgA의 레벨 측정)을 측정함으로써 및 그것이 면역 응답을 측정하기 위해 상기 통계학적 기술들을 사용하는 "점막의 타겟팅 단백질" 없이 제2 펩티드가 투여될 때 관찰되는 것에 비해 현저히 증가되는지 여부를 결정함으로써 조사될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "동물들"은 계통 발생학적 동물의 왕국 내에서 분류되는 유기체를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바의 "동물"은 또한 포유 동물을 의미한다. 본 발명에 유용한 동물들로는 포유동물들, 유대류들, 생쥐들, 개들, 고양이들, 소들, 인간들, 사슴들, 말들, 양들, 가축, 가금, 닭들, 칠면조들, 타조,물고기, 어류, 패류 등을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바의 "외떡잎 식물"은 그의 배들이 하나의 떡잎 또는 자엽을 갖는 유형의 식물을 의미한다. "외떡잎 식물"의 예로는 백합들; 목초들; 옥수수; 오트밀, 밀 및 보리를 포함하는 곡류; 난초들; 아이리스들; 양파들 및 야자수들을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바의 "쌍떡잎 식물"은 그의 배들이 2개의 자엽들 또는 떡잎들을 갖는 유형의 식물을 의미한다. "쌍떡잎 식물"의 예로는 담배; 토마토; 알팔파를 포함하는 콩류; 오크 나무; 단풍 나무; 장미들; 민트들; 호박류; 데이지들; 호두 나무들; 선인장류; 제비꽃들 및 미나리아재비속 식물들을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바의 "핵산 벡터"는 그것이 링크된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 한가지 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 추가의 핵산 단편들이 결찰될 수 있는 환상의 이중 스트랜드된 핵산 루프를 의미한다. 특정 벡터들은 이들이 도입되는 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제될 수 있다(예, 세균성 복제 장기를 갖는 세균 벡터들 및 에피좀 포유동물 벡터들). 다른 벡터들(예, 비에피좀 포유 동물 벡터들)은 숙주 세포로의 도입에 따라 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, 호스트 게놈에 따라 복제된다. 더욱이, 특정 벡터들은 이들이 작동 가능하게 링크되는 유전자들의 발현을 지향시킬 수 있다. 그러한 벡터들은 본 명세서에서 "발현 벡터들"이라 칭한다. 일반적으로, 재조합 핵산 기술들에서 유틸리티의 발현 벡터들은 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "촉진제"는 보편적으로 구조적 유전자의 코딩 영역의 상류(5') DNA의 서열을 의미하고, 이는 RNA 폴리머라제 및 전사의 개시에 필요할 수 있는 다른 인자들에 대한 인식 및 결합 부위들을 제공함으로써 코딩 영역의 발현을 제어한다. 촉진제의 선택은 관심있는 핵산 서열에 좌우될 것이다. "식물-기능성 촉진제"는 식물 세포들에서 전사의 개시를 지지할 수 있는 "촉진제"를 의미한다. "본 발명에 유용한 "식물-기능성 촉진제들"로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 촉진제; Zma10Kz 또는 Zmag12 등의 종자 저장 단백질 유전자들, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 스몰 서브유닛(rbcS) 등의 광 유도성 유전자들, 알콜 데히드로게나제(Adg1) 등의 스트레스 유도된 유전자들, 또는 모든 세포들에서 발현되는 "하우스키핑 유전자들"(Zmact, 옥수수 액틴 유전자 등)의 촉진제들; 토마토 E8 촉진제; 유비퀴틴; 만노핀 합성 효소(mas); 벼 액틴 1; 대두콩 단백질 글리시닌(Gy1); 대두의 비생식적 저장 단백질(vsp); 및 그래뉼-결합된 전분 합성 효소(gbss)를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 다른 "식물-기능성 촉진제들"로는 감자로부터의 파타틴 유전자 촉진제 등의 식용 식물 부분들에서 고도로 발현되는 것으로 공지된 유전자들에 대한 촉진제들을 들 수 있다.
본 명세서에 사용된 바의 "작동 가능하게 링크된"이라는 용어는 기재된 성분들이 그들의 의도되는 방식으로 그들이 기능하게 하는 관계에 있는 병치 관계를 의미한다. 코딩 서열에 "작동 가능하게 링크된" 대조군 서열은 코딩 서열의 발현이대조군 서열과 양립될 수 있는 조건들 하에 달성되는 방식으로 결찰된다. 촉진제 서열은 그것이 유전자의 전사를 조절하기 위해 유전자의 전사 시작 부위에 충분히 근접할 때 유전자에 "작동 가능하게-링크"된다.
본 명세서에 사용된 바의 "투여된"이라는 용어는 "전달된" 재료가 그것이 투여된 동물의 점막 표면과 접촉하는 것을 보장하도록 하는 방식으로 본 발명의 유전자 전이 식물, 세포들, 조성물들 및 제약학적 제형들을 동물에게 전달하는 것을 의미한다. 본 발명에 유용한 "전달" 경로들로는 경구 전달, 비내 전달, 직장 또는 질내 전달(예, 좌약 또는 국소 투여에 의해), 또는 전달된 재료가 점막의 표면과 직접적으로 접촉하는 전달 경로(즉, "점막 전달")를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바의 "제약학상 허용되는"이라는 용어는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 효과에 의해 간섭받지 않는 무독성 물질을 의미한다. 담체의 특성들은 투여 경로에 의존할 것이다.
본 명세서에 사용된 바의 "점막 표면", "점막 멤브레인" 또는 "점막"은 이들 구조들의 잘 공지된 의료적 정의를 의미하고, 이는 상피, 점막 고유층, 및 소화관에서, 평활근층을 포함하는 구조의 표면 또는 라이닝이다. "점막 표면들"의 예로는 기관지의 내부 코트, 고실의 점액층, 결장의 내부 점액질 코트, 소관 배설관들의 내부층, 식도의 내부 코트, 소장의 점액질 코트, 후두의 점액질 코트, 혀의 점액질 멤브레인, 뇌하수체막, 구강의 점액질막, 인두의 점액질막, 기관의 내부 점액층, 청각관의 라이닝, 자궁관의 점액층, 뇨관의 내부층, 요도의 내부층, 자궁내막, 질의 점액질막, 위의 점액층, 방광의 내부 코트, 및 저정낭의 점액질막을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바의 "종들"은 유기체들의 속과 그 속의 개개의 유기체들 간의 생물학적 분할을 의미하고, 여기서 그 종들에 속하는 모든 유기체들은 그들의 일반적인 형태학, 바디 플랜, 발육 등의 본질적인 특징들에서 근접한 외형을 공유한다.
본 명세서에 사용된 바의 "안정한"이란 나머지가 실온에서 보존되는 식물 재료를 의미한다. 여기서, "안정한 유전자 전이 식물 재료"는 "이질성" 단백질 또는 "유전자 전이 단백질"이 면역-반응성의 현저한 손실 없이 잠재적으로 남아있고, 여기서 면역-반응성은 Elisa, 정량적 웨스턴 블롯 또는 응집 반응 등의 평가에 의해 측정되는 것인 식물 재료를 의미한다. "이질성" 단백질은 본 발명의 공정에 따라 생산 시점에서 관찰되는 면역-반응성의 적어도 40%가 적어도 5개월 동안, 및 10개월, 또는 12개월 또는 18개월에 이르는 긴 기간 동안 또는 심지어 더 오랫동안 유지될 때 안정하다.
실시예 1. 식물-최적화된 합성 LT-B 유전자에 대한 식물-최적화된 생쥐 ZP3 에피토프의 융합
합성 LTB 시퀀스를 함유하는 TH210(매손 등, (1998) Vaccine 16: 1336)으로부터 얻은 EcoRV 및 KpnI 단편을 pBluescript(스트래타진, 미합중국 캘리포니아주 라졸라)의 대응하는 부위들에 삽입하여 pBlueLTB를 제조하였다. 플라스미드 pLTB-L은 pBlueLTB 내의 LTB 코딩 영역의 3' 단부에 6개의 아미노산 링커(병진형)의 코딩 영역을 융합시키기 위해 독특한 BbsI 부위를 사용함으로써 생성되었다. 링커는 변성된 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기 영동에 의해 정제된 2개의 상용 합성 올리고머들 5'AAC TCT GAT CCA CAT GTT CCT(SEQ ID NO:1) 및 5' AGT TAG GAA CAT GTG GAT CAG(SEQ ID NO:2)를 사용하여 구축되었다. 올리고머들은 별개의 반응들에서 T4 카이나제에 의해 인산화되었고, 동몰량으로 혼합되었고, 1시간에 걸쳐 23℃로 점차로 냉각시키기 전에 90℃까지 5분 동안 가열함으로써 어니일링시켰다. 플라스미드 pLTB-L는 BbsI 및 KpnI에 의한 일련의 소화 및 송아지 장의 포스파타제(CIP)에 의한 탈인산화에 의해 생쥐의 ZP3 에피토프의 삽입을 위해 제조하였다.
생쥐의 ZP3(336-342) 에피토프의 코딩 서열은 식물 유전자들에 의해 비교되는 그의 코돈 용법에 대해 분석되었다(와다 등, 1990 Nucleic Acid Research 18:2367). 식물-최적화된 에피토프는 올리고들의 어셈블리에 따라 BbsI 및 KpnI 양립성 단편을 만드는 5' 및 3' 말단들에 추가의 뉴클레오티드들을 갖는 천연 에피토프의 아미노산 서열을 유지하도록 고안되었다. 올리고뉴클레오티드들 MZepA 5' AAC TTC CAA ATT CAT GGA CCA AGA AAC TAA GTC TTC GGT AC(SEQ ID NO:3) 및 MzepB 5' CGA AGA CTT AGT TTC TTG GTC CAT GAA TTT GGA(SEQ ID NO:4)는 합성되고 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기 영동에 의해 정제되었다. 에피토프는 pLTB-L의 구축에 이미 기재된 바와 같이 어셈블되었다. 에피토프는 pLTBL7을 만드는 BbsI, KpnI 단편 pLTB-L로 결찰하기 전에 얼음 위에 놓았다. 플라스미드 pLTB-L 및 pLTB7은 디데옥시 사슬 정지법에 의해 시퀀싱되었다. 본 발명자들은 pLTB7의 NcoI 및 KpnI 단편을 얻고, NcoI 및 KpnI로 소화시킨 pIBT210(해크 등, 1995 Science 268:714)에 삽입하여 pAW7을 제조하였다. 발현 카세트는 HindIII 및 EcoRI에 의한 소화 후 pAW7로부터 정제시키고, HindIII 및 EcoRI에 의해 소화된 pGPTV.kan(베커 등, Plant Molecular Biology 20:1195)와 결찰시켜 pAWBin7을 얻었다.
실시예 2. 토마토 형질 전환
대장균 DH5∝의 배양액들로부터 제조한 pAWBin7은 아그로박테륨 tumefaciens EHA 105로 전기 영동시켰다. 토마토 떡잎들의 아그로박테륨-매개된 형질 전환(각종 탱크슬레이 TA234TM2R)은 종자들이 멸균수 중에서 헹구기 전에 2분 동안 0% 에탄올에 침지시키고 10% 도메스토스 및 1% 트윈-20의 혼합물 중에서 2시간 동안 세척함으로서 살균시키는 것을 제외하고는 프레리 및 어얼(프레리 및 어얼, 1996 Plant Cell Reports 16: 235)에 의해서와 같이 수행하였다. 종자들은 절반 강도의 무라시지 및 스쿠그 매질(절반 강도 MS 염(무라시지 및 스쿠그, 1962 Physiologia Plantarum 15: 473), 50mg/l 미오-이노시톨, 2mg/l 티아민 HCl, 0.5mg/l 피리독신 HCl, 0.5mg/l 니코틴산, 10g/l 설탕 및 8g/l 디프코 박토 한천, ph5.8) 상에 플레이팅하기 전에 멸균 증류수 중에서 3회 헹구었다. 묘목들은 300mg/l로 함유하는 배지 상에서 재발생되었다. 개개의 라인들은 잎들 및 과일에서 LTB 발현에 대해 강글리오사이드-의존 ELISA에 의해 스크리닝되었다. 최상의 과일이 발현된 라인들은 자체-수분되고, 결과의 종자들은 300mg/l 카나마이신으로 보충된 MS 배지 상에서 발아되었다. 생존하는 묘목들은 토지 및 온실로 전이시키고 자체-수분시켰다. 각각의 T1 식물로부터 얻은 과일은 동결 건조시키고, 분말화하고, 푸울시키고, 무수 환경에 저장하였다.
실시예 3. 단백질 추출 및 ELISA
온실에서 성장한 식물들로부터 얻은 잎 시료들 및 신선한 과일 또는 건조된 과일 시료들을 바이오 101 패스트 제조기 내에서 빙냉 추출 완충액(50mM 인산나트륨, pH6.6, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 10㎍/ml 류펩틴, 1mM PMSF)의 2 ml/l(신선한 시료) 또는 50ml/l (건조된 과일) 각각에서 균질화시켰다. 불용성 재료들은 4℃에서 5분 동안 에펜도르 5415c 마이크로원심분리기 내에서14000rpm으로 원심 분리에 의해 펠릿화시켰다. 상층액은 분석 중에 얼음 상에서 유지시키고 -80℃에서 저장하였다. 식물 시료들의 전체 단백질 농도는 쿠마지 염료 결합 평가(Bio Rad)를 사용하고, 표준물로서 송아지 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 측정하였다. 강글리오사이드-의존 ELISA는 기재된 바와 같이 각각의 추출물의 100 희석액들 중 1의 2개의 시료들에 대해 수행하였다(해크 등, 수프라)(도 1a, b, c).
실시예 4. 융합 단백질 정제 및 검출
무수 중량 그램당 8㎍ LTB 상으로 발현되는 T1 식물들로부터 건조된 과일 시료들을 푸울시켰다. 건조된 시료들로부터 얻은 추출물은 재료가 20ml/g 빙냉 추출 완충액 중에서 균질화시키는 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 제조하였다. 결과의 상층액은 4℃에서 플랫폼 록커 상에서 철야 PBS 평형된 세파덱스로 인큐베이션시켰다. 세파덱스 용액은 고정되고, 1ml 시료를 수집하여 4℃에서 저장하였다. 세파덱스 용액의 부피는 소결된 유리 퍼넬을 사용하여 감소시키고, 60ml 빙냉 PBS로 플러쉬하였다. 세파덱스 슬러리는 5ml PBS로 제조하고, Bio Rad X 컬럼으로 붓기 전에 진공 데시케이터를 통해 공기를 제거하였다. 컬럼은 제1 및 제5 밀리리터로 진행하여 수집한 1ml 시료들과 함께 50ml PBS로 세척하였다. 융합 단백질은 PBS 중의 0.2M D-(+)-갈락토스를 사용하여 용출시키고, 4℃에서 저장하였다. 시료들은 SDS-PAGE를 사용하여 후에 분석하고, 청색으로 염색하였다. 융합 단백질에 대응하는 대역은 SDS-PAGE 겔 상에서 검출되었다. 융합 단백질의 존재는 실시예 3에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 확인하였다.
실시예 5. 게놈성 핵산의 단리
게놈 핵산은 액체 질소 및 네일을 사용하여 1.5ml 마이크로원심분리관 내에서 재료 200-250mg을 분쇄함으로써 T1 식물들의 어린 잎 조직으로부터 단리시켰다. 분말은 추출 완충액(420g/l 우레아, 312.5mM NaCl, 50mM 트리스 HCl, pH 8.0, 20mM EDTA, 1% 사르코닌) 500㎕ 중에 재현탁시키고, 시료 회전기 상에서 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(25:24:1) 500㎕로 30분 동안 인큐베이션시켰다. 결과의 슬러리를 4℃에서 14000rpm으로 15분 동안 원심분리시켰다. 상부 수성상을 수집하고 동일 부피의 4M LiCl의 부가를 통해 RNA 침전시키고, 적어도 8시간 동안 -20℃에서 인큐베이션시켰다. 시료들을 4℃에서 15분 동안 15000rpm으로 원심분리시키고, 시험관들을 분리시키기 위해 상층액을 제거하였다. RNA 펠릿을 50㎕ Rnase 프리 멸균수 중에 재현탁시켰다. 게놈 DNA는 10% 부피 7.5M 암모늄 아세테이트, 1 부파 빙냉 이소프로판올의 부가를 통해 세이브한 상층액으로부터 침전시키고, 적어도 8시간 동안 -20℃에서 인큐베이션시켰다. DNA를 70% 빙냉 에탄올로 세척하고, 5분 동안 공기중 건조시키고, 50㎕ 멸균수+RNase(50㎍/ml) 중에 재현탁시켰다.
실시예 6. 써던 분석
써던 블롯 분석은 융합 DNA의 염색체 통합을 확인하기 위해 수행하였다.
15㎍ DNA를 함유하는 시료들을 37℃에서 철야 반응 중에 DNA ㎍ 당 HindIII의 3.4 유닛으로 소화시켰다. 소화된 시료들은 1% TAE 아가로스 겔 중에서 철야 진행시켰다. 겔은 정화시키고(0.25M HCl), 알칼리 전이를 위해 제조업자의 추천에 따라 제타 프로브 멤브레인(Bio Rad)에 전이되었다. DNA는 UV-가교 결합에 의해고정시켰다.
PCR 라벨된 프로브는 pAW7 템플레이트 상에서 프라이머 세트, TEV (5'-GCA TTC TAC TTC TAT TGC AGC)(SEQ ID NO:5) 및 VSP (5'-GTG CAT ATC AGC TAT C)(SEQ ID NO:6)를 사용하여 제조하였다. DIG 라벨된 dCTP는 제조업자의 명령들(PCR DIG 프로브 합성 키트, 베링커 만하임)에 따라 588bp 앰플리콘 내로 혼입되었다. 증폭은 하이브리드 PCR 익스프레스 써모-싸이클러를 사용하여 32 주기 상으로 수행되었다. 템플레이트는 초기에 94℃에서 4분, 이어서 94℃에서 15초 동안 30주기로, 55℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 90초 동안 용융되었다. 최종 확장 단계는 4℃에서 침지시키기 전에 72℃에서 5분 동안 수행되었다.
혼성화 병들 및 멤브레인당 10ml DIG 이지 Hyb(베링커 만하임)를 혼성화 오븐에서 45℃로 가온시켰다. 멤브레인들은 적어도 90분 동안 예비 혼성화시키고, 50㎕/ml DIG 이지 Hyb의 프로브 농도로 철야 혼성화시켰다. 후혼성화 세척 및 검출은 제조업자의 명령(베링거 만하임 - DIG 워시 및 블록 버퍼 세트 및 DIG 발광 검출 키트)에 따라 수행하였다. 라벨된 멤브레인들은 필름에 노출 후 가시화되었다. 식물 숙주 염색체로의 융합 DNA의 통합이 확인되었다.
실시예 7. 노던 분석
노던 블롯 분석은 mRNA 레벨로 융합 단백질의 발현을 확인하기 위해 사용되었다.
노던 분석은 몰리큘러 클로닝[샘브룩 등, 수프라]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히, 게놈 RNA 시료들은 포름알데히드/포름아미드로 변성시키고, 1%아가로스, MOPS-아세테이트-EDTA 겔 중에서 2시간 동안 진행시켰다. 이어서, RNA를 상향 모세관 작용에 의해 제타 프로브 멤브레인(Bio Rad)에 전이시키고, UV 가교 결합에 의해 고정시켰다. 멤브레인 혼성화 및 검출은 혼성화 단계들이 42℃에서 수행된 것을 제외하고는 써던 분석으로 수행하였다. 융합 단백질 mRNA의 존재가 확인되었다.
실시예 8. 생쥐 급식 및 시료 수집
유전자 전이 식물의 피임 효과의 효능은 실험실 생쥐들을 사용하여 생체 내에서 시험하였다.
생쥐들은 한마리의 수컷에 대해 3마리의 암컷을 우리에 넣어, 수컷/암컷 쌍들로서 수용하였다. 암컷당 새끼들의 수는 실험 전반에 걸쳐 기록되었다.
건조 중량 그램당 8㎍ LTB 이상을 발현시키는 토마토 식물들로부터 동결 건조되고, 분말화된 과일을 푸울시키고 혼합하였다. 각각의 급식 동안, 토마토 분말은 사과 사이더와 1:2(부피당 중량) 혼합되었다. 급식은 12주 동안 2주 간격으로 수행되었다(0, 3, 14, 17, 28, 31, 42, 45, 56, 59, 70, 73, 84, 87일). 동물들은 3 그룹으로 나뉘어, 4-6마리는 야생형 토마토 4g + 사과 사이더를 받고; 4-5마리는 유전자 전이 토마토 4g + 사과 사이더를 받고; 4-5마리는 토마토 4g + 사과 사이더 + 퀼라자 추출 분말(가루다) 10mg를 받았다. 31일에 시작하여, 암컷 생쥐는 점심에, 이들이 물만 있는 우리로 옮겨져 잠만 자는 금식 프로토콜에 적용되었다. 시험 식이는 4pm으로 제공되고 철야 방치되었다. 다음날 아침 8am에, 암컷들은 이들의 원래의 우리로 복귀하였다.
0일 및 70일째에, 꼬리 블리드들로부터의 혈청 시료들을 각각의 암컷으로부터 수집하고 장래 항체 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 최종 혈청 시료들은 심장 찌르기를 통해 96일째에 수집하고 상기한 바와 같이 저장하였다. 배설물 시료들을 70일 및 87일째에 수집하고 -80℃에서 철야 냉동시켰다. 냉동된 펠릿 시료들을 동결 건조시키고, 0.8ml 인산염 완충된 염수, pH 7.2(PBS)에 재현탁시키고, 14000rpm으로 5분 동안 원심분리시키고, 상층액을 평가할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
실시예 9. 실험 생쥐들의 안티-LTB 및 안티-ZP3 에피토프 항체들 및 수정률에 대한 ELISAs
시료들은 상기한 바와 같이 혈청 중의 안티-LTB 및 안티-ZP3 에피토프 IgG 및 배설물 펠릿 중의 안티-LTB 및 안티-ZP3 에피토프 IgA에 대해 평가하였다(디킨슨 및 클레멘츠, 1995, Infect. Immun. 63:1617). 그 결과는 도 2a 및 2b에 나타낸다. 시료들은 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS (PBST) 중에서 시리즈로 희석되었다. 안티-LTB 항체들을 검출하기 위해, 마이크로적정 플레이트들을 혼합된 강글리오사이드들 (타입 III),(시그마, 미합중국, 미조리주 세이트 루이스)로 코팅하고, 0.25% BSA로 봉쇄하고 정제된 재조합 LTB와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 안티-ZP3 에피토프의 검출을 위해, 마이크로적정 플레이트들은 BSA에 콘쥬게이트된 재조합 에피토프로 코팅하고, 0.25% BSA로 봉쇄하였다. 혈청 안티-LTB 또는 안티-ZP3 에피토프는 알칼리 포스파타제(시그마)와 콘쥬게이트된 생쥐 또는 들쥐 IgG 및 사슴 안티-토끼 항혈청에 대항하는 토끼 항혈청을 사용하여 검출하였다. 배설물의안티-LTB 및 안티-ZP3 에피토프 항체들의 레벨들은 알칼리 포스파타제와 콘쥬게이트된 생쥐 또는 들쥐 면역글로불린들 및 토끼 안티-염소 항혈청에 대항하는 염소 항혈청을 사용하여 검출하였다.
시험된 재료의 경구 전달 효과는 대조군 및 실험군으로부터 동배 출산군의 수 및 크기를 비교함으로써 조사하였다(도 3). 6마리의 생쥐들이 각각의 그룹으로 사용되었다. 실험군의 생쥐들은 유전자 전이된 토마토 페이스트를 급식받았다. 타겟 이외의 종들(들쥐들)에 대한 시험 재료의 효과 역시 조사되었다(도 4).
실시예 10. 피임성 담배 현탁 배양액들의 생산
생쥐 ZP3 에피토프, 주머니쥐 ZP3 에피토프, 및 일반적인 GnRH 에피토프에 대한 코딩 영역들이 LTB에 융합되었다(하기 구축물들, 도 5a, b, c). 생쥐 및 주머니쥐 에피토프들은 개별적으로 LTB에 융합됨으로써 이들이 LTB의 카르복실 말단을 해독할 수 있었다. GnRH 에피토프와의 3개의 융합들이 이루어졌다. GnRH 에피토프는 LTB에 융합됨으로써 그것이 LTB 펜타머의 외부에 안착되도록 예측되는 위치의 LTB 모노머 내에서 아미노 말단, 카르복시 말단을 해독할 수 있었다. 이어서, 이들 융합 단백질들의 코딩 영역은 pIBT210.1의 식물 발현 카세트 내로 놓이고, 아그로박테륨속-매개된 형질 전환을 위해 2진 벡터 pGPTV.kan으로 삽입되었다. NT1 세포들(담배 세포 현탁액)은 생쥐의 ZP3-LTB 융합, 주머니쥐 ZP3-LTB 융합, GnRH 카르복실 융합 및 GnRH 내부 융합에 의해 형질 전환되었다.
생쥐 및 GnRH 융합 형질 변환체들의 LTB 특이적 및 GnRH 특이적 ELISA 분석이 수행되었다(도 6). 검출은 카르복실 말단 융합에 대해 확인하고, LTB 레벨들은내부 융합에 대해 낮았다. 본 발명자들은 내부 융합이 펜타머 형성 및 그에 따른 검출에 의해 간섭받았다고 결론내렸다. 발현은 낮았지만, GnRH 에피토프는 식물 세포들에 의해 발현될 수 있었다.
실시예 11. 유전자 전이 당근의 생산
모든 형질 전환은 당근 컬티바 낸코(다우커스 카로타 L. cv. 낸코)를 사용하여 이루어졌다. 낸코는 1996년에 길버트 등에 의해 조사된 3개의 컬티바들 중의 하나였고, 형질 전환 빈도 및 재발생 속도에 대해 우위인 것으로 식별되었다. 종자는 영국 헤멜 헴스테드의 종자 시판 공급자로부터 입수하고, 보이스 톰슨 인스티튜트 포 플랜드 리써치(BTI)로 수입하였다. 모든 종자는 20분 동안 표백제로 표면 살균시키고, 이어 발아에 앞서 20분 동안 70% 에탄올로 처리하였다. 발아, 형질 전환, 또는 재발생 단계 동안 추가의 세균 또는 진균 감염에 의해 오염된 재료들이 파괴되었다. 당근 배축은 무균 발아후 7-15일에 절개하였다. 엑스플랜트들은 액체 성장 배지로 옮기고, 아그로박테륨속 균주 EHA105(아래 기재되는 바와 같이 적절한 발현 벡터들을 함유함)와 함께 실온에서 36-48시간 동안 암실에서 느린 진탕 조건 하에 동시-배양시켰다. 이어서, 엑스플랜트들을 추가의 식물 옥신 2,4-D(엠브리오겐성 유합 조직 생성을 자극하기 위해), 생물독소 티멘틴(아그로박테륨석의 모든 나머지 트레이스들을 경화시키기 위해)을 함유하는 고체 성장 배지로 옮기고, 실온의 암실에 저장하였다.
5주 후, 엑스플란트들은 현저한 유합 조직을 발육하였으며, 형질 전환되지 않은 세포들에 대항하는 선택적인 압력을 유도하기 위해 카나마이신을 함유하는 새롭게 제조된 고체 성장 배지로 옮겼다. 모든 조직들은 실온에서 유지하고 암실에 저장하였다. 추가로 5주 후, 건강한 유합 조직을 2,4-D의 부재하에 신선한 고체 배지로 옮기고, 묘목 재발생을 유도하기 위해 좋고 가벼운 조건 하에 배치하였다. 또한, 일부 유합 조직은 신선한 배지(2,4-D 함유)로 옮기고, 이후 단계에서 재발생을 위해 추가의 유합 조직 생산을 고무시키기 위해 암실로 복귀시켰다. 카나마이신 선택(유전자 전이되지 않은 것으로 추정됨)에 대해 적절히 성정하지 않거나, 또는 세균 또는 진균 오염의 징후를 보이는 모든 조직들이 파괴되었다.
재발생/선택 배지 상에서 약 10-14주 후, 앰플을 가볍게 하면서, 초기 뿌리들 및 새싹들을 갖춘 당근 묘목들을 통제되는 온실 성장 조건으로 옮길 수 있었다. 유전자 전이된 뿌리 재료들의 수확은 식수 후 8-10주 후에 행해졌다.
실시예 12. 유전자 전이 당근 현탁 배양액들의 생산
카나마이신 배지(상기함)로부터 선택된 건강한 당근 유합 조직 2-5그램을 액체 성장 배지 50ml에 넣었다. 표준 액체 배지는 400ml의 물, 400μL 무라시지&스쿠그 비타민들, 1.7g 무라시지&스쿠그 염들, 12g 설탕을 함유하였고, 미생물 오염을 통제하기 위해(300mg/L), 최종 농도의 2,4-D(2.2mg/L) 및 생물독소 티멘틴을 부가하기 전에 오토클레이빙에 의해 멸균시켰다. 이어서, 혼합물을 100-120rpm으로 진탕시키기 위해 주변 온도에서 오비탈 쉐이커 상에 놓았다. 유합 조직은 점차로 보다 작은 개개의 세포들 또는 세포 덩어리들로 해산되었다. 세포들의 건강한 성장을 유지하기 위해, 7-10일마다, 현탁 배양액 5ml를 신선한 액체 성장 배지 45ml에 부가하였다.
실시예 13. 분말화된 당근 세포들의 생산
7-10일의 성장 후, 액체 현탁 배양액들을 여과지 상으로 여과시키고, -80℃에서 최소한 24시간 동안 동결시켰다. 수주의 기간에 걸쳐 수집하고 냉동시킨 재료들을 동결 건조 튜브에 넣고, 최소한 48시간 동안 동결 건조 장치에 부착시켰다. 결과의 재료를 칭량하고, 손으로 으깨고, 약 350g의 할당량으로 기밀 플라스틱 백들 내에서 -20℃에서 저장하였다. 분말 재료는 고도의 무수성이므로, 인간의 피부와 접촉시 점성을 가질 것이다. 분말 재료는 신선한 수확 중량의 10% 미만까지 감소되었다. 분말 재료의 시료들은 ELISA 및 사용중 구축물에 대해 특이적인 PCR에 의해 평가하였다. 측정 가능한 항원 함량은 무수 그램당 50-100㎍ 범위 내에서 검출 가능한 항원 농도에서 약 10-15배 증가하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 14. 특이적 구축물들
pTH110이 구축물은 대장균 열 불안정 엔테로톡신(LT-B)로부터 B 서브유닛의 발현을 위해 인코딩한다. 이러한 구축물은 생쥐들로의 경구 전달(매슨 등, 수프라)을 위해서 및 인간들에서 인간의 임상적 시도(태킷 등, 1998 Nature Med. 4:607)를 위해서 감자들에서 이미 발현되었다. 이러한 구축물은 MAF 수입 허가 번호 1999007035의 주체인 감자들에서 발현되었고, 뉴저지주 링컨 소재 랜드케어 리써치 퍼실리티즈에서 주머니쥐들로의 후속 경구 전달이 진행되었다. LT-B를 발현시키는 당근들은 아래 명시된 피임 재료들의 면역학적 및 수정률 시도들에 대한 네거티브 대조군으로서 사용될 것이다.
LT-B 분자는 네이티브형 (및 식물 세포들에서)의 펜타머를 형성하고, 재생성, 호흡기 및 소화관들의 점막 표면을 라이닝하는 상피 세포들에 대한 결합 친화도를 제공한다. 이러한 친화도는 피임성 에피토프들 등의 보다 작은 단백질들의 타겟팅 전달을 위한 전략을 제공하였다. 많은 다음 구축물들은 LT-B와 면역 피임`성 펩티드들 간의 유적학적 융합들을 인코딩한다. ELISA에 의한 잎 및 뿌리 재료들의 분석은 결과의 분자가 후보 펩티드들을 동시-디스플레이하는 펜타머임을 보여준다.
pGPTV - MuZP3pTH110과는 대조적으로, 이러한 구축물은 VSP 정지기에 앞서 LT-B 유전자의 카르복실 말단에 삽입된 추가의 서열을 갖는다. 추가의 서열은 쥐의 투명대 글리코프로테인 3(MuZP3)으로부터 링커 펩티드(Asn-Ser-Asp-Pro-His-Val-Pro)(SEQ ID NO:7) 및 최소 B-세포 에피토프, 아미노산 잔기들 335-342 (Asn-Phe-Gln-Ile-His-Gly-Pro-Arg)(SEQ ID NO:8)을 포함한다.
pGPTV - GNRH1pGPTV - MuZP3와는 대조적으로, 이 구축물은 MuZP3 에피토프 대신에 돼지의 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH)에 대한 데카펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는다. 링커는 보존된다. 이러한 데카펩티드에 대한 서열(Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly)은 대부분의 포유 동물들에 대해 공통이다.
pGPTV - GNRH3pTH110과는 대조적으로, 이러한 구축물은 LT-B 유전자의 아미노-말단에 (링커를 통해) 융합된 GnRH 데카펩티드를 갖는다. 단일 펩티드는 LT-B 유전자 내에 함유되고, 성숙한 모노머성 단백질을 내기 위한 후 해독 처리 동안 분열된다. 이러한 분열은 티로신과 글리신(잔기들 20 & 21) 사이에서 발생한다. GnRH 에피토프는 글리신 잔기 직후에 삽입되었다. 짧은 링커(Tyr-Ala-His-Gly)(SEQ ID NO:10)는 LT-B의 아미노-말단에 GnRH 에피토프를 연결시키기 위해 사용되고, 성숙한 단백질의 서열을 시작하는 글리신-알라닌을 유지하였다.
pGPTV - pAW6pGPTV - GNRH1와는 대조적으로, 이 구축물은 GnRH 데카펩티드 대신에 호주 브러시테일 주머니쥐 투명대 글리코프로테인 3(PossZP3)으로부터 예측되는 B-세포 에피토프를 인코딩하는 서열을 갖는다. 이 에피토프는 27 아미노산들(천연 서열로부터 334-361)로 구성되어 있고, 링커는 보존된다.
pGPTV - pAW4pTH110과는 대조적으로, LT-B 유전자는 브러쉬테일 주머니쥐 ZP3에 대해 인코딩한 완전 길이 유전자에 의해 대체되었다.
pGPTV - pAW4 - A2pGPTV - pAW4와는 대조적으로, 이 구축물은 PossZP3의 절단된 버전을 함유하고, 여기서 추정되는 분열 펩티드가 제거되었다. 추가의 서열은 브러쉬테일 주머니쥐 ZP3 유전자의 카르목실 말단에 삽입되었고, 이는 대장균 열 불안정 엔테로톡신 서브유닛 A(LT-A)로부터 짧은 링커(Gly-Pro-Gly-Pro)(SEQ ID NO:11) 및 A2 영역에 대해 인코딩한다. 엔테로톡시겐 대장균에 의한 식민지화는 LT-A 및 LT-B의 분비를 초래한다. 이들의 천연 상태(및 또한 식물 상태)에서, 이들은 상호 결합하여 안정한 홀로톡신을 형성한다. LT-B는 상피 라이닝들에 대해 분자를 타겟화시키는 한편, 그것은 ADP-리보실화 및 후속하여 설사를 유발하는 독성의 A 서브유닛이다. LT-A 서브유닛은 2개의 영역 A1 및 A2로 구성되어 있다. A2로 지정된 영역은 A1 영역으로부터 LT-B에 의해 형성된 펜타머로 하향 확장하는 알파 헬릭스를 형성하고, 2개의 서브유닛 간의 결합을 형성한다. 이어서, A1 단백질은 펜타머 상에 앵커된다. pGPTV - pAW4 - A2의 경우에, 식물 세포들인pTH110(또는 상기 열거된 유도체들)과 동시 형질 전환될 때, A2 나선은 PossZP3 단백질과 LT-B 펜타머 사이에 앵커를 제공한다.
실시예 15. 당근 시료들에 의한 생쥐 피임 실험
실시예 14에서 구축물들 중의 하나를 포함하는 유전자 전이 당근들은 실시예 11에 기재된 바와 같이 생산되고, 실시예 12 및 13에서와 같이 처리되었다. 생쥐들은 한마리의 수컷당 3마리의 암컷을 우리에 넣어 수컷/암컷 쌍들을 수용하였다. 암컷당 새끼들의 수는 실험 전반에 걸쳐 기록하였다.
무수 중량 그램당 50㎍ 이상의 LTB를 발현시키는 분말화된 당근을 푸울시키고, 혼합하였다. 각각의 급식을 위해, 당근 분말은 사과 사이다와 1:2(부피 당 중량) 혼합하였다. 급식은 12주 동안 2주 간격으로 수행되었다(0, 3, 14, 17, 28, 31, 42, 45, 56, 59, 70, 73, 84, 87일). 동물들은 3 그룹으로 나뉘어, 4-6마리는 야생형 당근 4g + 사과 사이더를 받고; 4-5마리는 유전자 전이 당근 4g + 사과 사이더를 받고; 4-5마리는 유전자 전이 당근 4g + 사과 사이더 + 퀼라자 추출 분말(가루다) 10mg를 받았다.
31일에 시작하여, 암컷 생쥐들은 점심에, 이들이 물만 있는 우리로 옮겨져 잠만 자는 금식 프로토콜에 적용되었다. 시험 식이는 4pm으로 제공되고 철야 방치되었다. 다음날 아침 8am에, 암컷들은 이들의 원래의 우리로 복귀하였다.
0일 및 70일째에, 꼬리 블리드들로부터의 혈청 시료들을 각각의 암컷으로부터 수집하고 장래 항체 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 최종 혈청 시료들은 심장 찌르기를 통해 96일째에 수집하고 상기한 바와 같이 저장하였다. 배설물 시료들을 70일 및 87일째에 수집하고 -80℃에서 철야 냉동시켰다. 냉동된 펠릿 시료들을 동결 건조시키고, 0.8ml 인산염 완충된 염수, pH 7.2(PBS)에 재현탁시키고, 14000rpm으로 5분 동안 원심분리시키고, 상층액을 평가할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
실시예 16. 신선한 식물 재료들에 의한 생쥐 급식
실험용 생쥐들을 사육하기 위해 신선한 식물들을 역시 사용하였다. 토마토 및 당근 작물 모두의 잎들 또는 신선한 토마토 및 당근이 사용되었다.
무수 중량 그램당 50㎍ 이상의 LTB를 발현시키는 이들의 무수 분말에 대응하는 신선한 잎들 또는 토마토 및 당근을 푸울시키고, 혼합하였다. 일부 경우에, 신선한 재료들을 작은 조각들로 다졌다. 급식은 12주 동안 2주 간격으로 수행되었다(0, 3, 14, 17, 28, 31, 42, 45, 56, 59, 70, 73, 84, 87일). 동물들은 3 그룹으로 나뉘어, 4-6마리는 야생형 토마토 또는 당근 4g을 받고; 4-5마리는 유전자 전이 토마토 또는 당근 4g을 받고; 4-5마리는 유전자 전이 토마토 또는 당근 4g + 퀼라자 추출 분말(가루다) 10mg를 받았다.
31일에 시작하여, 암컷 생쥐들은 점심에, 이들이 물만 있는 우리로 옮겨져 잠만 자는 금식 프로토콜에 적용되었다. 시험 식이는 4pm으로 제공되고 철야 방치되었다. 다음날 아침 8am에, 암컷들은 이들의 원래의 우리로 복귀하였다.
0일 및 70일째에, 꼬리 블리드들로부터의 혈청 시료들을 각각의 암컷으로부터 수집하고 장래 항체 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 최종 혈청 시료들은 심장 찌르기를 통해 96일째에 수집하고 상기한 바와 같이 저장하였다. 배설물 시료들을 70일 및 87일째에 수집하고 -80℃에서 철야 냉동시켰다. 냉동된 펠릿 시료들을 동결 건조시키고, 0.8ml 인산염 완충된 염수, pH 7.2(PBS)에 재현탁시키고, 14000rpm으로 5분 동안 원심분리시키고, 상층액을 평가할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
실시예 17. 분말 이질체들에서 항원 농도 변화의 감소
식물-유도 백신들의 적용은 일정한 복용량을 제공하려는 노력 및 투여될 최소 및 최대 복용량들을 지지하기 위한 임상학적 데이터의 성취에 좌우된다. 배치 제조 및 QC 보장은 단지 그 백신 재료가 허용되는 범위 내에서 일관된 항원농도를 제공하는 경우 유효할 수 있다. 3회의 최근 인간 임상 시도들(태켓 등, 1998, 태켓 등, 2000, 타나발라 등, 펄스널 커뮤니케이션)에서, 인간 자원자들은 관심있는 항원성 단백질들을 발현시키는 원료, 입방 썰기되거나, 유전자 전이된 토마토 재료들을 급식받았다. 그 시도들 각각에서 실험 복용량들은 소비된 재료들의 랜덤화된 시료들에 대한 임의의 결과들로 나타낸 바와 같이 300%만큼 변화하는 것으로 보였다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 탈수된 분말로 감소된 유사한 토마토 재료들은 랜덤화된 시료들에 걸쳐 10배에 이르는 편차 감소를 보이는 등가의 시험관 내 이뮤노겐 반응성(적절한 평가 검출에 의함)을 초래하였다. 이러한 결과는 표 1에 나타낸 바와 같이, 동일한 항원(HBsAg)을 발현시키는 가공된 유전자 전이 토마토 재료, 및 여러 다른 모델 식물 종들 및 항원들에서 복제되었다.
실시예들에서, 균질화는 2가지 방법들 중의 하나에 의해 달성되었다. 제1 방법은 동결 건조 전에 적용되고, 신선하게 수확된 식물 재료들의 조잡한 펄프화및 혼합을 포함하고, 혼합된 재료들의 냉동 및 후속 동결 건조가 이어진다. 슬라이싱, 블렌딩 또는 분쇄의 제1 공정은 원료 식물 조직들(열매, 구근들, 잎, 종자 등)을 펄프 혼합물로 감소시킨다. 이러한 혼합물은 원상의 식물 세포들 및 분쇄된 세포 파편들 모두를 함유하는 것으로 추정되었다. 이러한 공정의 장점은 과일 또는 구근들 등의 보다 큰 식물 기관들을 관리 가능한 혼합물로 감소시킴으로써 조직들 간의 균질한 단백질 함량의 편차를 재료의 보다 균일한 배치 내에 조합시키는 것이다. 모든 식물 세포 통합성을 완전히 파괴함이 없이 균일한 배치를 제공하는 능력은 후속 가공 단계 동안 균질한 단백질 저장을 위한 안정한 환경을 제공한다. 제2 균질화 방법은 가공 전에 식물 재료들에 대한 최소 처리를 필요로 한다. 슬라이스되거나, 4등분 되거나 떠는 원상의 재료들의 동결 건조는 상기한 바와 같이 수행되었다. 이어서, 결과의 재료들은 손으로 으깨어 미세 분말기에 넣고, 단일 배치 용기 내로 조합하고, 진탕 또는 무수 블렌딩 등의 기계적 수단에 의해 철저히 혼합하였다.
임의의 퓌레화 단계의 제거는 전체적인 공정에 필요한 노동력을 감소시켰다. 전건조 처리(퓌레화, 껍질 벗기기, 4등분 하기, 또는 슬라이스됨)의 효과는 감자의 전체적인 건조 시간에 대한 그의 효과에 대해 평가하였다. 도 7에 디스플레이한 바와 같이, 완전히 동결 건조된 상태로의 감소는 감자 재료들이 일부 방식(4등분 하기, 입방 썰기, 슬라이싱 또는 퓌레로 만들기)으로 껍질 벗겨지지 않거나 또는 절단되지 않는 경우만으로 제한되었다.
실시예 18. 감자 구근 시료들은 퓌레로 만들기 이외의 프로토콜을 사용하여유전자 전이 단백질의 손실을 최소화하면서 탈수에 의해 건조 중량 대 습윤 중량의 척도로서 11배에 이르기까지 농축시킬 수 있다.
이전의 급식 시도들은 목적하는 항원의 충분한 복용량들을 전달하기 위해 비교적 대량의 재료를 이용하였다. 예를 들면, 상기 참조된 3회의 인간 임상 시도들은 각 세션당 100g 내지 150g 범위의 생감자를 소비하는 지원자들을 필요로 하였고, 일부 지원자들은 단 일회의 복용량을 소비하는 데 30분 이상을 소요하였다. 100g 이상의 원료 재료의 경구 투여는 백신 투여자들이 잘 받아들이기 쉽지 않거나, 또는 보다 넓은 스케일의 백신에 의해 참기가 쉽지 않다. 본 명세서에 기재된 공정의 주요 장점은 단백질의 농축이 달성된다는 것이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 재료 중량은 94% 만큼 감소되었다(감자에 대해 11% 최종 중량, 토마토에 대해 6% 최종 중량). 상기 임상 시도 기준과 비교하는 데 있어서, 그러한 중량의 감소는 이론적으로 단지 6그램의 분말을 소비함으로서 등가의 복용량을 제공할 수 잇고, 가공에 의한 항원의 어떠한 현저한 손실도 없음을 추정한다. 추가로, 이와 같이 분말화된 재료의 물질적 품질은 여러 테이블스푼의 페이스트 또는 음료 조제물을 소비하는 등의 보다 대중적인 방법들에 의한 경구 섭취용 제형을 허용하는 데 편리하다.
이와 같이 기재된 데이터는 여러 항원들 및 여러 식물 종들 및 조직들에 대한 예들을 제공한다. 90% 이상의 습기의 제거는 건조 중량 대 습윤 중량의 측정치로서 11배에 이르기까지 식물 시료들을 농축시켰다. 그러나, 재료 질량의 11배의 감소에도 불구하고, 항원 농축은 일반적으로 평가된 식물 종들에 의존하여 4-8배증가하였고, 이는 공정의 결과로서 항원의 현저한 손실(또는 적어도 항원 검출이 감소)을 지시한다. 사용된 예들은 일반적으로 원료 재료들의 퓌레, 임의이 부형제들(항산화제, 안정제, 보조제 등)의 부가에 이서 냉동, 이어서 동결-건조, 및 결과의 재료의 미세한 분말로의 감소를 포함한다. 표2에 요약된 바와 같이, 상기 퓌레 없음 프로토콜은 여러 식물 종들에서 항원의 손실을 최소화시키면서 등가의 특성들의 재료를 달성할 수 있음을 보여주었다.
이러한 공정의 실제 성과는 제형 및 경구 복용량이 현저하게 적은 부피의 복용량으로, 항원 농도의 병치 증가에 의해 달성될 수 있다는 것이다. 추가로, 이러한 방법은 그렇지 않으면 관심있는 세포 구조 및 유전자 전이 단백질들로의 현저한 붕괴 없이 습식 블렌딩에 의해 균질화되기 쉽지 않은 잎 또는 줄기 재료들 등의 광범위한 식물 조직들로부터 백신들 또는 치료제들을 안정화시키는 편리한 메커니즘을 제공한다.
실시예 19. 동질체 제형들의 주변 안정성 및 항원 회복 및 안정성에 대한 부형제들의 효과
식물-유도된 제약의 추출에 의존하는 이전 연구들은 조잡한 식물 추출물들 내의 타겟 단백질들의 안정성에 대해 평가하였다. 알팔파에서 생산된 모델 항체의 추출은 수중 추출물에서 2시간에 이르고, 건조된 알팔파에서 12주에 이르는 안정성을 보였다(코우디 등, 1999). 특히 경구 백신 전략들로서 가장 큰 값을 얻기 위한 식물-유도된 치료제들에 대해, 일부 부패되지 않는 음식 형태 중의 항원의 안정성은 적어도 6개월로, 바람직하게는 2-3변으로 연장될 필요가 있다.
관심있는 모델 항원들을 발현시키는 일부 제형들은 12개월에 이르는 규칙적인 기간에 목적하는 단백질의 주변 안정성에 대해 평가하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 대부분의 재료들은 주변 저장 온도에서, 또는 낮은 온도들에서 항원의 어떠한 현저한 저하 없음을 겪었다. 이는 효율적인 비-열 저하가 식물 재료들과 함께 건조되거나, 또는 식물 세포들 또는 부분적으로 붕괴된 세포 파편들 내에 캡슐화된 채 남겨지진 항체들에 대한 보호 상태를 제공하는 효율적인 수단임을 나타낸다. 식물 효소 또는 구조적 단백질들의 존재가 항원들이 비유전자 전이 동질체 내로 스파이크되는 경우의 제형 중에서 이들을 보호하기에 충분한지 여부를 결정하기 위한 추가의 조사가 완료되어야 한다.
모든 이뮤노겐 평가에 대해서 및 식물 재료 가공, 항원 회수 및 항원 안정성에 대한 이들의 효과를 조사하기 위해 이들 모델 제형들에 여러 부형제들이 부가되었다. 선행된 보고서들(레오폴드 1998)은 단순한 유리질화된 설탕이 천연 단백질 변성에 대항하여 보호시킴으로써 식물 효소들을 안정화시킬 수 있다고 결론을 내렸다. 음식 등급의 자당은 식물 재료에서 캡슐화된 항체의 안정성에 대한 그의 효과를 평가하기 위해 퓌레화하는 시점에서 유전자 전이 토마토 균질체에 부가되었다. 설탕 외에, 실험용 보조제들이 임상 평가를 위해 액체상(퓌레 후)으로 감자 또는 토마토 재료들에 부가되었고, 아스코르브산(알드리치)은 퓌레화된 감자에서 항원 손실을 최소화시키는 항산화제들에 대한 잠재성을 평가하기 위해 일부 시료들에 부가되었다. 항체 회수 및 안정성에 대한 이들 부형제들의 효과는 임의의 단일의 경우에서 심각하지 않지만 일관되지 않는다. 자당의 첨가는 적절히 탈수된 제품에도달하는 데 필요한 건조 시간을 현저히 증가시켰다. 아스코르브산의 부가는 퓌레화된 감자의 가시적 산화(갈변)를 효과적으로 차단하기 위해 1:150 이하(질량으로)의 농도로 요구되었지만, 이러한 농도는 시험된 시료들 내에서 회복 가능한 항원 레벨들에 대한 일관된 효과를 갖지 못하였다.
일반적으로, 모든 동결 건조된 재료들은 적어도 6개월 동안, 일부 경우에는 12개월에 이르기까지 주변 온도에서 항원의 안정성을 나타냈다. 동결 건조는 이들 실시예들에서 주된 탈수 방법이었지만, 대안으로 조잡하게 펄프화된 재료들이 저장에 앞서 공기중 건조 또는 분무 건조에 의해 안정화될 수 있었다. 이상적으로는, 무슨 건조 방법에 의해서든지, 최종 재료는 모든 수분 함량의 적어도 90중량%를 제거하기에 충분히 탈수되고 기밀 백들 또는 용기들에 저장된다. 일단 밀봉되면, 균질체 분말은 타겟 단백질의 측정 가능한 레벨들의 임의의 현저한 감소 없이 현저한 기간 동안 실온에서 저장될 수 있다.
실시예 20. 건조된 면역 피임성 유전자 전이 토마토를 급식받은 동물들은 대조군 동물들에 비해 동배 출산군 크기의 감소를 보여주었다.
본 연구에서 사포닌 보조제와 동시 투여되고 경구 전달되고, 식물 유도된 LTB-생쥐 ZP3 에피토프 융합 단백질은 종들-특이성을 나타냈고, 생쥐 수정률을 45.3%로 감소시켰다.
본 연구에 사용된 유전자 전이 토마토 열매는 밀러 등이 기재한 바와 같이 생쥐 ZP3 유전자로부터 에피토프로 융합된 LTB를 발현시켰다. 3개의 시험 식이가 사용되었다: 야생형 토마토(대조군), 유전자 전이 토마토(유전자 전이) 및 퀼라자추출물과 함께 유전자 전이 토마토(유전자 전이 + 보조제). 동결 건조되고, 분말화된 토마토 열매는 파스퇴르처리된 사과 사이더(코넬 오카즈)와 1:2(중량으로)로 혼합하였다. 토마토 열매 내의 LTB의 농도는 융합 단백질의 농도에 근접하는 것으로서 취하였다. 무수 질량 그램당 8g 이상의 LTB를 발현시키는 토마토 열매가 2개의 유전자 전이 군들을 위한 시험 식이에 사용되었다. 유전자 전이 과일을 푸울링시킨 후, 산출된 평균 LTB 또는 융합 단백질은 37.8g.g-1이었다. 본 발명자들은 또한 trans + quill 군에 대해 사료 4g 당 10mg의 퀼라자 추출물 분말(가루다)을 부가하였다. 각각의 급식에서, 암컷은 페트리 접시 내에 4g의 시험 급식을 제공받았다. 유전자 전이 과일로 구성된 처치들에서, 그 양은 급식당 전체 100.8g의 LTB 융합 단백질로 되었다.
생쥐들 및 들쥐들 모두는 0, 3, 14, 17, 28, 31, 42, 45, 56, 59, 70, 73, 84, 87일째에, 12주 동안 2주 간격으로 시험-식이를 제공받았다.
생쥐들에 대해, 제1의 5 시험 식이 급식일(0 내지 28일)째에, 암컷들은 이들의 홈 우리들로부터 취해지고, 이들의 홈 우리로 복귀하기 전에 시험 식이를 함유하는 개개의 우리에 넣어져 4 내지 6시간 동안 방치되었다. 31일에 시작하여, 암컷 생쥐들은 점심에, 이들이 물만 있는 우리로 옮겨져 잠만 자는 금식 프로토콜에 적용되었다. 시험 급식은 4pm으로 제공되고 철야 방치되었다. 다음날 아침 8am에, 암컷들은 이들의 원래의 우리로 복귀하였다. 모든 급식 식이 요법에 따라, 소비된 시험 식이의 최종 중량이 기록되었다.
들쥐들에 대해, 암컷에게 시험 식이를 제공하기 직전에, 수컷 및 임의의 새끼들이 홈 우리로부터 옮겨져 이들이 시험 식이를 소비하는 것을 방지하기 위해 일시적이 보호 우리로 전이되었다. 이들은 분리에 의해 유발된 임의의 스트레스를 감소시키기 위해 최고 1시간 후에 복귀하였다. 암컷이 모든 토마토 혼합물을 이 시간 내에 소비하지 못한 경우, 나머지 부분은 제거하고, 동일한 급식 절차에 따라 4시간 후에 다시 제공하였다.
한마리의 암컷당 동배 출산군 및 새끼들의 수는 생쥐들 및 들쥐들 모두에 대해 실험 전반에 걸쳐 기록하였다.
생쥐들에 의해, 생산된 동배 출산군의 수에 관하여 식이 처리들 간에 어떠한 현저한 차이도 발견되지 않았다(∝=0.05). 그러나, 대조군 식이를 공급받은 암컷들로부터의 동배 출산군 크기(동배 출산군 당 평균 5.3마리의 새끼)에서 유전자 전이 + 보조제 식이를 급식받은 암컷들의 동배 출산군 크기(동배 출산군 당 평균 2.9마리의 새끼)로 45.5% 감소가 있었다.
들쥐들에 의해, 생산된 동배 출산군의 수에 관하여 식이 처리들 간에 어떠한 현저한 차이도 발견되지 않았다(∝=0.05). 또한, 95%의 신뢰도 간격을 사용하여 동배 출산군 크기에 관하여 식이 처리들 간에 어떠한 현저한 차이도 없었다(α=0.05 및 α=0.1).
실시예 21. 항원 함량에 대한 처리 효과
중량 및 항체 함량에 대한 동결 건조 효과를 결정하기 위해, 5개의 T 식물들로부터 2개의 열매를 칭량하고, 가공 전후에 LTB 함량에 대해 평가하였다. 동결 전 후에 시료 중량의 비교는 그 공정이 그의 원래 중량의 6%로 시료를 감소시키는것을 보여주었다(데이터는 도시하지 않음). 신선한 재료 및 가공된 재료의 LTB 함량의 ELISA 분석은 항원이 유사한 16배 농도를 보이는 것을 디스플레이하고, 사용된 가공 방법에 의한 항원의 어떠한 가치있는 손실도 없음을 제안하였다.
실시예 22. 새끼를 수동으로 면역시키는 식물 유도된 백신에 의한 생쥐들의 경구 면역
동물들
생쥐들은 시험 식이를 급식받을 때를 제외하고는 물과 표준 실험실 음식을 구비한 우리들 내에서 유지되었다. 각각의 처치는 5-6마리의 성체 암컷들을 포함하였다. 생쥐들은 하나의 우리에 한마리의 수컷당 3마리의 암컷 또는 한마리의 수컷당 2마리의 암컷의 비율로 짝지웠다. 새끼들은 젖을 떼었을 때 옮기고 단일 성의 우리들 내에 유지시켰다.
시험 식이
LTB를 발현시키는 유전자 전이 토마토 라인들을 승인된 온실 설비 내에서 생장시켰다. 수확한 토마토 열매를 분말 형태로 가공하고 균일한 백신 배치로서 혼합하였다. 이러한 배치는 사용 전에 4℃에서 저장하였다. 백신 제형은 유전자 전이 토마토 분말을 사과 사이다와 1:2(부피으로)의 비율로 혼합함으로써 달성되었다. 보조된 제형은 4g의 유전자 전이 분말마다 10mg의 퀼라다 추출물로 기본 백신 제형을 증가시킴으로써 달성되었다.
백신 주사 식이요법
급식은 12주 동안 2주 간격으로 수행되었다(0, 3, 14, 17, 28, 31, 42, 45,56, 59, 70, 73, 84, 87일). 31일에 시작하여, 암컷들은 시험 식이를 부가하기 전 4시간 동안 물과 잠자리만이 제공된 개개의 우리들로 옮겨지는 금식 프로토콜에 적용되었다. 토마토 식이는 암컷들에 의해 철야 방치되고, 암컷들이 그들의 원래 우리로 복귀되는 시점인 다음날 아침 8am에 옮겨졌다. 상기한 바와 같이, 동물들은 비유전자 전이 제형(n=4), 유전자 전이 제형 (n=5) 또는 보조된 제형 (n=5)을 수용하였다.
혈청 샘플링
0일 및 70일째에, 혈청 시료들은 꼬리 블리드에 의해 각각의 성체 암컷으로부터 수집하고 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 최종 혈청 시료들은 심장 찌르기를 통해 96일째에 수집하고 상기한 바와 같이 저장하였다. 시험 42일 후, 각각의 실험군에 대해 태어난 새끼들(n=그룹당 최소 13마리, 그룹당 2마리 이상의 모체로부터)은 수동 안티-LTB 역가의 후기 결정을 위해 양호한 건강 상태로 유지되었다. 최소 21일령에, 이들 새끼들로부터 심장 찌르기에 의해 혈청을 수집하였다.
안티-LTB 항체들에 대한 ELISAs
시료들은 [8]에 기재된 바와 같이 혈청 안티-LTB IgG에 대해 평가하였다. 간단히 말하자면, 시료들은 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS (PBST) 중에서 시리즈로 희석되었다. 마이크로적정 플레이트들은 혼합된 강글리오사이드들 (타입 III),(시그마, 미합중국, 미조리주 세이트 루이스)로 코팅하고, 0.25% BSA로 봉쇄하고 정제된 재조합 LTB와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 희석된 혈청은 웰들에 부가하고, 알칼리 포스파타제(시그마)와 콘쥬게이트된 생쥐 IgG 및 염소 안티-토끼 항혈청에 대항하는 토끼 항혈청을 사용하여 세척 및 검출하기 전 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 본 발명자들은 댐들의 종말점 희석액들과 대응하는 동배 출산군들을 비교함으로써 댐과 새끼 역가 간의 관계를 조사하였다. 댐의 희석액은 새끼들의 출생일(70일 또는 96일째에)에 근접하게 취한 혈청 시료의 종말점 희석액으로서 취하였다. 21일령에 채취된 새끼들만이 이 분석에 사용되었다. 데이터 세트는 7댐, 9동배 출산군 및 41 새끼들로 구성되었다.
처치 및 동배 출산군들
LTB 역가 결정을 위해 샘플링된 새끼들 중에서, 4개의 동배 출산군으로부터 18마리의 새끼들이 대조군으로부터 3마리의 상이한 모체들에게 태어나고; 5개의 동배 출산군으로부터 17마리의 새끼들이 유전자 전이 토마토군으로부터 4마리의 상이한 모체들에게 태어나고; 3개의 동배 출산군으로부터 13마리의 새끼들이 유전자 전이 토마토 + 보조제군으로부터 2마리의 상이한 모체들에게 태어났다.
안티-LTB 항체들에 대한 ELISAs
유전자 전이 토마토 또는 유전자 전이 토마토 + 보조제 식이 군들 내의 부모 생쥐들은 하나의 접종당 75.6㎍의 LTB를 평균하는 토마토의 14개의 경구 접종을 수용하였다. 모체가 샘플링된 새끼들을 출산하기 전에 수용한 접종의 수는 발생한 식이의 적어도 8 급식으로 변화하였다. 유전자 전이된 토마토 식이를 수용한 모든 모체들은 시험 70일째에 대조군보다 현저히 큰 안티-LTB 혈청 IgG 역가들을 발생시켰다(도 11, α=0.05). 2개의 유전자 전이 재료 시험 식이들 사이에 역가들에서 어떠한 현저한 차이도 없었다(퀼라자 추출물 분말을 부가 및 부가하지 않은 유전자전이 토마토 분말). 대조군의 모체들에게 출생한 18마리의 새끼들 중에서, 어느것도 25보다 큰 종말점 희석을 소유하지 못했다(도 12). 유전자 전이 토마토군의 모체들에게 출생한 17마리의 새끼들의 평균 종말점 희석은 558.8일 한편 유전자 전이 토마토 + 보조제 군의 모체들에게 출생한 13마리의 새끼들에 대한 평균 종말점은 448.1이었다. 유전자 전이 토마토 및 유전자 전이 토마토 + 보조제 모체들에서 새끼들의 평균 종말점 희석들 간에 어떠한 현저한 차이도 발견되지 않은 한편(α=0.05), 두 유전자 전이 식이들로부터 새끼들의 평균 희석 종말점은 대조군의 그것에 비해 현저히 높았다(α=0.05). 댐과 이들의 대응하는 동배 출산군 간에 0.9289의 r2 값으로 포지티브한, 선형 관계가 밝혀졌다(도 13).
실시예 23. 안정성 연구들
많은 상이한 유전자 전이 식물 재료들이 본 명세서에 기재된 수단에 의해 처리되었다. 재료들은 AIV-HA(HAO NT) 또는 변형된 대장균 엔테로톡신(SLT102)를 발현시키는 유전자 전이 NT-1 세포 배양액, AIV-HA, NVCP, HBsAg 또는 대장균 엔테로톡신 B 서브유닛(LT-B)를 발현시키는 유전자 전이 감자, 및 NVCP 또는 HBsAg를 발현시키는 유전자 전이 토마토를 포함한다. 가공된 재료들은 6개월이 넘는 기간 동안 다양한 온도 하에 저장되었다. 그 기간 동안 규칙적인 간격으로, 랜덤화된 시료들은 항원 함량에 대해 평가되었다(관심있는 항원에 대한 적절한 평가에 의해). 도 14 내지 17은 샘플링 기간 동안 그들 재료에 보유된 검출 가능한 항원 레벨들을 기재한다.
기타 실시 형태들
다른 실시 형태들은 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다. 상기 설명은 명료성 만을 위한 것으로 단지 예시하기 위해 제공된 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 정신 및 범위는 상기 실시예들로만 제한되지 않고, 하기 특허 청구의 범위들에 의해 내포되어야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 특허들, 특허 출원들, 공개된 참고 문헌들은 참고 문헌들 및 표들을 포함하여 그의 전체를 참고 문헌으로서 이에 인용한다.
참고 문헌들

Claims (69)

  1. i) 원상 그대로 또는 분배된 식물 재료를 얻는 단계,
    ii) 상기 유전자 전이 식물 재료를 탈수시키는 단계, 및
    iii) 상기 탈수 단계 전후에 상기 유전자 전이 식물 재료를 동질체 내로 혼합하는 단계를 포함함으로써,
    이질성 제약 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물의 안정한 무수 동질체를 생산하는, 이질성 단백질을 발현시키는 유전자 전이 식물의 안정한 무수 동질체의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 탈수 반응은 상기 재료를 동결 건조시키거나, 공기중 건조시키거나 또는 분무 건조시킴으로써 달성되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혼합 단계 전에 상기 탈수된 재료를 분배하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 부형제의 부가를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항의 방법에 의한 안정한 무수 동질체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이질성 단백질은 항원 또는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 안정한 무수 동질체.
  7. 유전자 전이 단백질을 함유하는 탈수된 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 안정한 무수 동질체.
  8. 제약학상 허용되는 담체와 혼합된 제7항의 상기 안정한 무수 동질체를 포함하는 제약 조성물.
  9. 제8항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 병원성 질병의 예방 방법.
  10. 제8항의 제약 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물에게 유전자 전이 단백질을 전달하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유전자 전이 단백질은 백신인 방법.
  12. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 단계를 포함하고;
    여기서, 상기 투여 단계는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 피임 방법.
  13. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 피임을 유도하기에 효과적인 양으로 동물에게 투여하는 단계를 포함하고;
    여기서, 상기 투여 단계는 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하는 것인, 피임 방법.
  14. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 단계(여기서, 상기 핵산은 식물 염색체 내로 통합됨)를 포함하는 것으로;
    여기서, 상기 유전자 전이 식물 재료가 투여된 상기 동물에 의해 생산되는 사육 주기당 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 피임 방법.
  15. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 피임을 유도하기에 효과적인 양으로 동물에게 투여하는 단계(여기서, 상기 핵산은 식물 염색체 내로 통합됨)를 포함하는 것으로;
    여기서, 상기 유전자 전이 식물 재료가 투여된 상기 동물에 의해 생산되는 사육 주기당 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 피임 방법.
  16. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 유전자 전이 식물 재료는잎, 뿌리, 새싹, 가지, 과일, 구근, 꽃 및 종자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 식용성인 방법.
  18. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 핵산에 의해 인코딩된 상기 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제7항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제7항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP3인 방법.
  21. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 피임성 단백질은 종들-특이적인 방법.
  22. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 피임성 단백질을 인코딩하는 상기 핵산은 점막의 타겟팅 단백질을 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는 것인방법.
  23. 제11항에 있어서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B인 방법.
  24. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 전체 식물로서 투여되는 것인 방법.
  25. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 점막의 전달에 의해 투여되는 것인 방법.
  26. 제14항에 있어서, 상기 점막 투여는 경구, 코의 또는 눈의 전달인 방법.
  27. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 것으로, 여기서, 상기 투여 단계는 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하는 것이고, 상기 투여 단계는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 점막의 면역 응답 유도 방법.
  28. 제 16항에 있어서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 잎, 뿌리, 새싹, 가지, 과일, 구근, 꽃 및 종자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제16항에 있어서, 상기 유전자 전이 식물 재료는 식용성 식물의 형태인 것인 방법.
  30. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 핵산에 의해 인코딩된 상기 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제19항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제19항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP3인 것인 방법.
  33. 제19항에 있어서, 상기 피임성 단백질은 종들-특이적인 것인 방법.
  34. 제16항에 있어서, 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 핵산은 점막의 타겟팅 단백질을 추가로 인코딩하는 것인 방법.
  35. 제23항에 있어서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛B인 것인 방법.
  36. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 것으로, 여기서, 상기 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 것은 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하고, 상기 투여는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 유전자 전이 식물.
  37. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 것으로, 여기서, 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 핵산은 바이러스 입자 상에 발현되지 않는 것이고, 상기 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 것은 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하는, 유전자 전이 식물.
  38. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 유전자 전이 식물 재료를 포함하는 것으로, 여기서, 투여는 상기 유전자 전이 식물 재료가 투여되는 상기 동물에 의해 생산되는 사육 주기당 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 유전자 전이 식물.
  39. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 유전자 전이 식물재료를 포함하는 것으로, 여기서, 상기 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 것은 상기 동물에서 상기 피임성 단백질에 대한 점막의 면역 응답을 유도하고, 상기 핵산은 식물 염색체 내로 통합되는 것인, 식용 유전자 전이 식물.
  40. 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 전이 식물.
  41. 제29항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 전이 식물.
  42. 제29항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인 또는 그의 단편은 종들-특이적인 것인 유전자 전이 식물.
  43. 제29항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP3 또는 그의 단편인 유전자 전이 식물.
  44. 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 핵산은 점막의 타겟팅 단백질을 추가로 인코딩하는 것인 유전자 전이 식물.
  45. 제33항에 있어서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B인 유전자 전이 식물.
  46. 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 식물은 외떡잎 식물인 유전자 전이 식물.
  47. 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 식물은 쌍떡잎 식물인 유전자 전이 식물.
  48. 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 식물은 토마토 작물들, 벼 작물들, 밀 작물들. 옥수수 작물들, 당근 작물들, 감자 작물들, 사과 작물들, 대두 작물들, 알팔파 작물들, 개자리과 작물들, 채소류 작물들, 및 과일류 작물들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 유전자 전이 식물.
  49. 핵산 벡터를 포함하는 것으로, 여기서 상기 핵산 벡터는 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 것이고, 이 핵산 벡터는 식물 세포의 염색체 내로 혼입되고 그로부터 발현되는 것이고, 상기 유전자 전이 식물 재료를 동물에게 투여하는 것은 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 식물 세포.
  50. 제38항에 있어서, 상기 핵산 벡터에 의해 인코딩된 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 식물 세포.
  51. 제39항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 식물 세포.
  52. 제38항에 있어서, 상기 피임성 폴리펩티드는 종들-특이적인 것인 식물 세포.
  53. 제40항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP3인 식물 세포.
  54. 제38항에 있어서, 상기 핵산 벡터는 점막의 타겟팅 단백질을 추가로 인코딩하는 것인 식물 세포.
  55. 제43항에 있어서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B인 식물 세포.
  56. 제38항에 있어서, 상기 식물 세포는 외떡잎 식물로부터 얻어지는 것인 식물 세포.
  57. 제38항에 있어서, 상기 식물 세포는 쌍떡잎 식물로부터 얻어지는 것인 식물 세포.
  58. 제38항에 있어서, 상기 식물 세포는 토마토 작물 세포들, 벼 작물 세포들, 밀 작물 세포들. 옥수수 작물 세포들, 당근 작물 세포들, 감자 작물 세포들, 사과 작물 세포들, 대두 작물 세포들, 채소류 작물 세포들, 및 과일류 작물 세포들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 식물 세포.
  59. 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열;
    식물 세포에서 피임성 폴리펩티드의 합성을 지향시킬 수 있는 피임성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 링크된 식물-기능성 프로모터를 포함하는 것으로,
    여기서, 플라스미드 벡터를 포함하는 식물 세포를 동물에게 투여하는 것은 동물에서 점막의 면역 응답을 유도하고, 상기 투여는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 식물 세포를 형질 전환시키는 플라스미드 벡터.
  60. 제48항에 있어서, 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 상기 피임성 폴리펩티드는 투명대 글리코프로테인, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항정자 항원들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 플라스미드 벡터.
  61. 제49항에 있어서, 상기 투명대 글리코프로테인은 ZP1, ZP2, ZP3 및 ZP4로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 플라스미드 벡터.
  62. 제48항에 있어서, 상기 식물 세포는 식용 식물로부터 얻어지는 것인 플라스미드 벡터.
  63. 제48항에 있어서, 점막의 타겟팅 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 플라스미드 벡터.
  64. 제52항에 있어서, 상기 점막의 타겟팅 단백질은 대장균 엔테로톡신 서브유닛 B인 플라스미드 벡터.
  65. 동물에 의해 소화될 수 있는 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항의 상기 유전자 전이 식물의 적어도 일부를 포함하는 것으로, 여기서 유전자 전이 식물의 소화는 동물에서 점막의 면역 응답을 유도하고, 상기 소화는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 음식 조성물.
  66. 제54항에 있어서, 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항의 상기 유전자 전이 식물의 적어도 일부는 상기 유전자 전이 식물의 과일, 잎, 뿌리, 새싹, 가지, 구근, 및 종자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 음식.
  67. 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항의 상기 유전자 전이 식물의 적어도 일부; 및
    제약학상 허용되는 담체를 포함하는 것으로,
    여기서 제약 조성물을 동물에 투여하는 것은 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 제약 조성물.
  68. 제56항에 있어서, 제25항, 제26항, 제27항 또는 제28항의 상기 유전자 전이 식의 적어도 일부는 상기 식물의 과일, 잎, 뿌리, 가지, 구근, 및 종자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  69. 가공된 유전자 전이 식물 재료와의 혼합물로서 사포닌 보조제를 포함하는 것으로, 여기서, 조성물의 투여는 상기 동물에 의해 사육 주기당 생산되는 새끼의 평균수를 적어도 50%로 감소시키는 것인, 동물에게 경구 투여하기 위한 조성물.
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