TW201609130A - 大腸菌性下痢症之預防 - Google Patents

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Takeshi Matsui
Eiji Takita
Takeshi Matsumura
Akira Ito
Noriko Tabayashi
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Idemitsu Kosan Co
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Abstract

本發明提供一種大腸菌性下痢症防除劑，其係以志賀毒素為有效成分。

Description

大腸菌性下痢症之預防
本發明關於一種以志賀毒素為有效成分的大腸菌性下痢症防除劑。本發明另外還關於一種高效生產志賀毒素防除劑的方法。
大腸菌性下痢很多情況是因為腸管腸毒性大腸菌所引起，而其主要原因的毒素為不耐熱性毒素(LT)或耐熱性毒素(ST)，腸毒性大腸菌(enterotoxigenic Escherichia coli)所產生的蛋白質性內毒素。這些細菌毒素所導致的疾病的預防方法，已知有藉由注射或經鼻噴霧投予或口服投予疫苗的方法。
大腸菌性下痢有新生期下痢(早發性下痢)與離乳後下痢。在預防方面已有抗生物質的投予與疫苗的投予。在新生期下痢的預防方面，開發出了母豬免疫用不活化疫苗。哺乳豬可透過母豬由乳汁被動地獲得疫苗抗體。日本的國內市售疫苗是採用精製的F4、F5、F6纖毛等的附著因子或表現出這些附著因子的大腸菌的不活化菌體作為免疫原。除了這些附著因子之外，為了阻止LT的與細胞受 器之結合，有也摻合了LT的B次單元的疫苗。
另一方面報告指出在離乳後下痢之中，新生豬體內的免疫球蛋白G的半減期為平均13.8天，以透過初乳由母豬獲得的免疫球蛋白G的量無法期待防御感染。另外還嘗試開發出表現纖毛的生菌疫苗、或以纖毛作為成分的次單元疫苗，然而並未達成實用化。甚至近年來發現除了會產生LT或ST毒素還會產生Stx2e毒素的大腸菌，而必須開始進行複合的預防。
在專利文獻1中，記載了志賀毒素的B次單元對於豬浮腫病具有疫苗效果。在專利文獻2中，記載了以高效生產植物中的基因轉形雜合蛋白質為目的，若將志賀毒素疫苗及霍亂毒素各連結2~3個，則雜合蛋白質的累積量會提升。在專利文獻3中，記載了口服投予經過轉形而表現出不耐熱性毒素及霍亂毒素的植物來進行免疫化。
在非專利文獻1中，藉由使用小鼠的實驗，發現了不耐熱性毒素的B次單元可期待能夠預防大腸菌性下痢症。在非專利文獻2中，記載了含有B次單元的不耐熱性全毒素對於豬大腸菌性下痢症具有疫苗效果。在非專利文獻3中，記載了連結志賀毒素的B次單元而成的雜合蛋白質在萵苣之中大量表現。
然而，豬浮腫病與大腸菌性下痢症，從防疫的觀點看來，一般是採用不同對策，在上述先前技術文獻的任一者之中皆並未記載志賀毒素對於大腸菌性下痢症具有防除效果。另外，在專利文獻1、2及非專利文獻3中，記載了 將志賀毒素導入萵苣或菸草，可生產雜合蛋白質，然而並未記載以草莓等的營養繁殖性植物可高效生產雜合蛋白質。此外，志賀毒素蛋白質即使能夠在菸草大量表現，也會有由於防除劑等的開發有賴於蛋白質精製等而不適於應用層面的問題，而且在菸草等的種子繁殖性植物的情況，獲得的重組系統會有難以跨世代維持等的問題。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
〔專利文獻1〕國際公開WO2009/004842號小冊子
〔專利文獻2〕國際公開WO2009/133882號小冊子
〔專利文獻3〕歐洲專利第0793717號公報
〔非專利文獻〕
〔非專利文獻1〕Vaccine 19 (2001) 2742-2748
〔非專利文獻2〕Vet Microbiol. 2013 Mar 23；162 (2-4)：731-9
〔非專利文獻3〕Matsui et al., 2011, Transgenic Res., 20；735-48
本發明課題為預防大腸菌性下痢症，更詳細而言為離乳後下痢。另外，本發明課題為提供一種生產足量的志賀毒素蛋白質的方法。
本發明人等為了解決上述課題潛心研究，結果發現，志賀毒素的B次單元作為大腸菌性下痢症，尤其離乳後下痢的防除劑(疫苗效果，免疫賦活效果，或治療效果)是有效的，而且對於保有LT毒素及ST毒素等的多種毒素的大腸菌的感染預防是有效的。
本發明人等以這樣的方式完成了本發明。
亦即，本發明如以下所述。
(1)一種大腸菌性下痢症防除劑，其係以志賀毒素為有效成分。
(2)如(1)所記載之大腸菌性下痢症防除劑，其中志賀毒素為B次單元。
(3)如(1)或(2)所記載之大腸菌性下痢症防除劑，其中以至少兩個志賀毒素蛋白質透過胜肽連接子串列連結成的雜合蛋白質為有效成分。
(4)如(1)~(3)中任一項所記載之大腸菌性下痢症防除劑，其係以受含有含編碼志賀毒素的DNA的DNA構築體的重組載體轉形，而表現出志賀毒素的轉形體的形式投予。
(5)如(4)所記載之大腸菌性下痢症防除劑，其中轉形體為營養繁殖性植物。
(6)如(5)所記載之大腸菌性下痢症防除劑，其中營養繁殖性植物為草莓。
(7)如(1)~(6)中任一項所記載之大腸菌性 下痢症防除劑，其係非人類動物用。
(8)如(7)所記載之大腸菌性下痢症防除劑，其中非人類動物為豬、牛或雞。
(9)如(8)所記載之大腸菌性下痢症防除劑，其中非人類動物為哺乳期~120日齡的豬或母豬。
(10)一種大腸菌性下痢症防除劑之製造方法，其特徵為：以含有含編碼志賀毒素的DNA的DNA構築體的重組載體對營養繁殖性植物實施轉形。
(11)一種防除非人類動物的大腸菌性下痢症之方法，其特徵為：將志賀毒素或含有志賀毒素的轉形體投予至非人類動物。
(12)一種動物的肥育提升劑，其係以志賀毒素蛋白質的B次單元為有效成分。
(13)一種志賀毒素，其係用於動物的大腸菌性下痢症的防除。
(14)一種志賀毒素之使用，其係用於動物用大腸菌性下痢症防除劑的製造。
本發明之防除劑具有預防劑(疫苗或免疫賦活劑)或治療劑的功能，因此可預防或治療離乳後下痢等的大腸菌性下痢症，此結果對於豬的肥育提升是有效的。另外，藉由本發明之防除劑可預防保有多種毒素的大腸菌的感染。此外，本發明之防除劑具有可抑制大腸菌性下痢症的症狀 的治療效果。
本發明之轉形體為營養繁殖性的植物的轉形體，因此所獲得的重組系統容易複製增殖，也容易維持相同系統，因此在需要大量生產遺傳上均勻的種苗的實用化情況是有用的。
圖1表示將志賀毒素的B次單元導入農桿菌Ti質體的改良型2a質體構築體。
圖2表示具有抗生物質耐性的轉形草莓株的PCR解析(電泳照片)。
圖3表示轉形草莓株中的Stx2eB蛋白質表現解析(電泳照片)。
圖4表示腸毒性大腸菌攻撃後的體重變化。
本發明之大腸菌性下痢症防除劑是以志賀毒素為有效成分。
志賀毒素(Stx)可分成1型(Stx1)及2型(Stx2)。Stx1可分類為a~d的亞型，Stx2可分類為a~g的亞型。產生浮腫病菌的類型為Stx2e。志賀毒素蛋白質是由毒性本體即一個A次單元以及與侵入腸管黏膜有關的5個B次單元所構成。
Stx2e除了被稱為志賀毒素之外，還被稱為佛羅毒 素，是由毒性本體即A次單元一分子以及發揮侵入腸管黏膜功效的B次單元5分子所構成的全毒素，可對真核細胞的核糖體產生作用，並具有阻礙蛋白質合成的功用。它是造成在感染腸管出血性大腸菌或赤痢菌時所觀察到的出血性下痢、或溶血性尿毒症症候群(HUS)、急性腦病等的各種病態的直接原因的病原因子。
Stx2e也是已知的豬浮腫病毒素，其A次單元(Stx2eA)是以序列編號4的胺基酸序列來表示，B次單元(Stx2eB)是以序列編號6的胺基酸序列來表示。
Stx2eA及Stx2eB只要投予至豬等的動物能夠引起免疫反應，則分別在由序列編號4或序列編號6所表示的胺基酸序列中的1個或數個胺基酸可發生取代、缺漏、插入或附加。前述「數個」，例如在Stx2eA之中宜為2~30個，更佳為2~20個，較佳為2~10個，在Stx2eB之中宜為2~10個，更佳為2~5個，較佳為2~3個。
另外，Stx2eA及Stx2eB分別可為與序列編號4或序列編號6所表示之胺基酸序列具有宜為85%以上，更佳為90%以上，較佳為95%以上的相同性，且投予至豬等的動物而能夠引起免疫反應者。
此外，本發明所使用的Stx2e可為A次單元或B次單元之任一者，而以B次單元為佳。
本發明之大腸菌性下痢症防除劑是藉由以如上述般的以志賀毒素為有效成分，而對於大腸菌性下痢症發揮出效果。大腸菌性下痢症，是由產生不耐熱性腸毒素(LT)與 耐熱性腸毒素(ST)的任一者或兩者的腸管腸毒性大腸菌的感染所引起。在急性的症例中，會急劇脫水而在數天內死亡。即使恢復也容易罹患肺炎等、變成發育不良的情形很多，而造成很大的經濟損失。
不耐熱性腸毒素(LT)被稱為不耐熱性毒素。與霍亂毒素幾乎相同的蛋白質，為由毒性本體即A次單元一分子與B次單元5分子所構成的全毒素。分子量為86,000。認為係藉由使黏膜上皮細胞的腺苷酸環化酶活化，提高cAMP濃度，以對膜的離子運輸系統造成影響，導致水分流出，而引起下痢。將產生此毒素的大腸菌稱為腸毒性大腸菌(ETEC)。
耐熱性腸毒素(ST)是由分子量2,000的胜肽所構成的耐熱性毒素。藉由使黏膜上皮細胞的鳥苷酸環化酶活化，提高cGMP濃度，以對膜的離子運輸系統造成影響，導致水分流出，而引起下痢。產生此毒素的大腸菌稱為腸毒性大腸菌(ETEC)。
本發明之大腸菌性下痢症防除劑令人驚訝地，可有效預防保有LT毒素及ST毒素等的多種毒素的大腸菌的感染。
本發明之防除劑具有可抑制人類及動物的大腸菌性下痢症的症狀的治療效果。
合適的實施形態中，本發明之大腸菌性下痢症防除劑為至少兩個志賀毒素蛋白質的B次單元透過胜肽連接子串列連結成的雜合蛋白質。
此外，在本發明說明書中，會有將以志賀毒素或雜合蛋白質為有效成分的大腸菌性下痢症防除劑及肥育提升劑、編碼志賀毒素或雜合蛋白質的DNA構築體、以含有編碼志賀毒素或雜合蛋白質的DNA構築體的載體來轉形的植物等總稱為大腸菌性下痢症防除劑的情形。此外，本發明之大腸菌性下痢症防除劑只要含有上述志賀毒素或雜合蛋白質，則可為疫苗或免疫賦活劑等的醫藥及飼料的任一形態。在本發明中，防除包括預防及治療的任一者。
本發明所使用的胜肽連接子的胺基酸的個數宜為12~25個，更佳為12~22個。另外，在本發明所使用的胜肽連接子之中，脯胺酸的含有率宜為20~27%，較佳為20~25%。
在胜肽連接子之中，脯胺酸宜為間隔兩個或間隔3個來配置。但是，此情況下，在胜肽的末端，脯胺酸以外的胺基酸可在5個以內的範圍連續，宜為4個以內。這種合適的胜肽連接子，記載於例如國際公開WO2009/133882號小冊子。
在本發明中，胜肽連接子宜為由序列編號2所表示的胺基酸序列所構成的胜肽(PG12)。亦可為與此序列具有90%以上，宜為95%以上相同性的胜肽連接子。
本發明所使用的雜合蛋白質以兩個以上的B次單元透過前述胜肽串列連結為佳。本發明所使用的雜合蛋白質以兩個B次單元透過PG12(序列編號2)串列連結為較佳。本發明所使用的雜合蛋白質亦可含有A次單元，而在 含有A次單元情況，A次單元宜經過無毒化。
另外，本發明所使用的雜合蛋白質，其C末端宜進一步附加前述胜肽連接子。尤其，本發明所使用的雜合蛋白質，其C末端宜附加PG12。
本發明所使用的雜合蛋白質例如為具有由序列編號8所表示的胺基酸序列。具有由序列編號8所表示的胺基酸序列的雜合蛋白質為兩個Stx2eB透過PG12串列連結，其C末端進一步附加了PG12。
藉由將前述PG12等的胜肽使用作為用來連結前述志賀毒素蛋白質的連接子，可提高前述志賀毒素蛋白質之在植物細胞累積的程度。
本發明所使用的雜合蛋白質，其胺基末端宜附加來自植物的分泌訊號胜肽及/或葉綠體轉移訊號胜肽。此處，「附加」的概念還包括前述分泌訊號胜肽直接結合於透過前述胜肽連結的兩個以上的前述志賀毒素蛋白質的胺基末端的情況，以及透過其他胜肽結合的情況。
分泌訊號胜肽宜為來自屬於茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，更佳為屬於菸草屬(Nicotiana)、鼠耳芥屬(Arabidopsis)、萵苣屬(Lactuca)等的植物，較佳為菸草(Nicotiana tabacum)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、萵苣(Lactuca sativa)等。
另外，分泌訊號胜肽宜為來自菸草的β-D葡聚醣外切型水解酶(β-D-glucan exohydrolase)、菸草的38kDa 過氧化酶(GenBank Accession D42064)。前述分泌訊號胜肽，可列舉例如來自菸草的β-D葡聚醣外切型水解酶且具有由序列編號10所表示的胺基酸序列的胜肽。編碼菸草的β-D葡聚醣外切型水解酶的DNA的鹼基序列是由例如序列編號9所表示。
合適的葉綠體轉移訊號胜肽記載於例如國際公開WO2009/004842號小冊子及國際公開WO2009/133882號小冊子。
此外，本發明所使用的雜合蛋白質，其羧基末端亦可附加內質網殘留訊號胜肽、液胞轉移訊號胜肽等的訊號胜肽。此處，「附加」的概念包括了訊號胜肽直接結合於前述雜合蛋白質的羧基末端的情況，以及透過其他胜肽結合的情況。在本說明書之中，在胺基末端附加了分泌訊號胜肽，且在羧基末端附加了內質網殘留訊號胜肽的雜合蛋白質亦稱為內質網型(ER)的雜合蛋白質，將編碼該內質網型的雜合蛋白質的DNA構築體亦稱為內質網型的DNA構築體。有許多報告例指出內質網型的雜合蛋白質會在真核生物效率良好地累積。
本發明所使用的雜合蛋白質宜在其羧基末端附加內質網殘留訊號胜肽。合適的內質網殘留訊號胜肽被記載於例如國際公開WO2009/004842號小冊子及國際公開WO2009/133882號小冊子，可利用HDEL序列(序列編號11)。
其他合適的液胞轉移訊號胜肽被記載於例如國際公開 WO2009/004842號小冊子及國際公開WO2009/133882號小冊子。
本發明所使用的雜合蛋白質可為化學合成或基因工程的方式來生產。關於基因工程生產的方法如後述。
本發明所使用的DNA構築體，其特徵為：含有編碼前述雜合蛋白質的DNA。
亦即，本發明所使用的DNA構築體係，包含了編碼兩個以上的志賀毒素蛋白質的DNA透過編碼前述胜肽的DNA串列連結成的DNA。編碼前述胜肽連接子之DNA是由例如序列編號1(PG12)所表示。編碼志賀毒素蛋白質的DNA，可列舉例如編碼Stx2eA的DNA(序列編號3)、編碼Stx2eB的DNA(序列編號5)。編碼前述胜肽的DNA與編碼志賀毒素蛋白質的DNA會被除去終止密碼子並對準讀碼框而連結。
編碼志賀毒素蛋白質的DNA，例如能夠以序列編號3、5的鹼基序列為基礎並藉由一般基因工程的手段而得到。具體而言，係由產生各志賀毒素的細菌，依據常法調製出cDNA基因庫，由該基因庫，使用以上述鹼基序列為基礎所製作出的探針，來選擇所希望的殖株。另外還可藉由以上述鹼基序列為基礎的化學合成，以上述鹼基序列的5'及3'末端的鹼基序列作為引子，以基因組DNA為鑄型的PCR等來合成。
本發明所使用的編碼雜合蛋白質的DNA，是例如由序列編號7所表示。
編碼雜合蛋白質的DNA，亦宜因應生產該蛋白質的宿主細胞，適當地改變表現出構成雜合蛋白質的胺基酸的密碼子，以使雜合蛋白質的轉譯量增加。
改變密碼子的方法可參考例如Kang et al.(2004)的方法。另外還可列舉選擇在宿主細胞使用頻率高的密碼子、選擇GC含量高的密碼子、或選擇在宿主細胞的管家基因使用頻率高的密碼子的方法。
另外，編碼雜合蛋白質的DNA，可為具有序列編號7的鹼基序列的DNA與在嚴格的條件下雜合的DNA。「嚴格的條件」是指形成所謂特異性的雜合而並未形成非特異性雜合的條件。可列舉例如相同性高的兩個DNA彼此雜合，兩個DNA宜具有80%以上的相同性，較佳為90%以上，特佳為95%以上，而相同性低於此值的兩個DNA並未雜合的條件。可列舉例如2×SSC(330mM NaCl、30mM檸檬酸)、42℃，宜為0.1×SSC(330mM NaCl、30mM檸檬酸)、60℃。
在本發明所使用的DNA構築體之中，合適的情況是編碼前述雜合蛋白質的DNA能夠表現出來地被連結至強化子。此處，「可表現」是指前述DNA構築體插入含有適當的啟動子的載體，在將該載體導入適當的宿主細胞的情況，在宿主細胞內會產生前述雜合蛋白質。另外，「連結」的概念包括了兩個DNA直接結合的情況以及透過其他鹼基序列結合的情況。
強化子可列舉Kozak序列或來自植物的醇去氫酶基因 的5'-非轉譯區域。特別合適的情況是編碼前述雜合蛋白質的DNA能夠表現出來地被連結至來自植物的醇去氫酶基因的5'-非轉譯區域。
醇去氫酶基因的5'-非轉譯區域，是指包括從編碼醇去氫酶的基因的轉錄起始點至轉譯起始點(ATG，甲硫胺酸)之前的鹼基序列的區域。該區域具有增加轉譯量的功能。「增加轉譯量的功能」，是指於構造基因所編碼的資訊，在轉錄後進行轉譯而產生蛋白質時，可增加藉由轉譯所產生的蛋白質量的功能。前述區域只要來自植物即可，而宜為來自屬於茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，更佳為屬於菸草屬(Nicotiana)、鼠耳芥屬(Arabidopsis)、萵苣屬(Lactuca)等的植物，較佳為菸草(Nicotiana tabacum)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、萵苣(Lactuca sativa)等。
前述醇去氫酶基因的5'-非轉譯區域可使用例如來自菸草(Nicotiana tabacum)的醇去氫酶基因的5'-非轉譯區域(NtADH5'UTR)(序列編號12)，藉由使用改變轉譯起始點上游3個鹼基的NtADH5'UTR區域(NtADHmod 5'UTR)(序列編號13)，可期待達到更高效的轉譯。
來自植物的醇去氫酶基因的5'-非轉譯區域的獲得方法記載於例如國際公開WO2009/133882號小冊子。
另外，序列編號13的鹼基序列所表示般的NtADHmod 5'UTR，只要保持增加轉譯量功能，則亦可發 生1個或數個鹼基的取代、缺漏、插入或附加。前述「數個」宜為2~10個、更佳為2~5個，特佳為2~3個。
另外，還可使用與前述NtADHmod 5'UTR具有宜為85%以上，特佳為90%以上的相同性，且保持增加轉譯量功能的DNA。
關於前述區域是否具有作為目標的增加轉譯量功能，例如可藉由在菸草培養細胞中之以GUS(β-葡萄糖醛酸苷酶)基因或螢光酵素基因作為報導基因的暫態測試、在使染色體被殖入的轉形細胞進行的測試等來確認。
本發明所使用的DNA構築體，例如具有序列編號14所表示的鹼基序列。
具有序列編號14所表示的鹼基序列的DNA構築體，是將兩個Stx2eB蛋白質透過PG12串列連結在NtADHmod 5'UTR，並連結了編碼胺基末端附加分泌訊號胜肽且羧基末端附加內質網殘留訊號胜肽的雜合蛋白質之DNA而成的DNA構築體。
這種DNA構築體宜為Matsui et al.,2011,Transgenic Res.,20；735-48的圖4所記載的2BH質體。
本發明所使用的DNA構築體，可藉由一般的基因工程手段來製作，能夠藉由將來自植物的醇去氫酶基因的5'-非轉譯區域、編碼來自植物的分泌訊號胜肽的DNA、及編碼志賀毒素蛋白質的DNA、編碼內質網殘留訊號胜肽的DNA等的各DNA分別藉由適當的限制酵素切斷，以適當的結合酶連結來構築。
本發明所使用的重組載體，其特徵為含有前述DNA構築體。本發明所使用的重組載體，只要以編碼前述雜合蛋白質的DNA可在導入了載體的宿主細胞之中表現出來的方式插入載體內即可。載體只要能夠在宿主細胞中複製，則不受特別限制，可列舉例如質體DNA、病毒DNA等。另外，載體宜含有耐藥性基因等的選擇標記。質體DNA，可由大腸菌或農桿菌利用鹼萃取法(Birnboim,H.C.& Doly,J.(1979)Nucleic acid Res 7：1513)或其改良等來調製。另外，市售的質體亦可使用例如pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm等。病毒DNA可使用例如pTB2(Donson et al.,1991)等(參考Donson J.,Kerney CM.,Hilf ME.,Dawson WO.Systemic expression of bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector.Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)88：7204-7208)。
載體內所使用的啟動子可因應導入載體的宿主細胞適當地選擇。適合使用例如花椰菜嵌紋病毒35S RNA啟動子(Odell et al.1985 Nature 313：810)、稻米的肌動蛋白啟動子(Zhang et al.1991 Plant Cell 3：1155)、玉米的泛蛋白啟動子(Cornejo et al.1993 Plant Mol.Biol.23：567)等。另外，載體內所使用的終止子也同樣地可因應導入載體的宿主細胞適當地選擇。適合使用例如胭脂鹼合成酵素基因轉錄終止子、花椰菜嵌紋病毒35S RNA終止子等。
本發明所使用的重組載體，可藉由例如下述方式來製 作。
首先將前述DNA構築體以適當的限制酵素切斷，或藉由PCR來附加限制酵素部位，然後插入載體的限制酵素部位或多重選殖部位。
本發明所使用的轉形體，其特徵為以前述重組載體進行轉形。轉形所使用的宿主細胞可為真核細胞及原核細胞的任一者。
真核細胞適合採用植物細胞，尤其適合採用屬於萵苣屬(Lactuca)等的菊科(Asteraceae)、茄科、十字花科、藜科的植物的細胞。在本發明中，適合採用屬於薔薇科的植物的細胞，尤其草莓屬(Fragaria)的細胞。適合使用草莓(Fragaria×ananassa)。品種可列舉豐香、女峰、Summer Berry、HS-138等。
在宿主細胞採用草莓細胞的情況，載體可採用具有前述花椰菜嵌紋病毒35S RNA啟動子等的重組載體等。
原核細胞可採用大腸菌(Escherichia coli)、農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)等。
本發明所使用的轉形體採用一般基因工程的手段，可藉由將本發明的載體導入宿主細胞來製作。可採用例如利用農桿菌的導入方法(Hood,et al.,1993,Transgenic,Res.2：218,Hiei,et al.,1994 Plant J.6：271)、電穿孔法(Tada,et al.,1990,Theor.Appl.Genet,80：475)、聚乙二醇法(Lazzeri,et al.,1991,Theor.Appl.Genet.81：437)、粒子槍法(Sanford,et al.,1987,J.Part.Sci. tech.5：27)、聚陽離子法(Ohtsuki)等的方法。
將本發明所使用的載體導入宿主細胞，然後依選擇標記的表現型，可選抜本發明之轉形體。另外，藉由培養所選抜的轉形體，可生產前述志賀毒素蛋白質。培養所使用的培養基及條件可因應轉形體的種類適當地選擇。
另外，在宿主細胞為植物細胞的情況，依據常法來培養所選抜的植物細胞，藉此可使植物體再生，在植物細胞內或植物細胞的細胞膜外可累積足量前述志賀毒素蛋白質。如果是馬鈴薯，則可列舉例如Visser等人的方法(Theor.Appl.Genet 78：594(1989))，如果是菸草，則可列舉例如Nagata與Takebe的方法(Planta 99：12(1971))，情況會依照植物細胞的種類而有所不同。
農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)為在植物的傷口使之感染者，並且運入具有腫瘤誘發性而被稱為Ti(tumor-inducing)質體的大型染色體外因子。在許多研究所中，經過數年潛心研究之後，藉由農桿菌系的開發，可依照既定方法轉形各種植物組織。可藉由此技術轉換的代表性的組織，已知有菸草、番茄、向日葵、棉、油菜子、馬鈴薯、白楊、及黃豆等。
已經證實有許多種植物可由經過農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉形的組織使植物再生。該植物可列舉向日葵、番茄、白三葉草、油菜、棉花、菸草、馬鈴薯、玉米、稻米、其他多數的蔬菜作物。
在本發明中，宜藉由農桿菌Ti載體來轉形上述草莓 及馬鈴薯等的營養繁殖性植物。在本發明中，在草莓的情況，宜為在草莓植物體之包括葉及果實的整個植物體以充足的量產生志賀毒素蛋白質。馬鈴薯的情況，宜為在馬鈴薯植物體之包括葉、莖、及塊莖的整個植物體以充足的量產生志賀毒素蛋白質。
本發明之大腸菌性下痢症防除劑亦可含有前述轉形體。本發明之大腸菌性下痢症防除劑可含有整個含Stx2e蛋白質的前述轉形體，或可含有其一部分。另外，轉形體可直接使用或可加以乾燥、粉碎等然後使用。另外，在本發明之大腸菌性下痢症防除劑中，亦可摻合提高Stx2e蛋白質的免疫原性的佐劑。一般而言，考慮到安全性而使用氫氧化鋁等作為佐劑。另一方面，Stx2e蛋白質的B次單元本身會表現出佐劑活性，因此在前述DNA構築體含有編碼B次單元的DNA的情況，即使不進一步摻合佐劑，也能夠得到高免疫原性。
本發明之大腸菌性下痢症的防除方法，其特徵為：將以前述DNA構築體轉形的植物體投予至動物。本發明之大腸菌性下痢症的防除對象可列舉人類、豬、牛、或雞等，而以投予至豬為佳。
利用大腸菌性下痢症防除劑進行的免疫，在投予至豬的情況，以對於哺乳期~120日齡的豬進行為佳，宜為哺乳期~90日齡的豬。另外還宜對於繁殖期前後的母豬進行。免疫方法可列舉將以前述DNA構築體轉形的植物體投予至母豬，藉由乳汁將母豬產生的抗體投予至幼豬的方 法；將以前述DNA構築體轉形的植物體投予至哺乳期~120日齡的豬，宜為哺乳期~90日齡的幼豬，使幼豬直接免疫的方法等。
將本發明之大腸菌性下痢症防除劑投予至豬的方法，可列舉在豬飼料中混合以前述DNA構築體轉形的植物體或其乾燥物或粉碎物而投予至豬的方法、對豬點鼻的方法等。此情況下的投予量，以Stx2e蛋白質的質量而計，每天宜為1.5mg以上，更佳為3.0mg以上。本發明之大腸菌性下痢症防除劑宜以一定的間隔多次投予。可列舉例如間隔4~7天，合計2~3次投予的方法。
以下對本發明之實施例作說明，而本發明並不受限於這些實施例。
〔實施例〕 實施例1. Stx2eB表現載體的構築
Stx2eB表現載體是依據Matsui et al.,2011,Transgenic Res.,20；735-48的Materials and methods來製作。
具體而言，製作出C末端融合了PG12間隔區(序列編號1)及HA-tag、HDEL序列而成的Stx2eB(1×2eB)，進一步製成使Stx2eB透過PG12間隔區串列連結而成的2×2eB。將其殖入用來製作安定轉形體的雙偶型載體pRI909(序列編號14)。這種載體為Matsui et al.,2011,Transgenic Res.,20；735-48的圖4所記載的2BH 質體。
將以這種方式製作出的雙偶型載體表示於圖1。
實施例2. 對草莓的基因導入測試
將Stx2e表現質體(圖1)以直接導入法導入於農桿菌(菌系EHA105及LB4404)。使用所得到的康黴素(Km)耐性株(導入質體確認完成)，進行草莓(品種名：HS-138)的轉形測試。使用添加Km的培養基，進行癒合組織誘導與再分化，並選抜出抗生物質(Km)耐性個體。
由任一個農桿菌系的測試皆可得到100個體以上的抗生物質耐性個體。由生長快速的株依序進行導入的Stx2eB基因的確認及該蛋白質的表現解析。
由抗生物質耐性株18個體萃取基因組DNA，進行PCR解析。引子組合是以圖2所記載的pRI M3FW(序列編號15)與pRI RV(序列編號16)(預定增幅的斷片長約1.9kbp)、pro35SF(序列編號17)與pRI RV(序列編號16)(預定增幅的斷片長約1kbp)的兩個組合來進行，在17個體確認了目標基因的導入。此外，在任一組合之中皆並未觀察到非特異性條帶。
實施例3. 轉形草莓的表現解析
由圖2所示的PCR解析結果推測，所得到的再分化個體中，絕大部分的株插入了目標基因。所以對整個系統 中的目標蛋白質表現進行解析。
由約200~300mg鮮重的草莓培養株取樣葉子，在-80℃下保存直到進行蛋白質萃取。在上述試樣中加入5倍量的緩衝液(0.2M Tris-Cl(pH：8.0)、0.1M NaCl、0.01M EDTA、0.014M 2ME、0.001M PMSF、0.05% Tween20)，與液態氮一起以研鉢磨碎，進行可溶性蛋白質的萃取。在可溶性蛋白質試樣中添加等量的Laemmli Sample buffer(含有5% 2-Mercaptoethanol)，並且加熱處理，然後供給至丙烯醯胺膠體電泳(膠體濃度：15%，Wako)。將以電泳展開的膠體的蛋白質轉印至PVDF膜，進行西方墨點法。西方墨點法解析的一次抗體採用1000倍稀釋的融合瘤培養上清液Rat 37C mAb、P-12，二次抗體採用12000倍稀釋的Anti-Rat IgG(whole molecule)-Peroxidase,antibody produced in rabbit(SIGMA A5795)。抗體反應是使用Can Get Signal solution(TOYOBO)，偵測反應是使用ECL plus Western Blotting Detection System(GE Healthcare)，化學發光偵測是以VersaDoc Mode15000(BioRad)來實施。
將其結果的一部分表示於圖3。在供測試的150個系統中，99個系統確認了目標蛋白質的表現。
實施例4. 水耕栽培與果實採收
將確認了表現出目標蛋白質的系統加以馴化，在閉鎖型植物工廠內進行水耕栽培。進行摘葉、培養液更換等的 栽培管理，確認開花，並且進行果實採收。
實施例5. 豬投予樣品的調製
投予樣品採用果實。首先定量果實中所含的Stx2eB。蛋白質的萃取是依照TCA-acetone法(Shultz等，2005)來進行。在2ml小離心管中加入草莓果實的冷凍乾燥粉末約10mg、直徑5mm不銹鋼珠，以及冷卻至-20℃約0.7ml的TCA-acetone(10%三氯醋酸、90%丙酮、0.07% 2-巰乙醇)，將該離心管設置於以液態氮冷卻的Tissue Lyser Adapter Set 2×24(Qiagen)，並藉由以Tissue Lyser II(Qiagen)進行20次/秒鐘往復振動3分鐘而將樣品混合。在-20℃下靜置1小時後，以16,000×g、4℃進行離心操作30分鐘，除去上清液，而得到含有蛋白質的沉澱。進一步為了除去雜質，添加約0.7ml的acetone/BME(100%丙酮、0.07%2-巰乙醇)，與上述同樣地加以混合，並以16,000×g、4℃並進行離心操作10分鐘，除去上清液。進一步進行該雜質除去操作2次。使沉澱在減壓乾燥後，使其懸浮於1.1ml萃取I緩衝液〔20mM參羥甲基胺基甲烷(Tris)-HCl、pH7.9、0.5M氯化鈉、5mM咪唑、6M尿素〕，以16,000×g、4℃進行離心操作10分鐘，回收上清液，而得到蛋白質溶液。
藉由將該蛋白質溶液與同量的SDS-PAGE用樣品緩衝液(Ez Apply，ATTO製)混合，在沸水中加熱10分鐘使其變性。變性的蛋白質經過適當稀釋，置入Criterion Cell (電泳槽，BIO-RAD)、Ez Run(電泳緩衝液，ATTO製)，並且使用Criterion TGX膠(BIO-RAD)，以200V定電壓進行電泳(SDS-PAGE)40分鐘。使用Trans-Blot轉印組件(BIO-RAD)將電泳後的膠體，以Trans-Blot Turbo(BIO-RAD)進行印漬。
將轉印後的膜浸漬於阻斷溶液(TBS系，pH7.2，Nacalai Tesque)，在室溫下振動1小時或在4℃下靜置16小時，進行阻斷處理。將阻斷的膜，在TBS-T(137mM氯化鈉、2.68mM氯化鉀、1%聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯、25mM Tris-HCl，pH7.4)中並在室溫下進行3次5分鐘的振動洗淨。2×Stx2eB蛋白質的利用西方墨點解析進行的偵測中，一次抗體採用以TBS-T進行1,000倍稀釋的大鼠抗Stx2eB單株抗體Rat 37C mAb、P-12。藉由將膜浸在該一次抗體液中，並在室溫下振動2小時，以進行抗原抗體反應，在TBS-T中並在室溫下進行3次5分鐘的振動洗淨。二次抗體採用以TBS-T10,000倍稀釋的Anti-Rabbit IgG,AP-linked Antibody(Cell Signaling TECHNOLOGY)。藉由將膜浸在此稀釋液中，在室溫下振動1小時進行抗原抗體反應，且在TBS-T中並在室溫下進行3次5分鐘的振動洗淨。利用鹼性磷酸酶進行的發色反應，是藉由將膜浸在發色液(0.1M氯化鈉、5mM氯化鎂、0.33mg/ml硝基藍四氮唑、0.33mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸、0.1M Tris-HCl，pH9.5)中，在室溫下振動7分鐘來進行，以蒸餾水將膜洗淨，然後在常溫下乾燥。 藉由掃描器(PM-A900，EPSON)使發色的膜影像化，並使用影像解析軟體(CS Analyzer ver.3.0，Atto)進行2×Stx2eB蛋白質的定量。
以上述定量結果為為基礎，量取草莓果實以使每隻每次的Stx2eB投予量成為1.5mg，以攪拌研磨機打碎使其成為液狀，然後藉由冷凍乾燥使其粉末化，以此作為投予樣品。
實施例6. 腸毒性大腸菌對豬的攻擊測試 (a)菌種
將來自豬的生成不耐熱性毒素(LT)、耐熱性毒素(ST之Escherichia Coli(ETEC)No.4242-1(取自食環境衛生研究所股份有限公司)(來自野外圃場的死豬)供作測試。性狀如以下所述。
溶血性：+
纖毛型：F18，-；K88，+
毒素：Stx2e，-；ST，+；LT，+
(b)攻撃菌的調製(要用時才調製)
將上述No.4242-1菌株以胰蛋白酶大豆肉湯培養基在37℃下培養至對數增殖期。培養後進行離心分離，並以沉澱物的形式集菌。以鹼性漢克緩衝液將菌體調製成2×109CFU/隻。
(c)待測物質及攻撃菌的投予
從養豬場所飼養的1隻健康母豬所生的離乳期幼豬選抜出6隻。在24日齡時移動到屋內飼養室，如表1所示般，分成2群各3隻，將各群以柵欄圍住的空間(畜舍)進行隔離飼養。第1群的幼豬是在28日齡及31日齡將表1所示的既定量(每次)的待測物質混合至飼料，而進行自發的口服投予。對於第2群的幼豬以與待測物質相同的量、相同的方法來投予不含有效成分的草莓粉末。各群的幼豬分別在1天後強制口服投予29日齡與32日齡的2次攻撃菌。攻撃菌的投予是使用胃導管進行強制口服投予。飼料是使用幼豬人口乳後期用標準飼料(日本配合飼料股份有限公司製)，飼料及水則是自由攝取。此外在飼養期間中還記錄了體重。
第0天(第2次的攻撃菌強制投予日)至第14天，每天進行臨床觀察。觀察是針對病性鑑定手冊所記載，已知為大腸菌性下痢症的臨床症狀的被毛粗糙、糞便性狀項目來進行，並依照以下的基準評定臨床症狀分數。
被毛粗糙(0：無，1：有)
糞便性狀(0：正常、1：軟便、2：泥狀便、3：水樣．黏血便)
另外還針對解剖檢驗時的病變有無(腹水累積)進行調查。
腹水累積(0：正常、1：輕度、2：重度)
另外在第5天、第10天、第14天測定體重。
(d)測試結果 臨床觀察
將各項目所得到的合計臨床症狀分數與解剖檢驗時的病變分數揭示於表2。明顯可知整個觀察期間中(0~第14天)，投予待測物質的第1群可抑制大腸菌性下痢症的症狀。
在待測物質未投予第2群的幼豬之中，第10天開始觀察到被毛粗糙，在第14天整群皆觀察到。相對於此，投予待測物質的第1群的幼豬完全沒有觀察到。待測物質未投予之第2群的1隻幼豬從第13天開始觀察到軟便。 投予待測物質的第1群整群的糞便性狀皆未觀察到異常。
體重變遷
將整個期間的體重變遷表示於圖4。
在攻撃後第5天，第1群的平均體重為9.0kg。第2群為7.5kg。群間的體重差，在統計學上可判斷出有顯著差異。此傾向在第10天及第14天還持續觀察到。
另外，關於解剖檢驗時所觀察到結果，在待測物質未投予群(第2群)中的2隻有觀察到顯著的腹水的累積。待測物質投予群(第1群)整群皆並未觀察到腹水的累積。
〔產業上的可利用性〕
本發明之大腸菌性下痢症防除劑在畜產領域是有用的。
<110> Idemitsu Kosan Co.,Ltd. The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Hokusan Co.Ltd
<120> 大腸菌性下痢症之預防
<130> 1300427-4373
<150> JP2013-244096
<151> 2013-11-26
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的引子
<400> 17

Claims (14)

  1. 一種大腸菌性下痢症防除劑，其係以志賀毒素為有效成分。
  2. 如申請專利範圍第1項之大腸菌性下痢症防除劑，其中志賀毒素為B次單元。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之大腸菌性下痢症防除劑，其中以至少兩個志賀毒素蛋白質透過胜肽連接子串列連結成的雜合蛋白質為有效成分。
  4. 如申請專利範圍第1~3項中任一項之大腸菌性下痢症防除劑，其係以受到含有含編碼志賀毒素的DNA的DNA構築體的重組載體轉形而表現出志賀毒素的轉形體的形式投予。
  5. 如申請專利範圍第4項之大腸菌性下痢症防除劑，其中轉形體為營養繁殖性植物。
  6. 如申請專利範圍第5項之大腸菌性下痢症防除劑，其中營養繁殖性植物為草莓。
  7. 如申請專利範圍第1~6項中任一項之大腸菌性下痢症防除劑，其係非人類動物用。
  8. 如申請專利範圍第7項之大腸菌性下痢症防除劑，其中非人類動物為豬、牛或雞。
  9. 如申請專利範圍第8項之大腸菌性下痢症防除劑，其中非人類動物為哺乳期~120日齡之豬或母豬。
  10. 一種大腸菌性下痢症防除劑之製造方法，其特徵為：以含有含編碼志賀毒素的DNA的DNA構築體的重組 載體對營養繁殖性植物實施轉形。
  11. 一種防除非人類動物的大腸菌性下痢症之方法，其特徵為：將志賀毒素或含志賀毒素的轉形體投予至非人類動物。
  12. 一種動物的肥育提升劑，其係以志賀毒素蛋白質的B次單元為有效成分。
  13. 一種志賀毒素，其係用於動物的大腸菌性下痢症的防除。
  14. 一種志賀毒素之使用，其係用於動物用大腸菌性下痢症防除劑的製造。
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