KR102164282B1

KR102164282B1 - 돼지 병원성대장균의 재조합 톡소이드 및 이 톡소이드를 항원으로 포함하는 돼지 대장균 설사증, 부종병 등 질환 예방 백신 조성물

Info

Publication number: KR102164282B1
Application number: KR1020180137866A
Authority: KR
Inventors: 이낙형; 신동주; 정영주; 박형구; 김호룡; 송수열; 김채현; 김태환
Original assignee: 주식회사 고려비엔피
Priority date: 2018-11-12
Filing date: 2018-11-12
Publication date: 2020-10-13
Also published as: KR20200055175A

Abstract

본 발명은 병원성대장균 감염성 질환 예방용 또는 증상완화용 백신 조성물 등에 대한 것으로, 1) 병원성대장균 Stx2eB(Shiga toxin 2e B-subunit) 톡소이드와 병원성대장균 STb(Heat-stable enterotoxin b) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질; 및 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb(heat-labile enterotoxin B subunit) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질;을 항원으로 포함한다.

Description

돼지 병원성대장균의 재조합 톡소이드 및 이 톡소이드를 항원으로 포함하는 돼지 대장균 설사증, 부종병 등 질환 예방 백신 조성물 {RECOMBINATION TOXOID OF PORCINE PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI AND VACCINE COMPOSITION COMPRISING THE SAME AS ANTIGEN}

본 발명은 병원성 대장균의 톡소이드인 Stx2eB, LTb 및 STb을 재조합한 재조합한 Stx2eB-LTb, Stx2eB-STb 톡소이드, 이를 항원으로 포함하는 대장균 설사증, 부종병 등을 예방하는 백신 조성물 등에 관한 것이다.

사람이나 동물의 대장에 늘 존재하는 대장균(Escherichia coli)는 장관 외 감염을 일으킬 경우 화농성질환 등의 원인이 될 수는 있지만 설사나 장염의 원인이 되지는 않는다. 그러나 이러한 정상 대장균과는 달리 전염성의 설사증이나 성인에게 급성장염을 일으키는 대장균이 있는데 이것을 병원성대장균(pathogenic E. coli)이라 한다.

이들 대장균이 가진 항원은 체세포(somatic, O)항원, 피막(capsular, K)항원, 편모(flagella, H)항원 등 3종류로 분류되고 현재까지 O항원은 180종, K항원은 100여종, H항원은 56여종인 것으로 알려져 있다. 또한 혈청형, 생물형, phase type, 장독소 생성에 따라 세분화된다.

병원성 대장균은 O:H 혈청군, 독소와 부착인자의 생산능력, 장세포(enterocytes)에 대한 작용 및 임상적 증상이나 증후 등을 기초로 하여 장병원성 대장균(enteropathogenic E. coli, EPEC), 장관독소원성 대장균(enterotoxigenica E. coli, ETEC), 장관침투성 대장균(enteroinvasive E. coli, EIEC) 및 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli, EHEC)의 4가지 주요 군으로 분류되며 최근 병원성 대장균에 의하여 생산되는 세포독소(cytotoxin)로서 시겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae)가 생산하는 시가독소와 구조 및 기능이 유사하여 시가양독소(Shiga-like toxin, SLT) 또는 시가독소(Shiga toxin, STX)라고 하며 이런 독소를 생산하는 대장균을 STEC(Shiga-toxin E. coli)라고 한다.

국내공개특허 제10-2016-0142023호, 2016년12월12일 국내공개특허 제10-2007-0104720호, 2007년10월29일

본 발명의 목적은 특히 돼지 등에서 문제되는 병원성대장균 감염증의 백신에 적용 가능한 병원성 대장균의 톡소이드인 Stx2eB, LTb 및 STb을 재조합한 재조합 톡소이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 특히 돼지 등에서 문제되는 설사, 탈수, 폐사, 신경증상, 급사 등과 같은 증상 중 적어도 하나 이상을 동반하는 병원성대장균 감염증을 예방 또는 완화하는 것이며, 구체적으로 이하 설명하는 조성물 등을 적용하여 설사병, 부종병, 출혈성 위장관염 및 폐혈증 중에서 적어도 하나 이상을 예방 또는 완화한다. 상기 설사병은 조발성 설사병, 이유 후 설사병 등을 포함한다. 상기 부종병은 독혈증에 의한 신경증상 및/또는 부종을 포함한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 톡소이드를 항원으로 포함하는 대장균 설사증 등의 대장균증을 예방하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 위에서 설명한 병원성대장균 감염성 질환 예방용 백신 조성물을 돼지 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 대장균 감염성 질환의 예방 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 병원성대장균 감염성 질환 예방 또는 증상완화용 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 병원성대장균 감염성 질환 예방용 또는 증상완화용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 항생제 치료를 적용하지 않고도, 효과적으로 포유자돈, 이유자돈 등에 대장균증 발생을 억제할 수 있는 방법으로 설사, 탈수, 폐사, 신경증상, 급사 등과 같은 대장균증의 발생을 예방하거나 증상을 완화시킬 수 있는 백신을 제시한다. 병원성대장균 감염성 질환의 원인인 ETEC(Enterotoxigenic E.coli)의 독력인자인 LT(heat-labile enterotoxin) 및 ST(Heat-stable enterotoxin)와 STEC(Shiga toxin producing E. coli)의 독력인자인 Shiga toxin 등을 클로닝 후 재조합 단백질 발현 시스템을 이용한 단백질 백신을 개발하여 포유자돈, 이유자돈 등의 대장균성 설사증 및 부종병을 효과적으로 예방할 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 병원성대장균 Stx2eB(Shiga toxin 2e B-subunit) 톡소이드와 병원성대장균 STb(Heat-stable enterotoxin b) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질; 및 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb(heat-labile enterotoxin B subunit) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질;을 항원으로 포함하는 병원성대장균 감염성 질환 예방용 또는 증상완화용 백신 조성물을 제공한다.

Stx2eB는 시가 독소 2e의 B 서브유닛(Shiga Toxin 2e B Subunit)을 의미하며, 장출혈성 대장균의 일종인 STEC (Shiga toxin-producing E. coli)가 분비하는 독소인 시가 독소의 일종에 포함되는 단위이다. Stx2eB는 본 명세서에서 Stx로 약칭하여 표시하기도 한다.

STEC는 돼지 부종병의 원인인 시가톡신을 분비하며, 시가톡신은 여러 혈청형 중 Stx2e (shiga toxin type 2e)가 주요 원인 독소로 알려져있다. Stx2e는 크게 A-subunit과 B-subunit으로 구성되어 있으며, A-서브유닛은 N-glycosidase activity가 있어, 28s rRNA의 아데닌 염기를 분해에 돼지 장세포에 실질적인 독성을 보인다. B-서브유닛은 pentamer를 이루어 세포 표면에 존재하는 glycolipid receptor와 결합해 A-서브유닛이 세포 내부로 침투하여 독성을 나타날 수 있도록 돕는 역할을 한다.

LTb(heat-labile enterotoxin B subunit)과 STb(Heat-stable enterotoxin b)은, 각각 ETEC(Enterotoxigenic E.coli)의 독력인자 중 하나이다.

병원성대장균은 형태와 생화학적 성상이 비병원성 대장균(non-pathogenic E. coli)과 비슷하다. 장내세균과에 속하는 0.4∼0.7×1∼30 ㎛의 비포자형성(non-sporulating) 그람음성의 간균이며, 주모성 편모가 있어서 운동성이 있으나, 편모가 없고 비운동성인 것도 있다. 일반적으로 젖당(lactose) 또는 과당(fructose)을 분해하여 산과 가스(CO₂와 H₂)를 생산하고 질산염(nitrate)을 아질산염(nitrite)으로 전환시키는 호기성 또는 통성혐기성균이다. 또한 카탈라제(catalase) 양성과 산화효소(oxidase) 음성의 생화학적 특성을 지니며 보통배지에서 잘 발육하고 최적 온도는 37℃로 중온균(mesophile)으로 구분된다.

병원성 대장균은 O:H 혈청군, 독소와 부착인자의 생산능력, 장세포(enterocytes)에 대한 작용 및 임상적 증상이나 증후 등을 기초로 하여 장병원성 대장균(enteropathogenic E. coli, EPEC), 장관독소원성 대장균(enterotoxigenica E. coli, ETEC), 장관침투성 대장균(enteroinvasive E. coli, EIEC) 및 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli, EHEC)의 4가지 주요 군으로 분류되며 최근 병원성 대장균에 의하여 생산되는 세포독소(cytotoxin)로서 시겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae)가 생산하는 시가독소와 구조 및 기능이 유사하여 시가양독소(Shiga-like toxin, SLT) 또는 시가독소(Shiga toxin, STX)라고 하며 이런 독소를 생산하는 대장균을 STEC(Shiga-toxin E.coli)라고 한다.

돼지 대장균증(부종병 포함)을 일으키는 병원성대장균들은 연령별로 다양하게 나타난다. 신생 또는 포유자돈에서는 F4(K88), F5(K99), F6(987P) 등의 부착인자가 장관 상피세포에 부착한 이 후 독소(주로 LT 또는 ST)를 분비함으로써 설사를 유발하는 것이 특징이다. 그러나 이유 후에는 부착인자가 F18이라는 섬모항원으로 바뀌고 다양한 독소(LT, STa 또는 STb, STX2e(부종병인자))가 관여하여 이유 전에 나타나는 병원성대장균과는 다른 양상을 보인다. 특히, 일부 대장균은 부종병 독소(STX2e)를 분비하는 대장균(STEC: F18ab+STX2e, STX2e)이 증식하여 육성·비육돈에서 부종병을 일으킨다.

구체적으로, 0 내지 1주령의 신생자돈의 경우는 장독소형 대장균이 소장에 작용하여 설사, 탈수, 폐사 등의 증상을 일으키는 설사병이 유발된다.

구체적으로, 2 내지 4주령의 포유자돈의 경우는 장독소형 대장균이 소장에 작용하여 설사, 탈수, 폐사 등의 증상을 일으키는 설사병이 유발된다.

구체적으로, 4 내지 8주령의 이유자돈의 경우는 장독소형 대장균과 시가독소생산성 대장균이 소장과 대장에 작용하여 설사, 탈수, 폐사 등의 증상을 일으키는 설사병이 유발된다.

구체적으로, 4 내지 8주령의 자돈의 경우는 시가독소생산형 대장균이 소장에 작용하여 신경증상, 급사 등의 증상을 일으키는 부종병이 유발된다.

구체적으로, 1 내지 8주령의 자돈의 경우는 장독소형 대장균이 소장에 작용하여 급사 등의 증상을 일으키는 출혈성 위장관염이 유발된다.

구체적으로, 0 내지 4주령의 자돈의 경우는 비장관형 대장균과 장독소형 대장균이 전신에 작용하여 급사 등의 증상을 일으키는 패혈증이 유발된다.

이러한 병원성대장균 감염성 질환의 여러가지 섬모항원과 독소 유전자 조합 중에서 F18과 독소 LT, STa, Stx2e와 조합이 발생 빈도가 가장 높아, 설사 및 부종병의 주요 독력 인자로 파악하여, 이를 활용하여 본 발명에서는 개체면역을 높일 수 있는 톡소이드 재조합 백신으로, Stx2eB-LTb 융합단백질과 Stx2eB-STb 융합단백질을 함께 적용하는 백신 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, “예방”은 본 발명의 상기 융합 단백질, 형질전환체의 단백질 추출물 또는 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 병원성대장균 감염성 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 명세서에서 용어, “치료”는 본 발명의 상기 융합 단백질, 형질전환체의 단백질 추출물 또는 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 병원성대장균 감염성 질환의 임상 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 명세서에서 용어, “백신”은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.

본 명세서에서 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

삭제

본 명세서에서 용어, 염기서열과 "기능적으로 동등한 서열"은 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 특정 염기 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 특정 염기 서열에 의해 코딩된 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열을 의미하며, 변이체를 포함한다.

본 명세서에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이며, 상기 발현 벡터란, 목적하는 형질전환체(숙주세포 등)에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서는 돼지 장관독소원성 대장균/시가독소 대장균(ETEC/STEC) 균주로부터 톡소이드 Stx2eB, LTb, 그리고 STb을 발현하는 유전자를 확인하여 분리하고, 이들을 증폭한 후, 링커로 연결하여 각각 Stx2eB-LTb과 Stx2eB-STb 발현하는 시스템인 벡터 시스템을 제조하고, 이 벡터로부터 단백질을 합성, 분비하는 분비시스템을 제조하여, 항원으로 적용되는 융합단백질을 제조한다.

상기 Stx2eB 톡소이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 STb 톡소이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 LTb 톡소이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 Stx2eB-STb 유전자는 병원성대장균 톡소이드 Stx2eB 발현 유전자와 병원성대장균 톡소이드 STb 발현 유전자가 링커로 연결된 것일 수 있다.

상기 링커는 2 내지 100 개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 링커가 적용될 수 있다. 예시적인 링커는 Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly (G)_n 및 Gly-Ser (GS) 링커와 같은 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 갖는 선형 펩타이드를 포함한다. 상기 GS 링커는 (GS)_n, (GSGSG)_n, (G₂S)_n, G₂S₂G, (G₂SG)_n, (G₃S)_n, (G₄S)_n, (GGSGG)_nG_n 및 GSG₄SG₄SG를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 1 이상이다.

상기 링커는 이하 표 2의 서열번호 12에서 볼드로 표시된 염기서열(ggcccgggcccgggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggcggtggcggtagc)을 가질 수 있다.

상기 Stx2eB-STb 융합단백질은 병원성대장균 톡소이드 Stx2eB와 병원성대장균 톡소이드 STb가 펩티드 링커로 연결된 것일 수 있다.

상기 Stx2eB 발현 유전자는 서열번호 9를 포함한다.

상기 STb 발현 유전자는 서열번호 11를 포함한다.

상기 Stx2eB-STb 유전자는 Stx2eB 발현 유전자와 STb 발현 유전자가 gs 링커로 연결된 것으로 예시적으로 서열번호 12의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 Stx2eB-STb 유전자가 발현하는 Stx2eB-STb 융합단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 Stx2eB-LTb 유전자는 병원성대장균 톡소이드 Stx2eB 발현 유전자와 병원성대장균 톡소이드 LTb 발현 유전자가 링커로 연결된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 링커는 이하 표 2의 서열번호 13에서 볼드로 표시된 염기서열(ggcccgggcccgggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggcggtggcggtagc)을 가질 수 있다.

상기 Stx2eB-LTb 융합단백질은 병원성대장균 톡소이드 Stx2eB와 병원성대장균 톡소이드 LTb가 펩티드 링커로 연결된 것일 수 있다.

상기 Stx2eB 발현 유전자는 서열번호 9를 포함한다.

상기 LTb 발현 유전자는 서열번호 10를 포함한다.

상기 Stx2eB-LTb 유전자는 Stx2eB 발현 유전자와 LTb 발현 유전자가 gs 링커로 연결된 것으로 예시적으로 서열번호 13의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 Stx2eB-LTb 유전자가 발현하는 Stx2eB-LTb 융합단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 융합단백질을 코딩하는 유전자들은 각각 하나 이상의 코돈 서열이 숙주세포의 발현에 적합한 코돈으로 변형된 것일 수 있다.

상기 조성물은 병원성대장균 감염증을 예방 또는 완화한다.

상기 병원성대장균 감염증은 설사, 탈수, 폐사, 신경증상, 급사 등과 같은 증상 중 적어도 하나 이상을 동반하는 감염증이다.

구체적으로, 상기 병원성대장균 감염증은 설사병, 부종병, 출혈성 위장관염 및 폐혈증 중에서 적어도 하나 이상을 포함한다.

상기 설사병은 조발성 설사병, 이유 후 설사병 등을 포함한다.

상기 부종병은 독혈증에 의한 신경증상 및/또는 부종을 포함한다.

상기 조성물은 포유자돈 또는 이유자돈의 조발성 설사, 부종병 및 이유 후 설사 중 적어도 하나 이상의 증상을 예방 또는 완화할 수 있다.

상기 병원성대장균 감염성 질환은 돼지의 병원성 대장균 감염성 질환일 수 있고, 구체적으로 설사병 및/또는 부종병일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 병원성대장균 감염성 질환은 조발성 설사, 부종병, 이유후 설사 등일 수 있고, 주 증상이 설사, 탈수, 신경증상, 폐사, 급사 등이 증상으로 나타난다.

상기 조성물은 위에서 설명한 적어도 2 종의 단백을 유효성분으로 포함하여 위와 같은 증상을 동반하는 돼지 감염성 질환(Porcine collibacillosis)을 예방한다.

돼지에서 대장균증은 자돈에서 더 문제된다. 포유자돈의 대장균증은 백신을 이용하여 모체에서 생성된 항체를 초유를 통하여 면역을 유지하면 예방이 잘되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 포유가 끝난 이유자돈이나, 포유를 진행하기 힘든 자돈, 이유자돈 등에서는 이러한 방법이 적용되기 곤란하기 때문에 항생제치료가 일반적으로 사용되고 있다. 그러나 항생제는 내성세균의 증가로 인해 치료효율이 낮아지고 있다. 사료에 유기산이나 생균제의 첨가하는 방법 등이 시행되고 있으나, 그 효과는 미미한 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는, 이러한 자돈에서의 대장균증을 해결하는 가장 효과적인 방법으로 개체면역을 높이는 것이 중요하고, 그 효과적인 방법으로 효능을 확인한 상기 백신 조성물을 제안한다.

상기 조성물은 포유자돈 또는 이유자돈의 조발성 설사, 부종병 및 이유 후 설사 중 적어도 하나 이상을 효과적으로 예방할 수 있다.

특히, 상기 조성물은 톡소이드 융합 단백질 Stx2eB-LTb 또는 톡소이드 융합Stx2eB-STb 각각을 항원으로 적용한 백신 조성물과 그 활성을 비교하여도, 월등하게 높은 생존율을 보이며 개체면역을 높이는 것에 매우 우수한 활성을 보인다.

본 명세서에서 용어, “면역원” 또는 “항원성 물질”은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다.

상기 항원의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 0.1 내지 50 중량%일 수 있거 1 내지10 중량%일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 1종 이상의 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서의 용어 "면역증강제"란, 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 전통적인 백신들은 죽은 병원성 미생물의 비가공 제제로 구성되어, 병원성 미생물의 배양액과 관련된 불순물들은 면역 반응을 향상시키기 위한 면역증강제로서 작용할 수 있으나, 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제를 백신접종을 위한 항원으로서 사용하는 경우, 상기와 같은 항원에 의해 발동된 면역성은 불충분하여 면역증강제로서 일부 외래물질의 첨가가 필요해진다. 면역증강제를 사용함으로써 면역 반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다. 이러한 면역증강제는 그 원료(미네랄, 세균, 식물)와 성분(유제현탁액)에 따라 분류된다. 구체적으로, 콜레라 톡신(CT; cholera toxin), 알루미늄하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 또는 생분해성(Biodegradable) 오일이 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좋게는 상기 조성물은 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트)의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감음성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

상기 조성물은 하루 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg로 개체에 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 상기 수의학적 조성물에 포함된 유효성분의 함량 정도, 개체의 상태(체중 등), 상태의 심각성 등에 따라 변화될 수 있다. 상기 조성물은 2주 간격으로 1회 또는 2회 이상 반복하여 투여하는 것이 백신 효과 향상에 좋다.

다른 하나의 양태로써, 본 발명은 위에서 설명한 병원성대장균 감염성 질환 예방용 백신 조성물을 돼지 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 대장균 감염성 질환의 예방 또는 증상완화 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 동물은 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한 없이 적용 가능하다. 예를 들면, 상기 동물은 돼지이다.

본 발명에서, 상기 투여는 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하로 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 "치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양"은 당업자라면, 증상의 경중, 개체의 성별, 나이 및 체중 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다. 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 예를 들면 투여되는 개체 1kg 당 1pg 내지 10g의 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질일 수 있다.

본 발명의 조성물은 Stx2eB과 LTb이 융합된 Stx2eB-LTb 단백과 Stx2eB과 STb이 융합된 Stx2eB-STb 단백을 함께 포함하여 우수한 생존율인 90% 이상, 더 구체적으로 95% 이상의 생존율을 보이며, Stx2eB-LTb 단백 또는 Stx2eB-STb 단백 각각을 투여하였을 경우와 비교하여 월등하게 생존율이 높은 결과이다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 병원성대장균 감염성 질환 예방 또는 증상완화용 백신 조성물의 제조방법은, 1) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 STb 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질을 발현하는 제1형질전환체로부터 제1배양액을 얻고, 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질을 발현하는 제2형질전환체로부터 제2배양액을 얻는 발현단계; 그리고 상기 제1배양액으로부터 1) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 STb 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질을 분리 및 정제하고, 상기 제2배양액으로부터 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질을 분리 및 정제하는 회수단계;를 포함한다.

Stx2eB-STb 융합단백질을 발현하는 제1형질전환체는 상기 Stx2eB-STb 융합단백질을 발현하는 유전자를 포함한다.

상기 제1형질전환체는 구체적으로 서열번호 6의 pET-Stx-STb을 포함하는 형질전환체일 수 있다.

Stx2eB-LTb 융합단백질을 발현하는 제2형질전환체는 상기 Stx2eB-LTb 융합단백질을 발현하는 유전자를 포함한다.

상기 제2형질전환체는 구체적으로 서열번호 7의 pET-Stx-LTb를 포함하는 형질전환체일 수 있다.

Stx2eB-STb 융합단백질, Stx2eB-LTb 융합단백질, 이들을 발현하는 벡터, 이들을 각각 코딩하는 염기서열 등에 대한 내용은 위에서 설명한 것과 중복되므로 그 기재를 생략한다.

상기 형질전환체로는 대장균 등이 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제1형질전환체와 상기 제2형질전환체는 각각 적합한 배지에서 성장하여 합성된 융합단백을 포함하는 배양액을 형성하며, 상기 배양액의 세포를 분쇄하고 단백질을 정제하는 등의 통상의 정제방법을 적용해 i) Stx2eB과 LTb이 융합된 재조합 단백 Stx2eB-LTb 와 ii) Stx2eB과 STb이 융합된 재조합 단백 Stx2eB-STb 각각을 얻을 수 있다.

이렇게 얻어진 2 종의 재조합 단백은, 단독으로 백신 조성물로 활용되기 보다는, 이들을 혼합하여 백신 조성물로 활용하는 것이, 백신된 개체의 생존율, 면역 자극 효과 등을 얻는 것에 더 유리하다.

상기 백신 조성물은 위에서 언급한 것처럼 통상의 담체, 어쥬번트, 첨가제 등이 더 포함될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 병원성대장균 Stx2eB(Shiga toxin 2e B-subunit) 톡소이드와 병원성대장균 STb(Heat-stable enterotoxin b) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질; 및 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb(heat-labile enterotoxin B subunit) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질;을 포함하는 병원성대장균 감염성 질환 예방용 또는 증상완화용 사료 조성물이다.

본 발명의 사료 조성물은 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 한 당업계에 공지된 다양한 형태의 조성비로 당업자에 의해 적절하게 구성될 수 있다.

본 발명에서, 상기 사료 조성물은 사료첨가제 이외에, 개체의 유지와 성장을 위해 반드시 사료로부터 공급되어야 할 필수 영양소로서 에너지, 아미노산, 광물질, 비타민 및 물을 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용 가능하다.

상기 사료는, 각종 사료, 기능성 사료, 음료, 사료 첨가제 및 음료(음수) 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

또한, 상기 사료 조성물에서, 상기 유효성분의 양은 사료 조성물 총 중량의 0.00001 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로 50 중량% 이하, 더욱 구체적으로 40 중량% 이하로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 사료조성물은 사료첨가용 조성물일 수 있다.

본 발명의 용어 "사료첨가용 조성물"이란, 사료에 첨가하여 생산성 향상이나 건강을 증진시킬 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 것이다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 개별적으로 사용될 수 있고 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있고 종래의 사료첨가제와 순차적 또는 동시에 사용될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 사료용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용 가능하다.

본 발명의 병원성대장균 감염증 예방용 또는 증상완화용 백신 조성물 등은 돼지 특히 자돈에서 발생하는 설사증 및/또는 부종병의 형태로 나타나는 병원성대장균 감염증 예방 또는 증상완화 효과가 뛰어나며 특히 생존율을 90% 이상으로 높일 수 있다.

도 1은 pET-Stx-STb 벡터의 유전자지도.
도 2는 pET-Stx-LTb 벡터의 유전자지도.
도 3은 pET-Stx2eB 벡터의 유전자지도.
도 4는 본 발명의 실험실시예에서 Stx-LTb 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과.
도 5는 본 발명의 실험실시예에서 Stx-STb 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과.
도 6은 본 발명의 실시예에서 실시한 마우스에서의 각 항원을 포함하는 백신의 효과를 마우스의 생존율로 보여주는 그래프.
도 7은 본 발명의 실시예에서 실시한 마우스 실험에서의 각 항원을 포함하는 백신의 효과를 ELISA를 이용한 혈청 내 항체 역가 평가로 평가한 결과를 보여주는 그래프.
도 8은 본 발명의 실시예에서 이유자돈에 실시한 백신의 효과를 항체 역가 시험 결과로 보여주는 그래프.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

1. 융합 재조합 단백질의 제조.

1) Stx2eB, Stx2eB-LTB 및 Stx2eB-STb 발현 벡터의 제조

돼지 장관독소원성 대장균/시가독소 대장균(ETEC/STEC) 균주를 국내에서 돼지로부터 분리하여 활성을 확인하고 E.coli KE32로 명명하였다. 이 균주로부터 시가독소 2e B 톡소이드를 발현하는 Stx2eB 유전자(서열번호 9), 이열성엔테로톡신 B 톡소이드를 발현하는 LTb 유전자(서열번호 10), 그리고 내열성엔테로톡신 B 톡소이이드를 발현하는 STb 유전자(서열번호 11)를 각각 분리했고 각 서열을 아래 표 1에 나타냈다.

	염기서열
Stx2eB서열번호 9	ATGGATTGCGCGAAAGGCAAAATTGAATTTTCGAAATATAATGAAGATAACACCTTTACCGTGAAAGTGAGCGGTCGCGAATATTGGACCAATCGTTGGAATCTGCAGCCGTTACTGCAATCGGCCCAGCTGACCGGCATGACCGTTACCATTATCAGCAACACCTGCAGCTCGGGCAGTGGTTTTGCGAAGGTGAAATTCAAT
LTb서열번호 10	AATAAAGTAAAATGTTATGTTTTATTTACGGCGTTACTATCCTCTCTATATGCACACGGAGCTCCCCAGACTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATAATATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGAAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAGAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGGAAAAC
STb서열번호 11	AAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCATCTACACAATCAAATAAAAAAGATTTGTGTGAAAATTATAGACAAATAGCCAAGGAAAGTTGTAAAAAAGGTTTTTTAGGGGTTAGAGATGGTACTGCTGGAGCATGCTTTGGCGCCCAAATAATGGTTGCAGCAAAAGGATGC

대장균 균주 BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (애질런트테크놀로지스)이 융합 단백질 제조를 위한 숙주 균주(host strain)로 사용했다. 벡터로는 pET28a(+) (노바겐)을 적용했다. 제한 효소, Taq DNA 폴리머라아제, T4 DNA 리가아제는 타카라사(중국) 또는 뉴잉글랜드 바이오랩사 (영국) 제품을 사용했다. 기타 재료들은 시그마사로부터 구입하여 사용하였다. 모든 DNA 조작은 표준 절차(Sambrook and Russell, 2001)에 따라 수행되었다.

대장균의 형질변환은 표준 CaCl₂-competent cell 방식으로 진행되었다. ETEC strain E.coli KE32의 genomic DNA로부터 얻은 Mature peptide를 코딩하는 Stx2eB 서브유닛 유전자는 PCR으로 증폭하였고, 이 때 Stx2e 유전자 서열에 기초한 아래 P1과 P2 두 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 적용되었다.

P1: 5'- AACCATGGATTGCGCGAAAGGCA-3'

P2: 5'- ATTGAATTTCACCTTCGCAAA- 3'

상기 유전자 절편들은 5' 말단(프로틴의 N 말단)에 NcoI 제한효소 인지부위를 형성하고, 3' 말단에 LTb과 STb 유전자 절편의 N 말단을 코딩하는 24개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 한다.

ETEC strain E.coli KE32의 genomic DNA로부터 얻은 LTb 유전자 절편은 PCR을 이용해 증폭하였고, 이 때 LTb 유전자 서열에 따라 3' 말단에서 XhoI site를 형성하도록 디자인된 아래 프라이며 P3와 P4가 적용되었다.

P3: 5'- AATAAAGTAAAATGTTATGTT - 3'

P4: 5'- CCCTCGAGGTTTTCCATACTGATTGC - 3'

ETEC strain KE32으로부터 PCR을 이용해 얻은 STb 유전자 절편을 PCR을 이용해 증폭하였다. 프라이머는 STb 유전자 서열에 따라 3' 말단에 XhoI site를 형성하도록 디자인된 아래 P5와 P6을 적용했다.

P5: 5'- AAAAAGAATATCGCATTTCTT - 3'

P6: 5'- CCCTCGAGGCATCCTTTTGCTGCAACCA - 3'

Stx2eB-LTb 유전자와 Stx2eB-STb 유전자를 각각 제조하기 위해, 증폭된 Stx2eB 절편과 LTb 절편, 그리고 Stx2eB 절편과 STb 절편을 각각 상보적인 뉴클레오타이드와 함께 overlap extension으로 splicing하여 유전적으로 결합시켰다. 결합은 GS 링커를 활용했다.

이후, 겔 퓨리피케이션을 이용해 Stx2eB-LTb 유전자와 Stx2eB-STb 유전자인 융합유전자를 확인 및 분리하였다. Stx2eB-STb(서열번호 12)와 Stx2eB-LTb(서열번호 13)은 각각 서열을 확인하여 표 2에 나타냈다. 표 2에서 볼드로 표시한 부분은 링커를 표시한다.

	염기서열
Stx-gs링커-STb 서열번호 12	ATGGATTGCGCGAAAGGCAAAATTGAATTTTCGAAATATAATGAAGATAACACCTTTACCGTGAAAGTGAGCGGTCGCGAATATTGGACCAATCGTTGGAATCTGCAGCCGTTACTGCAATCGGCCCAGCTGACCGGCATGACCGTTACCATTATCAGCAACACCTGCAGCTCGGGCAGTGGTTTTGCGAAGGTGAAATTCAATggcccgggcccgggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCATCTACACAATCAAATAAAAAAGATTTGTGTGAAAATTATAGACAAATAGCCAAGGAAAGTTGTAAAAAAGGTTTTTTAGGGGTTAGAGATGGTACTGCTGGAGCATGCTTTGGCGCCCAAATAATGGTTGCAGCAAAAGGATGC
Stx-gs링커- LTb서열번호 13	ATGGATTGCGCGAAAGGCAAAATTGAATTTTCGAAATATAATGAAGATAACACCTTTACCGTGAAAGTGAGCGGTCGCGAATATTGGACCAATCGTTGGAATCTGCAGCCGTTACTGCAATCGGCCCAGCTGACCGGCATGACCGTTACCATTATCAGCAACACCTGCAGCTCGGGCAGTGGTTTTGCGAAGGTGAAATTCAATggcccgggcccgggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcAATAAAGTAAAATGTTATGTTTTATTTACGGCGTTACTATCCTCTCTATATGCACACGGAGCTCCCCAGACTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATAATATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGAAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAGAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGGAAAAC

융합된 유전자는 플라스미드 pET28a(+)으로 복제되어, 각각 플라스미드 pET-Stx2eB, pET-Stx2eB-LTb, 그리고 pET-Stx2eB-STb이 제조되었다. 각각의 벡터는 서열번호 6(pET-Stx-STb), 서열번호 7(pET-Stx-LTb) 및 서열번호 8(pET-Stx2eB)로 각각 염기서열을 확인하였다.

따라서, pET-Stx2eB은 숙주세포 내에서 서열번호 1의 Stx2eB 톡소이드를 생산하고, pET-Stx-STb 그리고 pET-Stx-LTb는 각각 서열번호 4의 Stx-STb 톡소이드와 서열번호 5의 Stx-LTb 톡소이드를 생산한다(표 3 참조). 즉, 각각 Stx2eB의 C 말단으로부터 LTb 또는 STb의 N 말단으로 연결되는 융합 단백을 발현한다..

	아미노산 서열
서열번호 1의 Stx2eB 톡소이드	M D C A K G K I E F S K Y N E D N T F T V K V S G R E Y W T N R W N L Q P L L Q S A Q L T G M T V T I I S N T C S S G S G F A K V K F N
서열번호 4의 Stx2eB-STb 톡소이드	M D C A K G K I E F S K Y N E D N T F T V K V S G R E Y W T N R W N L Q P L L Q S A Q L T G M T V T I I S N T C S S G S G F A K V K F N G P G P G G G G S G G G G S G G G G S K K N I A F L L A S M F V F S I A T N A Y A S T Q S N K K D L C E N Y R Q I A K E S C K K G F L G V R D G T A G A C F G A Q I M V A A K G C
서열번호 5의 Stx2eB-LTb 톡소이드	M D C A K G K I E F S K Y N E D N T F T V K V S G R E Y W T N R W N L Q P L L Q S A Q L T G M T V T I I S N T C S S G S G F A K V K F N G P G P G G G G S G G G G S G G G G S N K V K C Y V L F T A L L S S L Y A H G A P Q T I T E L C S E Y R N T Q I Y T I N D K I I S Y T E S M A G K R E M V I I T F K S G E T F Q V E V P G S Q H I D S Q K K A I E R M K D T L R I T Y L T E T K I D K L C V W N N K T P N S I A A I S M E N

재조합된 플라스미드는 PCR 오류가 없는지 확인하기 위해 서열을 분석해 확인한 후, 이후 단계를 진행했다. 재조합된 각 플라스미드에 대한 유전자 지도는 각각 도 1 내지 도 3에 나타냈다. 또한, 이들의 염기서열은 서열번호 6(pET-Stx-STb), 서열번호 7(pET-Stx-LTb) 그리고 서열번호 8(pET-Stx2eB)로 제시하였다.

2) 재조합 단백질의 발현과 정제

형질전환된 세포주는 카나마이신(50 ㎍/ml)이 공급된 LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 교반하면서 600 nm에서 흡광도가 0.4 내지 0.6이 될 때까지 배양하였다.

Stx2eB, Stx2eB-LTb 또는 Stx2eB-STb의 발현은 1mM의 IPTG(isopropyl b-D-thiogalactopyranoside)에서 유도되었다. 5000 g의 세포주 배양액을 Sorvall SS-34 rotor로 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리하여 펠렛을 얻고, 세포 용해와 초음파 분산을 진행해 배양액을 얻었다.

상기 배양액으로부터 얻어진 불용성인 재조합 Stx2eB, Stx2eB-LTb 그리고 Stx2eB-STb 단백은 Histrap kit (Amersham pharmacia)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 니켈 이온 친화성 크로마토그래피를 진행해 정제하였다.

평형 버퍼(8M 우레아, 0.5 M NaCl과 30 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM 인산염 버퍼, pH 7.6)로 평형 상태가 된 Ni2+-NTA 컬럼에 단백질 용액을 로딩하였다. 구체적으로, 컬럼을 평형 버퍼로 충분히 세척하고, 500mM의 이미다졸을 함유하는 평형 버퍼를 단계적으로 희석해 도입했다. 메인 피크의 용액을 회수하고, PBS(Phosphate-buffered saline)을 함유하는 refolding buffer에서 정제된 단백질을 투석(dialysis)했다. 최종 회수된 단백은 0.22 mm filter membrane으로 필터 되었고, 500 mg/ml의 농도로 조절되어 영하 20℃에서 저장되었다.

3) SDS-PAGE 분석

SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 위해 시료를 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 80V의 전압으로 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 겔은 Coomassie brilliant blue solution로 염색하고 Destaining solution으로 탈색하여 관찰하였다. 각각 샘플은 상기 세포주 배양액의 톡소이드 발현 유도 전과 후, 그리고 정제과정을 거친 후에 확인했다.

Stx2eB-LTb과 Stx2eB-STb의 배양액에서의 확인한 SDS-PAGE 결과와 단백질 정제 과정을 거친 후에 확인한 SDS-PAGE 결과를 도 4와 도 5에 각각 나타냈다.

2. 융합 재조합 단백질의 활성 평가(1)

1) 마우스에서 각 단백의 면역활성 평가

적응기간을 거친 female adult BALB/c 마우스 그룹(n=10)을 i) control(PBS) 그룹, ii) Stx2eB 그룹, iii) Stx2eB-LTb 그룹, iv) Stx2eB-STb 그룹, 그리고 v) Mix(Stx2eB-LTb & Stx2eB-STb) 그룹으로 각각 나누어 실험에 적용했다.

실험 day 0에 각각의 ii) 내지 v) 그룹에 각각의 정제된 재조합 단백(각각 30 μg의 단백을 100 μl PBS과 혼합해 적용하며, Mix 그룹의 경우 1:1로 혼합된 단백의 총 량이 30 μg으로 적용)을 100 μl의 Freund's complete adjuvant(Sigma)에 유화하여 복강주사로 주입하였다. Control 그룹인 i)의 경우 단백 적용 없이 PBS을 위와 동일한 조건으로 주입했다.

두 번의 부가 접종을 2주 간격으로 진행하고, 혈액 샘플은 주사 전과 각 주사 14일 후에 수집되었다. 수집된 혈액 샘플은 20분 동안 실온에 둔 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 회수하였다.

day 31에 모든 마우스에 반수치사량의 wild type E. coli KE32 (LD₅₀, 2.53 Х10⁸ CFU/mouse)을 복강 주입하고, 각 그룹의 마우스의 생존율을 평가하여 도 6에 나타냈다.

도 6을 참조하면 그룹 i)의 경우 약 10%의 생존을, 그룹 iii)과 그룹 iv)의 경우 각각 90%와 80%의 생존율을 보였고, 그룹 v)의 경우 100%의 생존율을 보여서 Mix 군에서 매우 뛰어난 생존율을 보인다는 점을 확인할 수 있었다.

2) 혈청 내 항체 역가의 측정

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assays)를 적용하여 Stx2eB 단백, Stx2eB-LTb 단백, Stx2eB-LTb과 Stx2eB-STb의 혼합 단백(Mix)의 항체 역가를 측정하였다. 96 웰 플레이트에 각 웰당 0.1 ng의 정제된 Stx2eB 단백, Stx2eB-LTb 단백, Stx2eB-LTb과 Stx2eB-STb의 혼합 단백인 항원을 도말하고 흡착을 위해 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이팅 하였다. 면역처리된 마우스들로부터 채취한 혈청을 1차항체로 적용하고, 2% BSA (sigma)로 블로킹한 후, 퍼옥시다아제 결합 염소 항마우스 IgG (ab-97023; abcam)를 2차항체로 적용하였다. 샘플들은 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 종말 역가(Endpoint titers)는 면역 혈청을 연속 희석법을 이용해 control군의 혈청을 적용한 대조군의 흡광도보다 적어도 2배 이상의 흡광도값(OD450)을 갖는 지점에서 기록했고, 그 결과를 도 7에 나타냈다.

3. 융합 재조합 단백질의 활성 평가(2)

1) 돼지에서 각 단백의 면역활성 평가

3주령 이유자돈을 5두를 공시하였고, 대조군과 백신군의 2개 그룹으로 나눈 후 시험에 적용했다. 각 자돈들은 밀키 골드(2호)를 식이로 각 주령에 맞추어 백신군과 대조군에 동일하게 급여했다.

백신 접종은 대조군과 백신군 모두에서 동일하게 3주령에 1차백신을, 5주령에 2차백신을 진행했고, 대조군에는 PBS를, 그리고 백신군에는 위에서 제조한 Stx-LTb 단백, Stx-Stb 단백을 각 100ug/dose씩 포함하는 Mix 백신 200ug/dose을 PBS와 혼합하고 Freund's complete adjuvant를 첨가해 현탁액 형태로 이근부이 1 ml주사하였다.

실험시작 전, 1차백신 2주후, 그리고 2차백신 2주후에 각각 혈액을 채취하여 20분 동안 실온에 둔 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 회수하였다.

2) 혈청 내 항체 역가의 측정

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assays)를 적용하여 Stx2eB-LTb과 Stx2eB-STb의 혼합 단백(Mix)의 항체 역가를 측정하였다.

96 웰 플레이트에 각 웰당 0.1 ng의 정제된 Stx2eB-LTb과 Stx2eB-STb의 혼합 단백인 항원을 도말하고 흡착을 위해 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이팅 하였다. 면역처리된 자돈로부터 채취한 혈청을 1차항체로 적용하고, 2% BSA (sigma)로 블로킹한 후, 퍼옥시다아제 결합 염소 항마우스 IgG (ab-97023; abcam)를 2차항체로 적용하였다. 샘플들은 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

1: 1600 비율로 희석하여 적용한 백신군과 대조군의 흡광도를 450 nm에서 측정하고, 그 결과를 도 8에 나타냈다. 도 8의 결과를 참고하면, 대조군과 백신군에 뚜렷한 역가 차이가 나타난다는 것을 확인할 수 있으며, 본 발명의 혼합백신이 이유자돈에서 우수한 면역 효과를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.

* 통계분석

모든 데이터는 SPSS 13.0 software (SPSS, Chicago, IL, USA)와 Student's t test로 분석되었다. 각 군들의 결과는 (평균±표준편차) 값으로 평가되었고, 두 샘플이 갖거나 분산이 동일하지 않은 경우와 함께 양측 분산에서 계산된 p 값은 <0.05 수준에서 유의미한 것으로 취급했다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> KBNP, INC. <120> RECOMBINATION TOXOID Stx2eB-LTb, Stx2eB-STb OF PORCINE PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI AND VACCINE COMPOSITION COMPRISING THE SAME AS ANTIGEN <130> RD18KB01KR <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 68 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu Asp 1 5 10 15 Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp Thr Asn Arg 20 25 30 Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met Thr 35 40 45 Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly Phe Ala Lys 50 55 60 Val Lys Phe Asn 65 <210> 2 <211> 70 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser Ile 1 5 10 15 Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Ser Thr Gln Ser Asn Lys Lys Asp Leu Cys 20 25 30 Glu Asn Tyr Arg Gln Ile Ala Lys Glu Ser Cys Lys Lys Gly Phe Leu 35 40 45 Gly Val Arg Asp Gly Thr Ala Gly Ala Cys Phe Gly Ala Gln Ile Met 50 55 60 Val Ala Ala Lys Gly Cys 65 70 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser Leu 1 5 10 15 Tyr Ala His Gly Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr 20 25 30 Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Ile Ser Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser 50 55 60 Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser 65 70 75 80 Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr 85 90 95 Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr 100 105 110 Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn 115 120 <210> 4 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx-STb <400> 4 Met Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu Asp 1 5 10 15 Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp Thr Asn Arg 20 25 30 Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met Thr 35 40 45 Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly Phe Ala Lys 50 55 60 Val Lys Phe Asn Gly Pro Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala 85 90 95 Ser Met Phe Val Phe Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Ser Thr Gln 100 105 110 Ser Asn Lys Lys Asp Leu Cys Glu Asn Tyr Arg Gln Ile Ala Lys Glu 115 120 125 Ser Cys Lys Lys Gly Phe Leu Gly Val Arg Asp Gly Thr Ala Gly Ala 130 135 140 Cys Phe Gly Ala Gln Ile Met Val Ala Ala Lys Gly Cys 145 150 155 <210> 5 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx-LTb <400> 5 Met Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu Asp 1 5 10 15 Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp Thr Asn Arg 20 25 30 Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met Thr 35 40 45 Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly Phe Ala Lys 50 55 60 Val Lys Phe Asn Gly Pro Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe 85 90 95 Thr Ala Leu Leu Ser Ser Leu Tyr Ala His Gly Ala Pro Gln Thr Ile 100 105 110 Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn 115 120 125 Asp Lys Ile Ile Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met 130 135 140 Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro 145 150 155 160 Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys 165 170 175 Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu 180 185 190 Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met 195 200 205 Glu Asn 210 <210> 6 <211> 5704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET-Stx-STb <400> 6 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720 gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080 tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380 cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880 tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940 tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060 gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180 catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240 ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300 gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360 gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420 ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480 atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600 tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900 gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960 tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260 tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320 tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500 tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740 ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860 cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980 aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040 ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggattgcg cgaaaggcaa aattgaattt 5100 tcgaaatata atgaagataa cacctttacc gtgaaagtga gcggtcgcga atattggacc 5160 aatcgttgga atctgcagcc gttactgcaa tcggcccagc tgaccggcat gaccgttacc 5220 attatcagca acacctgcag ctcgggcagt ggttttgcga aggtgaaatt caatggcccg 5280 ggcccgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag caaaaagaat 5340 atcgcatttc ttcttgcatc tatgttcgtt ttttctattg ctacaaatgc ctatgcatct 5400 acacaatcaa ataaaaaaga tttgtgtgaa aattatagac aaatagccaa ggaaagttgt 5460 aaaaaaggtt ttttaggggt tagagatggt actgctggag catgctttgg cgcccaaata 5520 atggttgcag caaaaggatg cctcgagcac caccaccacc accactgaga tccggctgct 5580 aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa 5640 ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc 5700 ggat 5704 <210> 7 <211> 5863 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET-Stx-LTb <400> 7 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720 gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080 tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380 cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880 tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940 tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060 gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180 catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240 ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300 gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360 gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420 ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480 atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600 tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900 gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960 tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260 tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320 tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500 tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740 ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860 cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980 aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040 ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggattgcg cgaaaggcaa aattgaattt 5100 tcgaaatata atgaagataa cacctttacc gtgaaagtga gcggtcgcga atattggacc 5160 aatcgttgga atctgcagcc gttactgcaa tcggcccagc tgaccggcat gaccgttacc 5220 attatcagca acacctgcag ctcgggcagt ggttttgcga aggtgaaatt caatggcccg 5280 ggcccgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag caataaagta 5340 aaatgttatg ttttatttac ggcgttacta tcctctctat atgcacacgg agctccccag 5400 actattacag aactatgttc ggaatatcgc aacacacaaa tatatacgat aaatgacaag 5460 ataatatcat atacggaatc gatggcaggc aaaagagaaa tggttatcat tacatttaag 5520 agcggcgaaa catttcaggt cgaagtcccg ggcagtcaac atatagactc ccagaaaaaa 5580 gccattgaaa ggatgaagga cacattaaga atcacatatc tgaccgagac caaaattgat 5640 aaattatgtg tatggaataa taaaaccccc aattcaattg cggcaatcag tatggaaaac 5700 ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 5760 gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 5820 gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gat 5863 <210> 8 <211> 5437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET-Stx2eB <400> 8 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720 gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080 tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380 cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880 tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940 tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060 gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180 catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240 ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300 gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360 gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420 ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480 atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600 tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900 gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960 tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260 tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320 tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500 tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740 ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860 cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980 aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040 ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggattgcg cgaaaggcaa aattgaattt 5100 tcgaaatata atgaagataa cacctttacc gtgaaagtga gcggtcgcga atattggacc 5160 aatcgttgga atctgcagcc gttactgcaa tcggcccagc tgaccggcat gaccgttacc 5220 attatcagca acacctgcag ctcgggcagt ggttttgcga aggtgaaatt caatctcgag 5280 caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 5340 gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 5400 aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggat 5437 <210> 9 <211> 204 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 atggattgcg cgaaaggcaa aattgaattt tcgaaatata atgaagataa cacctttacc 60 gtgaaagtga gcggtcgcga atattggacc aatcgttgga atctgcagcc gttactgcaa 120 tcggcccagc tgaccggcat gaccgttacc attatcagca acacctgcag ctcgggcagt 180 ggttttgcga aggtgaaatt caat 204 <210> 10 <211> 369 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 aataaagtaa aatgttatgt tttatttacg gcgttactat cctctctata tgcacacgga 60 gctccccaga ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat atatacgata 120 aatgacaaga taatatcata tacggaatcg atggcaggca aaagagaaat ggttatcatt 180 acatttaaga gcggcgaaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc 240 cagaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcacatatct gaccgagacc 300 aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt 360 atggaaaac 369 <210> 11 <211> 210 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 11 aaaaagaata tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttctattgc tacaaatgcc 60 tatgcatcta cacaatcaaa taaaaaagat ttgtgtgaaa attatagaca aatagccaag 120 gaaagttgta aaaaaggttt tttaggggtt agagatggta ctgctggagc atgctttggc 180 gcccaaataa tggttgcagc aaaaggatgc 210 <210> 12 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx- gslinker -STb <400> 12 atggattgcg cgaaaggcaa aattgaattt tcgaaatata atgaagataa cacctttacc 60 gtgaaagtga gcggtcgcga atattggacc aatcgttgga atctgcagcc gttactgcaa 120 tcggcccagc tgaccggcat gaccgttacc attatcagca acacctgcag ctcgggcagt 180 ggttttgcga aggtgaaatt caatggcccg ggcccgggcg gtggcggtag cggcggtggc 240 ggtagcggcg gtggcggtag caaaaagaat atcgcatttc ttcttgcatc tatgttcgtt 300 ttttctattg ctacaaatgc ctatgcatct acacaatcaa ataaaaaaga tttgtgtgaa 360 aattatagac aaatagccaa ggaaagttgt aaaaaaggtt ttttaggggt tagagatggt 420 actgctggag catgctttgg cgcccaaata atggttgcag caaaaggatg c 471 <210> 13 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stx- gslinker - LTb <400> 13 atggattgcg cgaaaggcaa aattgaattt tcgaaatata atgaagataa cacctttacc 60 gtgaaagtga gcggtcgcga atattggacc aatcgttgga atctgcagcc gttactgcaa 120 tcggcccagc tgaccggcat gaccgttacc attatcagca acacctgcag ctcgggcagt 180 ggttttgcga aggtgaaatt caatggcccg ggcccgggcg gtggcggtag cggcggtggc 240 ggtagcggcg gtggcggtag caataaagta aaatgttatg ttttatttac ggcgttacta 300 tcctctctat atgcacacgg agctccccag actattacag aactatgttc ggaatatcgc 360 aacacacaaa tatatacgat aaatgacaag ataatatcat atacggaatc gatggcaggc 420 aaaagagaaa tggttatcat tacatttaag agcggcgaaa catttcaggt cgaagtcccg 480 ggcagtcaac atatagactc ccagaaaaaa gccattgaaa ggatgaagga cacattaaga 540 atcacatatc tgaccgagac caaaattgat aaattatgtg tatggaataa taaaaccccc 600 aattcaattg cggcaatcag tatggaaaac 630 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stx2e primer, P1 <400> 14 aaccatggat tgcgcgaaag gca 23 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stx2e primer, P2 <400> 15 attgaatttc accttcgcaa a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ltB primer, P3 <400> 16 aataaagtaa aatgttatgt t 21 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ltB primer, P4 <400> 17 ccctcgaggt tttccatact gattgc 26 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STb primer, P5 <400> 18 aaaaagaata tcgcatttct t 21 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STb primer, P6 <400> 19 ccctcgaggc atccttttgc tgcaacca 28

Claims

1) 병원성대장균 Stx2eB(Shiga toxin 2e B-subunit) 톡소이드와 병원성대장균 STb(Heat-stable enterotoxin b) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질; 및 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb(heat-labile enterotoxin B subunit) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질;을 항원으로 포함하는, 병원성대장균 감염성 질환 예방용 또는 증상완화용 백신 조성물.

제1항에 있어서,
상기 Stx2eB-STb 융합단백질은 병원성대장균 톡소이드 Stx2eB와 병원성대장균 톡소이드 STb가 펩티드 링커로 연결된 것인, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 Stx2eB-LTb 융합단백질은 병원성대장균 톡소이드 Stx2eB와 병원성대장균 톡소이드 LTb가 펩티드 링커로 연결된 것인, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 Stx2eB 톡소이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 STb 톡소이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 LTb 톡소이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 Stx2eB-STb 융합단백질는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 Stx2eB-LTb 융합단백질는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 조성물은 포유자돈 또는 이유자돈의 조발성 설사, 부종병 및 이유 후 설사 중 적어도 하나 이상의 증상을 예방 또는 완화하는, 조성물.

제1항에 따른 병원성대장균 감염성 질환 예방용 백신 조성물을 돼지 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원성 대장균 감염성 질환의 예방 또는 증상완화 방법.

1) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 STb 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질을 발현하는 제1형질전환체로부터 제1배양액을 얻고, 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질을 발현하는 제2형질전환체로부터 제2배양액을 얻는 발현단계; 그리고
상기 제1배양액으로부터 1) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 STb 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질을 분리 및 정제하고, 상기 제2배양액으로부터 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질을 분리 및 정제하는 회수단계;를 포함하는, 병원성대장균 감염성 질환 예방 또는 증상완화용 백신 조성물의 제조방법.

제11항에 있어서,
상기 제1형질전환체는 서열번호 6으로 표시되는 벡터를 포함하는, 제조방법.

제11항에 있어서,
상기 제2형질전환체는 서열번호 7으로 표시되는 벡터를 포함하는, 제조방법.

1) 병원성대장균 Stx2eB(Shiga toxin 2e B-subunit) 톡소이드와 병원성대장균 STb(Heat-stable enterotoxin b) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-STb 융합단백질; 및 2) 병원성대장균 Stx2eB 톡소이드와 병원성대장균 LTb(heat-labile enterotoxin B subunit) 톡소이드가 포함된 Stx2eB-LTb 융합단백질;을 포함하는, 병원성대장균 감염성 질환 예방용 또는 증상완화용 사료 조성물.