KR20180083904A - 면역원성이 증강된 백신 항원 - Google Patents

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다케시 마츠이
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이데미쓰 고산 가부시키가이샤
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Abstract

항원 펩티드와 아쥬반트 단백질을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 아쥬반트 단백질은 시가 독소 2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB), 대장균 이열성 독소의 B 서브유닛 (LTB) 및 콜레라 독소의 B 서브유닛 (CTB) 에서 선택되는 2 이상의 단백질을 포함하는, 융합 단백질, 또는 그것을 코드하는 유전자로 형질 전환된 형질 전환체를 동물에게 투여함으로써 항원 펩티드의 면역원성을 높인다.

Description

면역원성이 증강된 백신 항원
본 발명은, 백신으로서 유용한 융합 단백질, 이것을 코드하는 DNA 를 포함하는 DNA 구축물, 그것을 포함하는 벡터 및 형질 전환체에 관한 것이다.
병해 방제의 유효한 방법으로서 백신의 이용이 있지만, 때에 따라서는 얻어지는 예방 효과에 있어서 불충분한 경우가 있다. 이것은 백신으로서 디자인한 항원의 면역원성이 원래 약한 경우나, 신생아나 고령자와 같이 백신을 접종하는 개체측의 면역력에서 기인하는 경우 등 여러 가지 이유를 생각할 수 있다. 대장균성 설사증의 원인 독소인 ST 는, 18 아미노산 (STp (돼지형)) 또는 19 아미노산 (STh (인간형)) 으로 이루어지는 분자량 약 2,000 의 소분자이며, 오래전부터 면역원성이 매우 낮은 것이 알려져 있다. ST 를 저면역원성 분자 모델로 하여, 면역원성을 향상시키기 위한 연구가 실시되어 왔다.
Klipstein et al. (1985) (비특허문헌 1) 은 STh 를 화학적으로 LTB 에 융합한 항원을 제작하고, 젤라틴 캡슐에 봉입하여 경구 투여함으로써, 혈청 IgG 와 소장 IgA 의 항체가 상승을 확인하였지만, 실용화를 위해서는 보다 더 나은 면역원성의 향상이 필요하였다.
Clements (1990) (비특허문헌 2) 는, LTB-ST 융합 단백질을 대장균에서 발현시키고, 이것을 정제하여 마우스에 복강내 주사함으로써, 혈청 중에 항 ST 항체의 유도를 확인하였지만, 보다 더 나은 면역원성의 상승이 필요하였다.
Zhang et al. (2010) (비특허문헌 3) 은, LT 홀로독소에 ST 를 융합한 단백질을 대장균에서 발현시켜, 이것을 정제하고, 프로인트의 불완전 아쥬반트와 함께 토끼에 근육주사함으로써, 항체 유도와 ST 독소에 대한 중화 활성의 유도를 확인하였지만, 아쥬반트를 포함하는 주사 투여인 점에서, 항원의 보다 더 나은 면역 향상이 중요하였다.
Rosales-Mendoza et al. (2011) (비특허문헌 4) 은, LTB 와 STh 의 융합 단백질을 담배에서 발현시키고, 마우스에 경구 투여함으로써 항 LT 항체가의 상승을 확인하고 있지만, 항 ST 항체가에 대해서는 언급하고 있지 않다.
한편, 본 발명자들은, 일본 특허 5360727호 (특허문헌 1) 에서, 특정 아미노산 서열을 갖는 링커 (PG12) 를 이용하여, 대장균 이열성 독소 B 서브유닛 (LTB) 이나 시가 독소 2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB) 을 식물에서 고산생시킨 것을 보고하고 있지만, 당해 융합 단백질의 백신으로서의 성능이나 제 3 항원을 융합한 경우의 당해 항원의 성능에 관해서는 불분명하였다.
일본 특허 5360727호 명세서
Klipstein et al., Infection and Immunity (1985) 50 : 328-32 Clements, Infection and Immunity (1990) 58 : 1159-66 Zhang et al., Clinical and Vaccine Immunology (2010) 17 : 1223-31 Rosales-Mendoza et al., Plant Cel Rep (2011) 30 : 1145-52
본 발명은, 면역원성이 증강된 백신 항원을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 실시한 결과, 항원 펩티드와, 시가 독소 2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB), 대장균 이열성 독소의 B 서브유닛 (LTB) 및 콜레라 독소의 B 서브유닛 (CTB) 에서 선택되는 2 이상의 독소 단백질을 결합한 융합 단백질을 제작하여 동물에게 투여함으로써, 2 이상의 독소 단백질 부분이 아쥬반트로서 작용하여, 동물 체내에서 항원 펩티드에 대한 면역원성이 증강되는 것을 알아내고, 이 융합 단백질을 우수한 백신 항원으로서 사용할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 항원 펩티드 (돼지 번식ㆍ호흡 장애 증후군 (PRRS) 바이러스의 당단백질 5 유래 펩티드를 제외한다) 와, 시가 독소 2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB), 대장균 이열성 독소의 B 서브유닛 (LTB) 및 콜레라 독소의 B 서브유닛 (CTB) 에서 선택되는 2 이상의 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
(2) 항원 펩티드 (돼지 번식ㆍ호흡 장애 증후군 (PRRS) 바이러스의 당단백질 5 유래 펩티드를 제외한다) 와 아쥬반트 단백질을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 아쥬반트 단백질은 시가 독소 2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB), 대장균 이열성 독소의 B 서브유닛 (LTB) 및 콜레라 독소의 B 서브유닛 (CTB) 에서 선택되는 2 이상의 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
(3) 상기 항원 펩티드는, 세균 독소 유래 펩티드인, (1) 또는 (2) 에 기재된 융합 단백질.
(4) 상기 항원 펩티드는, 대장균 내열성 독소 (ST) 유래 펩티드인, (1) 또는 (2) 에 기재된 융합 단백질.
(5) 상기 ST 펩티드는, 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖는, (3) 에 기재된 융합 단백질.
(6) 상기 항원 펩티드는, 포유류 감염성 바이러스 유래 펩티드인, (1) 또는 (2) 에 기재된 융합 단백질.
(7) 상기 포유류 감염성 바이러스 유래 펩티드는, 파보바이러스의 캡시드 단백질 VP2, 고양이 면역 부전 바이러스의 엔벨로프 단백질 gp120, 돼지 유행성 설사 바이러스의 스파이크 단백질, 또는 로타바이러스의 캡시드 단백질 VP7 의 부분 서열인, (6) 에 기재된 융합 단백질.
(8) 상기 파보바이러스의 캡시드 단백질 VP2 의 부분 서열이 서열 번호 33 또는 39 로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖고, 고양이 면역 부전 바이러스의 엔벨로프 단백질 gp120 의 부분 서열이 서열 번호 43 으로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖고, 돼지 유행성 설사 바이러스의 스파이크 단백질의 부분 서열이 서열 번호 50 으로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖고, 또는 로타바이러스의 캡시드 단백질 VP7 의 부분 서열은 서열 번호 56 또는 63 으로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖는, (7) 에 기재된 융합 단백질.
(9) 상기 2 이상의 단백질이 Stx2eB 와 LTB 를 포함하는, (1) ∼ (8) 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질.
(10) Stx2eB 의 73 위치의 Asn 잔기가 Ser 잔기로 치환되어 있는, (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 방제제.
(11) 상기 항원 펩티드 및 상기 2 이상의 단백질을 구성하는 독소 B 서브유닛의 각각이 펩티드 링커를 개재하여 연결되어 있는, (1) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질.
(12) 상기 펩티드 링커가 PG12 (서열 번호 2), PG12v2 (서열 번호 4), PG17 (서열 번호 25), 또는 PG22 (서열 번호 26), 또는 이들 서열과 80 ％ 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인, (11) 에 기재된 융합 단백질.
(13) 서열 번호 20 또는 22 의 아미노산 서열 또는 서열 번호 20 또는 22 와의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열로 나타내어지는, (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질.
(14) (1) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질을 코드하는 DNA.
(15) (14) 에 기재된 DNA 를 포함하는 DNA 구축물.
(16) (15) 에 기재된 DNA 구축물을 포함하는 재조합 벡터.
(17) (16) 에 기재된 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
(18) 상기 형질 전환체가 식물 또는 효모인, (17) 에 기재된 형질 전환체.
(19) (1) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 (17) 또는 (18) 에 기재된 형질 전환체를 포함하는 백신.
(20) (1) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 (17) 또는 (18) 에 기재된 형질 전환체를 포함하는 동물용 사료.
(21) (1) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 (17) 또는 (18) 에 기재된 형질 전환체를 비인간 포유 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 비인간 포유 동물에 있어서의 면역 증강 방법.
본 발명에 의해, 비약적으로 면역 유도 효율을 높일 수 있어, 면역원성이 낮은 항원에 대한 백신의 제공이 가능해졌다. 본 발명에서는, 예를 들어, 양상추 등의 가식 (可食) 식물에 백신 항원을 축적시켜 동물에게 경구 투여할 수 있기 때문에, 비용 절약화, 생력화 (省力化), 가축의 스트레스 경감에 의한 생산성의 향상을 기대할 수 있다.
도 1 은 양상추에 도입한 융합 단백질의 발현 카세트를 나타내는 도면이다.
도 2 는 백신 양상추의 마우스 경구 투여 프로그램을 나타내는 도면이다.
도 3 은 양상추에 있어서의 백신 단백질의 발현을 나타내는 도면이다 (일부, 사진). (A) LTB-mSTp 의 웨스턴 해석, (B) LTB-Stx2eB-mSTp 및 Stx2eB-LTB-mSTp 의 웨스턴 해석, (C) 양상추 중에서의 축적량.
도 4 는 백신 양상추 투여 마우스에 있어서의 항 STp IgA 항체가를 나타내는 도면이다.
도 5 는 효모에 도입한 융합 단백질의 발현 카세트를 나타내는 도면이다.
도 6 은 웨스턴 블롯에 의한 효모에 있어서의 백신 단백질의 발현 해석의 결과를 나타내는 도면이다 (사진).
도 7 은 웨스턴 블롯에 의한, 대장균에서 발현시킨 백신 단백질 (LBVP2) 의 정제의 결과를 나타내는 도면이다 (사진).
도 8 은 LBVP2 또는 VP2 를 고상화한 ELISA 에 의한, 백신 단백질 (LBVP2) 로 면역된 토끼에 있어서의 항체가의 평가 결과 (희석률과의 관계) 를 나타내는 도면이다.
도 9 는 LBVP2 또는 VP2 를 고상화한 ELISA 에 의한, 백신 단백질 (LBVP2) 로 면역된 토끼에 있어서의 항체가의 평가 결과 (시간 경과에 따른 변화) 를 나타내는 도면이다. 5000 배 희석한 혈액을 사용하였다.
도 10 은 양상추에 있어서의 LBVP2 백신 단백질의 발현을 나타내는 도면이다 (사진). 삼각은 LBVP2 단백질을 나타낸다. 별표는 비특이적 시그널을 나타낸다. 레인 상의 숫자는 독립적인 양상추 재조합체의 계통 번호를 나타낸다. WT 는 비재조합체 유래의 샘플을 나타낸다.
이하, 본 발명에 대하여 설명한다.
본 발명의 융합 단백질은, 항원 펩티드와 아쥬반트 단백질을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 아쥬반트 단백질은 시가 독소 2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB), 대장균 이열성 독소의 B 서브유닛 (LTB) 및 콜레라 독소의 B 서브유닛 (CTB) 에서 선택되는 2 이상의 단백질을 포함한다.
＜항원 펩티드＞
항원 펩티드는, PRRS 바이러스의 당단백질 5 유래 펩티드 이외의 펩티드이고, 투여된 비인간 포유 동물에 있어서 항원 항체 반응을 야기시킬 수 있는 펩티드라면 특별히 제한되지 않고, 그 서열이나 길이도 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 그 길이는, 10 ∼ 100 아미노산이다. 또한, 항원 펩티드에는, Stx2eB, LTB, CTB 도 포함되지 않는다.
항원 펩티드로는, 병원체 유래의 펩티드가 예시되고, 대장균, 마이코플라스마, 살모네라 등의 병원성 세균이 산생하는 펩티드, 예를 들어, 독소 (Stx2eB, LTB, CTB 이외) 나 세포벽 구성 단백질, 포유류 감염성 바이러스 유래의 펩티드, 예를 들어, 외피 유래 펩티드, 뉴클레오캡시드 유래 펩티드 등을 들 수 있다.
항원 펩티드의 일례로서, 대장균성 설사증의 원인 독소인 내열성 독소 ST 를 들 수 있다. ST 는, 18 아미노산의 STp (돼지형) 와 19 아미노산 STh (인간형) 등이 있는데, 융합 단백질의 투여 대상이 돼지인 경우, STp 를 사용한다.
항원으로서 사용되는 STp 로는, 예를 들어, 서열 번호 16 의 아미노산 서열을 갖는 무독화 변이체 (mSTp) (Sato et al., 1994) 를 사용할 수 있다. 단, STp 에 대한 항원 항체 반응을 야기시킬 수 있는 펩티드인 한, 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. 상기 「수 개」로는, 예를 들어, 2 ∼ 10 개, 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다. 또, STp 는, 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열과, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 것이어도 된다.
항원 펩티드의 다른 예로서, 파보바이러스의 캡시드 단백질 VP2 의 중화 에피토프, 고양이 면역 부전 바이러스의 엔벨로프 단백질 gp120 의 중화 에피토프, 돼지 유행성 설사 바이러스의 스파이크 단백질의 중화 에피토프, 로타바이러스의 캡시드 단백질 VP7 의 중화 에피토프를 들 수 있다. 단, 바이러스 유래의 항원 펩티드는 이것들에 한정되지 않고, 여러 가지 바이러스에서 유래하는 여러 가지의 펩티드를 적용할 수 있으며, 그 서열도 공지된 서열의 얼라이먼트 등으로부터 적절히 설정할 수 있다. 1 종류의 에피토프만을 이용하는 것도 가능하고, 또 복수의 에피토프를 다중 연결하여 이용할 수도 있다.
이하에, 상기 바이러스 단백질의 중화 에피토프 유래의 항원 펩티드의 아미노산 서열을 예시한다.
개 파보바이러스의 캡시드 단백질 VP2 의 중화 에피토프…서열 번호 33
돼지 파보바이러스의 캡시드 단백질 VP2 의 중화 에피토프…서열 번호 39
고양이 면역 부전 바이러스의 엔벨로프 단백질 gp120 의 중화 에피토프…서열 번호 43
돼지 유행성 설사 바이러스의 스파이크 단백질의 중화 에피토프…서열 번호 50
로타바이러스 A 형의 캡시드 단백질 VP7 의 중화 에피토프…서열 번호 56
로타바이러스 C 형의 캡시드 단백질 VP7 의 중화 에피토프…서열 번호 63
단, 각 바이러스 단백질에 대한 항원 항체 반응을 야기시킬 수 있는 펩티드인 한, 서열 번호 33, 39, 43, 50, 56, 또는 63 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. 상기 「수 개」로는, 예를 들어, 2 ∼ 10 개, 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다. 또, 항원 펩티드는, 서열 번호 33, 39, 43, 50, 56, 또는 63 으로 나타내는 아미노산 서열과, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 것이어도 된다.
＜아쥬반트 단백질＞
아쥬반트 단백질은 Stx2eB, LTB 및 CTB 에서 선택되는 2 이상의 단백질을 포함한다. 2 이상으로는, 바람직하게는 2 ∼ 5 이고, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 이고, 더욱 바람직하게는 2 이다. 또한, 2 이상의 단백질이란, Stx2eB, LTB 및 CTB 에서 선택되는 어느 1 종류의 독소 B 서브유닛이 2 개 이상 포함되는 양태여도 되고, Stx2eB, LTB 및 CTB 에서 선택되는 2 종류의 독소가 합계로 2 개 이상 포함되는 양태여도 되고, Stx2eB, LTB 및 CTB 가 합계로 3 개 이상 포함되는 양태여도 된다.
＜Stx2eB＞
시가 독소 (Stx) 는, 부종병의 원인이 되는 장관 출혈성 대장균 (EHEC, STEC) 이 산생하는 단백질성 독소이며, 1 형 (Stx1) 및 2 형 (Stx2) 으로 나누어진다. Stx1 은 a ∼ d 의 서브 클래스로, Stx2 는 a ∼ g 의 서브 클래스로 각각 분류된다. 독성 본체인 A 서브유닛 1 분자와 장관 점막으로의 결합에 작용하는 B 서브유닛 5 분자로 이루어지는 홀로독소이며, 진핵 세포의 리보솜에 작용하여, 단백질 합성을 저해하는 기능을 갖는다.
본 발명에서 사용되는 Stx2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB) 은, 예를 들어, 서열 번호 8 의 아미노산 서열로 나타내어진다. 서열 번호 8 은, Stx2e B 서브유닛 단백질 (GenBank Accession No.AAQ63639) 의 성숙 영역 (페리플라즘으로의 분비 시그널 펩티드를 제외함, Ala19 ∼ Asn87) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
또, Stx2eB 는, 예를 들어, Asn73 (서열 번호 8 의 아미노산 서열의 55 위치의 Asn 잔기) 이 Ser 잔기로 치환되어 있는 변이형이어도 된다. 서열 번호 8 의 아미노산 서열의 55 위치의 Asn 잔기가 Ser 로 치환되어 있는 아미노산 서열 (Asn73Ser) 을 서열 번호 10 으로 나타낸다.
또, Stx2eB 는, 융합 단백질로서 돼지 등의 동물에게 투여하여 아쥬반트 효과를 발휘할 수 있는 한, 서열 번호 8 또는 10 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. 상기 「수 개」로는, 예를 들어, 2 ∼ 10 개, 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다.
또, Stx2eB 는, 서열 번호 8 또는 10 으로 나타내는 아미노산 서열과, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 융합 단백질로서 돼지 등의 동물에게 투여하여 아쥬반트 효과를 발휘할 수 있는 것이어도 된다.
＜LTB＞
대장균성 설사증은, 독소원성 대장균 (ETEC) 이 생산하는 단백질성 독소 LT 가 원인이며, LT 는 대장균 이열성 독소라고도 불린다. 대장균 이열성 독소 (LT) 는, 독성 본체인 A 서브유닛 1 분자와 B 서브유닛 5 분자로 이루어지는 홀로독소이다. LT 의 A 서브유닛 (LTA) 은 세포질 내에 침입하여, 세포 내 cAMP 농도를 상승시켜, 세포막 클로라이드 채널을 활성화함으로써 장관 내로의 물의 누출, 즉 설사의 병태를 일으킨다. LT 의 B 서브유닛 (LTB) 은 무독이며, LT 독소와 장관 세포의 접착에 관여한다.
본 발명에서 사용되는 LTB 는, 예를 들어, 서열 번호 12 의 아미노산 서열로 나타내어진다. LTB 는, 융합 단백질로서 돼지 등의 동물에게 투여하여 아쥬반트 효과를 발휘할 수 있는 한, 서열 번호 12 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. 상기 「수 개」로는, 예를 들어, 2 ∼ 10 개, 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다. 서열 번호 12 로 나타내는 아미노산 서열은, GenBank Accession No.AAL55672 로서 등록되어 있다.
또, LTB 는, 서열 번호 12 로 나타내는 아미노산 서열과, 85 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 융합 단백질로서 돼지 등의 동물에게 투여하여 아쥬반트 효과를 발휘할 수 있는 것이어도 된다.
본 발명의 다른 실시형태에서는, LTB 에 당사슬이 부가되어 있어도 된다. 예를 들어, LTB 의 90 위치 (즉, 서열 번호 12 의 90 위치) 의 Asn 잔기에 N-결합형의 당사슬이 부가된다. 서열 번호 12 의 90 위치가 Ser 잔기로 치환된 LTB 의 아미노산 서열을 서열 번호 14 로 나타낸다.
＜CTB＞
콜레라 독소 (CT) 단백질은, 독성 본체인 1 개의 A 서브유닛 (CTA) 과, 장관 점막으로의 침입에 관여하는 5 개의 B 서브유닛 (CTB) 으로 이루어진다. 본 발명에서 사용되는 CTB 는, 예를 들어, 서열 번호 6 의 아미노산 서열로 나타내어진다. CTB 는, 융합 단백질로서 돼지 등의 동물에게 투여하여 아쥬반트 효과를 발휘할 수 있는 한, 서열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. 상기 「수 개」로는, 예를 들어, 2 ∼ 10 개, 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다.
또, CTB 는, 서열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 서열과, 85 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 돼지 등의 동물에게 투여하여 아쥬반트 효과를 발휘할 수 있는 것이어도 된다.
본 발명의 융합 단백질의 아쥬반트 부분을 구성하는 2 이상의 독소 펩티드는, Stx2eB, LTB, CTB 로부터 임의로 선택되는 2 이상의 독소 B 서브유닛이면 되는데, 바람직하게는 Stx2eB 와 LTB 의 조합이다. 본 발명에 있어서, Stx2eB 와 LTB 가 융합되는 순서는, 어느 것이 먼저여도 된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서는, St 등의 항원 펩티드와, Stx2eB, LTB, CTB 로부터 임의로 선택되는 2 이상의 독소 B 서브유닛의 각각은 펩티드 링커를 개재하여 탠덤하게 연결된다.
본 발명에서 사용하는 펩티드 링커의 아미노산의 개수는, 예를 들어 5 ∼ 25 개, 바람직하게는 10 ∼ 25 개, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 22 개, 보다 바람직하게는 12 ∼ 22 개이다. 또, 본 발명에서 사용하는 펩티드 링커에 있어서, 바람직하게는, 프롤린의 함유율이 20 ∼ 27 ％, 보다 바람직하게는 20 ∼ 25 ％ 이다.
펩티드 링커에 있어서, 프롤린은, 바람직하게는 2 개 간격, 또는 3 개 간격으로 배치된다. 프롤린 사이에 배치되는 아미노산은, 바람직하게는 글리신, 세린, 아르기닌에서 선택된다. 단, 펩티드의 일방 또는 양방의 말단에 있어서는, 프롤린 이외의 아미노산이, 5 개 이내, 바람직하게는 4 개 이내의 범위에서 부가되어 있어도 된다. 이와 같은 바람직한 펩티드 링커는, 예를 들어, 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 펩티드 링커는, 바람직하게는, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (PG12) 나 서열 번호 4 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (PG12v2) 이다. 또, 서열 번호 25 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (PG17) 나 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (PG22) 도 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 펩티드 링커는, 바람직하게는 서열 번호 2, 4, 25 또는 26 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드와 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성을 갖는 펩티드여도 된다.
상기와 같은 펩티드 링커를 사용함으로써, 융합 단백질의 안정성을 향상시켜, 숙주 세포에 있어서 고축적시킬 수 있다.
또, 본 발명에서 사용하는 융합 단백질은, 추가로 그 C 말단에 상기 펩티드 링커가 부가되어 있어도 된다.
본 발명에서 사용하는 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 20 또는 22 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 서열 번호 20 또는 22 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질은, Stx2eB 와, LTB 와, mSTp 가, PG12 를 개재하여 탠덤하게 연결되어 있다.
본 발명에서 사용하는 융합 단백질은, 식물에서 발현시키는 등의 경우에는, 그 아미노 말단에, 식물 유래의 분비 시그널 펩티드 또는 엽록체 이행 시그널 펩티드가 부가되어 있어도 된다. 여기에서, 「부가」란, 상기 분비 시그널 펩티드가, 상기 펩티드를 개재하여 연결한 융합 단백질의 아미노 말단에, 직접 결합하고 있는 경우도, 다른 펩티드를 개재하여 결합하고 있는 경우도 포함하는 개념이다.
분비 시그널 펩티드는, 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 십자화과 (Brassicaceae), 국화과 (Asteraceae) 에 속하는 식물, 더욱 바람직하게는 담배속 (Nicotiana), 애기장대속 (Arabidopsis), 왕고들빼기속 (Lactuca) 등에 속하는 식물, 보다 바람직하게는 담배 (Nicotiana tabacum), 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 양상추 (Lactuca sativa) 등에서 유래한다.
또, 분비 시그널 펩티드는, 바람직하게는 담배의 β-D 글루칸 엑소하이드로라아제 (β-D-글루칸 엑소히드롤라제), 담배의 38kDa 퍼옥시다아제 (GenBank Accession D42064) 에서 유래한다. 상기 분비 시그널 펩티드로는, 예를 들어, 담배의 β-D 글루칸 엑소하이드로라아제에서 유래하는, 서열 번호 28 로 나타내는 아미노산 서열을 가지고 있는 펩티드를 들 수 있다. 담배의 β-D 글루칸 엑소하이드로라아제를 코드하는 DNA 의 염기 서열은, 예를 들어 서열 번호 27 로 나타내어진다.
바람직한 엽록체 이행 시그널 펩티드는, 예를 들어, 국제 공개 WO2009/004842호 팜플렛 및 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 융합 단백질은, 식물에서 발현시키는 등의 경우에는, 그 카르복실 말단에, 소포체 잔류 시그널 펩티드, 액포 이행 시그널 펩티드 등의 시그널 펩티드가 부가되어 있어도 된다. 여기에서, 「부가」란, 시그널 펩티드가, 상기 융합 단백질의 카르복실 말단에, 직접 결합하고 있는 경우도, 다른 펩티드를 개재하여 결합하고 있는 경우도 포함하는 개념이다. 본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드가 부가되고, 또한 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드가 부가된 하이브리드 단백질을, 소포체형 (ER) 의 하이브리드 단백질이라고도 하고, 그 소포체형의 융합 단백질을 코드하는 DNA 구축물을, 소포체형의 DNA 구축물이라고도 한다. 소포체형의 융합 단백질은, 진핵 생물에서 효율적으로 축적되는 보고예가 다수 있다.
본 발명에서 사용하는 융합 단백질은, 그 카르복실 말단에, 바람직하게는 소포체 잔류 시그널 펩티드가 부가되어 있다. 바람직한 소포체 잔류 시그널 펩티드는, 예를 들어, 국제 공개 WO2009/004842호 팜플렛 및 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있는데, HDEL 서열 (서열 번호 29) 을 이용할 수 있다.
다른 바람직한 액포 이행 시그널 펩티드는, 예를 들어, 국제 공개 WO2009/004842호 팜플렛 및 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있다.
본 발명에서 사용하는 융합 단백질은, 화학적으로 합성할 수도 있고, 유전자 공학적으로 생산할 수도 있다.
유전자 공학적으로 생산하는 경우, 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 포함하는 DNA 구축물을 사용한다. 본 발명에서 사용하는 DNA 구축물은, ST 등의 항원 펩티드를 코드하는 DNA 와, Stx2eB 를 코드하는 DNA 와 LTB 를 코드하는 DNA, Stx2eB 를 코드하는 DNA 와 CTB 를 코드하는 DNA 또는 LTB 를 코드하는 DNA 와 CTB 를 코드하는 DNA 가, 상기 링커 펩티드를 코드하는 DNA 를 개재하여 탠덤하게 연결되어 있는 DNA 를 포함한다. 상기 링커 펩티드를 코드하는 DNA 는, 예를 들어 서열 번호 1 (PG12) 이나 서열 번호 3 (PG12v2) 등으로 나타내어진다. Stx2eB 를 코드하는 DNA 로서, 예를 들어, Stx2eB (Asn73) 를 코드하는 DNA (서열 번호 7), Stx2eB (Asn73Ser) 를 코드하는 DNA (서열 번호 9) 를 들 수 있다. LTB 를 코드하는 DNA 로서, 예를 들어, LTB (Asn90) 를 코드하는 DNA (서열 번호 11), LTB (Asn90Ser) 를 코드하는 DNA (서열 번호 13) 를 들 수 있다. CTB 를 코드하는 DNA 로서, 예를 들어, 서열 번호 5 의 염기 서열을 갖는 DNA 를 들 수 있다.
항원 펩티드를 코드하는 DNA 는, 공지된 정보에 기초하여 PCR 등의 수법에 의해 입수할 수 있는데, 예를 들어, mSTp 를 코드하는 DNA 로는, 서열 번호 15 의 염기 서열을 갖는 DNA 를 들 수 있다.
상기 항원 펩티드를 코드하는 DNA, 링커 펩티드를 코드하는 DNA, 독소 B 서브유닛 DNA 는, 각각 종지 코돈을 제외하고 해독틀을 맞춰서 연결된다.
Stx2eB, LTB, CTB 를 코드하는 DNA 는, 예를 들어, 서열 번호 7, 9, 11, 13, 5 의 염기 서열에 기초하여, 일반적인 유전자 공학적인 수법에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로는, 각 독소를 생산하는 세균으로부터, 통상적인 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 조제하고, 그 라이브러리로부터 상기 염기 서열에 기초하여 제작한 프로브를 사용하여 원하는 클론을 선택한다. 또, 상기 염기 서열을 기초로 한 화학 합성, 상기 염기 서열의 5' 및 3' 말단의 염기 서열을 프라이머로 하고, 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 등에 의해 합성할 수도 있다. 이것들을 공지된 수법으로 링커를 코드하는 DNA 와 연결시킴으로써 융합 단백질을 코드하는 DNA 가 얻어진다.
본 발명에서 사용하는 융합 단백질을 코드하는 DNA 는, 예를 들어, 서열 번호 19 또는 21 로 나타내어진다.
또, 융합 단백질을 코드하는 DNA 는, 서열 번호 19 또는 21 의 염기 서열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 여도 된다. 「스트린젠트한 조건」이란, 이른바 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들어, 동일성이 높은 2 개의 DNA 끼리, 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 특히 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 2 개의 DNA 가 하이브리다이즈되지만, 그것보다 동일성이 낮은 2 개의 DNA 가 하이브리다이즈되지 않는 조건을 들 수 있다. 예를 들어 2 × SSC (330 mM NaCl, 30 mM 시트르산), 42 ℃ 를 들 수 있고, 바람직하게는 0.1 × SSC (330 mM NaCl, 30 mM 시트르산), 60 ℃ 를 들 수 있다.
융합 단백질을 코드하는 DNA 는, 그 단백질을 생산시키는 숙주 세포에 따라, 하이브리드 단백질의 번역량이 증대되도록, 융합 단백질을 구성하는 아미노산을 나타내는 코돈이 적절히 개변되어 있는 것도 바람직하다.
코돈 개변의 방법으로는, 예를 들어 Kang et al. (2004) 의 방법을 참고로 할 수 있다. 또, 숙주 세포에 있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 선택하거나, GC 함량이 많은 코돈을 선택하거나, 숙주 세포의 하우스키핑 유전자에 있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 선택하거나 하는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 DNA 구축물에 있어서, 바람직하게는, 상기 융합 단백질을 코드하는 DNA 가, 인핸서에 발현 가능하게 연결되어 있다. 여기에서, 「발현 가능」이란, 본 발명에서 사용하는 DNA 구축물이 적절한 프로모터를 포함하는 벡터에 삽입되어, 그 벡터가 적절한 숙주 세포에 도입된 경우에, 숙주 세포 내에서 상기 융합 단백질이 생산되는 것을 말한다. 또, 「연결」이란, 2 개의 DNA 가 직접 결합하고 있는 경우도, 다른 염기 서열을 개재하여 결합하고 있는 경우도 포함하는 개념이다.
인핸서로는, Kozak 서열이나 식물 유래의 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역을 들 수 있다. 식물에서 발현시키는 등의 경우에는, 바람직하게는, 상기 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 가, 식물 유래의 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역에 발현 가능하게 연결되어 있다.
알코올 데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역이란, 알코올 데하이드로게나아제를 코드하는 유전자의 전사 개시점부터, 번역 개시점 (ATG, 메티오닌) 전까지의 염기 서열을 포함하는 영역을 말한다. 상기 영역은, 식물에서 유래하면 되는데, 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 십자화과 (Brassicaceae), 국화과 (Asteraceae) 에 속하는 식물, 더욱 바람직하게는 담배속 (Nicotiana), 애기장대속 (Arabidopsis), 왕고들빼기속 (Lactuca) 등에 속하는 식물, 보다 바람직하게는 담배 (Nicotiana tabacum), 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 양상추 (Lactuca sativa) 등에서 유래한다.
상기 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역으로는, 예를 들어 담배 (Nicotiana tabacum) 유래의 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역 (NtADH5'UTR) (서열 번호 30) 을 사용할 수 있고, 번역 개시점 상류 3 염기를 개변한 NtADH5'UTR 영역 (NtADHmod 5'UTR) (서열 번호 31) 을 사용함으로써 더욱 고번역을 기대할 수 있다.
식물 유래의 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역을 얻는 방법은, 예를 들어, 일본 공개특허공보 2012-19719호 및 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있다.
본 발명에서 사용하는 DNA 구축물은, 일반적인 유전자 공학적 수법에 의해 제작할 수 있고, 식물 유래의 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역, 식물 유래의 분비 시그널 펩티드를 코드하는 DNA, 및 융합 단백질을 코드하는 DNA, 소포체 잔류 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 등의 각 DNA 를, 각각 적당한 제한 효소에 의해 절단하고, 적당한 리가아제로 연결함으로써 구축할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 재조합 벡터는, 상기 DNA 구축물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용하는 재조합 벡터는, 상기 융합 단백질을 코드하는 DNA 가, 벡터가 도입되는 숙주 세포에 있어서 발현 가능하도록, 벡터 내에 삽입되어 있으면 된다. 벡터는, 숙주 세포에 있어서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA 등을 들 수 있다. 또, 벡터는 약제 내성 유전자 등의 선택 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 플라스미드 DNA 는, 대장균이나 아그로박테리움으로부터 알칼리 추출법 (Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7 : 1513) 또는 그 변법 등에 의해 조제할 수 있다. 또, 시판되는 플라스미드로서, 예를 들어 pBI221, pBI121, pBI101, pIG121Hm 등을 사용할 수도 있다. 바이러스 DNA 로는, 예를 들어 pTB2 (Donson et al.,1991) 등을 사용할 수 있다 (Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88 : 7204-7208 을 참조.).
벡터 내에서 사용되는 프로모터는, 벡터가 도입되는 숙주 세포에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (Odell et al. 1985 Nature 313 : 810), 벼의 액틴 프로모터 (Zhang et al. 1991 Plant Cell 3 : 1155), 옥수수의 유비퀴틴 프로모터 (Cornejo et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23 : 567) 등이 바람직하게 사용된다. 또, 벡터 내에서 사용되는 터미네이터도, 마찬가지로 벡터가 도입되는 숙주 세포에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 노팔린 합성 효소 유전자 전사 터미네이터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 터미네이터, 애기장대 heat shock protein 18. 2 유전자의 터미네이터 (HSP-T) 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 터미네이터는, 예를 들어, 서열 번호 32 로 나타내는 HSP-T 이다.
본 발명에서 사용하는 재조합 벡터는, 예를 들어 이하와 같이 하여 제작할 수 있다.
먼저, 상기 DNA 구축물을 적당한 제한 효소로 절단 또는 PCR 에 의해 제한 효소 부위를 부가하고, 벡터의 제한 효소 부위 또는 멀티 클로닝 사이트에 삽입한다.
본 발명에서 사용하는 형질 전환체는, 상기 재조합 벡터로 형질 전환되어 있는 것을 특징으로 한다. 형질 전환에 사용되는 숙주 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포 중 어느 것이어도 된다.
진핵 세포로는, 포유 동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등이어도 되지만, 식물 세포가 바람직하게 사용되고, 그 중에서도 왕고들빼기속 (Lactuca) 등의 국화과 (Asteraceae), 가지과, 십자화과, 명아주과에 속하는 식물의 세포가 바람직하게 사용된다. 또한, 왕고들빼기속 (Lactuca) 에 속하는 식물의 세포, 그 중에서도 양상추 (Lactuca sativa) 세포가 바람직하게 사용된다. 숙주 세포로서 양상추 세포를 사용하는 경우에는, 벡터는, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 등을 사용할 수 있다.
원핵 세포로는, 대장균 (Escherichia coli), 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) 등이 사용된다.
본 발명에서 사용하는 형질 전환체는, 일반적인 유전자 공학적 수법을 사용하여, 본 발명에서 사용하는 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 제작할 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움을 이용한 도입 방법 (Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2 : 218, Hiei, et al., 1994 Plant J. 6 : 271), 일렉트로포레이션법 (Tada, et al., 1990, Theor. Appl. Genet, 80 : 475), 폴리에틸렌글리콜법 (Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81 : 437), 파티클 건법 (Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5 : 27), 폴리카티온법 (Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29 ; 428(3) : 235-40.) 등의 방법을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에서 사용하는 벡터를 숙주 세포에 도입한 후, 선택 마커의 표현형에 따라 상기 형질 전환체를 선발할 수 있다. 또, 선발한 형질 전환체를 배양함으로써, 상기 융합 단백질을 생산할 수 있다. 배양에 사용하는 배지 및 조건은, 형질 전환체의 종 (種) 에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또, 숙주 세포가 식물 세포인 경우에는, 선발한 식물 세포를 통상적인 방법에 따라 배양함으로써, 식물체를 재생시킬 수 있고, 식물 세포 내 또는 식물 세포의 세포막 외에 상기 융합 단백질을 축적시킬 수 있다. 예를 들어, 식물 세포의 종류에 따라 상이하지만, 감자라면 Visser 들 (Theor. Appl. Genet 78 : 594 (1989)) 의 방법을 들 수 있고, 담배라면 Nagata 와 Takebe (Planta 99 : 12 (1971)) 의 방법을 들 수 있다.
양상추의 경우에는, 예를 들어 0.1 ㎎/ℓ의 NAA (나프탈렌아세트산), 0.05 mg/ℓ 의 BA (벤질아데닌) 및 0.5 g/ℓ 의 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 MS 배지에서 슈트의 재생이 가능하고, 재생한 슈트를 0.5 g/ℓ 의 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 1/2 MS 배지에서 배양함으로써 발근 (發根) 이 가능하다.
또, 상기와 같이 하여 재생한 식물체로부터 종자를 채취하고, 그것을 적당한 방법으로 파종하여 재배함으로써, 상기 융합 단백질을 생산하는 식물체로 할 수 있고, 이와 같은 식물체도, 상기 형질 전환체에 포함된다.
아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) 은 식물의 상처로 감염시키는 것으로, 종양 유발성의 Ti (tumor-inducing) 플라스미드라고 불리는 큰 염색체 외인자를 운반한다. 많은 연구소에 있어서, 수년에 걸친 예의 연구 후에, 아그로박테리움계의 개발에 의해, 여러 가지 식물 조직을 판에 박은 듯이 형질 전환하는 것이 가능해졌다. 이 기술에 의해 전환된 대표적인 식물로서, 담배, 토마토, 해바라기, 면, 유채씨, 감자, 포플러, 및 대두, 딸기, 벼 등이 있다.
여러 가지 종의 식물에 대하여, 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) 으로 형질 전환된 조직으로부터 식물을 재생하는 것이 실증되어 있다. 이 식물로서, 해바라기, 토마토, 토끼풀, 유채, 코튼, 담배, 감자, 옥수수, 딸기, 벼, 기타 다수의 야채 작물을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 아그로박테리움 Ti 벡터에 의해 상기 양상추를 비롯한 가식 식물을 형질 전환할 수도 있다.
본 발명의 백신은, 상기 융합 단백질을 포함하는 것이면 되고, 상기 융합 단백질을 코드하는 DNA 로 형질 전환된 형질 전환체를 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 백신은, 상기 융합 단백질을 포함하는 형질 전환체 전부를 포함하고 있어도 되고, 일부를 포함하고 있어도 된다. 또, 형질 전환체를 그대로 사용할 수도 있고, 건조, 분쇄하는 등 하여 사용할 수도 있다. 또, 본 발명의 백신에는, 융합 단백질의 면역원성을 더욱 높이는 아쥬반트를 배합할 수도 있다. 일반적으로는, 안전성을 고려하여 수산화알루미늄, 대장균의 부착 인자, 예를 들어 대장균의 섬모 등이 아쥬반트로서 사용된다.
본 발명의 백신을 투여함으로써, 항원 펩티드에 대한 면역을 높일 수 있고, 항원 펩티드가 유래하는 병원체가 일으키는 질병의 방제 효과를 기대할 수 있다. 예를 들어, ST 를 항원 펩티드에 사용하는 경우, 대장균성 설사증에 대한 방제 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 면역 증강 방법은, 상기 DNA 구축물로 형질 전환된 식물체 등의 형질 전환체 또는 그 건조물 혹은 분쇄물을 동물에게 투여하는 것을 특징으로 한다. 투여 대상으로는, 돼지, 소, 닭, 양, 염소, 개, 고양이 등의 비인간 포유 동물이나 어류를 들 수 있다. 또 대상 질병으로는, 돼지라면 브루셀라병, 탄저, 파상풍, 돼지 단독, 돼지 적리, 살모넬라증, 대장균증, 위축성 비염, 악티노바실루스증, 마이코플라스마 감염증, 돼지 전염성 위장염, 돼지 유행성 설사 발증, 돼지 인플루엔자, 일본 뇌염, 아우제스키병, 구제역, 돼지 수포병, 돼지 콜레라, 돼지 백혈병, 돼지 생식기ㆍ호흡기 증후군, 로타바이러스, 회충증, 폐충증, 톡소플라스마증, 콕시듐병 등을 들 수 있다. 소의 대상 질병으로는, 우폐역 (牛肺疫), 탄저병, 출혈성 패혈증, 브루셀라병, 결핵병, 살모넬라증, 파상풍, 우역 (牛疫), 구제역, 유행성 뇌염, 광견병, 수포성 구염, 리프트 밸리병, 요네병, 블루텅, 아카바네병, 츄잔병, 럼피스킨병, 소 바이러스성 설사, 소 백혈병, 피로플라스마병, 아나플라스마병 등을 들 수 있다. 닭의 대상 질병으로는 살모네라 감염증, 마이코플라스마병, 닭 대장균증, 헤모필루스, 뉴캐슬병, 고병원성 조류 인플루엔자, 독 닭 전염성 기관지염, 계두 (鷄痘), 닭 뇌척수염, 콕시듐병 등을 들 수 있다. 염소의 대상 질병으로서, 탄저병, 브루셀라병, 결핵병, 츄잔병, 구제역, 아카바네병 등을 들 수 있다. 개의 대상 질병으로서, 렙토스피라, 세균성 장염, 광견병, 파보바이러스 감염증, 디스템퍼 바이러스 감염증, 개 전염성 기관지염 (켄넬코프), 코로나 바이러스 감염증, 헤르페스바이러스 감염증, 바베시아증 등을 들 수 있다. 고양이의 대상 질병으로서, 고양이 헤모플라스마 감염증, 리케차 감염증, 광견병, 고양이 백혈병 바이러스 감염증, 고양이 헤르페스바이러스 감염증, 고양이 면역 부전 바이러스 (FIV) 감염증, 고양이 칼리시바이러스 감염증, 고양이 바이러스성 코 기관염 (FVR), 고양이 필라리아 등을 들 수 있다. 물고기의 대상 질병으로서, 연쇄구균, 비브리오병, 이리도바이러스 감염증 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신을 돼지에게 투여하는 경우, 예를 들어, 포유기 ∼ 120 일령의 돼지에게 투여할 수 있고, 포유기 ∼ 90 일령의 돼지에 대해 투여를 실시하는 것이 바람직하고, 또 번식기 전후의 어미 돼지에 대해 투여를 실시하는 것이 바람직하다. 면역의 방법으로는, 상기 DNA 구축물로 형질 전환된 식물체를 어미 돼지에게 투여하여, 어미 돼지가 산생한 항체를, 젖에 의해 새끼 돼지에게 주는 방법, 상기 DNA 구축물로 형질 전환된 식물체를 포유기 ∼ 90 일령의 새끼 돼지에게 투여하여, 새끼 돼지를 직접 면역하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신을 돼지 등의 동물에게 투여하는 방법으로는, 돼지의 사료에, 상기 DNA 구축물로 형질 전환된 식물체 또는 그 건조물 혹은 분쇄물을 혼합해서 주는 방법, 점비 (点鼻) 하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 백신은, 일정한 간격을 두고, 복수 회 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 4 ∼ 7 일 간격으로, 합계 2 ∼ 3 회 투여하는 방법을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
＜대장균 발현용 백신 유전자의 구축＞
백신 항원 후보로서 1) 독소원성 대장균이 생산하는 이열성 독소의 무독 B 서브유닛 (LTB : 서열 번호 12), 2) 독소원성 대장균이 생산하는 STp 독소의 무독화 변이체 (NTFYCCELCCNPLCAGCY (서열 번호 16), 이하 mSTp) (Sato et al., 1994), 3) 장관 출혈성 대장균이 생산하는 시가 독소 2e 의 무독 B 서브유닛 (Stx2eB) 을 사용하였다. 이 때, Stx2eB 는 당사슬 무 Stx2eB (N 말단에서부터 73 번째의 아스파라긴을 세린으로 치환) (서열 번호 10) 를 사용하였다. mSTp 를 코드하는 DNA 는 STpA13L-F (5'-gatcc aac acc ttc tac tgc tgc gag ttg tgc tgc-3' : 서열 번호 23) 와 STpA13L-R (5'-gatct gta gca gcc ggc gca caa ggg gtt gca gca caa ctc : 서열 번호 24) 을 사용하여 증폭시켰다.
LTB 와 mSTp 를 PG12 링커 (Matsui et al, Transgenic Res, 2011, 20 : 735-48 : 서열 번호 2) 를 개재하여 융합한 LTB-mSTp (서열 번호 18), LTB 와 Stx2eB 를 이 순서 또는 반대의 순서로 융합하고, 또한 그것들의 C 말단에 mSTp 를 융합한 LTB-Stx2eB-mSTp (서열 번호 20), Stx2eB-LTB-mSTp (서열 번호 22) 를 각각 구축하였다. 근방 서열 개변형 NtADH 5'-UTR (서열 번호 31) 과 장사슬형 AtHSP 터미네이터 (Matsui et al., Plant Biotech., 2014, 31 : 191-194 : 서열 번호 32) 를 사용하였다. 또한 담배 유래 β-D-글루칸 엑소히드롤라제 분비 시그널 펩티드 코드 서열 (서열 번호 27) 을 사용함으로써 콤비네이션화 백신 항원 후보 단백질의 고축적화를 도모하였다. 구축한 유전자 카세트는 바이너리 벡터 pRI909 (TAKARA) 에 도입하여, 양상추의 형질 전환에 사용하였다 (도 1).
＜아그로박테리움에 의한 양상추로의 유전자 도입＞
양상추 (Lactuca sativa L.) 품종 그린 웨이브 (타키이 종묘) 를 MS 배지 [1/2 × 무라시게ㆍ스쿠그 배지용 혼합 염류 (MS 염, 와코 순약 공업), 1 × Murashige and Skoog 비타민 용액 (MS 비타민, Sigma-Aldrich), 3 ％ 자당, 0.8 ％ 한천, pH 5.8] 에 무균 파종 후, 10 ∼ 16 일째의 본엽을 가로세로 5 ㎜ 정도로 절단하고, 그 절편을 벡터 콘스트럭트를 갖는 바이너리 플라스미드 (pRI909) 를 유지하는 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefacience EHA105) 현탁액에 10 분간 침지 후, 공존 배지 [1 × MS 염, 1 × MS 비타민, 0.05 mg/ℓ 6-벤질아미노푸린 (BA), 0.1 mg/ℓ 1-나프틸아세트산 (NAA), 0.1 M 아세토시린곤, 3 ％ 자당, 0.8 ％ 한천, pH 5.8] 에 치상 (置床) 하고, 25 ℃, 어두운 곳에서 2 일간 배양하였다. 절편을 멸균수로 세정 후, 선발 배지 [1 × MS 염, 1 × MS 비타민, 0.05 mg/ℓ BA, 0.1 mg/ℓ NAA, 0.5 g/ℓ 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 50 mg/ℓ 카나마이신 (Km), 250 ㎎ 세포탁심 (Cef), 3 ％ 자당, 0.8 ％ 한천, pH 5.8] 에 치상하고, 25 ℃, 형광등하 (2000 ∼ 3000 lux) 에서 배양을 실시하였다. 이후, 부정싹이 얻어질 때까지 3 ∼ 4 일 동안에 1 회 (2 회/주) 의 간격으로 새로운 선발 배지로의 이식을 실시하였다. 부정싹으로부터 형성된 재분화 개체는 발근 배지 [1/2 × MS 염, 1 × MS 비타민, 0.5 g/ℓ PVP, 250 ㎎ Cef, 3 ％ 자당, 0.8 ％ 한천, pH 5.8] 에 이식하고, 동일 조건에서 배양을 실시하였다. 이후, 3 ∼ 4 일 동안에 1 회 (2 회/주) 의 간격으로 새로운 발근 배지로의 이식을 실시하였다. 발근한 재분화 개체는 화분에 심고, 동일 조건에서 재배를 실시하였다.
＜양상추로부터의 단백질 추출＞
단백질 추출은 TCA-아세톤 법 (Shultz et al. Plant Mol Biol Rep, 2005, 23 : 405) 에 따라, 액체 질소 동결 후, -80 ℃ 에서 보존한 유전자 도입 양상추 본엽을 사용하여 실시하였다. 100 ∼ 200 ㎎ 의 샘플을 TissueLyzer II (QIAGEN) 를 사용하여 파쇄 후, 샘플의 5 배량의 TCA-아세톤 (10 ％ 트리클로로 아세트산, 90 ％ 아세톤, 0.07 ％ 2-메르캅토에탄올) 을 첨가, 혼합하고, -20 ℃ 에서 1 시간 정치 (靜置) 후, 16,000 × g, 4 ℃, 30 분간 원심 조작을 실시하고, 상청을 제거하여, 단백질을 포함하는 침전을 얻었다. 또한 협잡물을 제거하기 위해서, 샘플의 5 배량의 아세톤/BME (100 ％ 아세톤, 0.07 ％ 2-메르캅토에탄올) 를 첨가, 혼합하고, 16,000 × g, 4 ℃, 10 분간 원심 조작을 실시하여, 상청을 제거하였다. 본 협잡물 제거 조작은 추가로 2 회 실시하였다. 침전은 감압 건조 후, 샘플의 2 배량의 추출 I 버퍼 [0.5 M 염화나트륨, 5 mM 이미다졸, 6 M 우레아, 20 mM 트리스하이드록시메틸아미노메탄 (Tris)-HCl, pH 7.9] 에 현탁시키고, 16,000 × g, 4 ℃, 10 분간 원심을 실시하여, 상청을 회수, 단백질 용액을 얻었다. 단백질 농도의 측정은, Protein Assay Kit II (Bio-Rad) 를 사용하여 실시하였다.
＜웨스턴 해석＞
얻어진 단백질 용액을 마이크로튜브에 적당량 넣고, 동량의 샘플 버퍼 (EZ Apply, ATTO 제조) 를 첨가하여 혼합하고, 비등수 중에서 5 분간 가온하여, 샘플의 SDS 화를 실시하였다. 단백질 정량시의 표준 물질에는 정제 LTB+ 를 사용하였다. 이것을 추출 I 버퍼로 2 배 희석을 반복함으로써 희석 계열을 제작하고, 이들 희석 계열을 스탠더드로서 사용하였다.
단백질의 전기 영동 (SDS-PAGE) 은, 전기 영동조 (미니 프로티언 Tetra 셀) 및 미니 프로티언 TGX-겔 (BIO RAD) 을 사용하였다. 전기 영동 버퍼 (EZ Run, ATTO 제조) 를 넣고, 웰에 SDS 화한 샘플을 5 ㎕ 어플라이하고, 200 V 정전압으로 40 분간 실시하였다.
전기 영동 후의 겔은, 트랜스블롯 전사 팩 (BIO RAD) 을 사용하여, 트랜스블롯 Turbo (BIO RAD) 로 블롯팅을 실시하였다.
블롯팅 후의 멤브레인은 블로킹 용액 (TBS 계, pH 7.2, 나카라이 테스크) 에 침지시키고, 실온에서 1 시간 진탕 또는 4 ℃ 에서 16 시간 정치 후, TBS-T (137 mM 염화나트륨, 2.68 mM 염화칼륨, 1 ％ 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4) 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하여 세정하였다. LTB 단백질의 검출에는, 항혈청 토끼-항혈청 항-LTp 991109 (불활성) (0.1 ％ NaN3) AO 를 TBS-T 로 10,000 배 희석하여 사용하였다. 본 희석액 중에 멤브레인을 침지시키고, 실온에서 2 시간 진탕함으로써 항원 항체 반응을 실시하고, TBS-T 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하여 세정하였다. 2 차 항체에는 TBS-T 로 10,000 배 희석한 항-토끼 IgG, AP-결합 항체 (Cell Signaling TECHNOLOGY) 를 사용하였다. 본 희석액 중에 멤브레인을 침지시키고, 실온에서 1 시간 진탕함으로써 항원 항체 반응을 실시하고, TBS-T 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하여 세정하였다. 알칼리 포스파타아제에 의한 발색 반응은, 발색액 (0.1 M 염화나트륨, 5 mM 염화마그네슘, 0.33 ㎎/㎖ 니트로블루테트라졸륨, 0.33 ㎎/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-인산, 0.1 M Tris-HCl, pH 9.5) 중에 멤브레인을 침지시키고, 실온에서 7 분간 진탕함으로써 실시하고, 멤브레인을 증류수로 세정한 후, 상온에서 건조시켰다.
발색된 멤브레인은 스캐너 (PM-A900, 엡손) 에 의해 해상도 600 dpi 로 화상화하고, 화상 해석 소프트 (CS Analyzer ver. 3.0, 아토) 를 사용하여, LTB 단백질의 정량을 실시하였다.
＜재조합 양상추의 마우스 경구 면역＞
6 주령의 Balb/c 암컷 마우스를 도입하고, 순화, 면역 전 채혈을 실시하고, 8 주령부터 면역을 개시하였다. 730 ㎍ 상당의 LTB 가 포함되는 재조합 양상추 가루를 생리 식염수로 현탁 후, 위 존데를 사용하여 경구 투여하였다. 경구 투여는 7 일마다 4 회 실시하였다 (도 2). 장관 세정액의 채취는, 소장 회맹부로부터 5 ㎝ 를 잘라내고 5 ㎖ 의 PBS 로 세정하였다. 사용시까지 -80 ℃ 에서 보존하고, 항체가 측정시에는 프로테아제 저해제를 첨가하였다.
＜항체가의 측정＞
항체가의 측정은, 2.5 ㎍/㎖ 의 항원을 100 ㎕/웰 로 고상화한 ELISA 플레이트 (Maxisorp : Nunc) 를 사용하여 실시하였다. 항원은, 항 Stx2eB 항체에 관해서는 정제한 무독화 Stx2eB 를, 항 LTp 항체에 관해서는 정제한 LTp 를, 항mSTp 항체에 관해서는 합성 STp 펩티드를 각각 사용하였다. 피험 혈청은 소 혈청 알부민 (0.1 ％w/v) 을 포함하는 희석액으로 2 배 희석열을 제작하여, ELISA 플레이트에 어플라이하였다. 2 차 항체에는 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 표지 항체를 사용하고, 기질에 과산화수소, ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)) 를 사용한 발색법으로 검출하였다. 음성 컨트롤인 희석액에 대한 흡광도 평균의 2 배의 값 이상의 흡광도를 항체가 양성으로 하고, 양성이 되는 최대 희석률을 그 혈청의 항체가로 하였다. 면역 전 혈청에 대하여 항체가가 검출된 경우에는 면역 전 혈청의 항체가 값을 나눈 값을 당해 혈청의 항체가로 하였다.
＜결과＞
(1) 유전자 재조합 식물의 작출
도 1 에 나타내는 컨스트럭트를 사용하여 유전자 재조합 양상추를 작출하였다. LTB-mSTp 도입 양상추에서는 추정 분자량 (약 15 kDa) 의 위치에 밴드가 검출되었다 (도 3A). LTB-Stx2eB-mSTp 와 Stx2eB-LTB-mSTp 도입 양상추에서는 추정 분자량 (약 24 kDa) 의 위치에 밴드가 검출되었다 (도 3B). 또 LTB 로의 당사슬 부가에서 유래하는 것으로 추정되는 시그널도 검출되었다. 도 3C 에 각 콤비네이션 백신 항원의 축적량을 나타낸다.
(2) 유전자 재조합 백신 식물의 마우스 경구 면역
(1) 에서 작출한 유전자 재조합 양상추를 동결 건조 및 분쇄하여, 마우스에 경구 투여하였다. 투여 분말량은 LTB 등량으로 동일하게 하였다. 부검시에 소장 세정액을 회수하고, 항 STp IgA 항체가를 측정한 결과, LTB-mSTp 투여군에서는 항체가 상승이 보인 개체 비율은 10 마리 중 3 마리였음에 반해, LTB-Stx2eB-mSTp 및 Stx2eB-LTB-mSTp 투여군에서는 각각 7 마리, 4 마리에서 명료한 항체 유도가 확인되었다 (도 4). 또 항체가 타이터도, LTB-mSTp 보다 LTB-Stx2eB-mSTp 와 Stx2eB-LTB-mSTp 군에서 높은 값을 나타냈다.
실시예 2
＜유전자 구축＞
이하의 각 질병에 대한 백신 항원을 LTB-Stx2eB 에 융합하였다. 먼저 LTB-Stx2eB 융합 유전자를 pYES2 (invitrogen) 에 도입하였다.
개 파보바이러스 중화 에피토프로서 캡시드 단백질 VP2 의 중화 에피토프에서 유래하는 서열 (SDGAVQPDGGQPAVRNE : 서열 번호 33) 을 사용하였다 (Casal et al., Journal of Virology, 1995, 69, 7274-7277). 본 에피토프는 주간 (株間) 에서의 보존성이 높은 서열이다. 예를 들어 DNA 서열은 5'-tcggacggcgcggtgcagccggacggcggccagccggcggtgcggaacgag-3' (서열 번호 34) 로 나타내어진다.
본 중화 에피토프 영역 DNA 를, CP-F 프라이머 (5'-TGGTTCTCCTAGATCC TCG GAC GGC GCG GTG CAG CCG GAC GGC GGC CAG CCG GCG GTG-3' : 서열 번호 35) 와 CP-R 프라이머 (5'-CCTTAGAGCTCCCGGGTACTATCAGTCCTT CTC GTT CCG CAC CGC CGG CTG GCC GCC-3' : 서열 번호 36) 를 어닐링하고, DNA 폴리머라제로 신장 반응을 실시하여 제작하였다. 또 Stx2eB 의 하류 영역에 상당하는 단편을 2eB-Sal-F 프라이머 (5'-GGTCACGATCATCTCGTCGACGTGCTCGTC-3' : 서열 번호 37) 와 PG-R 프라이머 (5'-GGATCTAGGAGAACCAGGACCAGAACCAGGTCC-3' : 서열 번호 38) 및 주형으로서 pYES2 LTB-Stx2eB 를 사용하여 PCR 을 실시하여 증폭시켰다. 얻어진, 중화 에피토프 단편과 Sts2eB 단편을, 상동 재조합에 의해 GeneArt Seamless PLUS Cloning and Assembly Kits (Invitrogen) 를 사용하여 pYES2 LTB-Stx2eB 에 도입하여 C 말단에 항원 영역을 부가하였다 (도 5).
돼지 파보바이러스 중화 에피토프로서 캡시드 단백질 VP2 의 중화 에피토프에서 유래하는 서열 (VEQHNPINAGTELSAT : 서열 번호 39) 을 사용하였다 (Kamstrup et al., Virus Research, 1998, 53, 163-173). 본 에피토프는 주간에서의 보존성이 높은 서열이다. 예를 들어 DNA 서열은 5'-gtggagcagcacaaccccatcaacgccggcaccgagctgtccgccacc-3' (서열 번호 40) 로 나타내어진다.
본 중화 에피토프 영역 DNA 를, PP-F 프라이머 (5'-TGGTTCTCCTAGATCC gtg gag cag cac aac ccc atc aac gcc ggc acc gag ctg-3' : 서열 번호 41) 와 PP-R 프라이머 (5'-CCTTAGAGCTCCCGGGTACTATCAGTCCTT ggt ggc gga cag ctc ggt gcc ggc gtt gat-3' : 서열 번호 42) 를 어닐링하고, DNA 폴리머라제로 신장 반응을 실시하여 제작하였다. 얻어진, 중화 에피토프 단편과 전술한 Sts2eB 단편을, 상동 재조합에 의해 GeneArt Seamless PLUS Cloning and Assembly Kits (Invitrogen) 를 사용하여 pYES2 LTB-Stx2eB 에 도입하여 C 말단에 항원 영역을 부가하였다.
고양이 면역 부전 바이러스 중화 에피토프로서 엔벨로프 단백질 gp120 의 중화 에피토프에서 유래하는 서열 (GSWMRAISSWRHRNRWEWRPDF : 서열 번호 43) 을 사용하였다 (Lombardi et al., Journal of Virology, 1993, 67, 4742-4749). 본 에피토프는 주간에서의 보존성이 높은 서열이다. 예를 들어 DNA 서열은 5'-ggctcctggatgagggccatctcctcctggaggcacaggaacaggtgggagtggaggcccgacttc-3' (서열 번호 44) 로 나타내어진다.
본 중화 에피토프 영역 DNA 를, FIV-F 프라이머 (5'-TGGTTCTCCTAGATCC ggc tcc tgg atg agg gcc atc tcc tcc tgg agg-3' : 서열 번호 45), FIV-M 프라이머 (5'-ctc cca cct gtt cct gtg cct cca gga gga gat ggc-3' : 서열 번호 46) 와 FIV-R 프라이머 (5'-CCTTAGAGCTCCCGGGTACTATCAGTCCTT gaa gtc ggg cct cca ctc cca cct gtt cct gtg-3' : 서열 번호 47) 를 어닐링하고, DNA 폴리머라제로 신장 반응을 실시하여 제작하였다. 얻어진, 중화 에피토프 단편과 전술한 Sts2eB 단편을, 상동 재조합에 의해 GeneArt Seamless PLUS Cloning and Assembly Kits (Invitrogen) 를 사용하여 pYES2 LTB-Stx2eB 에 도입하여 C 말단에 항원 영역을 부가하였다.
돼지 유행성 설사 바이러스 중화 에피토프로서 스파이크 단백질의 중화 에피토프에서 유래하는 2 종류의 서열 (YSNIGVCK : 서열 번호 48) (Chen et al., Viruses, 2013, 5, 2601-2613) 과 (RGPRLQPYE : 서열 번호 49) (Deu et al., Virus Research 2008, 132, 192-196) 을 융합한 서열 (YSNIGVCKSSRGPRLQPYE : 서열 번호 50) 을 사용하였다. 본 에피토프는 주간에서의 보존성이 높은 서열이다. 예를 들어 DNA 서열은 5'-tactccaacatcggcgtctgcaagtcctcccggggcccccggttgcagccctacgag-3' (서열 번호 51) 로 나타내어진다.
본 중화 에피토프 영역 DNA 를, PED-F 프라이머 (5'-TGGTTCTCCTAGATCC tac tcc aac atc ggc gtc tgc aag tcc tcc cgg ggc ccc cgg-3' : 서열 번호 52) 와 PED-R 프라이머 (5'-CCTTAGAGCTCCCGGGTACTATCAGTCCTT CTC GTA GGG CTG CAA CCG GGG GCC CCG GGA GGA CTT-3' : 서열 번호 53) 를 어닐링하고, DNA 폴리머라제로 신장 반응을 실시하여 제작하였다. 얻어진, 중화 에피토프 단편과 전술한 Sts2eB 단편을, 상동 재조합에 의해 GeneArt Seamless PLUS Cloning and Assembly Kits (Invitrogen) 를 사용하여 pYES2 LTB-Stx2eB 에 도입하여 C 말단에 항원 영역을 부가하였다.
돼지 로타바이러스 A 형 백신 항원 후보로서 VP7 단백질의 에피토프에서 유래하는 2 종류의 서열 (TEASTQIGDTEWKN : 서열 번호 54) 과 (TTNPATFEEVAKNEKL : 서열 번호 55) (Nishikawa et al., Virology, 1989, 171, 503-515) 를 융합한 서열 (TEASTQIGDTEWKNSTTNPATFEEVAKNEKL : 서열 번호 56) 을 사용하였다. 예를 들어 DNA 서열은 5'-accgaggcctccacccagatcggcgacaccgagtggaagaactccaccaccaaccccgccaccttcgaggaggtggccaagaacgagaagttg-3' (서열 번호 57) 로 나타내어진다.
본 영역 DNA 를, RoA7-F 프라이머 (5'-TGGTTCTCCTAGATCC acc gag gcc tcc acc cag atc ggc gac acc gag tgg aag aac tcc acc acc aac ccc gcc-3' : 서열 번호 58), RoA7-M 프라이머 (5'-ggc cac ctc ctc gaa ggt ggc ggg gtt ggt ggt gga-3' : 서열 번호 59) 와 RoA7-R 프라이머 (5'-CCTTAGAGCTCCCGGGTACTATCAGTCCTT CAA CTT CTC GTT CTT GGC CAC CTC CTC GAA GGT GGC-3' : 서열 번호 60) 를 어닐링하고, DNA 폴리머라제로 신장 반응을 실시하여 제작하였다. 얻어진, 중화 에피토프 단편과 전술한 Sts2eB 단편을, 상동 재조합에 의해 GeneArt Seamless PLUS Cloning and Assembly Kits (Invitrogen) 를 사용하여 pYES2 LTB-Stx2eB 에 도입하여 C 말단에 항원 영역을 부가하였다.
돼지 로타바이러스 C 형 백신 항원 후보로서 VP7 단백질의 에피토프에서 유래하는 2 종류의 서열 (NAAIGSPGPGKADGLLNDNNYAQ : 서열 번호 61) 과 (SPASTETYEVVSNDTQL : 서열 번호 62) 를 융합한 서열 (NAAIGSPGPGKADGLLNDNNYAQSSPASTETYEVVSNDTQL : 서열 번호 63) 을 사용하였다. 예를 들어 DNA 서열은 5'-aacgccgccatcggctcccccggccccggcaaggccgacggcctgctgaacgacaacaactacgcccagtcctcccccgcctccaccgagacctacgaggtggtgtccaacgacacccagctg-3' (서열 번호 64) 로 나타내어진다.
본 영역 DNA 를, RoC7-F 프라이머 (5'-TGGTTCTCCTAGATCC aac gcc gcc atc ggc tcc ccc ggc ccc ggc aag gcc gac ggc ctg ctg aac gac aac-3' : 서열 번호 65), RoC7-M 프라이머 (5'-cac cac ctc gta ggt ctc ggt gga ggc ggg gga gga ctg ggc gta gtt gtt gtc gtt cag cag gcc gtc-3' : 서열 번호 66) 와 RoC7-R 프라이머 (5'-CCTTAGAGCTCCCGGGTACTATCAGTCCTT cag ctg ggt gtc gtt gga cac cac ctc gta ggt ctc ggt-3' : 서열 번호 67) 를 어닐링하고, DNA 폴리머라제로 신장 반응을 실시하여 제작하였다. 얻어진, 중화 에피토프 단편과 전술한 Sts2eB 단편을, 상동 재조합에 의해 GeneArt Seamless PLUS Cloning and Assembly Kits (Invitrogen) 를 사용하여 pYES2 LTB-Stx2eB 에 도입하여 C 말단에 항원 영역을 부가하였다.
＜효모의 형질 전환과 단백질 발현＞
효모 (Saccharomyces cerevisiae INVSc1, Invitrogen) 는 이하와 같이 형질 전환하였다. 효모를 YPD 배지 (1 ％ yeast extract, 2 ％ peptone, 2 ％ dextrose (D-글루코스)) 에서 30 ℃, 200 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양하였다. 10 ㎖ 의 YPD 중에 OD600 이 0.2 ∼ 0.4 가 되도록 희석한 후, OD600 이 0.6 ∼ 1.0 이 될 때까지 30 ℃, 200 rpm 으로 진탕 배양하였다. 500 × g, 실온에서 5 분간 원심하고, 세포를 펠릿으로 하고, 상청을 버렸다. 10 ㎖ 의 Solution I (S.c. EasyComp Transformation Kit, Invitrogen) 에 현탁시켰다. 500 × g, 실온에서 5 분간 원심하고, 세포를 펠릿으로 하고, 상청을 버렸다. 1 ㎖ 의 Solution II (S.c. EasyComp Transformation Kit, Invitrogen) 에 현탁시키고, 50 ㎕ 씩 분주하여, 컴피턴트 셀로 하였다. 사용할 때까지 -80 ℃ 의 냉동고에 보관하였다 (세포벽에 데미지를 주기 때문에 액체 질소에 의해 급속 냉동은 실시하지 않는다).
얻어진 컴피턴트 셀을 융해하여 실온으로 되돌리고, 1 ㎍ 의 pYES 플라스미드를 첨가한 후, 500 ㎕ 의 Solution III (실온) 을 첨가하여 보텍스하였다. 30 ℃ 에서 1 시간 진탕하였다 (15 분마다 보텍스를 실시하였다). 1 ㎖ 의 YPD 배지를 첨가하고, 30 ℃ 에서 1 시간 진탕 배양하였다. 3,000 × g, 실온에서 5 분간 원심하고, 세포를 펠릿으로 하여 상청을 제거하였다. 100 ㎕ 의 Solution III 에 현탁하고, 2 ％ 글루코스를 포함하는 SC-Ura 배지 (6.7 g/ℓ 효모 질소 베이스, 0.1 g/ℓ 아데닌, 0.1 g/ℓ 아르기닌, 0.1 g/ℓ 시스테인, 0.1 g/ℓ 류신, 0.1 g/ℓ 리신, 0.1 g/ℓ 트레오닌, 0.1 g/ℓ 트립토판, 0.05 g/ℓ 아스파르트산, 0.05 g/ℓ 히스티딘, 0.05 g/ℓ 이소류신, 0.05 g/ℓ 메티오닌, 0.05 g/ℓ 페닐알라닌, 0.05 g/ℓ 프롤린, 0.05 g/ℓ 세린, 0.05 g/ℓ 티로신, 0.05 g/ℓ 발린) 에 플레이팅하였다. 30 ℃ 에서 2 ∼ 4 일 정치 배양하였다.
효모에 있어서의 단백질 발현은 이하와 같이 실시하였다. 형질 전환 효모의 싱글 콜로니를 2 ％ 라피노오스를 포함하는 SC-Ura 배지를 사용하여 30 ℃, 200 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양하였다. 배지 10 ㎖ 의 OD600 을 0.4 로 하는 데에 필요한 효모 세포를 원심 (1,500 × g, 실온에서 5 분간) 으로 모아, 2 ％ 갈락토오스를 포함하는 SC-Ura 10 ㎖ 에 현탁하여, 발현 유도하였다. 30 ℃, 200 rpm 으로 진탕 배양하고, 시간이 경과함에 따라 샘플링을 실시하였다.
＜웨스턴 해석＞
얻어진 효모 배양액 200 ㎕ 와, 동량의 샘플 버퍼 (EZ Apply, ATTO 제조) 를 첨가하여 혼합하고, 비등수 중에서 5 분간 가온하여, 샘플의 SDS 화를 실시하였다. 단백질의 전기 영동 (SDS-PAGE) 은, 전기 영동조 (미니 프로티언 Tetra 셀) 및 미니 프로티언 TGX-겔 (BIO RAD) 을 사용하였다. 전기 영동 버퍼 (EZ Run, ATTO 제조) 를 넣고, 웰에 SDS 화한 샘플을 5 ㎕ 어플라이하고, 200 V 정전압으로 40 분간 실시하였다.
전기 영동 후의 겔은, 트랜스블롯 전사 팩 (BIO RAD) 을 사용하여, 트랜스블롯 Turbo (BIO RAD) 로 블롯팅을 실시하였다.
블롯팅 후의 멤브레인은 블로킹 용액 (TBS 계, pH 7.2, 나카라이 테스크) 에 침지시키고, 실온에서 1 시간 진탕 또는 4 ℃ 에서 16 시간 정치 후, TBS-T (137 mM 염화나트륨, 2.68 mM 염화칼륨, 1 ％ 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4) 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하여 세정하였다. 백신 단백질의 검출에는, 항 Stx2eB 모노클로날 항체를 TBS-T 로 2,000 배 희석하여 사용하였다. 본 희석액 중에 멤브레인을 침지시키고, 실온에서 2 시간 진탕함으로써 항원 항체 반응을 실시하여, TBS-T 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하여 세정하였다. 2 차 항체에는 TBS-T 로 2,000 배 희석한 항-랫트 IgG, AP-결합 항체 (Promega) 를 사용하였다. 본 희석액 중에 멤브레인을 침지시키고, 실온에서 1 시간 진탕함으로써 항원 항체 반응을 실시하고, TBS-T 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하여 세정하였다. 알칼리 포스파타아제에 의한 발색 반응은, 발색액 (0.1 M 염화나트륨, 5 mM 염화마그네슘, 0.33 ㎎/㎖ 니트로블루테트라졸륨, 0.33 ㎎/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-인산, 0.1 M Tris-HCl (pH 9.5)) 중에 멤브레인을 침지시키고, 실온에서 7 분간 진탕함으로써 실시하고, 멤브레인을 증류수로 세정한 후, 상온에서 건조시켰다.
＜결과＞
유전자 재조합 효모에 있어서의 각 융합 항원의 발현을 도 6 에 나타낸다. 어느 백신이나 단백질의 축적이 확인되었다.
실시예 3
＜유전자 구축＞
실시예 2 에 기재된 방법과 동일하게 하여 LTB-Stx2eB 의 C 말단에 개 파보바이러스 중화 에피토프로서 캡시드 단백질 VP2 의 중화 에피토프에서 유래하는 서열 (SDGAVQPDGGQPAVRNE : 서열 번호 33) (이하 VP2 라고 표기) 을 연결하고, 또한 정제용의 태그로서 6 × His 를 융합하고, 분비 시그널 펩티드를 부가한 융합 단백질 (LBVP2) 을 발현시키기 위한 유전자 구축물을 제작하였다. 이 유전자 구축물을 대장균용 발현 벡터 pET15b 에 삽입하였다. 얻어진 발현 벡터를 대장균 BL21 pLys 주에 형질 전환하였다.
＜대장균을 사용한 재조합 단백질의 발현＞
재조합 플라스미드를 갖는 대장균의 콜로니를 100 mg/ℓ 의 암피실린을 포함하는 2 × YT 배지 5 ㎖ 를 넣은 시험관 4 개에 식균하고, 180 rpm, 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 이 전 배양액 20 ㎖ 를 100 mg/ℓ 의 암피실린을 포함하는 2 × YT 배지 1 ℓ 에 식균하고, 180 rpm, 37 ℃ 에서 O.D.600 이 0.4 정도가 될 때까지 배양하였다. 종농도 1 mM 의 IPTG 를 첨가하고, 22 ℃, 120 rpm 으로 4 시간 배양하였다. 배양액을 8,000 rpm, 5 분간 원심하고, 얻어진 균체를 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 보관하였다.
＜대장균으로부터의 가용성 단백질의 조제＞
배양액 1 ℓ 상당 균체에 대해 100 ㎖ 의 용해액 (10 ㎖ Bug buster, 90 ㎖ 평형 버퍼, 500 ㎖ DNaseI) 을 첨가하고, 실온에서 30 분간 용균을 실시한 후, 8,000 rpm, 4 ℃ 에서 15 분간 원심 분리를 실시하였다. 상청을 새로운 원심관으로 옮겨, 추가로 동일한 원심 분리를 2 회 실시하였다. 얻어진 상청을 정제에 사용하였다.
＜어피니티 칼럼에 의한 정제＞
TALON (Cobalt) (Clontech) 을 사용한 정제를 실시하였다. 레진 5 ㎖ 를 에코노 팩 칼럼 (BIO-RAD) 에 충전하고, 평형 버퍼 50 ㎖ 를 통과시켜 평형화하였다. 상기 서술한 단백질 용액과 레진을 혼합하고, 실온에서 30 분간 혼합하였다. 이 현탁액을 에코노 팩 칼럼으로 되돌리고, 단백질 용액을 통과시켰다. 5 ㎖ 의 평형 버퍼를 10 회 통과시켜, 비결합 단백질을 세정하였다. O.D.280 을 계측하여, 단백질의 용출이 없는 것을 확인하였다. 용출 버퍼 2 ㎖ 를 첨가하고, 용출액을 2 ㎖ 튜브에 회수하였다. 이 용출 조작을 이후에 9 회 반복하여, 10 개의 용출 획분을 얻었다. 레진을 평형 버퍼로 세정하였다. 도 7 에 나타내는 바와 같이, LBVP2 의 정제를 확인할 수 있었다.
＜토끼에 대한 면역＞
정제된 200 ㎎ 의 항원을 컴플리트 아쥬반트와 함께 토끼 2 마리의 풋 패드에 주사하였다. 4 주간 후에 100 ㎎ 의 항원을 컴플리트 아쥬반트와 함께 토끼 2 마리의 풋 패드에 주사하였다. 면역 전에 전 채혈 (前採血) 을, 초회 면역의 4, 5 주간 후에 도중 채혈 (途中採血) 을, 6 주간 후에 전채혈 (全採血) 을 실시하였다.
＜항체가 측정＞
각 채혈에 대하여 1000, 5000, 25000, 125000 배 희석한 후에, 면역 항원 (LBVP2) 혹은 VP2 합성 펩티드 (MSDGAVQPDGGQPAVRNERATG : 서열 번호 68) 를 고층 (固層) 하여 ELISA 를 실시하였다. 그 결과, LBVP2 및 합성 VP2 펩티드에 대한 항체가의 상승을 확인하였다 (도 8, 9).
실시예 4
＜유전자 재조합 양상추의 작출＞
실시예 2 에 기재된 LTB-Stx2eB 의 C 말단에 개 파보바이러스 중화 에피토프 (이하 VP2 라고 표기) 를 연결한 DNA 단편을, 실시예 1 에 기재된 식물 발현용 벡터인 pRI909 에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 사용하여, 실시예 1 에 기재된 방법으로 유전자 재조합 양상추를 작출하였다. 항 Stx2eB 항체를 사용한 웨스턴 해석을 실시하여, 목적으로 하는 LBVP2 재조합 단백질의 축적을 확인하였다 (도 10). 또, LTB 로의 당사슬 부가에서 유래하는 것으로 생각되는 시그널도 검출되었다.
산업상 이용가능성
본 발명의 융합 단백질은, 축산 등의 분야에서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Idemitsu Kosan Co., Ltd. <120> Antigen for Vaccine with enhanced immunogenicity <130> 150300-16404 <150> JP2015-233714 <151> 2015-11-30 <150> JP2016-023090 <151> 2016-02-09 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA <400> 1 agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcc 36 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 2 Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA <400> 3 agaggacctg gttctggtcc tggttctcct agatct 36 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 4 Arg Gly Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 312 <212> DNA <213> Vibrio cholerae <400> 5 accccccaga acatcaccga cctctgcgcc gagagccaca acacccaaat ctacaccctc 60 aacgacaaga ttttcagcta caccgagagc ctcgccggca agagggagat ggccatcatc 120 accttcaaga acggcgccat cttccaggtc gaggtccccg gcagccagca catcgacagc 180 cagaagaagg ccatcgagag gatgaaggac accctcagga tcgcctacct caccgaggcc 240 aaggtcgaga agctctgcgt ctggaacaac aagacccccc acgccatcgc cgccatcagc 300 atggccaact ga 312 <210> 6 <211> 103 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 6 Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Ser His Asn Thr Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala 20 25 30 Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe 35 40 45 Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala 50 55 60 Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala 65 70 75 80 Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile 85 90 95 Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn 100 <210> 7 <211> 210 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 gcggcggact gcgcgaaggg caagatcgag ttctcgaagt acaacgagga caacacgttc 60 acggtcaagg tctcgggccg cgagtactgg acgaaccgct 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Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys 115 120 125 tac aac gag gac aac acg ttc acg gtc aag gtc tcg ggc cgc gag tac 432 Tyr Asn Glu Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr 130 135 140 tgg acg aac cgc tgg aac ctg cag ccg ctg ctg cag tcg gcg cag ctg 480 Trp Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu 145 150 155 160 acg ggc atg acg gtc acg atc atc tcg tcg acg tgc tcg tcg ggc tcg 528 Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Ile Ser Ser Thr Cys Ser Ser Gly Ser 165 170 175 ggc ttc gcg cag gtc aag ttc aac aga gga cct ggt tct ggt cct ggt 576 Gly Phe Ala Gln Val Lys Phe Asn Arg Gly Pro Gly Ser Gly Pro Gly 180 185 190 tct cct aga tcc aac acc ttc tac tgc tgc gag ttg tgc tgc aac ccc 624 Ser Pro Arg Ser Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro 195 200 205 ttg tgc gcc ggc tgc tac tga 645 Leu Cys Ala Gly Cys Tyr 210 <210> 20 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn 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Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn 1 5 10 15 Glu <210> 34 <211> 51 <212> DNA <213> Canine Parvovirus <400> 34 tcggacggcg cggtgcagcc ggacggcggc cagccggcgg tgcggaacga g 51 <210> 35 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP-F primer <400> 35 tggttctcct agatcctcgg acggcgcggt gcagccggac ggcggccagc cggcggtg 58 <210> 36 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP-R primer <400> 36 ccttagagct cccgggtact atcagtcctt ctcgttccgc accgccggct ggccgcc 57 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2eB-Sal-F primer <400> 37 ggtcacgatc atctcgtcga cgtgctcgtc 30 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PG-R primer <400> 38 ggatctagga gaaccaggac cagaaccagg tcc 33 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Porcine Parvovirus <400> 39 Val Glu Gln His Asn Pro Ile Asn Ala Gly Thr Glu Leu Ser Ala Thr 1 5 10 15 <210> 40 <211> 48 <212> DNA <213> Porcine Parvovirus <400> 40 gtggagcagc acaaccccat caacgccggc accgagctgt ccgccacc 48 <210> 41 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP-F primer <400> 41 tggttctcct agatccgtgg agcagcacaa ccccatcaac gccggcaccg agctg 55 <210> 42 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP-R primer <400> 42 ccttagagct cccgggtact atcagtcctt ggtggcggac agctcggtgc cggcgttgat 60 <210> 43 <211> 22 <212> PRT <213> Feline Immunodeficiency Virus <400> 43 Gly Ser Trp Met Arg Ala Ile Ser Ser Trp Arg His Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Glu Trp Arg Pro Asp Phe 20 <210> 44 <211> 66 <212> DNA <213> Feline Immunodeficiency virus <400> 44 ggctcctgga tgagggccat ctcctcctgg aggcacagga acaggtggga gtggaggccc 60 gacttc 66 <210> 45 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIV-F primer <400> 45 tggttctcct agatccggct cctggatgag ggccatctcc tcctggagg 49 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIV-M primer <400> 46 ctcccacctg ttcctgtgcc tccaggagga gatggc 36 <210> 47 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIV-R primer <400> 47 ccttagagct cccgggtact atcagtcctt gaagtcgggc ctccactccc acctgttcct 60 gtg 63 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Porcine epidemic diarrhea virus <400> 48 Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine epidemic diarrhea virus <400> 49 Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr Glu 1 5 <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine epidemic diarrhea virus <400> 50 Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Ser Arg Gly Pro Arg Leu Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Glu <210> 51 <211> 57 <212> DNA <213> Porcine epidemic diarrhea virus <400> 51 tactccaaca tcggcgtctg caagtcctcc cggggccccc ggttgcagcc ctacgag 57 <210> 52 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PED-F primer <400> 52 tggttctcct agatcctact ccaacatcgg cgtctgcaag tcctcccggg gcccccgg 58 <210> 53 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PED-R primer <400> 53 ccttagagct cccgggtact atcagtcctt ctcgtagggc tgcaaccggg ggccccggga 60 ggactt 66 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Porcine Rotavirus A type <400> 54 Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Gly Asp Thr Glu Trp Lys Asn 1 5 10 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Porcine Rotavirus A type <400> 55 Thr Thr Asn Pro Ala Thr Phe Glu Glu Val Ala Lys Asn Glu Lys Leu 1 5 10 15 <210> 56 <211> 31 <212> PRT <213> Porcine Rotavirus A type <400> 56 Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Gly Asp Thr Glu Trp Lys Asn Ser Thr 1 5 10 15 Thr Asn Pro Ala Thr Phe Glu Glu Val Ala Lys Asn Glu Lys Leu 20 25 30 <210> 57 <211> 93 <212> DNA <213> Porcine Rotavirus A type <400> 57 accgaggcct ccacccagat cggcgacacc gagtggaaga actccaccac caaccccgcc 60 accttcgagg aggtggccaa gaacgagaag ttg 93 <210> 58 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RoA7-F primer <400> 58 tggttctcct agatccaccg aggcctccac ccagatcggc gacaccgagt ggaagaactc 60 caccaccaac cccgcc 76 <210> 59 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RoA7-M primer <400> 59 ggccacctcc tcgaaggtgg cggggttggt ggtgga 36 <210> 60 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RoA7-R primer <400> 60 ccttagagct cccgggtact atcagtcctt caacttctcg ttcttggcca cctcctcgaa 60 ggtggc 66 <210> 61 <211> 23 <212> PRT <213> Porcine Rotavirus C type <400> 61 Asn Ala Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Gly Lys Ala Asp Gly Leu Leu 1 5 10 15 Asn Asp Asn Asn Tyr Ala Gln 20 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Porcine Rotavirus C type <400> 62 Ser Pro Ala Ser Thr Glu Thr Tyr Glu Val Val Ser Asn Asp Thr Gln 1 5 10 15 Leu <210> 63 <211> 41 <212> PRT <213> Porcine Rotavirus C type <400> 63 Asn Ala Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Gly Lys Ala Asp Gly Leu Leu 1 5 10 15 Asn Asp Asn Asn Tyr Ala Gln Ser Ser Pro Ala Ser Thr Glu Thr Tyr 20 25 30 Glu Val Val Ser Asn Asp Thr Gln Leu 35 40 <210> 64 <211> 123 <212> DNA <213> Porcine Rotavirus C type <400> 64 aacgccgcca tcggctcccc cggccccggc aaggccgacg gcctgctgaa cgacaacaac 60 tacgcccagt cctcccccgc ctccaccgag acctacgagg tggtgtccaa cgacacccag 120 ctg 123 <210> 65 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RoC7-F primer <400> 65 tggttctcct agatccaacg ccgccatcgg ctcccccggc cccggcaagg ccgacggcct 60 gctgaacgac aac 73 <210> 66 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RoC7-M primer <400> 66 caccacctcg taggtctcgg tggaggcggg ggaggactgg gcgtagttgt tgtcgttcag 60 caggccgtc 69 <210> 67 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RoC7-R primer <400> 67 ccttagagct cccgggtact atcagtcctt cagctgggtg tcgttggaca ccacctcgta 60 ggtctcggt 69 <210> 68 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 peptide <400> 68 Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg 1 5 10 15 Asn Glu Arg Ala Thr Gly 20

Claims (21)

  1. 항원 펩티드 (돼지 번식ㆍ호흡 장애 증후군 (PRRS) 바이러스의 당단백질 5 유래 펩티드를 제외한다) 와, 시가 독소 2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB), 대장균 이열성 독소의 B 서브유닛 (LTB) 및 콜레라 독소의 B 서브유닛 (CTB) 에서 선택되는 2 이상의 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
  2. 항원 펩티드 (돼지 번식ㆍ호흡 장애 증후군 (PRRS) 바이러스의 당단백질 5 유래 펩티드를 제외한다) 와 아쥬반트 단백질을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 아쥬반트 단백질은 시가 독소 2e 의 B 서브유닛 (Stx2eB), 대장균 이열성 독소의 B 서브유닛 (LTB) 및 콜레라 독소의 B 서브유닛 (CTB) 에서 선택되는 2 이상의 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항원 펩티드는, 세균 독소 유래 펩티드인, 융합 단백질.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항원 펩티드는, 대장균 내열성 독소 (ST) 유래 펩티드인, 융합 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 ST 유래 펩티드는, 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖는, 융합 단백질.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항원 펩티드는, 포유류 감염성 바이러스 유래 펩티드인, 융합 단백질.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 포유류 감염성 바이러스 유래 펩티드는, 파보바이러스의 캡시드 단백질 VP2, 고양이 면역 부전 바이러스의 엔벨로프 단백질 gp120, 돼지 유행성 설사 바이러스의 스파이크 단백질, 또는 로타바이러스의 캡시드 단백질 VP7 의 부분 서열인, 융합 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 파보바이러스의 캡시드 단백질 VP2 의 부분 서열이 서열 번호 33 또는 39 로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖고, 고양이 면역 부전 바이러스의 엔벨로프 단백질 gp120 의 부분 서열이 서열 번호 43 으로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖고, 돼지 유행성 설사 바이러스의 스파이크 단백질의 부분 서열이 서열 번호 50 으로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖고, 또는 로타바이러스의 캡시드 단백질 VP7 의 부분 서열은 서열 번호 56 또는 63 으로 나타내는 아미노산 서열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열을 갖는, 융합 단백질.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2 이상의 단백질이 Stx2eB 와 LTB 를 포함하는, 융합 단백질.
  10. Stx2eB 의 73 위치의 Asn 잔기가 Ser 잔기로 치환되어 있는, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방제제.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 펩티드 및 상기 2 이상의 단백질을 구성하는 독소 B 서브유닛의 각각이 펩티드 링커를 개재하여 연결되어 있는, 융합 단백질.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 펩티드 링커가 PG12 (서열 번호 2), PG12v2 (서열 번호 4), PG17 (서열 번호 25), 또는 PG22 (서열 번호 26), 또는 이들 서열과 80 ％ 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인, 융합 단백질.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 20 또는 22 의 아미노산 서열 또는 서열 번호 20 또는 22 와의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 서열로 나타내어지는, 융합 단백질.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 코드하는 DNA.
  15. 제 14 항에 기재된 DNA 를 포함하는 DNA 구축물.
  16. 제 15 항에 기재된 DNA 구축물을 포함하는 재조합 벡터.
  17. 제 16 항에 기재된 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 형질 전환체가 식물 또는 효모인, 형질 전환체.
  19. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 제 17 항 또는 제 18 항에 기재된 형질 전환체를 포함하는 백신.
  20. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 제 17 항 또는 제 18 항에 기재된 형질 전환체를 포함하는 동물용 사료.
  21. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 제 17 항 또는 제 18 항에 기재된 형질 전환체를 비인간 포유 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 비인간 포유 동물에 있어서의 면역 증강 방법.
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