KR20170040305A - 돼지 번식·호흡 장해 증후군 방제제 - Google Patents

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다케시 마츠이
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Abstract

본 발명은, PRRS 백신의 고성능화를 위해서, GP5 항원을 최적화 및 고축적화하는 것을 과제로 하고, 돼지 번식·호흡 장해 증후군 (PRRS) 바이러스의 글리코프로테인 5 (GP5) 의 바이러스 외영역 (ectGP5) 과 아쥬반트 단백질을 함유하는 융합 단백질을 제공한다.

Description

돼지 번식·호흡 장해 증후군 방제제{AGENT FOR CONTROLLING PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME}
본 발명은 돼지 번식·호흡 장해 증후군 (PRRS) 에 대해 방제, 즉, 예방 및 치료 효과를 갖는 융합 단백질, 이것을 코드하는 DNA 를 함유하는 DNA 구축물, PRRS 바이러스 항원을 코드하는 DNA 를 함유하는 DNA 구축물, 이들을 함유하는 벡터 및 형질 전환체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, PRRS 바이러스 항원을 발현하는 방법, 및 PRRS 바이러스 항원을 제조하는 방법에 관한 것이다.
돼지 번식·호흡 장해 증후군 (PRRS) 은 양돈 업계에서 가장 문제가 되고 있는 질병이며, 일본 국내에서의 추정 손실액은 연간 280 억엔이나 되는 것으로 시산 (試算) 되고 있다. PRRS 는 자돈 (仔豚) 에서는 번식 장해, 모돈 (母豚) 에서는 유산을 일으킨다. PRRS 의 원인이 되는 PRRS 바이러스 (PRRSV) 는 면역계 세포의 매크로파지에 감염되는 성질을 갖기 때문에, 돼지의 기초적인 면역력의 저하를 일으킨다. 그 때문에, 다른 병원 세균이나 바이러스의 감염을 유발하기 때문에 피해가 심대한 것이 된다. 최근에는 중국을 비롯한 해외에 있어서, 고병원성 PRRSV 의 출현이 보고되고 있고, 이 바이러스는 단독 감염으로도 심한 피해를 일으킨다.
현재, 해외 메이커로부터 백신이 시판되고 있지만, 효과가 낮은 것이 현상황이다. 그 이유로서 PRRSV 의 다양성을 들 수 있다. PRRSV 는 크게 Type1 (유럽형) 과 Type2 (북미형) 로 나눌 수 있고, 각 타입은 다시 서브타입으로 분류된다. 일본 국내에서는 북미형 바이러스를 기초로 제조된 약독 백신이 시판되고 있지만, 다형에 대한 유효성은 의문시되고 있다. 또, 해외에 있어서도 유럽형 바이러스를 기초로 한 백신이 시판되고 있지만, 다형에 대한 효과는 낮다. 또 약독화되어 있다고는 해도, 바이러스 그 자체를 사용한 경우에는 병원성의 복귀를 부정할 수 없다는 문제도 있다.
비특허문헌 1 에서는, 유전자 재조합 식물 (바나나) 을 사용하여 PRRSV 항원의 전체 길이 글리코프로테인 5 (Glycoprotein 5, GP5) 를 생산하고, 돼지에의 경구 투여에 의해 PRRSV 예방 효과를 확인하고 있다. 그러나, GP5 의 축적량은 ∼ 250 ng/g 습중량 (엽 (葉)) 정도로 낮아, 백신 효과 발휘를 위해서는 50 g 습중량의 엽을 3 회 투여할 필요가 있었다.
비특허문헌 2 에서는, M 단백질을 발현하는 옥수수가 제조되고, 당해 옥수수의 마우스 경구 투여에 의해 중화 항체를 유도할 수 있는 것이 나타나 있다. 그러나, 비특허문헌 2 에서는, 실제의 대상 동물인 돼지에서의 효과 확인 시험은 실시되어 있지 않고, GP5 와 M 단백질을 따로따로 발현시키는 것도 기재되어 있지 않다.
특허문헌 1 에서는, GP5 와 M 단백질을 함유하는 비감염성의 바이러스형 입자가 개시되어 있다. 특허문헌 1 에서는, GP5 와 M 단백질 이외의 엔벨로프 단백질도 바이러스형 입자에 포함되어 있다. 또, 특허문헌 1 에서는, 단백질의 발현 양식은, GP5 와 M 이 다른 전사 단위로서 전사되는 것이 아니라, 1 개의 전사 산물로부터 복수 종류의 PRRSV 단백질이 번역되어 있다. 또한 특허문헌 1 에서는, 포유류의 배양 세포를 숙주로 하여 바이러스형 입자가 생산되기 때문에, 백신으로서 상업화하기 위해서는 비용과 생산성 면에 있어서 문제가 있었다.
비특허문헌 3 에서는, GP5 의 에피토프 영역만을 항원으로서 사용하여, PRRS 백신 효과가 있는 것이 확인되고 있다. 그러나, GP5 의 축적량은 낮아, 백신 효과를 발휘시키기 위해서는 대량 생산이 필요하다는 과제가 있었다.
비특허문헌 4 에서는, 대장균 이열성 독소 B 서브 유닛 (LTB) 과 전체 길이 GP5 를 융합한 백신 항원이 담배로 발현되어 있다. 그러나, 전체 길이 GP5 만을 발현하는 담배와 비교하여 성능이 유의하게 우수한 점은 없고, 백신의 고성능화를 위해서는 LTB 와 융합하는 GP5 의 최적화 등의 개량이 필요하였다.
이와 같이, PRRS 백신의 고성능화를 위해서, GP5 항원의 최적화, 고축적화가 요구되고 있었다.
유럽 특허 공개 제1156111호
Chan et al., Plant Biotechnology J. 11 (2013) 315-324 Hu et al., Vaccine (2012) 68-74 Ostrowski et al., J. Virology 2002, 4241-4250 Min-Yuan Chia et al., Veterinary Immunology and Immunopathology 2011, 140, 215-225
본 발명은 PRRS 백신의 고성능화를 위해서, GP5 항원을 최적화 및 고축적화하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 실시한 결과, LTB 와 GP5 바이러스 외영역 (ectGP5) 을 융합함으로써, 식물체에 있어서 GP5 항원을 효과적으로 축적할 수 있는 것을 알아내었다.
또, 본 발명자들은, GP5 바이러스 외영역을 포함하는 전체 길이 GP5 단백질과 M 단백질을 다른 전사 단위로서 공발현시킴으로써, 단독 발현의 경우보다 GP5 항원의 축적량이 현저하게 개선되는 것을 알아내었다.
본 발명자들은 이와 같이 하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 돼지 번식·호흡 장해 증후군 (PRRS) 바이러스의 글리코프로테인 5 (Glycoprotein 5, GP5) 의 바이러스 외영역 (ectGP5) 과 아쥬반트 단백질을 함유하는 융합 단백질.
(2) 상기 바이러스 외영역은, 배열 번호 1 의 아미노산 배열에 있어서의 30 위치의 아스파라긴으로부터 53 위치의 스레오닌으로 이루어지는 아미노산 배열, 또는 당해 아미노산 배열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열을 갖고, PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는, (1) 에 기재된 융합 단백질.
(3) 상기 GP5 가 유럽형 또는 북미형인, (1) 또는 (2) 에 기재된 융합 단백질.
(4) 상기 GP5 가 유럽형 I, III 형 및 북미형 II, III, IV 형 중 어느 형인, (3) 에 기재된 융합 단백질.
(5) 상기 바이러스 외영역은, 배열 번호 3, 6, 21 ∼ 34 로 나타내는 아미노산 배열 또는 배열 번호 6 과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열을 갖고, PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는, (1) 에 기재된 융합 단백질.
(6) 상기 아쥬반트 단백질이 대장균 이열성 독소 B 서브 유닛 (LTB) 및/또는 2 형 쉬가 독소 서브클래스 e(Stx2e) 의 B 서브 유닛 (Stx2eB) 인, (1) ∼ (5) 중 어느 1 항에 기재된 융합 단백질.
(7) 상기 바이러스 외영역 및 상기 아쥬반트 단백질이 펩티드 링커를 개재하여 연결되어 있는, (1) ∼ (6) 중 어느 1 항에 기재된 융합 단백질.
(8) 상기 펩티드 링커의 아미노산 개수가 5 ∼ 25 개인, (7) 에 기재된 융합 단백질.
(9) 상기 링커가 PG12 (배열 번호 55), PG17 (배열 번호 57), 혹은 PG22 (배열 번호 59), 또는 배열 번호 55, 57 혹은 59 와의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열로 나타내는, (7) 또는 (8) 에 기재된 융합 단백질.
(10) 배열 번호 61 의 아미노산 배열 또는 배열 번호 61 과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열로 나타내는, (9) 에 기재된 융합 단백질.
(11) (1) ∼ (10) 중 어느 1 항에 기재된 융합 단백질을 코드하는 DNA.
(12) (11) 에 기재된 DNA 를 함유하는 DNA 구축물.
(13) 돼지 번식·호흡 장해 증후군 (PRRS) 바이러스의 글리코프로테인 5 (GP5) 를 코드하는 DNA 및 메트릭스 프로테인 (Matrix protein, M) 을 코드하는 DNA 를 함유하고, 각 DNA 는 각각 프로모터 및 터미네이터와 연결된, DNA 구축물.
(14) 상기 GP5 를 코드하는 DNA 는, 배열 번호 1, 7 ∼ 20 으로 나타내는 아미노산 배열 또는 배열 번호 1 과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열을 코드하는 DNA 이고, 상기 GP5 는 PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는, (13) 에 기재된 DNA 구축물.
(15) 상기 GP5 를 코드하는 DNA 는, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 32 위치의 세린이 알라닌으로 치환되고, 또한 33 위치의 아스파르트산이 세린으로 치환되어 있는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 를 함유하는, (13) 또는 (14) 에 기재된 DNA 구축물.
(16) 상기 M 이 유럽형 또는 북미형인, (13) ∼ (15) 중 어느 1 항에 기재된 DNA 구축물.
(17) 상기 M 이 유럽형 I, II 형 및 북미형 II, III, IV 형 중 어느 형인, (16) 에 기재된 DNA 구축물.
(18) 상기 M 은, 배열 번호 35, 37 ∼ 50 으로 나타내는 아미노산 배열 또는 배열 번호 35 와의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열을 갖고, PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는, (13) ∼ (15) 중 어느 1 항에 기재된 DNA 구축물.
(19) (12) ∼ (18) 중 어느 1 항에 기재된 DNA 구축물을 함유하는 재조합 벡터.
(20) (19) 에 기재된 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
(21) 상기 형질 전환체가 식물인, (20) 에 기재된 형질 전환체.
(22) (21) 에 기재된 형질 전환체 또는 그것으로부터 얻어진 단백질을 함유하는 PRRS 방제제.
(23) (22) 에 기재된 방제제를 돼지에 투여하는 것을 특징으로 하는 PRRS 의 치료 또는 예방 방법.
(24) 소포 (小胞) 수송 경로를 구비한 진핵 생물을, (13) ∼ (18) 중 어느 1 항에 기재된 DNA 구축물을 함유하는 재조합 벡터로 형질 전환하는 것을 특징으로 하는, 진핵 생물의 동일 세포 내에서 GP5 와 M 을 발현시키는 방법.
(25) 소포 수송 경로를 구비한 진핵 생물을, (13) ∼ (18) 중 어느 1 항에 기재된 DNA 구축물을 함유하는 재조합 벡터로 형질 전환하고, 그 진핵 생물의 동일 세포 내에서 GP5 와 M 을 발현시키는 것을 포함하는, PRRS 방제제의 제조 방법.
본 발명의 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 벡터 또는 본 발명의 DNA 구축물을 함유하는 벡터를 사용하여 식물 세포를 형질 전환함으로써, 선행 기술 문헌에 기재되는 백신과 비교하여, 식물 세포 내에서의 항원 축적·방제 (백신 효과, 면역 부활 효과, 또는 치료 효과) 성능이 현저하게 개선된다.
본 발명의 융합 단백질 또는 이것을 코드하는 DNA 구축물에 의해, PRRS 를 예방 또는 치료할 수 있다. 건강한 상태의 돼지에 본 발명의 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 벡터 또는 본 발명의 DNA 구축물을 함유하는 벡터로 형질 전환된 형질 전환 식물을 부여하면, 백신 효과나 면역 부활제로서의 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에서는, 가식 (可食) 식물에 단백 항원을 고레벨로 축적시켜 경구 투여하기 때문에, 기존의 백신보다 비용 절약화, 생력화, 돼지의 스트레스 경감에 의한 생산성의 향상을 기대할 수 있다.
도 1 은, LTB 융합 ectGP5 를 코드하는 DNA 를 함유하는 벡터의 개략도이다. ER 은 소포체, Apo 는 아포플라스트, Vac 는 액포에 수송되도록 시그널 배열이 부가되어 있는 것을 나타낸다.
도 2 는, PRRS 바이러스의 전체 길이 엔벨로프 단백질 (GP5 및 M) 을 코드하는 DNA 를 함유하는 벡터의 개략도이다.
도 3 은, 본 발명의 LTB 융합 ectGP5 의 담배 배양 세포 또는 양상추 세포에 있어서의 일과성 발현을 나타낸다 (전기 영동 사진).
도 4 는, 본 발명의 LTB 융합 ectGP5 의 담배 배양 세포의 안정 형질 전환체에 있어서의 발현을 나타낸다 (전기 영동 사진).
도 5 는, 본 발명의 DNA 구축물에 의해 코드되는 전체 길이 엔벨로프 단백질 (GP5, GP4 및 M) 의 담배 배양 세포의 안정 형질 전환체에 있어서의 발현을 나타낸다 (전기 영동 사진).
도 6 은, 양상추에 있어서의 LTB 융합 ectGP5 및 전체 길이 엔벨로프 단백질 (GP5 및 M) 의 축적을 나타낸다 (전기 영동 사진).
도 7 은, 형질 전환 양상추의 돼지에 대한 경구 투여에 의한 PRRV 예방 효과를 나타낸다. 음성 대조에는 공벡터 양상추를 투여하였다. 공격 첫날부터 부검시 (공격 후 3 주간째) 까지의 체중 증가율 (％) 을 나타낸다.
도 8 은, PRRS 바이러스의 서브 타입, 주 (株) 의 명칭, 발견 장소, 년, 전체 길이 GP5 및 ectGP5 그리고 M 의 EMBL 단백질의 번호 및 배열 번호의 일람을 나타낸다.
도 9 는, 각종 전체 길이 GP5 의 아미노산 배열의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 10 은, 각종 ectGP5 의 아미노산 배열의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 11 은, 각종 전체 길이 M 의 아미노산 배열의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 12 는, LTB 융합 ectGP5 (NA 는 북아메리카형, EU 는 유럽형) 를 코드하는 DNA 를 함유하는 벡터의 개략도이다. 2, 4 이외는 당 사슬이 부가되어 있다. 또, 8, 9 는 Stx2eB 도 부가되어 있다.
도 13 은, 효모에 있어서의 LTB 융합 ectGP5 의 축적을 나타낸다 (전기 영동 사진). ○ 는 당 사슬이 부가되지 않은 재조합 단백질의 밴드를, 별표는 당 사슬이 부가된 재조합 단백질의 밴드를 나타낸다.
<GP5 바이러스 외영역과 아쥬반트 단백질을 함유하는 융합 단백질과 그것을 코드하는 DNA 구축물 (제 1 DNA 구축물)>
본 발명의 융합 단백질은, PRRS 바이러스의 글리코프로테인 5 (GP5) 의 바이러스 외영역 (ectGP5) 과 아쥬반트 단백질이 융합되어 있다.
본 발명의 ectGP5 와 아쥬반트 단백질의 융합 단백질은, 바람직하게는, 유전자 재조합 기술에 의해 만들어진 단백질로, 2 종류 이상의 단백질 유전자 (코드 영역) 가 해독틀을 맞춰 연결되고, 연속적으로 전사·번역됨으로써, 1 개의 단백질을 형성한 것이다. 본 발명에 사용하는 융합 단백질은, 단백질끼리가 직접 융합되어 있어도 되고, 펩티드 링커를 개재하여 결합되어 있어도 된다.
본 발명에서 사용하는 PRRSV 는, Type1 (유럽형) 과 Type2 (북미형) 어느 것이어도 된다. 북미형에 대해서는 다시 I ∼ VI 형으로 나누어진다. 일본 국내에서는 Type2 (북미형) 바이러스를 사용하는 것이 바람직하다. 특히 Type1 (유럽형) 의 I, III 형을 사용하는 것이 바람직하다. 또 Type2 (북미형) 의 II, III, IV 형 바이러스를 사용하는 것이 바람직하다.
GP5 는 PRRS 바이러스의 엔벨로프 단백질의 하나이며, GP5 에는 바이러스 외영역 (ectGP5) 이 포함된다. ectGP5 는, 예를 들어, Ostrowski et al., Journal of virology (2002) 76 : 4241 - 4250 에 기재되어 있다. 본 발명에 있어서, ectGP5 는, 바람직하게는, PRRS 바이러스에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는 에피토프 영역이다. 본 발명에 있어서, ectGP5 는, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 30 위치의 아스파라긴으로부터 53 위치의 스레오닌을 포함하는 영역이 보다 바람직하다.
ectGP5 의 아미노산 배열은, 예를 들어, EDRD-I 주 유래의 배열 번호 3 에 의해 나타내는 아미노산 배열이며, 그 염기 배열은, 배열 번호 4 에 의해 나타낸다. 배열 번호 3 의 15 위치와 22 위치의 아스파라긴에는, N-결합형 당 사슬이 부가된다. 그러나, 본 발명에 있어서, 당 사슬 부가 부위의 아미노산은 당 사슬이 부가되지 않게 치환되어도 된다.
ectGP5 의 아미노산 배열은, EDRD-I 주 이외의 주에서 유래하는 배열 번호 21 ∼ 34 에 의해 나타내는 배열이어도 된다. 이들 배열이 유래하는 주의 명칭 등은 도 8 에 기재되어 있다. 또, 각종 ectGP5 의 아미노산 배열의 얼라이먼트를 도 10 에 나타낸다. 배열 번호 6 과 배열 번호 21 ∼ 34 의 동일성 ％ 는 각각 79, 83, 79, 83, 79, 92, 86, 86, 75, 71, 86, 79, 86, 92 ％ 이다.
ectGP5 는 PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는 한, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 30 위치의 아스파라긴으로부터 53 위치의 스레오닌을 포함하는 영역 또는 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. ectGP5 의 설명에 있어서, 상기 「수 개」 로는, 바람직하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다. 또 ectPG5 란, 상기 배열과의 동일성이 70 ％ 이상, 보다 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상이고, PRRS 바이러스의 예방 효과를 유도하는 기능을 유지하는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 배열 번호 3 의 3 위치의 세린이 알라닌으로 치환되고, 또한 4 위치의 아스파르트산이 세린으로 치환되어 있는 배열 번호 6 의 아미노산이 바람직하다. 또, ectGP5 는, 배열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 배열과, 바람직하게는 70 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 상기 기능을 유지하는 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 사용되는 아쥬반트 단백질로는, PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는 기능을 보조 또는 증강시키는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 대장균성 설사의 원인이 되는 독소원성 대장균 (ETEC) 이 생산하는 단백질성 독소의 대장균 이열성 독소 (LT) 를 들 수 있다. LT 는, 독성 본체인 A 서브 유닛 1 분자와 B 서브 유닛 5 분자로 이루어지는 홀로 독소이다. LT 의 A 서브 유닛 (LTA) 은 세포질 내에 침입하여, 세포 내 cAMP 농도를 상승시키고, 세포막 클로라이드 채널을 활성화함으로써 장관 내에의 물의 누출 즉 설사의 병태를 일으킨다. LT 의 B 서브 유닛 (LTB) 은 무독이며, LT 독소와 장관 세포의 접착에 관여하여, 점막 아쥬반트 작용을 갖는 것이 알려져 있다.
LTB 는, 점막 아쥬반트 작용을 갖는 한, 각각 배열 번호 53 으로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. 상기 「수 개」 로는, 예를 들어, LTB 에 있어서, 바람직하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다. 배열 번호 53 으로 나타내는 아미노산 배열은, GenBank Accession No. AAL55672 로서 등록되어 있다.
또, LTB 는, 각각 배열 번호 53 으로 나타내는 아미노산 배열과, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 아쥬반트 작용을 갖는 것이어도 된다.
대장균 이열성 독소의 B 서브 유닛의 90 위치 (즉, 배열 번호 53 의 90 위치) 는 아스파라긴이고, 진핵 생물의 소포 수송 경로를 사용하여 발현한 경우에는 당 사슬이 부가된다. 본 발명에 있어서는, 90 위치의 아스파라긴이 세린으로 치환되어 있고, 당 사슬이 부가되어 있지 않은 것을 사용하였다. 90 위치가 세린 잔기인 LTB 서브 유닛 단백질의 설명에 있어서, 「수 개」 란, 배열 번호 53 으로 나타내는 아미노산 배열의 제 90 위치의 세린 잔기 이외의 위치에서, 바람직하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다.
또, 90 위치가 세린 잔기인 LTB 서브 유닛 단백질은, 배열 번호 53 으로 나타내는 아미노산 배열의 90 위치에 대응하는 위치가 세린인 것 이외에는, 배열 번호 53 으로 나타내는 아미노산 배열과, 바람직하게는 85 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 단백질이어도 된다.
상기와 같이, 본 발명의 융합 단백질은, ectGP5 및 아쥬반트 단백질의 융합 단백질이고, 본 발명의 DNA 구축물은, ectGP5 및 아쥬반트 단백질의 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하기 때문에, GP5 바이러스 외영역의 면역원성을 상승시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 백신에 있어서의 PRRS 바이러스에 대한 예방 효과의 유도란, 백신을 투여하고 있지 않은 동물에 대해, 백신을 투여한 동물의 PRRS 에 대한 임상 스코어가 개선되고, 예를 들어, 체중이 1.2 배 이상 증가하고 있는 것을 말한다. 본 발명에 있어서, LTB 와 융합한 ectGP5 항원은, 전체 길이 GP5 와 LTB 를 융합시켰을 경우와 비교하여, 예를 들어, 10 배, 100 배, 400 배 이상, 축적량이 증가하고 있다.
또한, 아쥬반트 단백질은 WO2009/004842 에 기재된 바와 같은 쉬가 독소의 서브 유닛 단백질이어도 된다. 쉬가 독소 (Stx) 는, 장관 출혈성 대장균 (EHEC, STEC) 이 산생하는 단백질성 독소로, 1 형 (Stx1) 및 2 형 (Stx2) 으로 나눌 수 있다. Stx1 은, a ∼ d 의 서브 클래스로, Stx2 는 a ∼ g 의 서브 클래스로 각각 분류된다. 독성 본체인 A 서브 유닛 1 분자와 장관 점막에 대한 결합에 작용하는 B 서브 유닛 5 분자로 이루어지는 홀로 독소이고, 진핵 세포의 리보솜에 작용하여, 단백질 합성을 저해하는 작용을 갖는다. 이 중, Stx2e 의 B 서브 유닛 (Stx2eB) 이 아쥬반트 단백질로는 특히 바람직하고, B 서브 유닛 (Stx2eB) 으로는 배열 번호 187 의 아미노산 배열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 또, Stx2eB 는, Asn73 (즉, 배열 번호 187 의 아미노산 배열의 55 위치의 Asn 잔기) 이 Ser 로 치환되어 있는 변이체나, 일본 공개특허공보 2012-019719 에 개시된 바와 같은 변이체이어도 된다. 또한 Stx2eB 는, 배열 번호 187 로 나타내는 아미노산 배열과, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 아쥬반트 작용을 갖는 것이어도 된다.
아쥬반트는 LTB 와 Stx2eB 의 조합이어도 된다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은, GP5 바이러스 외영역 및 아쥬반트 단백질이 링커를 개재하여 연결되어 있다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, GP5 바이러스 외영역과 아쥬반트 단백질이 융합되는 순서는, 어느 것이 먼저이어도 된다.
본 발명에서 사용하는 펩티드 링커의 아미노산의 개수는, 바람직하게는 5 ∼ 25 개, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 22 개, 보다 바람직하게는 12 ∼ 22 이다. 또, 본 발명에서 사용하는 펩티드 링커에 있어서, 바람직하게는, 프롤린의 함유율이 20 ∼ 27 ％, 보다 바람직하게는, 20 ∼ 25 ％ 이다.
펩티드 링커에 있어서, 프롤린은, 바람직하게는 2 개 간격으로, 또는 3 개 간격으로 배치된다. 단, 이 경우에도, 펩티드의 말단에 있어서는, 프롤린 이외의 아미노산이 5 개 이내, 바람직하게는 4 개 이내의 범위에서 연속되어 있어도 된다. 이와 같은 바람직한 펩티드 링커는, 예를 들어, 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 펩티드 링커는, 바람직하게는, 배열 번호 55 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 (PG12) 또는 배열 번호 55 (PG12) 와 동일성이 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성을 갖는 펩티드, 배열 번호 57 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 (PG17) 또는 배열 번호 57 (PG17) 과 동일성이 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성을 갖는 펩티드, 및 배열 번호 59 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 (PG22) 또는 배열 번호 59 (PG22) 와 동일성이 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성을 갖는 펩티드이다.
본 발명의 융합 단백질은, GP5 바이러스 외영역과 아쥬반트 단백질이 PG12 (배열 번호 55) 를 개재하여 연결되어 있는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 융합 단백질의 아미노산 배열은, 예를 들어, 배열 번호 61 로 나타낸다.
본 발명의 융합 단백질은, 대장균 이열성 독소 (LT) A 서브 유닛을 함유하고 있어도 되지만, A 서브 유닛을 함유하는 경우에는, A 서브 유닛은 무독화되어 있는 것이 바람직하다.
상기 PG12, PG17 및 PG22 등의 펩티드를, 상기 융합 단백질을 연결하기 위한 링커로서 사용함으로써, 그 융합 단백질의 식물 세포에 대한 축적 레벨이 증대된다.
본 발명의 융합 단백질은, 바람직하게는, 그 아미노 말단에, 식물 유래의 분비 시그널 펩티드가 부가되어 있다. 여기서, 「부가」 란, 상기 분비 시그널 펩티드가, 상기 펩티드를 개재하여 연결된 융합 단백질의 아미노 말단에, 직접 결합되어 있는 경우도, 다른 펩티드를 개재하여 결합되어 있는 경우도 포함하는 개념이다.
분비 시그널 펩티드는, 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 장미과 (Rosaceae), 유채과 (Brassicaceae), 국화과 (Asteraceae) 에 속하는 식물, 또한 바람직하게는 담배속 (Nicotiana), 애기장대속 (Arabidopsis), 딸기속 (Fragaria), 왕고들빼기속 (Lactuca) 등에 속하는 식물, 보다 바람직하게는 담배 (Nicotiana tabacum), 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 딸기 (Fragaria × ananassa), 양상추 (Lactuca sativa) 등에서 유래한다.
또, 분비 시그널 펩티드는, 바람직하게는 담배의 β-D 글루칸엑소하이드로라아제 (β-D-glucan exohydrolase), 담배의 38 kDa 퍼옥시다아제 (GenBank Accession D42064) 에서 유래한다. 상기 분비 시그널 펩티드로는, 예를 들어, 담배의 β-D 글루칸엑소하이드로라아제에서 유래하는 배열 번호 63 으로 나타내는 아미노산 배열을 가지고 있는 펩티드를 들 수 있다. 담배의 β-D 글루칸엑소하이드로라아제를 코드하는 DNA 의 염기 배열은, 예를 들어 배열 번호 64 로 나타낸다.
또, 효모에서 발현시키는 경우에는, 인베르타아제 분비 시그널 등, 효모에서 기능하는 분비 시그널을 사용해도 된다.
또한 본 발명의 융합 단백질은, 그 카르복실 말단에, 소포체 잔류 시그널 펩티드, 액포 이행 시그널 펩티드 등의 시그널 펩티드가 부가되어 있어도 된다. 여기서, 「부가」 란, 시그널 펩티드가, 상기 융합 단백질의 카르복실 말단에, 직접 결합되어 있는 경우도, 다른 펩티드를 개재하여 결합되어 있는 경우도 포함하는 개념이다.
본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드가 부가되고, 또한 카르복실 말단에 소포체 잔류 시그널 펩티드가 부가된 융합 단백질을, 소포체형 (ER) 의 융합 단백질이라고도 하고, 그 소포체형의 융합 단백질을 코드하는 DNA 구축물을, 소포체형의 DNA 구축물이라고도 한다. 소포체형의 융합 단백질은, 진핵 생물에서 효율적으로 축적되는 보고예가 다수 있다.
본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드가 부가되고, 카르복실 말단에는 소포체 잔류 시그널 펩티드 또는 액포 이행 시그널 펩티드 모두 부가되어 있지 않은 융합 단백질을, 아포플라스트형 (Apo) 의 융합 단백질이라고도 하고, 그 아포플라스트형의 융합 단백질을 코드하는 DNA 구축물을, 아포플라스트형의 DNA 구축물이라고도 한다.
본 명세서에 있어서, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드가 부가되고, 또한 카르복실 말단에 액포 이행 시그널 펩티드가 부가된 융합 단백질을 액포형 (Vac) 의 융합 단백질이라고도 하고, 그 액포형의 융합 단백질을 코드하는 DNA 구축물을 액포형의 DNA 구축물이라고도 한다.
본 발명의 융합 단백질은, 바람직하게는, 그 카르복실 말단에, 소포체 잔류 시그널 펩티드 또는 액포 이행 시그널 펩티드가 부가되어 있다. 바람직한 소포체 잔류 시그널 펩티드는, 예를 들어, 국제 공개 WO2009/004842호 팜플렛 및 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있지만, HDEL 배열 (배열 번호 65) 을 이용할 수 있다. 바람직한 액포 이행 시그널 펩티드는, 예를 들어, 국제 공개 WO2009/004842호 팜플렛 및 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있지만, VSD 배열 (배열 번호 66) 을 이용할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은, 화학적으로 합성할 수도 있고, 유전자 공학적으로 생산할 수도 있다. 유전자 공학적으로 생산하는 방법에 대해서는 후술한다.
본 발명의 제 1 DNA 구축물은, 본 발명의 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 것을 특징으로 한다,
즉, 본 발명에서 사용하는 제 1 DNA 구축물은, PRRS 바이러스의 GP5 바이러스 외영역을 코드하는 DNA, 및 아쥬반트 단백질을 코드하는 DNA, 바람직하게는, 대장균 이열성 독소의 B 서브 유닛을 코드하는 DNA 를 함유한다. 상기 펩티드 링커를 코드하는 DNA 는, 예를 들어 배열 번호 56 (PG12), 배열 번호 58 (PG17), 배열 번호 60 (PG22) 으로 나타낸다. 대장균 이열성 독소를 코드하는 DNA 로서, 예를 들어 B 서브 유닛 (Asn90) 을 코드하는 DNA (배열 번호 54) 를 들 수 있다. 상기 GP5 바이러스 외영역을 코드하는 DNA, 및 대장균 이열성 독소 등의 아쥬반트 단백질을 코드하는 DNA 는, 종지 코돈을 제외하고 해독틀을 맞춰 연결된다.
GP5 바이러스 외영역을 코드하는 DNA 및 대장균 이열성 독소를 코드하는 DNA 는, 예를 들어, 배열 번호 34, 54 의 염기 배열에 기초하여, 일반적인 유전자 공학적인 수법에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로는, 각 단백질을 생산하는 바이러스 및 세균으로부터, 통상적인 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 조제하고, 그 라이브러리로부터 상기 염기 배열에 기초하여 제조한 프로브를 사용하여 원하는 클론을 선택한다. 또, 상기 염기 배열을 기초로 한 화학 합성, 상기 염기 배열의 5' 및 3' 말단의 염기 배열을 프라이머로 하고, 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 등에 의해 합성할 수도 있다.
본 발명의 융합 단백질을 코드하는 DNA 는, 예를 들어, 배열 번호 62 로 나타낸다.
본 발명의 융합 단백질을 코드하는 DNA 는, 그 단백질을 생산시키는 숙주 세포에 따라, 하이브리드 단백질의 번역량이 증대되도록, 융합 단백질을 구성하는 아미노산을 나타내는 코돈이 적절히 개변되어 있는 것도 바람직하다.
코돈 개변의 방법으로는, 예를 들어 Kang et al. (2004) 의 방법을 참고로 할 수 있다. 또, 숙주 세포에 있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 선택하거나, GC 함량이 많은 코돈을 선택하거나, 숙주 세포의 하우스키핑 유전자에 있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 선택하거나 하는 방법을 들 수 있다.
또, 본 발명의 융합 단백질을 코드하는 DNA 는, 배열 번호 62 의 염기 배열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 이어도 된다. 「스트린젠트한 조건」 이란, 이른바 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들어, 동일성이 높은 2 개의 DNA 끼리, 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 특히 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 2 개의 DNA 가 하이브리다이즈하지만, 그것보다 동일성이 낮은 2 개의 DNA 가 하이브리다이즈하지 않는 조건을 들 수 있다. 예를 들어 2 × SSC (300 mM NaCl, 30 mM 시트르산), 42 ℃ 를 들 수 있고, 바람직하게는 0.1 × SSC (15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산), 60 ℃ 를 들 수 있다.
<GP5 및 M 을 코드하는 DNA 를 함유하는 DNA 구축물 (제 2 DNA 구축물)>
본 발명의 DNA 구축물의 제 2 양태는, PRRV 바이러스의 글리코프로테인 5 (GP5) 및 메트릭스 프로테인 (Matrix protein, M) 을 코드하는 DNA 를 함유하고, GP5 및 M 은 각각 프로모터 및 터미네이터의 세트와 연결되고, 다른 전사 단위로서 발현된다.
본 발명의 GP5 및 M 을 코드하는 DNA 구축물은, 각각 프로모터 및 터미네이터의 세트와 연결되어 있기 때문에, GP5 및 M 의 단백질 유전자 (코드 영역) 가 연결되어 있지 않고, 따로따로 번역됨으로써, 다른 단백질을 형성한다.
본 발명의 GP5 및 M 을 코드하는 DNA 구축물은, GP5 를 코드하는 DNA 그리고 그 프로모터 및 터미네이터의 세트와, M 을 코드하는 DNA 그리고 그 프로모터 및 터미네이터의 세트가 연결되어 1 개의 DNA 구축물로 되어 있어도 된다. 혹은, 본 발명의 GP5 및 M 을 코드하는 DNA 구축물은, GP5 를 코드하는 DNA 그리고 그 프로모터 및 터미네이터의 세트와, M 을 코드하는 DNA 그리고 그 프로모터 및 터미네이터의 세트가 연결되어 있지 않은 다른 DNA 구축물이어도 된다.
GP5 는 PRRS 바이러스의 엔벨로프 단백질의 하나이며, GP5 에는 바이러스 외영역 (ectGP5) 이 포함된다. 본 발명에 있어서, GP5 는 전체 길이 단백질인 것이 바람직하지만, 전체 길이 단백질이 아니어도 되고, 부분 배열이어도 된다.
GP5 의 아미노산 배열은, 예를 들어, EDRD-I 주에서 유래하는 배열 번호 1 에 의해 나타내고, 그 염기 배열은, 배열 번호 2 에 의해 나타낸다. 배열 번호 1 의 30 위치, 44 위치, 51 위치의 아스파라긴에는, N-결합형 당 사슬이 부가될 가능성이 있다. 그러나, 본 발명에 있어서, 당 사슬 부가 부위의 아미노산은 당 사슬이 부가되지 않게 치환되어도 된다.
GP5 의 아미노산 배열은, EDRD-I 주 이외의 주에서 유래하는 배열 번호 7 ∼ 20 에 의해 나타내는 배열이어도 된다. 이들 배열이 유래하는 주의 명칭 등은 도 8 에 기재되어 있다. 또, GP5 의 아미노산 배열의 얼라이먼트를 도 9 에 나타낸다. 배열 번호 5 와 배열 번호 7 ∼ 20 의 동일성 ％ 는 각각, 89, 89, 89, 89, 88, 91, 57, 56, 63, 55, 57, 60, 60, 57 ％ 이다.
GP5 는 바이러스 외영역 (ectGP5) 을 포함하는 한, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. GP5 의 설명에 있어서, 상기 「수 개」 로는, 바람직하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다.
또, GP5 는, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열과, 바람직하게는 50 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 70 ％ 이상, 보다 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 상기 기능을 유지하는 것이어도 된다.
또한 GP5 는, 배열 번호 1 에 있어서 33 위치의 아스파르트산이 세린으로 치환된 배열, 또는 배열 번호 1 에 있어서 32 위치의 세린이 알라닌으로 치환되고, 또한 33 위치의 아스파르트산이 세린으로 치환된 배열 (배열 번호 5) 과, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 상기 기능을 유지하는 것이어도 된다.
메트릭스 프로테인 (Matrix protein, M) 은 PRRS 바이러스의 엔벨로프 단백질의 하나이며, M 에도 PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는 영역이 포함된다. M 은 GP5 와 디술파이드 결합을 형성한다. 본 발명에 있어서, M 은 전체 길이 단백질인 것이 바람직하지만, 전체 길이 단백질이 아니어도 되고, 부분 배열이어도 된다.
M 의 아미노산 배열은, 예를 들어, 배열 번호 35 에 의해 나타내고, 그 염기 배열은, 배열 번호 36 에 의해 나타낸다.
M 의 아미노산 배열은, EDRD-I 주 이외의 주에서 유래하는 배열 번호 37 ∼ 50 에 의해 나타내는 배열이어도 된다. 이들 배열이 유래하는 주의 명칭 등은 도 8 에 기재되어 있다. 또, M 의 아미노산 배열의 얼라이먼트를 도 11 에 나타낸다. 배열 번호 35 와 배열 번호 37 ∼ 50 의 동일성 ％ 는 각각, 96, 96, 96, 96, 97, 95, 81, 81, 81, 78, 82, 82, 82, 81 ％ 이다.
M 은 PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는 한, 바람직하게는, PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있고, 또한 GP5 와 디술파이드 결합할 수 있는 한, 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다. 상기 「수 개」 로는, 예를 들어, M 에 있어서, 바람직하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다.
또, M 은, 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열과, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 상기 기능을 유지하는 것이어도 된다.
상기와 같이, 본 발명의 제 2 DNA 구축물은, GP5 및 M 을 다른 전사 단위로서 코드하는 DNA 를 함유하기 때문에, GP5 바이러스 외영역을 포함하는 GP5 및 M 을 효율적으로 산생할 수 있다. 또, 본 발명의 제 2 DNA 구축물은, 특허문헌 1 의 바이러스 입자와는 상이하고, 바이러스 입자를 사용하고 있지 않기 때문에, 병원성을 회복할 우려는 없다. 또, M 과 GP5 이외의 항체를 유도할 가능성이 높은 바이러스 입자와는 상이하고, 선택적으로 M 과 GP5 를 발현시킬 수 있다. 따라서, 매크로파지에 도입된 후에 복제되어 데미지를 부여할 가능성이 높은 바이러스 입자와는 상이하고, 백신으로서의 효과가 높다.
본 발명에서 사용하는 제 1 및 제 2 DNA 구축물에 있어서, 바람직하게는, 상기 융합 단백질을 코드하는 DNA 또는 상기 GP5 및 M 을 코드하는 DNA 가, 엔핸서에 발현 가능하게 연결되어 있다. 여기서, 「발현 가능」 이란, 본 발명에서 사용하는 DNA 구축물이 적절한 프로모터를 함유하는 벡터에 삽입되고, 그 벡터가 적절한 숙주 세포에 도입되었을 경우에, 숙주 세포 내에서 상기 융합 단백질 또는 GP5 및 M 이 생산되는 것을 말한다. 또, 「연결」 이란, 2 개의 DNA 가 직접 결합되어 있는 경우도, 다른 염기 배열을 개재하여 결합되어 있는 경우도 포함하는 개념이다.
엔핸서로는, Kozak 배열이나 식물 유래의 알코올데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역을 들 수 있다. 특히 바람직하게는, 상기 하이브리드 단백질을 코드하는 DNA 가, 식물 유래의 알코올데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역에 발현 가능하게 연결되어 있다.
알코올데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역이란, 알코올데하이드로게나아제를 코드하는 유전자의 전사 개시점으로부터 번역 개시점 (ATG, 메티오닌) 전까지의 염기 배열을 포함하는 영역을 말한다. 그 영역은, 번역량 증대 기능을 가지고 있다. 「번역량 증대 기능」 이란, 구조 유전자에 코드된 정보가, 전사 후, 번역되어 단백질이 산생될 때, 번역에 의해 산생되는 단백질량을 증대시키는 기능을 말한다. 상기 영역은 식물에서 유래하면 되지만, 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 유채과 (Brassicaceae), 장미과 (Rosaceae), 국화과 (Asteraceae) 에 속하는 식물, 더욱 바람직하게는 담배속 (Nicotiana), 애기장대속 (Arabidopsis), 딸기속 (Fragaria), 왕고들빼기속 (Lactuca) 등에 속하는 식물, 보다 바람직하게는 담배 (Nicotiana tabacum), 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 딸기 (Fragaria × ananassa), 양상추 (Lactuca sativa) 등에서 유래한다.
상기 알코올데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역으로는, 예를 들어 담배 (Nicotiana tabacum) 유래의 알코올데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역 (NtADH5'UTR) (배열 번호 67) 을 사용할 수 있고, 번역 개시점 상류 3 염기를 개변한 NtADH5'UTR 영역 (NtADHmod 5'UTR) (배열 번호 68) 을 사용함으로써 더욱 고번역을 기대할 수 있다.
식물 유래의 알코올데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역을 얻는 방법은, 예를 들어, 일본 공개특허공보 2012-19719호 및 국제 공개 WO2009/133882호 팜플렛에 기재되어 있다.
또, 배열 번호 68 의 염기 배열로 나타내는 바와 같은 상기 NtADHmod 5'UTR 은, 번역량 증대 기능을 유지하고 있는 한, 하나 또는 수 개의 염기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 가지고 있어도 된다. 상기 「수 개」 로는, 바람직하게는 2 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 개, 특히 바람직하게는 2 ∼ 3 개이다.
또, 상기 NtADHmod 5'UTR 과 바람직하게는 85 ％ 이상, 특히 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 번역량 증대 기능을 유지하고 있는 DNA 를 사용해도 된다.
상기 영역이 목적으로 하는 번역량 증대 기능을 갖는지의 여부에 대해서는, 예를 들어 담배 배양 세포에 있어서 GUS (β-글루쿠로니다아제) 유전자 또는 루시페라아제 유전자를 리포터 유전자로 한 트랜션트 어세이, 염색체에 삽입시킨 형질 전환 세포에서의 어세이 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 융합 단백질을 코드하는 제 1 DNA 구축물은, 예를 들어, 배열 번호 69 ∼ 71 로 나타내는 염기 배열을 갖는다 (도 1).
배열 번호 69 (ER LTB-ectGP5) 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, NtADHmod5'UTR (배열 번호 68) 에, LTB 단백질 (변이형 Asn90Ser) 및 ectGP5 단백질을 PG12 를 개재하여 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를, 카르복실 말단에 HA 태그 및 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다.
배열 번호 70 (Apo LTB-ectGP5) 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, NtADHmod5'UTR (배열 번호 68) 에, LTB 단백질 (변이형 Asn90Ser) 및 ectGP5 단백질을 PG12 를 개재하여 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를, 카르복실 말단에 HA 태그를 부가한 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다.
배열 번호 71 (Vac LTB-ectGP5) 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, NtADHmod5'UTR (배열 번호 68) 에, LTB 단백질 (변이형 Asn90Ser) 및 ectGP5 단백질을 PG12 를 개재하여 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를, 카르복실 말단에 HA 태그 및 액포 이행 시그널 펩티드를 부가한 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다.
배열 번호 72 (ER LTB) 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, NtADHmod5'UTR (배열 번호 68) 에, LTB 단백질 (변이형 Asn90Ser) 및 PG12 를 연결하고, 아미노 말단에 분비 시그널 펩티드를, 카르복실 말단에 HA 태그 및 소포체 잔류 시그널 펩티드를 부가한 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다.
본 발명에서 사용하는 전체 길이 엔벨로프 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 제 2 DNA 구축물은, 예를 들어, 배열 번호 73 ∼ 78 로 나타내는 염기 배열을 갖는다 (도 2).
배열 번호 73 (GP5-HA) 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, NtADHmod5'UTR (배열 번호 68) 에, 카르복실 말단에 HA 태그를 부가한 GP5 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다.
배열 번호 74 (GP5-Flag) 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, NtADHmod5'UTR (배열 번호 68) 에, 카르복실 말단에 Flag 태그를 부가한 GP5 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다.
배열 번호 75 (M-YFP-HA) 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, NtADHmod5'UTR (배열 번호 68) 에, 카르복실 말단에 YFP 태그 및 HA 태그를 부가한 M 단백질을 코드하는 DNA 를 연결한 DNA 구축물이다.
배열 번호 76 (GP5-HA/M-YFP-HA) 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, 상기 GP5-HA 및 M-YFP-HA 의 각각에 대해, 하기의 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 및 HSPT878 터미네이터를 전사 단위로서 사용하고, 서로 연결된 재조합 벡터이다.
배열 번호 77 (GP5-Flag/M-YFP-HA) 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, 상기 GP5-Flag 및 M-YFP-HA 의 각각에 대해, 하기의 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 및 HSPT878 터미네이터를 전사 단위로서 사용하고, 서로 연결된 재조합 벡터이다.
배열 번호 78 (GP5-Flag/GP4-YFP-HA) 로 나타내는 염기 배열을 갖는 DNA 구축물은, 상기 GP5-Flag 및 GP4-YFP-HA 의 각각에 대해, 하기의 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 및 HSPT878 터미네이터를 전사 단위로서 사용하고, 서로 연결된 재조합 벡터이다.
본 발명에서 사용하는 제 1 및 제 2 DNA 구축물은, 일반적인 유전자 공학적 수법에 의해 제조할 수 있고, 식물 유래의 알코올데하이드로게나아제 유전자의 5'-비번역 영역, 식물 유래의 분비 시그널 펩티드를 코드하는 DNA, 및 융합 단백질을 코드하는 DNA, 소포체 잔류 시그널 펩티드 또는 액포 이행 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 등의 각 DNA 를 각각 적당한 제한 효소에 의해 절단하고, 적당한 리가아제로 연결함으로써 구축할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 재조합 벡터는, 상기 제 1 또는 제 2 DNA 구축물을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용하는 재조합 벡터는, 상기 융합 단백질을 코드하는 DNA 또는 GP5 및 M 을 코드하는 DNA 가, 벡터가 도입되는 숙주 세포에 있어서 발현 가능하도록 벡터 내에 삽입되어 있으면 된다. 벡터는, 숙주 세포에 있어서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA 등을 들 수 있다. 또, 벡터는 약제 내성 유전자 등의 선택 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 플라스미드 DNA 는, 대장균이나 아그로박테륨으로부터 알칼리 추출법 (Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7 : 1513) 또는 그 변법 등에 의해 조제할 수 있다. 또, 시판되는 플라스미드로서, 예를 들어 pRI909, pRI910, pBI221, pBI121, pBI101, pIG121Hm 등을 사용할 수도 있다. 바이러스 DNA 로는, 예를 들어 pTB2 등을 사용할 수 있다 (Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88 : 7204 - 7208 을 참조).
벡터 내에서 사용되는 프로모터는, 벡터가 도입되는 숙주 세포에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (Odell et al. 1985 Nature 313 : 810), 벼의 액틴 프로모터 (Zhang et al. 1991 Plant Cell 3 : 1155), 옥수수의 유비퀴틴 프로모터 (Cornejo et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23 : 567), 양상추의 유비퀴틴 프로모터 (Hirai et al. 2011 Plant Cell Rep. 30 : 2255 - 65) 등이 바람직하게 사용된다. 또, 벡터 내에서 사용되는 터미네이터도, 동일하게 벡터가 도입되는 숙주 세포에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 노팔린 합성 효소 유전자 전사 터미네이터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 터미네이터, 애기장대 heat shock protein 18.2 유전자의 터미네이터 (HSPT) 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 터미네이터는, 예를 들어, Matsui et al., 2014 에 기재되는 바와 같은 배열 번호 79 로 나타내는 HSPT878 이다.
본 발명의 재조합 벡터는, 예를 들어 이하와 같이 하여 제조할 수 있다.
먼저, 상기 제 1 또는 제 2 DNA 구축물을 적당한 제한 효소로 절단 또는 PCR 에 의해 제한 효소 부위를 부가하고, 벡터의 제한 효소 부위 또는 멀티클로닝 사이트에 삽입한다.
본 발명에서 사용하는 형질 전환체는, 상기 재조합 벡터로 형질 전환되어 있는 것을 특징으로 한다. 형질 전환에 사용되는 숙주 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포 중 어느 것이어도 되지만, 소포 수송 경로를 갖는 진핵 세포가 바람직하다.
진핵 세포로는, 식물 세포가 바람직하게 사용되고, 그 중에서도 왕고들빼기속 (Lactuca) 등의 국화과 (Asteraceae), 가지과, 유채과, 장미과 (Rosaceae), 명아주과에 속하는 식물의 세포가 바람직하게 사용된다. 또한 왕고들빼기속 (Lactuca) 에 속하는 식물의 세포, 그 중에서도 양상추 (Lactuca sativa) 세포나, 딸기속 (Fragaria) 에 속하는 식물의 세포, 그 중에서도 딸기 (Fragaria × ananassa) 가 바람직하게 사용된다. 숙주 세포로서 양상추 세포를 사용하는 경우에는, 벡터는, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터나 양상추의 유비퀴틴 프로모터 (Hirai et al. 2011 Plant Cell Rep. 30 : 2255 - 65) 등을 사용할 수 있다. 또 효모 (Saccharomyces cerevisiae), 누룩 (Aspergillus) 등의 미생물을 사용할 수도 있다.
원핵 세포로는, 대장균 (Escherichia coli), 락트산균 (Lactobacillus), 고초균 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 아그로박테륨 (Agrobacteriumtumefaciens) 등이 사용된다.
본 발명에서 사용하는 형질 전환체는, 일반적인 유전자 공학적 수법을 사용하여, 본 발명에서 사용하는 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 아그로박테륨을 이용한 도입 방법 (Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2 : 218, Hiei, et al., 1994 Plant J. 6 : 271), 일렉트로포레이션법 (Tada, et al., 1990, Theor. Appl. Genet, 80 : 475), 폴리에틸렌글리콜법 (Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81 : 437), 파티클 건법 (Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5 : 27), 폴리카티온법 (Ohtsuki) 등의 방법을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에서 사용하는 벡터를 숙주 세포에 도입한 후, 선택 마커의 표현형에 의해 상기 형질 전환체를 선발할 수 있다. 또, 선발한 형질 전환체를 배양함으로써, 상기 융합 단백질 또는 GP5 및 M 을 생산할 수 있다. 배양에 사용하는 배지 및 조건은, 형질 전환체의 종에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또, 숙주 세포가 식물 세포인 경우에는, 선발한 식물 세포를 통상적인 방법에 따라 배양함으로써, 식물체를 재생할 수 있고, 식물 세포 내 또는 식물 세포의 세포막 외에 상기 GP5 단백질을 축적시킬 수 있다. 예를 들어, 식물 세포의 종류에 따라 상이하지만, 감자이면 Visser 등 (Theor. Appl. Genet 78 : 594 (1989)) 의 방법을 들 수 있고, 담배이면 Nagata 와 Takebe (Planta 99 : 12 (1971)) 의 방법을 들 수 있다.
양상추의 경우에는, 예를 들어 0.1 ㎎/ℓ 의 NAA (나프탈렌아세트산), 0.05 ㎎/ℓ 의 BA (벤질아데닌) 및 0.5 g/ℓ 의 폴리비닐피로리돈 (polyvinylpyrrolidone) 을 함유하는 MS 배지에서 슈트의 재생이 가능하고, 재생한 슈트를 0.5 g/ℓ 의 폴리비닐피로리돈 (polyvinylpyrrolidone) 을 함유하는 1/2 MS 배지에서 배양함으로써 발근이 가능하다.
또, 본 발명에서 사용하는 종자는, 상기와 같이 하여 재생한 식물체로부터 종자를 채취함으로써 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용하는 종자는 적당한 방법으로 파종하여 재배함으로써, 상기 GP5 단백질을 생산하는 식물체로 할 수 있고, 이와 같은 식물체도 상기 형질 전환체에 포함된다.
아그로박테륨 (Agrobacterium tumefaciens) 은 식물의 상처에 의해 감염시키는 것으로, 종양 유발성의 Ti (tumor-inducing) 플라스미드라고 불리는 큰 염색체 외인자를 운반한다. 많은 연구소에 있어서, 수년에 걸친 예의 연구 후, 아그로박테륨계의 개발에 의해, 여러 가지 식물 조직을 판에 받은 듯이 형질 전환하는 것이 가능해졌다. 이 기술에 의해 전환된 대표적인 식물로서, 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 유채의 씨, 감자, 포플러 및 대두, 딸기, 벼 등이 있다.
여러 가지 종의 식물에 대해, 아그로박테륨 (Agrobacterium tumefaciens) 으로 형질 전환된 조직으로부터 식물을 재생하는 것이 실증되어 있다. 이 식물로서, 해바라기, 토마토, 토끼풀, 유채, 코튼, 담배, 감자, 옥수수, 딸기, 벼, 그 밖의 다수의 야채 작물을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 아그로박테륨 Ti 벡터에 의해 상기 양상추를 비롯한 가식 식물을 형질 전환하는 것이 바람직하다.
본원 명세서 중에 있어서, GP5 바이러스 외영역과 아쥬반트 단백질의 융합 단백질, GP5 바이러스 외영역과 아쥬반트 단백질이 펩티드 링커를 개재하여 연결된 융합 단백질, 그 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 제 1 DNA 구축물, PRRS 바이러스의 GP5 및 M 을 코드하는 DNA 를 함유하는 제 2 DNA 구축물, 및 그 제 1 또는 제 2 DNA 구축물을 함유하는 벡터로 형질 전환된 식물 등을 총칭하여, PRRS 방제제라고 하는 경우가 있다. 또한, 본 발명의 PRRS 방제제는, 상기 융합 단백질을 함유하는 한, 또는 PRRS 바이러스의 GP5 및 M 을 코드하는 DNA 를 따로따로 함유하는 한, 백신 또는 면역 부활제 등의 의약 및 사료 중 어느 형태이어도 된다. 본 발명에 있어서, 방제란, 예방 및 치료 모두 포함하는 것이다.
본 발명의 PRRS 방제제는, PRRS 의 방제 (백신 효과, 면역 부활 효과 또는 치료 효과) 효과를 갖는다. 본 발명에서 말하는 PRRS 의 증상에는, 자돈에 있어서는 면역력의 저하, 체중 감소, 호흡기 질환이 포함되고, 모돈에 있어서는 번식 장해 (유산) 가 포함된다. PRRS 는 매크로파지에 감염되어 면역력을 저하시키기 때문에, 다른 질환 (마이코플라스마, 써코바이러스 등) 에 의한 2 차 감염의 리스크를 높이지만, 광의로는 다른 질환에 의한 증상도 PRRS 바이러스에 의한 증상으로 파악할 수 있다. 또 최근 중국을 중심으로 유행하고 있는 고병원성 PRRS 는, 단독 감염이어도 죽음에 이르는 경우가 있다.
본 발명의 PRRS 방제제는, 상기 형질 전환체를 함유하고 있어도 된다. 본 발명의 PRRS 방제제는, 상기 융합 단백질 또는 GP5 및 M 을 함유하는 형질 전환체 전부를 함유하고 있어도 되고, 일부를 함유하고 있어도 된다. 또, 형질 전환체를 그대로 사용할 수도 있고, 건조, 분쇄하거나 하여 사용할 수도 있다. 또, 본 발명의 PRRS 방제제에는, 융합 단백질 또는 GP5 및 M 의 면역원성을 높이는 다른 아쥬반트를 배합할 수도 있다. 일반적으로는, 수산화알루미늄, 콜레라 독소 (CTB), 세균의 편모 (鞭毛), 예를 들어 살모넬라의 플라젤린 등이 아쥬반트로서 사용된다.
본 발명의 PRRS 의 방제 방법은, 상기 DNA 구축물로 형질 전환된 식물체 또는 그 건조물 혹은 분쇄물을 동물에 투여하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 PRRS 방제제의 방제 대상으로는, 돼지를 들 수 있다.
본 발명의 PRRS 방제제를 돼지에 투여하는 방법으로는, 돼지의 사료에, 상기 DNA 구축물로 형질 전환된 식물체 또는 그 건조물 혹은 분쇄물을 혼합하여 돼지에게 주는 방법, 돼지에게 점비 (点鼻) 하는 방법 등을 들 수 있다. 이 경우의 투여량은, 융합 단백질 또는 GP5 및 M 의 질량으로서, 1 일당 바람직하게는 0.2 ㎎ 이상, 더욱 바람직하게는 0.5 ㎎ 이상이다. 본 발명의 PRRS 방제제는, 일정한 간격을 두고, 복수회 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 4 ∼ 7 일 간격으로, 합계 2 ∼ 3 회 투여하는 방법을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 식물 발현용 백신 유전자의 구축
PRRS 바이러스의 중화 에피토프인 것으로 알려져 있는 GP5 의 바이러스 외영역 (ectGP5) (Ostrowski et al., 2002) 을 백신 항원으로서 사용하여, 점막 아쥬반트 활성을 갖는 것으로 알려져 있는 LTB 에 융합하였다. 식물 세포 내에서의 축적 부위로서, 소포체, 아포플라스트, 액포에 수송되도록 디자인하였다. 또, PRRS 바이러스의 전체 길이 엔벨로프 단백질의 발현을 위해서, GP5, M, GP4 의 각 단백질 유전자를 구축하였다. 검출용 태그로서 YFP, HA, Flag 태그를 융합하였다. 자세한 것은 이하와 같다.
본 발명의 융합 단백질을 코드하는 DNA 구축물을 함유하는 벡터의 제조
LTB (Asn90Ser 변이체) 단편 (페리플라즘에 대한 분비 시그널 펩티드를 제외한 Ala22 내지 Asn124 까지의 영역) 을 이하의 요령으로 제조하였다. 이하의 2 개의 올리고뉴클레오티드를 3' 상보 말단을 개재하여 어닐한 후, T4 DNA polymerase (Toyobo, Fukui, Japan) 를 사용하여 신장 반응을 실시하였다. 1 단계째는 LTB-A 와 LTB-B, LTB-C 와 LTB-D, LTB-E 와 LTB-F, LTB-G 와 LTB-H, LTB-IN90S 와 LTB-J 를 사용하여, 각각 A+B, C+D, E+F, G+H, IN90S+J 단편을 제조하였다. 2 단계째의 반응에는, A+B 와 C+D, E+F 와 G+H 를 사용하여 A+B+C+D 와 E+F+G+H 단편을 제조하였다. 마지막으로 A+B+C+D 와 E+F+G+H 와 IN90S+J 를 사용하여, 전체 길이의 A+B+C+D+E+F+G+H+IN90S+J 단편을 제조하였다.
LTB-A : 5'-ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac-3' (배열 번호 80)
LTB-B : 5'-cgttgatggtgtagatttgggtgttgcggtactcgctgc-3' (배열 번호 81)
LTB-C : 5'-ccatcaacgacaagatcctcagctacaccgagagcatgg-3' (배열 번호 82)
LTB-D : 5'-cttgaaggtgatgatcaccatctccctcttgccggccatgctc-3' (배열 번호 83)
LTB-E : 5'-atcaccttcaagagcggcgagaccttccaggtcgaggtc-3' (배열 번호 84)
LTB-F : 5'-cttctggctgtcgatgtgctggctgccggggacctcgacctggaa-3' (배열 번호 85)
LTB-G : 5'-gacagccagaagaaggccatcgagaggatgaaggacaccctcaggatc-3' (배열 번호 86)
LTB-H : 5'-gcagagcttgtcgatcttggtctcggtgaggtaggtgatcctga-3' (배열 번호 87)
LTB-IN90S : 5'-aagctctgcgtctggaacagcaagaccccc-3' (배열 번호 88)
LTB-J : 5'-aaagatctgttctccatgctgatggcggcgatgctgttgggggtcttgttgttccagacgcagagctt-3' (배열 번호 89)
얻어진 LTB (Asn90Ser) 단편을 BamHI 와 BglII 로 절단한 후, Plasmid14 (Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 1628-34) 의 탈인산화한 BamHI-BglII 갭에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 BglII 로 처리한 후, 탈인산화하고, 인산화한 PG12 단편을 삽입하였다. 또한 PG12 단편은, PG12-F 프라이머 (5'-gatcccctggttctggtcctggttctccta-3') (배열 번호 90) 와 PG12-R 프라이머 (5'-gatctaggagaaccaggaccagaaccaggg-3') (배열 번호 91) 를 어닐링한 후 T4 polynucleotide kinase (PNK) (New England Biolabs, Hitchin, UK) 로 인산화하여 제조하였다.
얻어진 플라스미드를 BglII 로 처리한 후, 탈인산화하고, 인산화한 HA 단편을 삽입하였다 (LTBN90S-PG12-HA). 또한 HA 단편은, HA-F 프라이머 (5'-gatcttatccttatgattatcctgattatgctg-3') (배열 번호 92) 와 HA-R 프라이머 (5'-gatccagcataatcaggataatcataaggataa-3') (배열 번호 93) 를 어닐링한 후 T4 polynucleotide kinase (PNK) 로 인산화하여 제조하였다.
PRRSV 의 ectGP5 단편은, EDRD-1 주 (Yoshii et al., Arch Virol, 2005, 150 : 2313-24) 의 아미노산 배열을 기초로, Ser32 를 Ala 로, Asp33 을 Ser 로 치환한 인공 유전자를 합성하였다. ectGP5-2 (5'-tcg tcc tcc tcg cac ctc cag ctc atc tac aac ttg acc ctc-3') (배열 번호 95) 와 ectGP5-3 (5'-tt agatct ggt gcc gtt cag ctc gca gag ggt caa gtt gta-3') (배열 번호 96) 을 3' 상보 말단을 개재하여 어닐한 후, T4 DNA polymerase (Toyobo, Fukui, Japan) 를 사용하여 신장 반응을 실시하였다. 얻어진 ectGP5-2+3 단편을 열변성한 후에 ectGP5-1 (5'-aa gcatgc ggatcc aac gcc gcc tcc tcg tcc tcc tcg cac-3') (배열 번호 94) 과 어닐한 후, T4 DNA polymerase 를 사용하여 신장 반응을 실시하였다. 얻어진 ectGP5-1+2+3 단편을 BamHI 와 BglII 로 처리한 후, 상기 LTBN90S-PG12-HA 플라스미드를 BglII 로 처리하여 탈인산화한 벡터에 삽입하였다.
얻어진 플라스미드로부터 BamHI 와 SacI 를 사용하여 LTBN90S-PG12-ectGP5-HA-HDEL 단편을 잘라내고, 2BH 플라스미드 (Matsui et al., Transgenic Res., 2011, 20 ; 735-48) 의 BamHI-SacI 갭에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드로부터 SacI 와 EcoRI 를 사용하여 애기장대 열쇼크 단백질 유전자 전사 터미네이터 (HSPT) 를 제거하고, 장사슬 버전의 HSPT (HSPT878, Matsui et al., 2014) 의 SacI-EcoRI 단편을 삽입하였다. 이로써, pRI909 ER LTBN90S-PG12-ectGP5 (배열 번호 69) 플라스미드를 구축하였다 (도 1).
또, pRI909 Apo LTBN90S-PG12-ectGP5 (배열 번호 70) 와 pRI909 Vac LTBN90S-PG12-ectGP5 (배열 번호 71) 에 대해서는, ER LTB-ectGP5 의 구축에서 사용한 Plasmid14 대신에 Plasmid 13 과 15 (Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 1628-34) 를 각각 사용함으로써 동일하게 제조하였다 (도 1).
전체 길이의 GP5, M, GP4 를 코드하는 DNA 구축물을 함유하는 벡터의 제조
전체 길이의 GP5, M, GP4 단백질은 EDRD-1 주 (Yoshii et al., Arch Virol, 2005, 150 : 2313-24) 의 아미노산 배열을 기초로 이하의 요령으로 제조하였다. GP5 는 ectGP5 와 동일하게 Ser32 를 Ala 로, Asp33 을 Ser 로 치환하였다. 글리코프로테인 4 (Glycoprotein 4, GP4) 는 PRRS 바이러스의 엔벨로프 단백질의 하나이다. GP4 의 아미노산 배열은, 예를 들어, 배열 번호 51 에 의해 나타내고, 그 염기 배열은, 배열 번호 52 에 의해 나타낸다.
이하의 2 개의 올리고뉴클레오티드를 3' 상보 말단을 개재하여 어닐한 후, T4 DNA polymerase (Toyobo, Fukui, Japan) 를 사용하여 신장 반응을 실시하고, LTB 의 구축과 동일하게 각 전체 길이의 유전자를 합성하였다.
GP5-1 : 5'-aatgcatgttgggca agtgcttgac cgccggctgc-3' (배열 번호 97)
GP5-2 : 5'-gcaccacaagaaggggagcctggagcagcagccgg-3' (배열 번호 98)
GP5-3 : 5'-tctt gtggtgcatc gtgcccttct gcttggccgc c-3' (배열 번호 99)
GP5-4 : 5'-ggaggacgaggaggcggcgttcaccaaggcggcca-3' (배열 번호 100)
GP5-5 : 5'-tcg tcc tcc tcg cac ctc cag ctc atc tac aac ttg acc ctc-3' (배열 번호 101)
GP5-6 : 5'-accagtcggtgccgttcagctcgcagagggtcaag-3' (배열 번호 102)
GP5-7 : 5'-ccg actggttggc cgacaagttc gactgggccg tg-3' (배열 번호 103)
GP5-8 : 5'-tcaacacggggaagatcacgaagctctccacggcc-3' (배열 번호 104)
GP5-9 : 5'-ccgtgttga cccacatcgt gagctactgc gccttg-3' (배열 번호 105)
GP5-10 : 5'-cacggtgtccaagaagtggctggtggtcaaggcgc-3' (배열 번호 106)
GP5-11 : 5'-gacacc gtgggcttgg tggccgtgag caccgccgg-3' (배열 번호 107)
GP5-12 : 5'-gctcaacacgtatctgccgtggtagaagccggcgg-3' (배열 번호 108)
GP5-13 : 5'-cgt gttgagcagc atctacgccg tgtgcgcctt gg-3' (배열 번호 109)
GP5-14 : 5'-gcctgatcacgaagcacaccaaggcggccaaggcg-3' (배열 번호 110)
GP5-15 : 5'-tgatcaggct caccaagaac tgcatgagct ggaga-3' (배열 번호 111)
GP5-16 : 5'-agttggtgtatctggtgcagctgtatctccagctc-3' (배열 번호 112)
GP5-17 : 5'-ga tacaccaact tcttgttgga caccaagggc agg-3' (배열 번호 113)
GP5-18 : 5'-tgatcacggggctcctccatctgtagagcctgccc-3' (배열 번호 114)
GP5-19 : 5'-cccgtgatc atcgagaagg gcggcaaagt ggaagt-3' (배열 번호 115)
GP5-20 : 5'-tcaagtcgatcaagtggccctccacttccactttg-3' (배열 번호 116)
GP5-21 : 5'-tcgacttgaa gagggtggtg ttggacggca gcgcc-3' (배열 번호 117)
GP5-22 : 5'-ggtgatgggggtggcggcgctg-3' (배열 번호 118)
GP5-23 : 5'-ccccatcacc aaagtgagcg ccga-3' (배열 번호 119)
GP5-24 : 5'-ttagatctggggtggccccactgctcggcgctc-3' (배열 번호 120)
M-1 : 5'-aatgcatg ggcagca gcttggacga cttctgccac-3' (배열 번호 121)
M-2 : 5'-acactttctggggggcggtgctgtcgtggcagaag-3' (배열 번호 122)
M-3 : 5'-ccagaa agtgttgttg gccttcagca tcacctaca-3' (배열 번호 123)
M-4 : 5'-caaggcgtagatcatgatgggggtgtaggtgatgc-3' (배열 번호 124)
M-5 : 5'-ctacgcct tgaaagtgag caggggcagg ctcttgg-3' (배열 번호 125)
M-6 : 5'-caagaagatcaacaagtgcaacaagcccaagagcc-3' (배열 번호 126)
M-7 : 5'-gttgatcttc ttgaactgcg ccttcacctt cggct-3' (배열 번호 127)
M-8 : 5'-gctctggaagtgcacgaaggtcatgtagccgaagg-3' (배열 번호 128)
M-9 : 5'-cttccagag caccaacaaa gtggccttga ccatgg-3' (배열 번호 129)
M-10 : 5'-cccacaacaaggccaccacggcgcccatggtcaag-3' (배열 번호 130)
M-11 : 5'-gttgtggg gcgtgtacag cgccatcgag acctgga-3' (배열 번호 131)
M-12 : 5'-agcctgcatctgctggtgatgaatctccaggtctc-3' (배열 번호 132)
M-13 : 5'-gatgcagg ctctgcttgt tgggcaggaa gtacatc-3' (배열 번호 133)
M-14 : 5'-ctccacgtggtgggcgggggccaagatgtacttcc-3' (배열 번호 134)
M-15 : 5'-cacgtgga gagcgccgcc ggcttccacc ccatcgc-3' (배열 번호 135)
M-16 : 5'-accacgaaggcgtggttgtcgctggcggcgatggg-3' (배열 번호 136)
M-17 : 5'-ccttcg tggtgaggag gcccggcagc accaccgtg-3' (배열 번호 137)
M-18 : 5'-gccgggcaccaaggtgccgttcacggtggt-3' (배열 번호 138)
M-19 : 5'-tgcccggc ttgaagagct tggtg-3' (배열 번호 139)
M-20 : 5'-tcttcacggccttcctgccgcccaacaccaagctc-3' (배열 번호 140)
M-21 : 5'-gccgtgaaga ggggcgtggt gaacttg-3' (배열 번호 141)
M-22 : 5'-ttagatctcttggcgtacttcaccaagttcaccac-3' (배열 번호 142)
GP4-1 : 5'-aatgcatg gccgcca gcttgttgtt cttgttggtg-3' (배열 번호 143)
GP4-2 : 5'-ggctcaccaagaagcactcgaagcccaccaacaag-3' (배열 번호 144)
GP4-3 : 5'-ggt gagccaggcc ttcgcctgca agccctgctt c-3' (배열 번호 145)
GP4-4 : 5'-gtcttgatgtcgctcaagctgctgctgaagcaggg-3' (배열 번호 146)
GP4-5 : 5'-gaca tcaagaccaa caccaccgcc gccgccagct t-3' (배열 번호 147)
GP4-6 : 5'-agcagctgatgtcctgcaacacggcgaagctggcg-3' (배열 번호 148)
GP4-7 : 5'-catc agctgcttga ggcacggcga cagcagcccc c-3' (배열 번호 149)
GP4-8 : 5'-ctgcactgcctgctcttcctgatggtctgggggct-3' (배열 번호 150)
GP4-9 : 5'-gcagtgcagg accgccatcg gcacccccgt gtaca-3' (배열 번호 151)
GP4-10 : 5'-tcggtcacgttggcggtgatggtgatgtacacggg-3' (배열 번호 152)
GP4-11 : 5'-cgtgaccga cgagaactac ttgcacagca gcgact-3' (배열 번호 153)
GP4-12 : 5'-gaacaagcagctgctcaacatcaacaagtcgctgc-3' (배열 번호 154)
GP4-13 : 5'-gctgcttgt tctacgccag cgagatgagc gagaag-3' (배열 번호 155)
GP4-14 : 5'-cgttgccgaacaccactttgaagcccttctcgctc-3' (배열 번호 156)
GP4-15 : 5'-cggcaac gtgagcggca tcgtggccgt gtgcgtga-3' (배열 번호 157)
GP4-16 : 5'-acgtgctgcacgtagctggtgaagttcacgcacac-3' (배열 번호 158)
GP4-17 : 5'-gcagca cgtgagggag ttcacccaga ggagcttgg-3' (배열 번호 159)
GP4-18 : 5'-gtgcaagagcctcacgtggtccaccaccaagctcc-3' (배열 번호 160)
GP4-19 : 5'-gctct tgcacttcat gacccccgag accatgag-3' (배열 번호 161)
GP4-20 : 5'-acggtggcccatctcatggtctc-3' (배열 번호 162)
GP4-21 : 5'-gccaccgt gttggcctgc ttgttcgcca-3' (배열 번호 163)
GP4-22 : 5'-ttagatctgatggccaacaagatggcgaacaagc-3' (배열 번호 164)
개시 코돈 근방 배열 개변형 담배 알코올데하이드로게나아제 유전자의 5' 비번역 영역 (NtADHmod 5'-UTR) 을, ADH-221 (Sato et. al., 2004) 을 주형으로 하여, ADH XbaI-F 프라이머 (5'-aatctagagtctatttaactcagtattcagaaacaacaaaa-3') (배열 번호 165) 및 ADHmod NsiI-R 프라이머 (5'-aaatgcatcttttttcttgatttccttcac-3') (배열 번호 166) 를 사용한 PCR 에 의해 증폭시켰다. 얻어진 DNA 단편을 XbaI 와 NsiI 로 처리하고, GP5 단편을 NsiI 와 BglII 로 처리한 단편과 함께, Plasmid 14 (Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 1628-34) 의 XbaI-BglII 갭에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 NsiI 로 절단한 후 셀프 라이게이션하고, NtADHmod 5'-UTR 의 개시 코돈 (atg) 과 GP5 의 개시 코돈이 일치하도록 융합하였다. 얻어진 플라스미드를 BglII 로 절단하고, HA 단편을 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 주형으로서 사용하여, ADH KpnI-F 프라이머 (5'-aaggtacctatttaactcagtattcagaaacaacaaaa-3') (배열 번호 167) 와 NOST-R 프라이머 (5'-tgccaaatgtttgaacgatc-3') (배열 번호 168) 를 사용하여 PCR 을 실시하여 NtADHmod 5'-UTR-GP5-HA 단편을 증폭시키고, 얻어진 단편을 pRI909 ER LTBN90S-PG12-ectGP5 의 KpnI-Sac 갭에 삽입하였다 (GP5-HA) (배열 번호 73) (도 2). GP5-Flag 에 대해서는, 전술한 HA 단편 대신에 Flag 단편을 삽입하여 제조하였다. 또한 Flag 단편은 Flag-F (5'-gatctgattataaggatgacgatgacaagg-3') (배열 번호 171) 와 Flag-R (5'-gatcccttgtcatcgtcatccttataatca-3') (배열 번호 172) 을 어닐링하여 제조하였다.
전술한 NtADHmod 5'-UTR 을 XbaI 와 NsiI 로 처리하고, M 혹은 GP4 단편을 NsiI 와 BglII 로 처리한 단편과 함께, Plasmid 14 (Matsui et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 1628-34) 의 XbaI-BglII 갭에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 각각 NsiI 로 절단한 후, 셀프 라이게이션하고, NtADHmod 5'-UTR 의 개시 코돈 (atg) 과 M 혹은 GP4 의 개시 코돈이 일치하도록 융합하였다. YFP 유전자 단편 (pEYFP, Clontech) 을 YFP-F (5'-tttggatcc agcaagggcgaggagctgttca-3') (배열 번호 169) 와 YFP-R (5'-tttagatct cttgtacagctcgtccatgccgag-3') (배열 번호 170) 을 사용하여 증폭시킨 후 BamHI 와 BglII 로 절단하고, BglII 로 절단 후에 탈인산화 처리한 전술한 GP4 혹은 M 플라스미드에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 BglII 로 절단하고, HA 단편을 삽입하였다. 얻어진 단편을 주형으로서 사용하고, ADH KpnI-F 프라이머 (배열 번호 167) 와 NOST-R 프라이머 (배열 번호 168) 를 사용하여 PCR 을 실시하여 NtADHmod 5'-UTR-M/GP4-YFP-HA 단편을 증폭시키고, 얻어진 단편을 pRI909 ER LTBN90S-PG12-ectGP5 의 KpnI-Sac 갭에 삽입하였다 (M-YFP-HA (배열 번호 75), GP4-YFP-HA) (도 2).
GP5 와 M 혹은 GP4 를 공발현하는 카세트는 이하의 요령으로 구축하였다. GP5-HA 를 SpeI 와 EcoRI 로 처리하여 HSPT878 의 하류를 절단하고, 35Spro-NtADHmod 5'-UTR-M/GP4-HA-HSPT878 의 XbaI-EoRI 단편을 삽입하였다 (GP5-HA/M-YFP-HA) (배열 번호 76). 동일하게 GP5-Flag 를 사용하여 GP5-Flag/M-YFP-HA (배열 번호 77) 와 GP5-Flag/GP4-YFP-HA (배열 번호 78) 를 제조하였다.
실시예 2. 프로토플라스트를 사용한 일과성 발현 실험
프로토플라스트를 사용한 일과성 발현은, Matsui et al., 2011, Transgenic Res. 20(4) : 735-48 에 따라 실시하였다.
3 종류의 LTB 융합 ectGP5 에 대해, 담배 배양 세포 (Nicotiana tabacumL. cv. BY2) (리켄 바이오리소스 센터) 및 양상추 프로토플라스트 (Lactucasativa L. cv. greenwave) (타키이 종묘) 로 일과성 발현을 실시하였다. 그 결과, BY2 와 양상추의 양 숙주에 있어서, 소포체, 아포플라스트, 액포 중 어느 구획형에서도 축적을 확인하였다 (도 3).
실시예 3. 담배 배양 세포에의 유전자 도입
담배 배양 세포의 형질 전환은, Nakayama et al., 2000, Plant Physiol. 122 : 1239-47 에 따라 실시하였다.
각 백신을 담배 배양 세포의 안정 형질 전환체로 발현하였다. LTB 융합 ectGP5 는 소포체, 아포플라스트, 액포 중 어느 형에서도 축적을 확인하였다 (도 4).
전체 길이의 엔벨로프 단백질의 발현에서는, GP5-HA, M-YFP-HA, GP4-HA 모두 축적을 확인하였다. 또 단독 발현보다 M 과 공발현하는 편이 GP5 의 축적이 상승하는 것을 알아내었다. 이 축적량 상승 효과는, GP4 와의 공발현에서는 볼 수 없었다 (도 5).
실시예 4. 아그로박테륨에 의한 양상추에의 유전자 도입
이하와 같이, ER LTB-ectGP5, GP5-HA, GP5-HA/M-YFP-HA 의 3 종류에 대해 유전자 재조합 양상추를 제조하였다.
양상추 (Lactuca sativa L.) 품종 그린 웨이브 (타키이 종묘) 를 MS 배지 [1/2 × 무라시게·스쿠그 배지용 혼합 염류 (MS 염, 와코우 순약 공업), 1 × Murashige and Skoog vitamin solution (MS 비타민, Sigma-Aldrich), 3 ％ 수크로오스, 0.8 ％ 한천, pH5.8] 에 무균 파종 후, 10 - 16 일째의 본엽을 가로세로 5 ㎜ 정도로 절단하고, 본 절편을 벡터 컨스트럭트를 갖는 바이너리 플라스미드 (pRI909) 를 유지하는 아그로박테륨 (Agrobacterium tumefacience EHA105) 현탁액에 10 분간 침지 후, 공존 배지 [1 × MS 염, 1 × MS 비타민, 0.05 ㎎/ℓ 6-벤질아미노푸린 (BA), 0.1 ㎎/ℓ 1-나프틸아세트산 (NAA), 0.1 M 아세토시린곤, 3 ％ 수크로오스, 0.8 ％ 한천, pH5.8] 에 치상 (置床) 하고, 25 ℃, 암소 (暗所) 에서 2 일간 배양하였다. 절편을 멸균수로 세정 후, 선발 배지 [1 × MS 염, 1 × MS 비타민, 0.05 ㎎/ℓ BA, 0.1 ㎎/ℓ NAA, 0.5 g/ℓ 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 50 ㎎/ℓ 카나마이신 (Km), 250 ㎎ 세포탁심 (Cef), 3 ％ 수크로오스, 0.8 ％ 한천, pH5.8] 에 치상하고, 25 ℃, 형광등하 (2000 - 3000 lux) 에서 배양을 실시하였다. 이후, 부정아 (不定芽) 가 얻어질 때까지 3 - 4 일간에 1 회 (2 회/주) 의 간격으로 새로운 선발 배지에의 이식을 실시하였다. 부정아로부터 형성된 재분화 개체는 발근 배지 [1/2 × MS 염, 1 × MS 비타민, 0.5 g/ℓ PVP, 250 ㎎ Cef, 3 ％ 수크로오스, 0.8 ％ 한천, pH5.8] 에 이식하고, 동 조건에서 배양을 실시하였다. 이후, 3 - 4 일간에 1 회 (2 회/주) 의 간격으로 새로운 발근 배지에의 이식을 실시하였다. 발근한 재분화 개체는 화분에 심고, 동 조건에서 재배를 실시하였다.
실시예 5. 식물로부터의 단백질 추출
단백질 추출은 TCA-아세톤 법 (acetone 법) (Shultz et al. Plant Mol Biol Rep, 2005, 23 : 405) 에 따라, 액체 질소 동결 후, -80 ℃ 에서 보존한 유전자 도입 양상추 본엽을 사용하여 실시하였다. 100 - 200 ㎎ 의 샘플을 TissueLyzer II (QIAGEN) 를 사용하여 파쇄 후, 샘플의 5 배량의 TCA-아세톤 (10 ％ 트리클로로아세트산, 90 ％ 아세톤, 0.07 ％ 2-메르캅토에탄올) 을 첨가, 혼합하고, -20 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 16,000 × g, 4 ℃, 30 분간 원심 조작을 실시하고, 상청을 제거하여, 단백질을 함유하는 침전을 얻었다. 또한 협잡물을 제거하기 위해, 샘플의 5 배량의 아세톤 (acetone)/BME (100 ％ 아세톤, 0.07 ％ 2-메르캅토에탄올) 를 첨가, 혼합하고, 16,000 × g, 4 ℃, 10 분간 원심 조작을 실시하고, 상청을 제거하였다. 본 협잡물 제거 조작은 추가로 2 회 실시하였다. 침전은 감압 건조 후, 샘플의 2 배량의 추출 I 버퍼 [0.5 M 염화나트륨, 5 mM 이미다졸, 6 M 우레아, 20 mM 트리스하이드록시메틸아미노메탄 (Tris)-HCl, pH7.9] 에 현탁하고, 16,000 × g, 4 ℃, 10 분간 원심을 실시하고, 상청을 회수, 단백질 용액을 얻었다. 단백질 농도의 측정은, Protein Assay Kit II (Bio-Rad) 를 사용하여 실시하였다.
실시예 6. 웨스턴 해석
얻어진 단백질 용액을 마이크로 튜브에 적당량 넣고, 동량의 샘플 버퍼 (EZ Apply, ATTO 제조) 를 첨가하여 혼합하고, 비등수 중에서 5 분간 가온하여, 샘플의 SDS 화를 실시하였다. 단백질 정량시의 표준 물질에는 정제 LTB (LTB (Asn90)) 를 사용하였다. 이것을 추출 I 버퍼로 2 배 희석을 반복함으로써 희석 계열을 제조하고, 이들 희석 계열을 스탠더드로서 사용하였다.
단백질의 전기 영동 (SDS-PAGE) 은, 전기 영동조 (미니프로티안 Tetra 셀) 및 미니프로티안 TGX-겔 (BIO RAD) 을 사용하였다. 전기 영동 버퍼 (EZ Run, ATTO 제조) 를 넣고, 웰에 SDS 화한 샘플을 5 ㎕ 어플라이하고, 200 V 정전압으로 40 분간 실시하였다.
전기 영동 후의 겔은, 트랜스 블롯 전사 팩 (BIO RAD) 을 사용하여, 트랜스 블롯 Turbo (BIO RAD) 로 블로팅을 실시하였다.
블로팅 후의 멤브레인은 블로킹 용액 (TBS 계, pH7.2, 나칼라이 테스크) 에 담그고, 실온에서 1 시간 진탕 또는 4 ℃ 에서 16 시간 가만히 정지시킨 후, TBS-T (137 mM 염화나트륨, 2.68 mM 염화칼륨, 1 ％ 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4) 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하여 세정하였다.
재조합 단백질의 검출에는, 1 차 항체 TBS-T 에서 10,000 배 희석시켜 사용하였다. 본 희석액 중에 멤브레인을 담그고, 실온에서 2 시간 진탕함으로써 항원 항체 반응을 실시하고, TBS-T 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하고 세정하였다. 2 차 항체는 TBS-T 에서 10,000 배 희석시키고, 본 희석액 중에 멤브레인을 담그고, 실온에서 1 시간 진탕함으로써 항원 항체 반응을 실시하고, TBS-T 중에서 실온, 5 분간의 진탕을 3 회 실시하여 세정하였다.
항 HA 태그 :
1 차 항체 항 HA 항체 (Roche, Cat No. 11-867-423-001)
2 차 항체 Anti-Rat IgG, AP-conjugate (Promega, Cat No. S3831)
항 FLAG 태그 :
1 차 항체 항 FLAG 항체 (SIGMA, Cat No. F1804)
2 차 항체 Anti-Rabbit IgG, AP-linked Antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY, Cat No. 7054S)
알칼리포스파타아제에 의한 발색 반응은, 발색액 (0.1 M 염화나트륨, 5 mM 염화마그네슘, 0.33 ㎎/㎖ 니트로블루-테트라졸륨, 0.33 ㎎/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-인산, 0.1 M Tris-HCl, pH9.5) 중에 멤브레인을 담그고, 실온에서 7 분간 진탕함으로써 실시하고, 멤브레인을 증류수로 세정한 후, 상온에서 건조시켰다. 발색한 멤브레인은 스캐너 (PM-A900, 엡손) 에 의해 해상도 600 dpi 로 화상화하고, 화상 해석 소프트 (CS Analyzer ver. 3.0, 아토) 를 사용하여, 항원 단백질의 정량을 실시하였다. 항원으로서, 전체 길이 GP5-LTB 를 사용했을 경우 (비특허문헌 4 에 대응), 전체 길이 GP5 를 사용했을 경우 (비교예에 대응), 전체 길이 GP5/M 을 사용했을 경우 (본 발명 2 에 대응), LTB-ectGP5 를 사용했을 경우 (본 발명 1 에 대응) 의 항원 축적량의 비교를 이하의 표 1 에 나타낸다. 전체 길이 GP5 만 발현시켰을 경우보다, 전체 길이 GP5 와 M 을 동시에 발현시키는 편이 2.5 배 이상 항원의 축적량이 많은 것을 알 수 있었다. 또 비특허문헌 4 (전체 길이 GP5-LTB) 보다 LTB-ectGP5 쪽이 400 배 이상 항원 (ectGP5) 의 축적량이 많은 것을 알 수 있었다.
Figure pct00001
그 결과, 어느 컨스트럭트를 사용한 경우도 재조합 항원의 축적을 확인하였다. 또 담배 배양 세포와 동일하게, 단독 발현보다, GP5 와 M 을 발현하는 쪽이 GP5 의 축적이 상승하였다 (도 6).
실시예 7. PRRS 바이러스 감염 방어 시험
ER LTB-ectGP5 (백신 1) 및 GP5-HA/M-YFP-HA (백신 2) 의 2 종류에 대해, 백신 양상추의 경구 투여에 의한 PRRS 바이러스 예방 효과 확인 시험을 실시하였다. 음성 대조로서 공벡터 (pRI909) 재조합 양상추를 사용하였다. 분만 후 9, 16, 29, 30, 31, 36, 37, 38, 43, 44, 45, 51, 52 일째에 동결 건조된 백신 양상추 혹은 공벡터 양상추의 동결 건조 분말 (0.5 g/회) 을 물에 현탁하고, 튜브를 접속한 시린지로 강제 투여하였다.
감염 바이러스를 DMEM (10 ％ 비동화가 끝난 우태아 혈청, 100 U/㎖ penicillin, 100 U/㎖ 스트렙토마이신 첨가) 으로 컨플루언트까지 증식시킨 MA-104 주 (아프리카 녹색 원숭이 신세포) (ATCC 수탁 번호 CRL-2378) 에 감염시키고, CO2 인큐베이터 내에서 37 ℃, 6 일간 배양하였다. 배양 후, 원심분리 (3,000 rpm, 15 분간) 를 실시하고, 상청을 바이러스 현탁액으로 하였다. 65 일령의 돼지의 양 비강 내에 캐니언 스프레이를 사용하여 바이러스 희석액을 투여하였다. 투여 바이러스량은, 1 마리당 8.89 × 108 카피 (copies) 이었다.
공격 후, 체중, 사료 섭취량, 체온을 측정하였다. 또 정기적으로 채혈하고, ELISA 에 의해 PRRSV 특이적 항체가를 측정하였다. STEC 에 의한 공격 21 일째에 안락사 후, 부검을 실시하여, 각 장기 및 조직의 이상을 육안적으로 관찰하였다. 주요 장기의 병리 표본을 제조하여, 병리 조직학적 소견을 관찰하였다.
그 결과, 호흡 증상이나 체온에 대해서는 군간에서 차이는 관찰되지 않았다. 증체중에 대해서는, 백시네이션 기간에서는 군간에서는 차이는 없었지만, 공격 후 3 주간에서, 백신 투여군에서 증체중이 양호한 경향이 관찰되었다 (도 7).
실시예 8. 재조합 단백질의 효모에서의 발현
도 12 에 나타내는 바와 같은 효모에서의 재조합 단백질 발현용의 유전자 컨스트럭트를 준비하였다. 먼저, 효모의 소포 수송 경로에 재조합 단백질을 수송하기 위해서, 효모 인베르타아제의 분비 시그널 펩티드를 이용하였다 (SUCSP, Hashimoto et al., Protein Engineering, 1998 2 ; 75-77). SUCSP 의 DNA 단편은 이하와 같이 조제하였다. HindIII-SUCSP-F 프라이머 (5'-aaagcttaagatgcttttgcaagccttccttttcctcttggctggtttcgccgccaag-3' (배열 번호 173), 밑줄은 HindIII 사이트) 와 BamHI-SUC2SP-R 프라이머 (5'-aaggatccggcagaaatcttggcggcgaaaccagccaagag-3' (배열 번호 174), 밑줄은 BamHI 사이트) 를 어닐링한 후, T4 DNA 폴리메라아제로 처리하였다. 계속해서 HindIII 과 BamHI 로 절단하였다. LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 에 상당하는 DNA 단편 (NA 는 North American 을 의미하고, + 는 N-결합형 당 사슬 부가 부위가 있는 것을 나타낸다) 을 BamHI 와 SacI 로 ER LTB-ectGP5 (배열 번호 69) 로부터 잘라내었다. SUCSP 및 LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 를 BamHI 사이트를 개재하여 라이게이션하고, pYES2 (Invitrogen) 의 HindIII-SacI 갭에 삽입하여 pYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 를 제조하였다. 얻어진 플라스미드의 염기 배열은 T7 프로모터 프라이머 (T7 pro F) (5'-taatacgactcactataggg-3' (배열 번호 175)) 및 pYES2-R 프라이머 (5'-gtaagcgtgacataactaattacatga-3' (배열 번호 176)) 를 사용하여 확인하였다.
유럽형 바이러스주의 ectGP5 (ectGP5 (EU)(+) ; DGSGSSSTYQYIYNLTICELNGT (배열 번호 177), N-결합형 당 사슬 부가 부위를 밑줄로 나타낸다) 는, EURO type-F 프라이머 (5'-aaggatccgacggctccgggtcctcctcgacctaccagtacatctacaacttgaccatctgc-3' (배열 번호 178), 밑줄은 BamHI 사이트), HDEL-SacI-R 프라이머 (5'-aagagctcacaattcatcatgttcaga-3' (배열 번호 179), 밑줄은 SacI 사이트) 및 주형으로서 LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 를 사용하여 PCR 을 실시하여 제조하였다. 얻어진 ectGP5 (EU)(+) 의 단편을 BamHI 와 SacI 로 절단하고, LTB-PG12 혹은 LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 의 C 말단에 융합하여 LTB-PG12-ectGP5 (EU)(+) 혹은 LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+)-ectGP5 (EU)(+) 를 제조하였다.
LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+)-PG12-ectGP5 (EU)(+) 의 구축은, LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+)-ectGP5 (EU)(+) 를 주형으로 한 인버스 PCR 에 의해 ectGP5 (NA)(+) 와 ectGP5 (EU)(+) 사이에 PG12 를 삽입하여 실시하였다.
N-결합형 당 사슬이 부가되는 아스파라긴을 세린으로 치환한 LTB-PG12-ectGP5 (NA)(-) 는 이하의 요령으로 제조하였다. LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 를 주형으로 하고, LTB 1F 프라이머 (5'-ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac-3' (배열 번호 180), 밑줄은 BamHI 사이트) 와 ectGP5 (NA) deglycosylation-R 프라이머 (5'-tttagatctggtgccggacagctcgcagagggtcaaggagtagat-3' (배열 번호 181), 밑줄은 BglII 사이트) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 증폭된 DNA 단편은 BamHI 와 BglI 로 절단하고, pYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 의 탈인산화한 BamHI-BglII 갭에 삽입하여 LTB-PG12-ectGP5 (NA)(-) 를 제조하였다.
ectGP5 (NA) 가 LTB 의 N 말단에 부가된 융합 항원의 구축은 이하와 같이 실시하였다. PG12 의 N 말단측 배열을 부가한 ectGP5 (NA) 를, HindIII-SUCSP-F 프라이머와 PGGP5-R 프라이머 (5'-gagaaccaggaccagaaccaggggatctggtgccgttcagctcgcagagggtcaagtt-3' (배열 번호 182), 밑줄로 나타낸 것은 PG12 의 N 말단측 배열이고, 그 이후는 ectGP5 의 배열을 나타낸다) 및 주형으로서 pYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 를 사용하여 PCR 을 실시하여 증폭시켰다. 또, PG12 의 C-말단측 배열을 부가한 LTB 를, PGLTB-F 프라이머 (5'-cctggttctggtcctggttctcctagatccgccccccagaccatcaccga-3' (배열 번호 183), 밑줄로 나타낸 것은 PG12 의 C 말단측 배열이고, 그 이후는 LTB 영역의 배열을 나타낸다) 와 LTB-BglII-R 프라이머 (5'-aaagatctgttctccatgctgatggcggcgatgctgttgggggtcttgttgttccagacgcagagctt-3' (배열 번호 184), 밑줄은 BglII 사이트) 및 주형으로서 pYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 를 사용하여 PCR 을 실시하여 증폭시켰다. 양 PCR 산물을 혼합하여 PG12 영역에서 어닐링하고, NA ectGP5-F 프라이머 (5'-aagcatgcggatccaacgccgcctcctcgtcctcctcgcac-3' (배열 번호 185), 밑줄은 BamHI 사이트) 와 LTB-BglII-R 프라이머를 사용하여 2nd PCR 을 실시하였다. 얻어진 DNA 단편을 BamHI 와 BglII 로 절단하고, pYES2 SUCSP-LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 의 탈인산화한 BamHI-BglII 갭에 삽입하여 ectGP5 (NA)(+)-PG12-LTB 를 제조하였다.
N-결합형 당 사슬 부가 부위에 변이를 도입한 ectGP5 (NA)(-)-PG12-LTB 도 기본적으로 동일한 방법으로 구축하였다. 단, PGGP5-R 프라이머 대신에 PGGP5minusGly-R 프라이머 (5'-gagaaccaggaccagaaccaggggatctggtgccggacagctcgcagagggtcaaggagtagat-3' (배열 번호 186), 밑줄로 나타낸 것은 PG12 의 N 말단측 배열이고, 그 이후는 ectGP5 영역의 배열을 나타낸다) 를 사용하였다.
LTB 와 Stx2eB 의 융합 단백질에 추가로 ectGP5 를 융합한 Stx2eB-PG12-LTB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 와 LTB-PG12-Stx2eB-PG12-ectGP5 (NA)(+) 는 이하와 같이 구축하였다. Stx2eB-PG12-LTB-PG12 와 LTB-PG12-Stx2eB-PG12 의 DNA 단편은 일본 특허출원 2013-243932 에 기재된 방법으로 제조하였다. 각 단편을 ectGP5 (NA)(+) 에 융합하여 pYES2 에 삽입하였다.
각 유전자 컨스트럭트를 효모에 도입하여 발현시켰다.
효모 (Saccharomyces cerevisiaeINVSc1, Invitrogen) 의 형질 전환은 S. c. EasyCompTM Transformation Kit (Invitrogen) 에 첨부된 방법에 따라 실시하였다. LTB 융합 단백질은 갈락토오스 처리를 12 시간 실시하여 발현 유도하였다. 갈락토오스 유도 후, 효모 배양액 200 ㎕ 와 2 × SDS-PAGE sample buffer (EZ Apply, ATTO) 200 ㎕ 를 혼합하고, 95 ℃ 에서 5 분간 열처리를 실시하였다. 얻어진 샘플 4 ㎕ 를 SDS-PAGE 에 제공하였다. 웨스턴 해석은, 항 HA 항체 (No. 11 867 423 001, Roche) 혹은 항 LT 독소 항체를 사용하여 실시하였다. 각 컨스트럭트에 대해, 독립된 2 클론을 해석하였다. 그 결과, 도 13 에 나타내는 바와 같이, 각 재조합 단백질의 발현을 확인할 수 있고, 당 사슬 부가 산물에 대응하는 밴드도 확인할 수 있었지만, 당 사슬 부가 부위에 변이를 도입한 것은 당 사슬 부가 산물은 볼 수 없었다. ectGP5 (NA)(+) 와 ectGP5 (EU)(+) 의 융합에 있어서는 사이에 PG12 를 부가함으로써 축적량이 상승하였다.
산업상 이용가능성
본 발명의 융합 단백질은 축산 분야에서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Idemitsu Kosan Co., Ltd. <120> An agent for preventing and treating porcine reproductive and respiratory syndrome <130> 140253-15220 <150> JP2014-163108 <151> 2014-08-08 <160> 187 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 200 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 1 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Pro Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Leu Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30 Asp Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Ala Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Val Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ile Thr Lys Val 180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Gly His Pro 195 200 <210> 2 <211> 606 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 2 atgttgggca agtgcttgac cgccggctgc tgctccaggc tccccttctt gtggtgcatc 60 gtgcccttct gcttggccgc cttggtgaac gcctccgact cgtcctcctc gcacctccag 120 ctcatctaca acttgaccct ctgcgagctg aacggcaccg actggttggc cgacaagttc 180 gactgggccg tggagagctt cgtgatcttc cccgtgttga cccacatcgt gagctactgc 240 gccttgacca ccagccactt cttggacacc gtgggcttgg tggccgtgag caccgccggc 300 ttctaccacg gcagatacgt gttgagcagc atctacgccg tgtgcgcctt ggccgccttg 360 gtgtgcttcg tgatcaggct caccaagaac tgcatgagct ggagatacag ctgcaccaga 420 tacaccaact tcttgttgga caccaagggc aggctctaca gatggaggag ccccgtgatc 480 atcgagaagg gcggcaaagt ggaagtggag ggccacttga tcgacttgaa gagggtggtg 540 ttggacggca gcgccgccac ccccatcacc aaagtgagcg ccgagcagtg gggccacccc 600 agatct 606 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 3 Asn Ala Ser Asp Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 4 <211> 72 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 4 aacgcctccg actcgtcctc ctcgcacctc cagctcatct acaacttgac cctctgcgag 60 ctgaacggca cc 72 <210> 5 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized polypeptide <400> 5 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Pro Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Leu Ala Ala Leu Val Asn Ala Ala 20 25 30 Ser Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Ala Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Val Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ile Thr Lys Val 180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Gly His Pro 195 200 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized polypeptide <400> 6 Asn Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 7 <211> 200 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 7 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Cys Cys Cys Ser Arg Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30 Asn Asn Asn Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Gln Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ala Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val 180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu 195 200 <210> 8 <211> 200 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 8 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Cys Cys Cys Ser Arg Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu Ala Asn 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Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 13 Met Arg Cys Ser His Lys Leu Gly Arg Phe Leu Thr Pro His Ser Cys 1 5 10 15 Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Ala 20 25 30 Asp Gly Asn Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Ser His Phe Gly Trp 50 55 60 Ala Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly 85 90 95 Ala Val Ser Thr Ala Gly Phe Val Gly Gly Arg Tyr Val Leu Cys Ser 100 105 110 Val Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Val Ile Arg 115 120 125 Ala Ala Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr 130 135 140 Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Val His Arg Trp Lys Ser Pro 145 150 155 160 Ile Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Asp Gly Asn Leu Val 165 170 175 Thr Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gln Pro Leu Thr 180 185 190 Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala 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reproductive and respiratory syndrome virus <400> 29 Val Asp Gly Asn Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 30 <211> 24 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 30 Ala Asp Gly Ser Gly Asn Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 31 Ala Asp Gly Asn Gly Asn Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 32 Ala Asp Gly Asn Gly Asn Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Met 1 5 10 15 Thr Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 33 <211> 24 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 33 Ala Asp Gly Asn Gly Asn Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 34 <211> 24 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 34 Ala Asp Gly Asn Gly Asn Ser Ser Thr Tyr Leu Tyr Ile Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 35 <211> 174 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 35 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gln 1 5 10 15 Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Ile Met Ile Tyr 20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val His 50 55 60 Phe Gln Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Arg Phe Ile Thr 85 90 95 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110 Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Ser 115 120 125 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu 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cagaagaagg ccatcgagag gatgaaggac accctcagga tcacctacct caccgagacc 240 aagatcgaca agctctgcgt ctggaacaac aagaccccca acagcatcgc cgccatcagc 300 atggagaac 309 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 55 Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA <400> 56 agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcc 36 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 57 Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser Pro Gly Ser Arg 1 5 10 15 Ser <210> 58 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA <400> 58 agatcccctg gttctggtcc tggttctcct agatcccctg gttccagatc t 51 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 59 Arg Ser Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ser Pro Arg Ser Pro Gly Ser Gly 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417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificially synthesized polynucleotide <400> 62 gccccccaga ccatcaccga gttgtgcagc gagtaccgca acacccaaat ctacaccatc 60 aacgacaaga tcctcagcta caccgagagc atggccggca agagggagat ggtgatcatc 120 accttcaaga gcggcgagac cttccaggtc gaggtccccg gcagccagca catcgacagc 180 cagaagaagg ccatcgagag gatgaaggac accctcagga tcacctacct caccgagacc 240 aagatcgaca agctctgcgt ctggaacagc aagaccccca acagcatcgc cgccatcagc 300 atggagaaca gatcccctgg ttctggtcct ggttctccta gatctaacgc cgcctcctcg 360 tcctcctcgc acctccagct catctacaac ttgaccctct gcgagctgaa cggcacc 417 <210> 63 <211> 24 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 63 Met Gly Arg Met Ser Ile Pro Met Met Gly Phe Val Val Leu Cys Leu 1 5 10 15 Trp Ala Val Val Ala Glu Gly Ser 20 <210> 64 <211> 72 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 64 atggggagaa tgtcaatacc catgatgggt tttgtggtgt tatgtctatg ggcagtggta 60 gcagaaggat cc 72 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 65 His Asp Glu Leu 1 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 66 Asp Leu Leu Val Asp Thr Met 1 5 <210> 67 <211> 91 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 67 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaata a 91 <210> 68 <211> 91 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 68 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaaaa g 91 <210> 69 <211> 640 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA construct <400> 69 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaaaa gatggggaga atgtcaatac ccatgatggg 120 ttttgtggtg ttatgtctat gggcagtggt agcagaagga ggatccgccc cccagaccat 180 caccgagttg tgcagcgagt accgcaacac ccaaatctac accatcaacg acaagatcct 240 cagctacacc gagagcatgg ccggcaagag ggagatggtg atcatcacct tcaagagcgg 300 cgagaccttc caggtcgagg tccccggcag ccagcacatc gacagccaga agaaggccat 360 cgagaggatg aaggacaccc tcaggatcac ctacctcacc gagaccaaga tcgacaagct 420 ctgcgtctgg aacagcaaga cccccaacag catcgccgcc atcagcatgg agaacagatc 480 ccctggttct ggtcctggtt ctcctagatc taacgccgcc tcctcgtcct cctcgcacct 540 ccagctcatc tacaacttga ccctctgcga gctgaacggc accagatctt atccttatga 600 ttatcctgat tatgctggat ctgaacatga tgaattgtga 640 <210> 70 <211> 625 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA construct <400> 70 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaaaa gatggggaga atgtcaatac ccatgatggg 120 ttttgtggtg ttatgtctat gggcagtggt agcagaagga ggatccgccc cccagaccat 180 caccgagttg tgcagcgagt accgcaacac ccaaatctac accatcaacg acaagatcct 240 cagctacacc gagagcatgg ccggcaagag ggagatggtg atcatcacct tcaagagcgg 300 cgagaccttc caggtcgagg tccccggcag ccagcacatc gacagccaga agaaggccat 360 cgagaggatg aaggacaccc tcaggatcac ctacctcacc gagaccaaga tcgacaagct 420 ctgcgtctgg aacagcaaga cccccaacag catcgccgcc atcagcatgg agaacagatc 480 ccctggttct ggtcctggtt ctcctagatc taacgccgcc tcctcgtcct cctcgcacct 540 ccagctcatc tacaacttga ccctctgcga gctgaacggc accagatctt atccttatga 600 ttatcctgat tatgctggat cttga 625 <210> 71 <211> 646 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA construct <400> 71 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaaaa gatggggaga atgtcaatac ccatgatggg 120 ttttgtggtg ttatgtctat gggcagtggt agcagaagga ggatccgccc cccagaccat 180 caccgagttg tgcagcgagt accgcaacac ccaaatctac accatcaacg acaagatcct 240 cagctacacc gagagcatgg ccggcaagag ggagatggtg atcatcacct tcaagagcgg 300 cgagaccttc caggtcgagg tccccggcag ccagcacatc gacagccaga agaaggccat 360 cgagaggatg aaggacaccc tcaggatcac ctacctcacc gagaccaaga tcgacaagct 420 ctgcgtctgg aacagcaaga cccccaacag catcgccgcc atcagcatgg agaacagatc 480 ccctggttct ggtcctggtt ctcctagatc taacgccgcc tcctcgtcct cctcgcacct 540 ccagctcatc tacaacttga ccctctgcga gctgaacggc accagatctt atccttatga 600 ttatcctgat tatgctggat ctgatttgtt ggttgatact atgtga 646 <210> 72 <211> 562 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA construct <400> 72 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaaaa gatggggaga atgtcaatac ccatgatggg 120 ttttgtggtg ttatgtctat gggcagtggt agcagaagga ggatccgccc cccagaccat 180 caccgagttg tgcagcgagt accgcaacac ccaaatctac accatcaacg acaagatcct 240 cagctacacc gagagcatgg ccggcaagag ggagatggtg atcatcacct tcaagagcgg 300 cgagaccttc caggtcgagg tccccggcag ccagcacatc gacagccaga agaaggccat 360 cgagaggatg aaggacaccc tcaggatcac ctacctcacc gagaccaaga tcgacaagct 420 ctgcgtctgg aacagcaaga cccccaacag catcgccgcc atcagcatgg agaacagatc 480 ccctggttct ggtcctggtt ctcctagatc ttatccttat gattatcctg attatgctgg 540 atctgaacat gatgaattgt ga 562 <210> 73 <211> 733 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA construct <400> 73 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaaaa gatgttgggc aagtgcttga ccgccggctg 120 ctgctccagg ctccccttct tgtggtgcat cgtgcccttc tgcttggccg ccttggtgaa 180 cgccgcctcc tcgtcctcct cgcacctcca gctcatctac aacttgaccc tctgcgagct 240 gaacggcacc gactggttgg ccgacaagtt cgactgggcc gtggagagct tcgtgatctt 300 ccccgtgttg acccacatcg tgagctactg cgccttgacc accagccact tcttggacac 360 cgtgggcttg gtggccgtga gcaccgccgg cttctaccac ggcagatacg tgttgagcag 420 catctacgcc gtgtgcgcct tggccgcctt ggtgtgcttc gtgatcaggc tcaccaagaa 480 ctgcatgagc tggagataca gctgcaccag atacaccaac ttcttgttgg acaccaaggg 540 caggctctac agatggagga gccccgtgat catcgagaag ggcggcaaag tggaagtgga 600 gggccacttg atcgacttga agagggtggt gttggacggc agcgccgcca cccccatcac 660 caaagtgagc gccgagcagt ggggccaccc cagatcttat ccttatgatt atcctgatta 720 tgctggatct tga 733 <210> 74 <211> 730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA construct <400> 74 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaaaa gatgttgggc aagtgcttga ccgccggctg 120 ctgctccagg ctccccttct tgtggtgcat cgtgcccttc tgcttggccg ccttggtgaa 180 cgccgcctcc tcgtcctcct cgcacctcca gctcatctac aacttgaccc tctgcgagct 240 gaacggcacc gactggttgg ccgacaagtt cgactgggcc gtggagagct tcgtgatctt 300 ccccgtgttg acccacatcg tgagctactg cgccttgacc accagccact tcttggacac 360 cgtgggcttg gtggccgtga gcaccgccgg cttctaccac ggcagatacg tgttgagcag 420 catctacgcc gtgtgcgcct tggccgcctt ggtgtgcttc gtgatcaggc tcaccaagaa 480 ctgcatgagc tggagataca gctgcaccag atacaccaac ttcttgttgg acaccaaggg 540 caggctctac agatggagga gccccgtgat catcgagaag ggcggcaaag tggaagtgga 600 gggccacttg atcgacttga agagggtggt gttggacggc agcgccgcca cccccatcac 660 caaagtgagc gccgagcagt ggggccaccc cagatctgat tataaggatg acgatgacaa 720 gggatcttga 730 <210> 75 <211> 1372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized DNA construct <400> 75 tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60 agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaaaa gatgggcagc agcttggacg acttctgcca 120 cgacagcacc gccccccaga aagtgttgtt ggccttcagc atcacctaca cccccatcat 180 gatctacgcc ttgaaagtga gcaggggcag gctcttgggc ttgttgcact tgttgatctt 240 cttgaactgc gccttcacct tcggctacat gaccttcgtg cacttccaga gcaccaacaa 300 agtggccttg accatgggcg ccgtggtggc cttgttgtgg ggcgtgtaca gcgccatcga 360 gacctggaga ttcatcacca gcagatgcag gctctgcttg ttgggcagga agtacatctt 420 ggcccccgcc caccacgtgg agagcgccgc cggcttccac cccatcgccg ccagcgacaa 480 ccacgccttc gtggtgagga ggcccggcag caccaccgtg aacggcacct tggtgcccgg 540 cttgaagagc ttggtgttgg gcggcaggaa ggccgtgaag aggggcgtgg tgaacttggt 600 gaagtacgcc aagagatcca gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct 660 ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg 720 cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt 780 gccctggccc accctcgtga ccaccttcgg ctacggcctg cagtgcttcg cccgctaccc 840 cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 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cgagggacct ataaacctcc cttcatcatg 1980 ctatttcatg atctatttta taaaataaag atgtagaaaa aagtaagcgt aataaccgca 2040 aaacaaatga tttaaaacat ggcacataat gaggagatta agttcggttt acgtttattt 2100 tagtactaat tgtaacgtga gactacgtat cgggaatcgc ctaattaaag cattaatgcg 2160 aacctgatta gattcaccga ccctcctatc gtgtcgacct ttctgtttct tagaattttt 2220 tggtagtcta tgtactaata atgtcagctt cgtatttatt tcataagcaa tttgcatttg 2280 caatttgttt tttactttta tttttattgt attgtggaat gtggactcgt accaacatga 2340 agttatatac caccaaaaaa attacagtta gtcaaaagat tcacgagtga gagctactta 2400 tgattgtctt ttacgtatat gtctaattgt ctatttgctc aataatcttt gtactttctt 2460 ttgtcgttga taaaatcaca aagttccaaa agtaatcgaa tgatttgctt ttaagaaaag 2520 aagagctcaa taattcaaca tatatctgta cactagatta gccttttcaa tttcagaaag 2580 aatgctaacc cacagatggt tagagaggct tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac 2640 ccgagcaata atctccagga aatcaaatac cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa 2700 agattcagga ctaactgcat caagaacaca gagaaagata tatttctcaa gatcagaagt 2760 actattccag tatggacgat tcaaggcttg cttcacaaac caaggcaagt aatagagatt 2820 ggagtctcta aaaaggtagt tcccactgaa tcaaaggcca tggagtcaaa gattcaaata 2880 gaggacctaa cagaactcgc cgtaaagact ggcgaacagt tcatacagag tctcttacga 2940 ctcaatgaca agaagaaaat cttcgtcaac atggtggagc acgacacact tgtctactcc 3000 aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg 3060 gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag 3120 atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc 3180 gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc 3240 gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc 3300 actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa 3360 ggaagttcat ttcatttgga gagaacacgc ccgggtacct atttaactca gtattcagaa 3420 acaacaaaag ttcttctcta cataaaattt tcctatttta gtgatcagtg aaggaaatca 3480 agaaaaaaag atgggcagca gcttggacga cttctgccac gacagcaccg ccccccagaa 3540 agtgttgttg gccttcagca tcacctacac ccccatcatg atctacgcct tgaaagtgag 3600 caggggcagg ctcttgggct tgttgcactt gttgatcttc ttgaactgcg ccttcacctt 3660 cggctacatg accttcgtgc acttccagag caccaacaaa gtggccttga ccatgggcgc 3720 cgtggtggcc ttgttgtggg gcgtgtacag cgccatcgag acctggagat tcatcaccag 3780 cagatgcagg ctctgcttgt tgggcaggaa gtacatcttg gcccccgccc accacgtgga 3840 gagcgccgcc ggcttccacc ccatcgccgc cagcgacaac cacgccttcg tggtgaggag 3900 gcccggcagc accaccgtga acggcacctt ggtgcccggc ttgaagagct tggtgttggg 3960 cggcaggaag gccgtgaaga ggggcgtggt gaacttggtg aagtacgcca agagatccag 4020 caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 4080 aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 4140 gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 4200 caccttcggc tacggcctgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 4260 cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 4320 cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 4380 catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 4440 gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 4500 ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 4560 ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 4620 ctaccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 4680 gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaaga gatcttatcc 4740 ttatgattat cctgattatg ctggatcttg atcttgaaat caagctagct tatcgatacc 4800 gtcgacctcg agggggggcc cggtacccgg gagctcaata tgaagatgaa gatgaaatat 4860 ttggtgtgtc aaataaaaag ctagcttgtg tgcttaagtt tgtgtttttt tcttggcttg 4920 ttgtgttatg aatttgtggc tttttctaat attaaatgaa tgtaagatct cattataatg 4980 aataaacaaa tgtttctata atccattgtg aatgttttgt tggatctctt cgcatataac 5040 tactgtatgt gctatggtat ggactatgga atatgattaa agataagact agatgggctc 5100 atagagtaaa acgaggcgag ggacctataa acctcccttc atcatgctat ttcatgatct 5160 attttataaa ataaagatgt agaaaaaagt aagcgtaata accgcaaaac aaatgattta 5220 aaacatggca cataatgagg agattaagtt cggtttacgt ttattttagt actaattgta 5280 acgtgagact acgtatcggg aatcgcctaa 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gggtcttgtt gttccagacg 60 cagagctt 68 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 90 gatcccctgg ttctggtcct ggttctccta 30 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 91 gatctaggag aaccaggacc agaaccaggg 30 <210> 92 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 92 gatcttatcc ttatgattat cctgattatg ctg 33 <210> 93 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 93 gatccagcat aatcaggata atcataagga taa 33 <210> 94 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 94 aagcatgcgg atccaacgcc gcctcctcgt cctcctcgca c 41 <210> 95 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 95 tcgtcctcct cgcacctcca gctcatctac aacttgaccc tc 42 <210> 96 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 96 ttagatctgg tgccgttcag ctcgcagagg gtcaagttgt a 41 <210> 97 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 97 aatgcatgtt gggcaagtgc ttgaccgccg gctgc 35 <210> 98 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 98 gcaccacaag aaggggagcc tggagcagca gccgg 35 <210> 99 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 99 tcttgtggtg catcgtgccc ttctgcttgg ccgcc 35 <210> 100 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 100 ggaggacgag gaggcggcgt tcaccaaggc ggcca 35 <210> 101 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 101 tcgtcctcct cgcacctcca gctcatctac aacttgaccc tc 42 <210> 102 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 102 accagtcggt gccgttcagc tcgcagaggg tcaag 35 <210> 103 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 103 ccgactggtt ggccgacaag ttcgactggg ccgtg 35 <210> 104 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 104 tcaacacggg gaagatcacg aagctctcca cggcc 35 <210> 105 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 105 ccgtgttgac ccacatcgtg agctactgcg ccttg 35 <210> 106 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 106 cacggtgtcc aagaagtggc tggtggtcaa ggcgc 35 <210> 107 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 107 gacaccgtgg gcttggtggc cgtgagcacc gccgg 35 <210> 108 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 108 gctcaacacg tatctgccgt ggtagaagcc ggcgg 35 <210> 109 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 109 cgtgttgagc agcatctacg ccgtgtgcgc cttgg 35 <210> 110 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 110 gcctgatcac gaagcacacc aaggcggcca aggcg 35 <210> 111 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 111 tgatcaggct caccaagaac tgcatgagct ggaga 35 <210> 112 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 112 agttggtgta tctggtgcag ctgtatctcc agctc 35 <210> 113 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 113 gatacaccaa cttcttgttg gacaccaagg gcagg 35 <210> 114 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 114 tgatcacggg gctcctccat ctgtagagcc tgccc 35 <210> 115 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 115 cccgtgatca tcgagaaggg cggcaaagtg gaagt 35 <210> 116 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 116 tcaagtcgat caagtggccc tccacttcca ctttg 35 <210> 117 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 117 tcgacttgaa gagggtggtg ttggacggca gcgcc 35 <210> 118 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 118 ggtgatgggg gtggcggcgc tg 22 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 119 ccccatcacc aaagtgagcg ccga 24 <210> 120 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 120 ttagatctgg ggtggcccca ctgctcggcg ctc 33 <210> 121 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 121 aatgcatggg cagcagcttg gacgacttct gccac 35 <210> 122 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 122 acactttctg gggggcggtg ctgtcgtggc agaag 35 <210> 123 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 123 ccagaaagtg ttgttggcct tcagcatcac ctaca 35 <210> 124 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 124 caaggcgtag atcatgatgg gggtgtaggt gatgc 35 <210> 125 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 125 ctacgccttg aaagtgagca ggggcaggct cttgg 35 <210> 126 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 126 caagaagatc aacaagtgca acaagcccaa gagcc 35 <210> 127 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 127 gttgatcttc ttgaactgcg ccttcacctt cggct 35 <210> 128 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 128 gctctggaag tgcacgaagg tcatgtagcc gaagg 35 <210> 129 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 129 cttccagagc accaacaaag tggccttgac catgg 35 <210> 130 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 130 cccacaacaa ggccaccacg gcgcccatgg tcaag 35 <210> 131 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 131 gttgtggggc gtgtacagcg ccatcgagac ctgga 35 <210> 132 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 132 agcctgcatc tgctggtgat gaatctccag gtctc 35 <210> 133 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 133 gatgcaggct ctgcttgttg ggcaggaagt acatc 35 <210> 134 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 134 ctccacgtgg tgggcggggg ccaagatgta cttcc 35 <210> 135 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 135 cacgtggaga gcgccgccgg cttccacccc atcgc 35 <210> 136 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 136 accacgaagg cgtggttgtc gctggcggcg atggg 35 <210> 137 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 137 ccttcgtggt gaggaggccc ggcagcacca ccgtg 35 <210> 138 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 138 gccgggcacc aaggtgccgt tcacggtggt 30 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 139 tgcccggctt gaagagcttg gtg 23 <210> 140 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 140 tcttcacggc cttcctgccg cccaacacca agctc 35 <210> 141 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 141 gccgtgaaga ggggcgtggt gaacttg 27 <210> 142 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 142 ttagatctct tggcgtactt caccaagttc accac 35 <210> 143 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 143 aatgcatggc cgccagcttg ttgttcttgt tggtg 35 <210> 144 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 144 ggctcaccaa gaagcactcg aagcccacca acaag 35 <210> 145 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 145 ggtgagccag gccttcgcct gcaagccctg cttc 34 <210> 146 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 146 gtcttgatgt cgctcaagct gctgctgaag caggg 35 <210> 147 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 147 gacatcaaga ccaacaccac cgccgccgcc agctt 35 <210> 148 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 148 agcagctgat gtcctgcaac acggcgaagc tggcg 35 <210> 149 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 149 catcagctgc ttgaggcacg gcgacagcag ccccc 35 <210> 150 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 150 ctgcactgcc tgctcttcct gatggtctgg gggct 35 <210> 151 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 151 gcagtgcagg accgccatcg gcacccccgt gtaca 35 <210> 152 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 152 tcggtcacgt tggcggtgat ggtgatgtac acggg 35 <210> 153 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 153 cgtgaccgac gagaactact tgcacagcag cgact 35 <210> 154 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 154 gaacaagcag ctgctcaaca tcaacaagtc gctgc 35 <210> 155 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 155 gctgcttgtt ctacgccagc gagatgagcg agaag 35 <210> 156 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 156 cgttgccgaa caccactttg aagcccttct cgctc 35 <210> 157 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 157 cggcaacgtg agcggcatcg tggccgtgtg cgtga 35 <210> 158 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 158 acgtgctgca cgtagctggt gaagttcacg cacac 35 <210> 159 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 159 gcagcacgtg agggagttca cccagaggag cttgg 35 <210> 160 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 160 gtgcaagagc ctcacgtggt ccaccaccaa gctcc 35 <210> 161 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 161 gctcttgcac ttcatgaccc ccgagaccat gag 33 <210> 162 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 162 acggtggccc atctcatggt ctc 23 <210> 163 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 163 gccaccgtgt tggcctgctt gttcgcca 28 <210> 164 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 164 ttagatctga tggccaacaa gatggcgaac aagc 34 <210> 165 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 165 aatctagagt ctatttaact cagtattcag aaacaacaaa a 41 <210> 166 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 166 aaatgcatct tttttcttga tttccttcac 30 <210> 167 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 167 aaggtaccta tttaactcag tattcagaaa caacaaaa 38 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 168 tgccaaatgt ttgaacgatc 20 <210> 169 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 169 tttggatcca gcaagggcga ggagctgttc a 31 <210> 170 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 170 tttagatctc ttgtacagct cgtccatgcc gag 33 <210> 171 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 171 gatctgatta taaggatgac gatgacaagg 30 <210> 172 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer <400> 172 gatcccttgt catcgtcatc cttataatca 30 <210> 173 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 173 aaagcttaag atgcttttgc aagccttcct tttcctcttg gctggtttcg ccgccaag 58 <210> 174 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 174 aaggatccgg cagaaatctt ggcggcgaaa ccagccaaga g 41 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 175 taatacgact cactataggg 20 <210> 176 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 176 gtaagcgtga cataactaat tacatga 27 <210> 177 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ectGP5(EU) <400> 177 Asp Gly Ser Gly Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr 20 <210> 178 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 178 aaggatccga cggctccggg tcctcctcga cctaccagta catctacaac ttgaccatct 60 gc 62 <210> 179 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 179 aagagctcac aattcatcat gttcaga 27 <210> 180 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 180 ttggatccgc cccccagacc atcaccgagt tgtgcagcga gtac 44 <210> 181 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 181 tttagatctg gtgccggaca gctcgcagag ggtcaaggag tagat 45 <210> 182 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 182 gagaaccagg accagaacca ggggatctgg tgccgttcag ctcgcagagg gtcaagtt 58 <210> 183 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 183 cctggttctg gtcctggttc tcctagatcc gccccccaga ccatcaccga 50 <210> 184 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 184 aaagatctgt tctccatgct gatggcggcg atgctgttgg gggtcttgtt gttccagacg 60 cagagctt 68 <210> 185 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 185 aagcatgcgg atccaacgcc gcctcctcgt cctcctcgca c 41 <210> 186 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 186 gagaaccagg accagaacca ggggatctgg tgccggacag ctcgcagagg gtcaaggagt 60 agat 64 <210> 187 <211> 69 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 187 Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu 1 5 10 15 Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp Thr Asn 20 25 30 Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met 35 40 45 Thr Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly Phe Ala 50 55 60 Gln Val Lys Phe Asn 65

Claims (25)

  1. 돼지 번식·호흡 장해 증후군 (PRRS) 바이러스의 글리코프로테인 5 (Glycoprotein 5, GP5) 의 바이러스 외영역 (ectGP5) 과 아쥬반트 단백질을 함유하는 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이러스 외영역은, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 30 위치의 아스파라긴으로부터 53 위치의 스레오닌으로 이루어지는 아미노산 배열, 또는 당해 아미노산 배열과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열을 갖고, PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는, 융합 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 GP5 가 유럽형 또는 북미형인, 융합 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 GP5 가 유럽형 I, II 형 및 북미형 II, III, IV 형 중 어느 형인, 융합 단백질.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이러스 외영역은, 배열 번호 3, 6, 21 ∼ 34 로 나타내는 아미노산 배열 또는 배열 번호 6 과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열을 갖고, PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는, 융합 단백질.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아쥬반트 단백질이 대장균 이열성 독소 B 서브 유닛 (LTB) 및/또는 2 형 쉬가 독소 서브 클래스 e(Stx2e) 의 B 서브 유닛 (Stx2eB) 인, 융합 단백질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스 외영역 및 상기 아쥬반트 단백질이 펩티드 링커를 개재하여 연결되어 있는, 융합 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 펩티드 링커의 아미노산 개수가 5 ∼ 25 개인, 융합 단백질.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 링커가 PG12 (배열 번호 55), PG17 (배열 번호 57), 혹은 PG22 (배열 번호 59), 또는 배열 번호 55, 57 혹은 59 와의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열로 나타내는, 융합 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서,
    배열 번호 61 의 아미노산 배열 또는 배열 번호 61 과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열로 나타내는, 융합 단백질.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 코드하는 DNA.
  12. 제 11 항에 기재된 DNA 를 함유하는 DNA 구축물.
  13. 돼지 번식·호흡 장해 증후군 (PRRS) 바이러스의 글리코프로테인 5 (GP5) 를 코드하는 DNA 및 메트릭스 프로테인 (Matrix protein, M) 을 코드하는 DNA 를 함유하고, 각 DNA 는 각각 프로모터 및 터미네이터와 연결된, DNA 구축물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 GP5 를 코드하는 DNA 는, 배열 번호 1, 7 ∼ 20 으로 나타내는 아미노산 배열 또는 배열 번호 1 과의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열을 코드하는 DNA 이고, 상기 GP5 는 PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는, DNA 구축물.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    상기 GP5 를 코드하는 DNA 는, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 32 위치의 세린이 알라닌으로 치환되고, 또한 33 위치의 아스파르트산이 세린으로 치환되어 있는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 를 함유하는, DNA 구축물.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 M 이 유럽형 또는 북미형인, DNA 구축물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 M 이 유럽형 I, II 형 및 북미형 II, III, IV 형 중 어느 형인, DNA 구축물.
  18. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 M 은, 배열 번호 35, 37 ∼ 50 으로 나타내는 아미노산 배열 또는 배열 번호 35 와의 동일성이 80 ％ 이상인 아미노산 배열을 갖고, PRRS 바이러스에 대한 예방 효과를 유도할 수 있는, DNA 구축물.
  19. 제 12 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 구축물을 함유하는 재조합 벡터.
  20. 제 19 항에 기재된 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 형질 전환체가 식물인, 형질 전환체.
  22. 제 21 항에 기재된 형질 전환체 또는 그것으로부터 얻어진 단백질을 함유하는 PRRS 방제제.
  23. 제 22 항에 기재된 방제제를 돼지에 투여하는 것을 특징으로 하는 PRRS 의 치료 또는 예방 방법.
  24. 소포 수송 경로를 구비한 진핵 생물을, 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 구축물을 함유하는 재조합 벡터로 형질 전환하는 것을 특징으로 하는, 진핵 생물의 동일 세포 내에서 GP5 와 M 을 발현시키는 방법.
  25. 소포 수송 경로를 구비한 진핵 생물을, 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 구축물을 함유하는 재조합 벡터로 형질 전환하고, 그 진핵 생물의 동일 세포 내에서 GP5 와 M 을 발현시키는 것을 포함하는, PRRS 방제제의 제조 방법.
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