JP6497679B2 - 大腸菌症用ワクチン - Google Patents
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Description
感染有機体の特異的ビルレンス決定子に抗する分泌型IgA(sIgA)抗体は、粘膜免疫性において重要な役割を果たす。多くの場合、感染有機体の関連ビルレンス決定子に抗する粘膜sIgAレベルの生産を刺激することにより、粘膜表面の初期感染を防止することができる。分泌型IgAは、付着及び/又は集落化をブロックし、表面作用毒素を中和し、又は宿主細胞の侵入を防止することにより、病原体の粘膜表面との初期相互作用を防止できる。
特許文献2には、遺伝子組換え植物に、ブタ浮腫病ワクチン抗原と大腸菌性下痢症抗原を連結して高蓄積させるための技術が開示されている。しかしながら、特許文献2では、当該組換え植物が実際にワクチンとして利用可能かどうかを確認する課題が残されていた。また、特許文献2では、(1)大腸菌易熱性毒素Bサブユニット(LTB)とStx2eBの融合順序、及び(2)LTBに付加されるN-結合型糖鎖が、それぞれ、植物細胞内での抗原蓄積やワクチン性能に対する影響については検討されていない。
非特許文献1では、遺伝子組換え大腸菌を用いてStx2eB-LTB融合抗原を発現・精製し、その性能評価がなされている。しかしながら、宿主として、イチゴやレタス等の植物を用いた性能評価はなされていない。また、LTBとStx2eBの融合順序が、植物細胞内での抗原蓄積・ワクチン性能に対して及ぼす影響について検討されていない。さらに、Stx2eB-LTB融合抗原について、Stx2e毒素予防効果は確認しているが、LT毒素予防の観点からの評価はなされていない。また、動物への投与は注射(アジュバント添加有)で行われており、より簡便かつ低コストな手法である経口投与(アジュバント添加無し)での免疫誘導有無は確認されていない。
また、本発明者らは、大腸菌易熱性毒素Bサブユニット(LTB)の90位のAsn残基にN−結合型の糖鎖が付加されていることにより、植物細胞内での高生産でき、かつ、防除剤(ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果)として有効であることを見出した。
本発明者らは、このようにして本発明を完成するに至った。
(1)志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質を含む大腸菌症防除剤。
(2)志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットがペプチドリンカーを介して融合されている、(1)に記載の防除剤。
(3)志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットが共にBサブユニットである、(1)または(2)に記載の防除剤。
(4)志賀毒素サブユニットのBサブユニットの73位のAsn残基がSerに変更されている、(3)に記載の防除剤。
(5)大腸菌易熱性毒素のBサブユニットに糖鎖が付加されている、(3)または(4)に記載の防除剤。
(6)大腸菌易熱性毒素のBサブユニットの90位のAsn残基にN−結合型の糖鎖が付加されている、(5)に記載の防除剤。
(7)志賀毒素のC末端側に大腸菌易熱性毒素が融合されている、(1)〜(6)のいずれか1項に記載の防除剤。
(8)志賀毒素のN末端側に大腸菌易熱性毒素が融合されている、(1)〜(6)のいずれか1項に記載の防除剤。
(9)大腸菌易熱毒素に対する抗体を誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、(1)〜(8)のいずれか1項に記載の防除剤。
(10)IgAを誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、(9)に記載の防除剤。
(11)IgGを誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、(9)に記載の防除剤。
(12)大腸菌症が大腸菌性下痢症である、(1)〜(11)のいずれか1項に記載の防除剤。
(13)大腸菌症がブタ浮腫病及び大腸菌性下痢症の両方である、(12)に記載の防除剤。
(14)(1)〜(13)のいずれか1項に記載の防除剤を含む飼料。
(15)志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物を含む組み換えベクターで形質転換した可食植物を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の大腸菌症を防除する方法。
(16)大腸菌症の防除に用いるための志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質。
(17)大腸菌症防除剤の製造のための志賀毒素のサブユニットと大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質の使用。
本発明の大腸菌症防除剤により、ブタ浮腫病と大腸菌性下痢を同時に予防することができる。
本発明では、可食植物にタンパク抗原を蓄積させ経口投与するため、省コスト化、省力化、家畜のストレス軽減による生産性の向上が期待できる。
本発明の大腸菌症防除剤は、大腸菌症の症状を予防することができる、または治療することができる。健康な状態の非ヒト動物に本発明の大腸菌症防除剤を与えると、ワクチン効果や免疫賦活剤としての効果が期待できる。
志賀毒素(Stx)は、腸管出血性大腸菌(EHEC, STEC)が産生するタンパク質性毒素で、1型(Stx1)及び2型(Stx2)に分けられる。Stx1は、a〜dのサブクラスに、Stx2はa〜gのサブクラスにそれぞれ分類される。毒性本体であるAサブユニット1分子と腸管粘膜への結合に働くBサブユニット5分子からなるホロ毒素で、真核細胞のリボソームに作用して、タンパク質合成を阻害する働きを持つ。腸管出血性大腸菌や赤痢菌の感染時に見られる出血性の下痢や、溶血性尿毒症症候群(HUS)、急性脳症などのさまざまな病態の直接の原因となる病原因子である。アフリカミドリザルの腎臓上皮由来培養細胞(ベロ細胞)に対して細胞毒性を示すことから、ベロ毒素とも呼ばれる。
ブタ浮腫病は、Stx2eを産生する腸管出血性大腸菌が経口感染し、小腸内で産生された該毒素が体内に吸収されることにより発病する。全身に浮腫が出現し、急性経過をとって高い死亡率を示す。
本明細書中において、Stx2eのAサブユニット(Stx2eA)は配列番号6のアミノ酸配列で表され、Bサブユニット(Stx2eB)は配列番号8のアミノ酸配列で表される。また、配列番号8は、Stx2e Bサブユニットタンパク質(GenBank Accession No. AAQ63639)の成熟領域(ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ala19〜Asn87)のアミノ酸配列を示す。本明細書において、単に「Stx2e Bサブユニットタンパク質」、「Stx2eB」という場合には、上記成熟領域のアミノ酸配列からなるStx2e Bサブユニットタンパク質を指す。
本発明において、Stx2eのBサブユニットは、例えば、Asn73(すなわち、配列番号8のアミノ酸配列の55位のAsn残基)がSerに置換されている。配列番号8のアミノ酸配列の55位のAsn残基がSerに置換されているアミノ酸配列(Asn73Ser)を配列番号10で示す。
また、Stx2eA及びStx2eBは、それぞれ、配列番号6又は配列番号8もしくは10で表されるアミノ酸配列と、好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有し、かつブタに投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
ただし、配列番号10において上記置換等を含む配列、または、配列番号10と上記同一性を有する配列は、配列番号10の55位の残基はSerに置換されたままである。
なお、本発明で使用されるStx2eは、AサブユニットまたはBサブユニットのいずれでもよいが、Bサブユニットが好ましい。
LTBとして配列番号12で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが、ブタに投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、配列番号12で表されるアミノ酸配列における1個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、LTBにおいて、好ましくは2〜10個、さらに好ましくは2〜5個、より好ましくは2〜3個である。配列番号12で表されるアミノ酸配列は、Gen Bank Accession No. AAL55672として登録されている。
また、LTBは、それぞれ、配列番号12で表されるアミノ酸配列と、好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有し、かつブタに投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
また、90位がAsn残基であるLTBサブユニットタンパク質は、配列番号12で表されるアミノ酸配列の90位に対応する位置がAsnである以外は、配列番号12で表されるアミノ酸配列と、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。
なお、配列番号8の90位がSer残基に置換されたLTBサブユニットタンパク質のアミノ酸配列を配列番号14で表す。配列番号14において上記置換等を含む配列、または、配列番号14と上記同一性を有する配列を使用するこができるが、配列番号14において上記置換等を含む配列、または、配列番号14と上記同一性を有する配列は、配列番号14の90位の残基はSerに置換されたままである。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の大腸菌症防除剤によって誘導される抗体は、易熱性毒素エンテロトキシン(LTp)の毒素中和活性を有する。
本発明の大腸菌症防除剤は、大腸菌症の症状の防除(ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果)効果を有する。本発明でいう大腸菌症とは、ブタ浮腫病(毒素原性大腸菌)、大腸菌下痢症(腸管出血性大腸菌)、腸管侵入性大腸菌、腸管凝集性大腸菌、腸管病原性大腸菌を含む。
本発明の大腸菌症防除剤の有効成分である融合タンパク質とは、遺伝子組換え技術によって作られたタンパク質で、2種類以上のタンパク質遺伝子(コード領域)が連結され、連続的に転写・翻訳されることにより、1つのタンパク質を形成したものである。本発明に用いる融合タンパク質は、タンパク質同士が直接融合していても良いし、ペプチドリンカーを介して結合していても良い。
本発明において、志賀毒素タンパク質のBサブユニットと大腸菌易熱性毒素のBサブユニットとが融合される順序は、いずれが先であってもよい。なお、植物における発現では、融合順序はStx2eBをN末端側に配置した方が、組換えタンパク質が高蓄積となる傾向がある。
本願明細書中において、志賀毒素のサブユニット及び大腸菌易熱性毒素のサブユニットの融合タンパク質を有効成分とする大腸菌症防除剤、並びに、志賀毒素タンパク質のBサブユニットと大腸菌易熱性毒素のBサブユニットがペプチドリンカーを介してタンデムに連結された融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするDNA構築物、該融合タンパク質をコードするDNA構築物を含むベクターで形質転換された植物等を総称して、大腸菌症防除剤ということがある。なお、本発明の大腸菌症防除剤は、上記融合タンパク質を含む限り、ワクチンまたは免疫賦活剤などの医薬及び飼料のいずれの形態であってもよい。本発明において、防除とは、予防及び治療のいずれも含むものである。
ペプチドリンカーにおいて、プロリンは、好ましくは2つ置き、又は3つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、5つ以内、好ましくは4つ以内の範囲で連続していてもよい。このような好ましいペプチドリンカーは、例えば、国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
本発明において、ペプチドリンカーは、好ましくは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG12)や配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG12v2)である。これらの配列と90%以上、好ましくは95%以上同一性を有するペプチドリンカーでもよい。
また、本発明で用いる融合タンパク質は、さらにそのC末端に前記ペプチドリンカーが付加されていることが好ましい。特に、本発明で用いる融合タンパク質は、そのC末端にPG12もしくはPG12v2が付加されていることが好ましい。
本発明で用いる融合タンパク質は、例えば、配列番号15〜18で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号15〜18で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、志賀毒素のBサブユニット及び大腸菌易熱性毒素のBサブユニットが、PG12もしくはPG12v2を介してタンデムに連結され、そのC末端にはPG12もしくはPG12v2がさらに付加されている。
前記PG12もしくはPG12v2などのペプチドを、前記融合タンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、該融合タンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科(Solanaceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属(Nicotiana)、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
また、分泌シグナルペプチドは、好ましくはタバコのβ-Dグルカンエキソヒドロラーゼ(β-D-glucan exohydrolase)、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ-Dグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号28で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。タバコのβ-DグルカンエキソヒドロラーゼをコードするDNAの塩基配列は、例えば配列番号27で表される。
好ましい葉緑体移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
本発明で用いる融合タンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。好ましい小胞体残留シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されているが、HDEL配列(配列番号29)を利用することができる。
他の好ましい液胞移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
すなわち、本発明で用いるDNA構築物は、志賀毒素のサブユニットをコードするDNA及び大腸菌易熱性毒素のサブユニットをコードするDNA、好ましくは、志賀毒素のBサブユニットをコードするDNA及び大腸菌易熱性毒素のBサブユニットをコードするDNAが、前記ペプチドをコードするDNAを介してタンデムに連結されているDNAを含む。前記ペプチドリンカーをコードするDNAは、例えば配列番号1(PG12)や配列番号3(PG12v2)で表される。志賀毒素タンパク質をコードするDNAとして、例えばStx2eAをコードするDNA(配列番号5)、Stx2eB(Asn73)をコードするDNA(配列番号7)、Stx2eB(Asn73Ser)をコードするDNA(配列番号9)が挙げられる。大腸菌易熱性毒素をコードするDNAとして、例えばBサブユニット(Asn90)をコードするDNA(配列番号11)、Bサブユニット(Asn90Ser)をコードするDNA(配列番号13)が挙げられる。前記ペプチドをコードするDNA、志賀毒素タンパク質をコードするDNA、及び大腸菌易熱性毒素をコードするDNAは、終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
本発明で用いる融合タンパク質をコードするDNAは、例えば、配列番号19〜22で表される。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’-非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’-非翻訳領域に発現可能に連結されている。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’-非翻訳領域としては、例えばタバコ(Nicotiana tabacum)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’-非翻訳領域(NtADH5'UTR)(配列番号30)を用いることができ、翻訳開始点上流3塩基を改変したNtADH5'UTR領域(NtADHmod 5'UTR)(配列番号31)を用いることでさらに高翻訳が期待できる。
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’-非翻訳領域を得る方法は、例えば、特開2012−19719号公報および国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
また、前記NtADHmod 5'UTRと好ましくは85%以上、特に好ましくは90%以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているDNAを使用してもよい。
配列番号23(L+E-)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR(配列番号31)に、1つのLTBタンパク質(野生型Asn90)および1つのStx2eBタンパク質(変異型Asn73Ser)を、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号24(L-E-)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR(配列番号31)に、1つのLTBタンパク質(変異型Asn90Ser)および1つのStx2eBタンパク質(変異型Asn73Ser)を、PG12を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号25(E-L+)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR(配列番号31)に、1つのStx2eBタンパク質(変異型Asn73Ser)および1つのLTBタンパク質(野生型Asp90)を、PG12v2を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
配列番号26(E-L-)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR(配列番号31)に、1つのStx2eBタンパク質(変異型Asn73Ser)および1つのLTBタンパク質(変異型Asp90Ser)を、PG12v2を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
まず、前記DNA構築物を適当な制限酵素で切断又はPCRによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
真核細胞としては、植物細胞が好ましく用いられ、中でもアキノノゲシ属(Lactuca)などのキク科(Asteraceae)、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属(Lactuca)に属する植物の細胞、中でもレタス(Lactuca sativa)細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。
原核細胞としては、大腸菌(Escherichia coli)、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)等が用いられる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記志賀毒素タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら(Theor.Appl.Genet 78:594(1989))の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe(Planta 99:12(1971))の方法が挙げられる。
また、本発明で用いる種子は、上記のようにして再生した植物体から種子を採取することにより得ることができる。本発明で用いる種子は適当な方法で播種し栽培することにより、前記細菌毒素タンパク質を生産する植物体とすることができ、このような植物体も、前記形質転換体に含まれる。
様々な種の植物について、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)で形質転換された組織から植物を再生することが実証されている。この植物として、ヒマワリ、トマト、シロツメクサ、アブラナ、コットン、タバコ、ジャガイモ、トウモロコシ、イチゴ、イネ、その他多数の野菜作物を挙げることができる。
本発明においては、アグロバクテリウムTiベクターにより上記レタスをはじめとした可食植物を形質転換することが好ましい。
本発明の大腸菌症防除剤をブタに投与する方法としては、ブタの飼料に、前記DNA構築物で形質転換された植物体またはその乾燥物もしくは粉砕物を混合してブタに与える方法、ブタに点鼻する方法などが挙げられる。本発明の大腸菌症防除剤は、一定の間隔をおいて、複数回投与することが好ましい。例えば、4〜7日おきに、合計2〜3回投与する方法が挙げられる。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
タンパク抗原候補として、1) 毒素原生大腸菌が生産する易熱性毒素の無毒Bサブユニット(LTB)と2) 腸管出血性大腸菌が生産するベロ毒素の無毒Bサブユニット(Stx2eB)を用いた。
またLTBはレタス小胞体で生産した場合に90番目Asn残基にN-結合型糖鎖が付加されるが、このAsnをSerに置換した変異体も作製した(以下、野生型をL+、変異型をL-と表記する)。Stx2eBは糖鎖付加部位変異体(Asn73Ser、以下E-と表記する)を用い、L+もしくはL-と二通りの融合順序で連結し、4通りの融合抗原を作製した(L+E-, L-E-, E-L+, E-L-)。得られた断片(L+E-, L-E-, E-L+, E-L-)をそれぞれ配列番号19〜22の塩基配列で示す。各抗原はStx2eBのシグナルペプチドに融合し、IPTG誘導性プロモーターに連結し、pET101ベクター(Invitrogen)に挿入した(図1)。
具体的には、Stx2eBのリボソーム結合サイト(SD配列)とシグナルペプチドを含む領域を、Stx2eB−SDSP−Fプライマー(aaatctagaaataataaggagttaagaatgaagaa(配列番号33)、下線はXbaIサイト)とStx2eB−SP−Rプライマー(aaaggatcctgcattaacagaaaccaatgcaaa(配列番号34)、下線はBamHIサイト)を用いて増幅した。
得られた断片をXbaIとBamHIで処理し、以下に示すpRI909L+,L−,L+E−,L−E−,E−L+,E−L−のXbaI―BamHIに挿入した。XbaIとSacIを用いてSD配列−Stx2eBSP−抗原領域−HDEL断片を切り出し、pET101(Invitrogen)のXbaI−SacIギャップに挿入した(図1)。
各発現ベクターを組換えタンパク質生産用大腸菌(BL21 DE3)に導入した。得られた組換え大腸菌のシングルコロニーをピックアップし、100 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地(LB+Amp培地)で一晩培養した後、50%グリセロールと等量混合して-80℃でストックした。
グリセロールストックをチップでかきとりLB+Amp培地に植菌し、37℃、180 rpmにて一晩前培養を行った。培養液1 mlを250 mlのLB+Amp培地が入った2 Lバッフル付きフラスコに植え継ぎ、37℃ 、180 rpmにて培養を行った。O.D.が0.4-0.6になったタイミングでIPTG(終濃度1 mM)を添加し、25℃、120 rpmで4時間培養を行った。培養液を50 mlの遠沈管に移し、8,000 rpm、室温で5分間遠心を行って集菌した。培地を除き、さらに50 mlの培養液を追加して8,000 rpm、室温で5分間遠心を行った。菌体は-80℃で保存した。
実施例2で得られた菌体に、培養液125 ml分あたり20 mlの溶解バッファー(BugBuster(メルクミリポア)、0.2 mg/ml lysozyme、1 mM PMSF、30U/ml DNase Iを含むPBS pH 7.4)を添加し、室温で30 分間、ローテーターで撹拌した。8,000 rpm、4℃で20分間遠心し、上清を回収し新しい遠沈管に移した。この遠心操作をあと2回繰り返した。
PBST(0.05% Tween-20 を含むPBS pH 7.4)で平衡化したガラクトースビーズ(Immobilized D-Galactose Gel、Thermo SCIENTIFIC社、No. 20372) 5 mlを、実施例3で得られた菌体破砕液に添加し、ローテーターで2時間撹拌した。懸濁液をクロマトグラフィー用カラム(エコノパッククロマトグラフィー用カラム、BIO-RAD社、#732-1010)にロードし、溶液を排出した。120 mlのPBSTをカラムに添加し、カラムを洗浄した。ナノドロップを用いてカラム滴下溶液の280 nm吸光度を測定し、O.D.がベースラインになっていることを確認した。洗浄が不十分な場合は、PBSTを適宜追加し、洗浄した。0.5 M ガラクトースを含むPBSTを1フラクションあたり1 ml添加して、LTBを溶出した。280 nm吸光度を測定して溶出タンパク質が無くなったことを確認した後、6 Mグアニジン塩酸を50 ml添加してカラムを洗浄した。20% エタノールで置換し、4℃でカラムを保存した。
LTBのガラクトースに対する親和性を利用してアフィニティー精製を行った結果を図2Aに示す。また、0.5Mガラクトースを用いて競合溶出し、小動物免疫に用いた。
熱変性無しの条件下でSDS-PAGEを行ったところ、精製LTBは約70 kDaの位置に検出され(図2B)、5量体を形成していると思われる。L-およびL+E-についても同様に精製抗原を調製した。なお、E-L+は大腸菌内で不溶化したため精製抗原調製は実施しなかった。
実施例4,5で調製した精製抗原を用い、ウサギに注射免疫を行い、抗体価を測定した。抗LTp抗体価は、L+, L-, L+E-のいずれでも上昇が確認された、LTp毒素中和活性も検出された(表1)。表1の結果より、(1)LTB糖鎖付加部位への変異導入は中和抗体誘導に影響がないこと、(2)本発明の大腸菌症防除剤でもLTp中和抗体誘導可能であることが分かった。抗Stx2e抗体価の上昇は弱く、Stx2e毒素中和活性は検出されなかった。
LTBとStx2eBのコンビネーション化は、Stx2eBのC末端にLTB(糖鎖付加有/無)を融合したものと、N末端にLTB(糖鎖付加有/無)を融合させた計4通りを作成した。この際、Stx2eBは糖鎖無Stx2eB(N末端から73番目のアスパラギンをセリンに置換)を使用し、糖鎖無LTBはN末端から90番目のアスパラギンをセリンに置換したものを用いた。またこれらのタンパク抗原遺伝子は、蓄積量を高めることが報告されているPG12スペーサー(Matsui et al, Transgenic Res, 2011, 20:735-48)もしくは類似のPG12v2を介して連結し、近傍配列改変型NtADH 5’-UTRとAtHSPターミネーターを使用した。さらにタバコ由来β-D-glucan exohydrolase分泌シグナルペプチドコード配列および小胞体残留シグナル(HDEL)を用いることで融合タンパク質抗原候補タンパク質の高蓄積化をはかった。
LTB(野生型Asn90)断片(ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除くAla22からAsn124までの領域)を以下の要領で作製した。以下の二本のオリゴヌクレオチドを、3’相補末端を介してアニールした後、T4 DNA polymerase (Toyobo, Fukui, Japan)を用いて伸長反応を行った。一段階目はLTB-AとLTB-B、LTB-CとLTB-D、LTB-EとLTB-F、LTB-GとLTB-H、LTB-IとLTB-Jを用い、それぞれA+B、C+D、E+F、G+H、I+J断片を作製した。二段階目の反応には、A+BとC+D、E+FとG+Hを用いA+B+C+DとE+F+G+H断片を作製した。最後にA+B+C+DとE+F+G+HとI+Jを用い、全長のA+B+C+D+E+F+G+H+I+J断片を作製した。LTB(Asn90Ser)変異体の作製は、LTB-IのかわりにLTB-IN90Sを用いて、上記と同様に作製した。
LTB-A: ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac(配列番号35)
LTB-B: cgttgatggtgtagatttgggtgttgcggtactcgctgc(配列番号36)
LTB-C: ccatcaacgacaagatcctcagctacaccgagagcatgg(配列番号37)
LTB-D: cttgaaggtgatgatcaccatctccctcttgccggccatgctc(配列番号38)
LTB-E: atcaccttcaagagcggcgagaccttccaggtcgaggtc(配列番号39)
LTB-F: cttctggctgtcgatgtgctggctgccggggacctcgacctggaa(配列番号40)
LTB-G: gacagccagaagaaggccatcgagaggatgaaggacaccctcaggatc(配列番号41)
LTB-H: gcagagcttgtcgatcttggtctcggtgaggtaggtgatcctga(配列番号42)
LTB-I: aagctctgcgtctggaacaacaagaccccc(配列番号43)
LTB-J: aaagatctgttctccatgctgatggcggcgatgctgttgggggtcttgttgttccagacgcagagctt(配列番号44)
LTB-IN90S: aagctctgcgtctggaacagcaagaccccc(配列番号45)
pRI909L+プラスミドもしくはpRI909L−プラスミドからBamHIとEcoRIを用いてLTB−PG12−HDEL−HSPT断片を切り出した。pRI909E−プラスミドからXbaIとBglIIを用いて35Sプロモーター−NtADHmod5’UTR−分泌シグナルペプチド−Stx2eBAsn73Ser−PG12v2断片を切り出した。両断片をライゲーションし、2BHプラスミドのXbaI−EcoRIギャップに挿入し、植物発現用のpRI909E−L+(配列番号25)プラスミドおよびpRI909E−L−(配列番号26)プラスミドを作製した(図1)。
レタス(Lactuca sativa L.)品種グリーンウェーブ(タキイ種苗)をMS培地 [1/2×ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類(MS塩、和光純薬工業)、1×Murashige and Skoog vitamin solution(MSビタミン、Sigma-Aldrich)、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に無菌播種後、10-16日目の本葉を5 mm角程度に切断し、本切片を、ベクターコンストラクトを有すバイナリープラスミド(pRI909)を保持するアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefacience EHA105)懸濁液に10分間浸漬後、共存培地 [1× MS塩、1× MSビタミン、0.05 mg/l 6-ベンジルアミノプリン(BA)、0.1 mg/l 1-ナフチル酢酸(NAA)、0.1 M アセトシリンゴン、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に置床し、25℃、暗所で2日間培養した。切片を滅菌水で洗浄後、選抜培地 [1× MS塩、1× MSビタミン、0.05 mg/l BA、0.1 mg/l NAA、0.5 g/l ポリビニルピロリドン(PVP)、50 mg/lカナマイシン(Km)、250 mg セフォタキシム(Cef)、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に置床し、25℃、蛍光灯下(2000-3000 lux)で培養を行った。以降、不定芽が得られるまで3-4日間に1回(2回/週)の間隔で新しい選抜培地への移植を行った。不定芽から形成された再分化個体は発根培地[1/2× MS塩、1× MSビタミン、0.5 g/l PVP、250 mg Cef、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に移植し、同条件で培養を行った。以降、3-4日間に1回(2回/週)の間隔で新しい発根培地への移植を行った。発根した再分化個体は鉢植えにし、同条件で栽培を行った。
タンパク質抽出はTCA-acetone法(Shultz et al. Plant Mol Biol Rep, 2005, 23:405)に従い、液体窒素凍結後、-80℃で保存した遺伝子導入レタス本葉を用いて行った。100-200 mgのサンプルをTissueLyzerII(QIAGEN)を用い破砕後、サンプルの5倍量の TCA-acetone(10% トリクロロ酢酸、90% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール)を添加、混合し、-20℃で1時間静置後、16,000×g、4℃、30分間遠心操作を行い、上清を除去し、タンパク質を含む沈殿を得た。さらに夾雑物を除去するために、サンプルの5倍量の acetone/BME(100% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール)を添加、混合し、16,000×g、4℃、10分間遠心操作を行い、上清を除去した。本夾雑物除去操作はさらに2回行った。沈殿は減圧乾燥後、サンプルの2倍量の 抽出Iバッファー [0.5 M 塩化ナトリウム、5 mM イミダゾール、6 M 尿素、20 mM トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)-HCl、pH 7.9] に懸濁し、16,000×g、4℃、10分間遠心を行い、上清を回収、タンパク質溶液を得た。タンパク質濃度の測定は、Protein Assay Kit II(Bio-Rad)を用いて行った。
得られたタンパク質溶液をマイクロチューブに適量入れ、同量のサンプルバッファー(EZ Apply、ATTO製)を加え混合し、沸騰水中で5分間加温し、サンプルのSDS化を行った。タンパク質定量時の標準物質には精製LTB+を用いた。これを抽出Iバッファーで2倍希釈を繰り返すことにより希釈系列を作成し、これら希釈系列をスタンダードとして用いた。
タンパク質の電気泳動(SDS-PAGE)は、電気泳動槽(ミニプロティアンTetraセル)およびミニプロティアンTGX-ゲル(BIO RAD)を用いた。電気泳動バッファー(EZ Run、ATTO製)を入れ、ウェルにSDS化したサンプルを5 μlアプライし、200 V定電圧で40分間行った。
電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック(BIO RAD)を用い、トランスブロットTurbo(BIO RAD)でブロッティングを行った。
ブロッティング後のメンブレンはブロッキング溶液(TBS系, pH7.2、ナカライテスク)に浸し、室温で1時間振とうまたは4℃で16時間静置後、TBS-T(137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、25 mM Tris-HCl、pH 7.4)中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。LTBタンパク質の検出には、抗血清Rabbit-Antiserum Anti-LTp 991109(inactive)(0.1% NaN3)AO をTBS-Tで10,000倍希釈して使用した。当該希釈液中にメンブレンを浸し、室温で2時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。二次抗体にはTBS-Tで10,000倍希釈したAnti-Rabbit IgG, AP-linked Antibody(Cell Signaling TECHNOLOGY)を使用した。本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。アルカリホスファターゼによる発色反応は、発色液(0.1 M 塩化ナトリウム、5 mM 塩化マグネシウム、0.33 mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.33 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、0.1 M Tris-HCl、pH9.5)中にメンブレンを浸し、室温で7分間振とうすることにより行い、メンブレンを蒸留水で洗浄した後、常温で乾燥した。
発色したメンブレンはスキャナー(PM-A900、エプソン)により解像度600 dpiで画像化し、画像解析ソフト(CS Analyzer ver. 3.0、アトー)を用い、LTBタンパク質の定量を行った。
図1に示すコンストラクトを用いて作成した遺伝子組換えレタスにおいて発現された融合タンパク質の発現解析の結果を図3に示す。N-結合型糖鎖付加部位に変異を導入したL-E-とE-L-では推定分子量(約20 kDa)の位置に一本のバンドが検出された(図3A)。L+E-とE-L+では20 kDaのバンドに加えてN-結合型糖鎖が付加されたと推定される高分子量のバンドも検出された。図3Bに各融合タンパク質抗原の蓄積量を示す。N-結合型糖鎖有のLTB(L+)を用いた方が無し(L-)よりも高蓄積する傾向があり、融合順序はStx2eBをN末端側に配置した方が、高蓄積傾向が認められた。
大腸菌易熱性毒素Bサブユニット(L+)、LTB糖鎖修飾部位変異体(L-)、L+と浮腫病毒素Bサブユニット(Stx2eB)の糖鎖修飾部位変異体の融合タンパク(L+E-)、の抗原性(抗体誘導)を確認するため、精製したそれぞれのタンパク質をフロイント完全(あるいは不完全)アジュバントでエマルジョン化し、ウサギに皮下免疫した。1回目に50 μg、以後2週間間隔で4回(100 μg/回)の追加免疫を行った。抗原に対する抗体価がELISAで十分に上昇したことを確認した後、全採血を行い、遠心分離により血清を調製した。
6週齢のBalb/c雌マウスを導入し、馴化、免疫前採血を行い、8週齢から免疫を開始した。90 μg相当のLTBが含まれる組換えレタス末を生理食塩水で懸濁後、胃ゾンデを用いて経口投与した。投与粉末量はLTB等量で揃えた。経口投与は7日毎に4回行った。初回投与後10日目と28日目に採血を行い、血清を分離した。血清は56℃、30分処理し非働化した。組換えレタス末の経口投与についても同様に65 μg相当組換えレタス末を経口投与した。定期的に採血を行い、血清を分離、非働化した。腸管洗浄液の採取は大腸ではその全長を、小腸は回盲部から5 cmを切り取り5 mLのPBSで洗浄した。使用時まで-80℃で保存し、抗体価測定時にはプロテアーゼ阻害剤を添加した。
体重2.5 kgの日本白色種ウサギを導入し、馴化、免疫前採血を行った後、7日毎に6回、2 mg相当のLTBが含まれる組換えレタス末を生理食塩水で懸濁し、経口投与した。一回当たりの投与量はL+E-とL+は2 mg LTB等量/回(L+E-;0.85 gレタス末, L+;1.5gレタス末)、陰性対照の空ベクターレタスは1.0 gレタス末/回とした。初回投与後10日、28日、44日目に採血を行い、血清を分離した。血清は56℃、30分処理し非働化した。プロテインGカラムを用いてIgGを精製し中和活性測定に用いた。
血清中の抗Stx2e毒素抗体の中和活性の測定はベロ細胞アッセイで行った。96-well細胞培養用プレートに1×104/wellのベロ細胞(アフリカミドリザルの腎上皮由来の培養細胞)を播種し、2日間の前培養の後、半数細胞致死量の4倍のStx2eを加えて3日間、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)で培養した。ベロ細胞の生死判定はセルカウンティングキット(同仁化学)を用いて細胞内脱水素酵素活性を測定することで行った。
血清中の抗LTp毒素抗体の中和活性の測定はCHO細胞アッセイで行った。8-well チャンバースライドに被験血清と、最終濃度が20 ng/mLとなるようにLTpを加え、2.5×103/wellのCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞)を播種し24時間、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)で培養した。培養後、CHO細胞の形体観察を行い、細胞の長径が短径の2倍以上の細胞を異型細胞とした。総細胞数に対する異型細胞の率を計算し、自然発生する異型細胞の発生率との比が50%を超えないものを中和活性陽性とした。中和活性が陽性となる最小の血清量を中和活性の力価とした。
抗体価の測定は、2.5 μg/mLの抗原を100 μL/wellで固相化したELISAプレート(Maxisorp、Nunc)を用いて行った。抗原は、抗Stx2e抗体に関しては精製した無毒化Stx2eを、抗LTp抗体に関しては精製したLTpをそれぞれ用いた。被験血清は0.1%(w/v)牛血清アルブミンを含む希釈液で2倍希釈列を作製し、ELISAプレートにアプライした。2次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗体を用い、基質に過酸化水素、発色剤にABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid))を用いた発色法にて検出した。陰性コントロールである希釈液に対する吸光度の平均の2倍の値以上の吸光度を抗体価陽性とし、陽性となる最大希釈率をその血清の抗体価とした。免疫前血清について抗体価が検出された場合は免疫前血清の抗体価値を除した値を当該血清の抗体価とした。結果を図4〜7に示す。
血清IgGとIgA(図4、5)、腸管洗浄液のIgA(図6)についてタンパク抗原レタス投与マウスで抗体価の上昇が確認された。これらの結果から、融合タンパク質抗原生産植物の経口投与によって抗LTp抗体の誘導が可能であることが確認された。コンストラクト間での抗体誘導能の顕著な差は見られなかった。
タンパク抗原レタス投与群では抗LTp抗体価の上昇が確認された(図7)。抗体価が十分に上昇した44日目の血清からIgGを精製し、LTp毒素中和活性評価を行った。L+E-免疫ウサギの全2羽、L+免疫ウサギの2羽中1羽で中和活性が確認された(表2)。
タンパク抗原レタスの経口投与による浮腫病予防効果確認試験を行った。試験に供試した子ブタは分娩後24時間目までは初乳を与えず人工乳を与え、以降は母豚哺乳に戻した。各試験群につき3頭のブタを供試した。分娩後6、12、18日目にタンパク抗原レタス(Stx2eB 2.3 mg相当量)もしくは空ベクターレタスの凍結乾燥粉末を水に懸濁し、チューブを接続したシリンジで強制投与した。ブタ由来志賀毒素産生大腸菌(STEC、帯広株、ST-、LT-)を腸溶性カプセルに充填して25、26、27日目に投与し攻撃した。体重、飼料摂取量を測定するとともに、臨床症状を毎日観察し、ブタ浮腫病に典型的な症状である元気(0:正常、1:減退、2:消失)、眼周囲の浮腫(0:なし、1:軽度、2:中度、3:重度)、神経症状(0:なし、1:軽度、2:中度、3:重度)について観察しスコア化した。また定期的に採血、採便し、ELISAによりStx2eB特異的抗体価を測定した。STECによる攻撃7日目に安楽死後、剖検を行い、各臓器及び組織の異常を肉眼的に観察した。主要臓器の病理標本を作製し、病理組織学的所見を観察した。結果を図8に示す。
E-L+とL+E-ともに、臨床症状と増体重の両指標において浮腫病予防効果が確認された。
Claims (10)
- 志賀毒素Stx2eのBサブユニットと大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットの融合タンパク質を含む大腸菌症防除剤であって、前記大腸菌症がブタ浮腫病及びLTを原因とする大腸菌性下痢症の両方であり、前記LTのBサブユニットの90位のAsn残基にN−結合型の糖鎖が付加されていることを特徴とする、大腸菌症防除剤。
- 志賀毒素Stx2eのBサブユニットと大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットがペプチドリンカーを介して融合されている、請求項1に記載の防除剤。
- 前記ペプチドリンカーが配列番号2または配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項2に記載の防除剤。
- 前記ペプチドリンカーが配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項2に記載の防除剤。
- 志賀毒素Stx2eのBサブユニットのC末端側に大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットが融合されている、請求項1または2に記載の防除剤。
- 志賀毒素Stx2eのBサブユニットのN末端側に大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットが融合されている、請求項1または2に記載の防除剤。
- 大腸菌易熱性毒素LTに対する抗体を誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の防除剤。
- IgAを誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、請求項7に記載の防除剤。
- IgGを誘導するタンパク抗原または免疫賦活剤である、請求項7に記載の防除剤。
- 志賀毒素Stx2eのBサブユニットと大腸菌易熱性毒素LTのBサブユニットの融合タンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物を含む組み換えベクターで形質転換した可食植物であって、LTのBサブユニットの90位のAsn残基にN−結合型の糖鎖が付加されている前記融合タンパク質を産生する可食植物を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物のブタ浮腫病及びLTを原因とする大腸菌性下痢症を防除する方法。
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