WO2018225662A1 - 自然免疫増強剤 - Google Patents

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WO2018225662A1
WO2018225662A1 PCT/JP2018/021286 JP2018021286W WO2018225662A1 WO 2018225662 A1 WO2018225662 A1 WO 2018225662A1 JP 2018021286 W JP2018021286 W JP 2018021286W WO 2018225662 A1 WO2018225662 A1 WO 2018225662A1
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fusion protein
innate immunity
stx2eb
toxin
subunit
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PCT/JP2018/021286
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川端　孝博
健史 松井
和敏 澤田
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出光興産株式会社
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an innate immunity enhancer using a toxin fusion protein.
  • Pigs are usually weaned about 21 days after birth. Before weaning, a transfer antibody by immunization with milk from mother pigs is free from pathogen infection. However, at the same time as weaning, the sow movement, environment change, food switching, group formation, etc. caused a lot of stress on the piglets and the disappearance of the previous transfer antibody, so-called weaning 70 days old from weaning The period of piglets is said to be the most prone to disease during the life of pigs.
  • Vaccines are an effective means for disease prevention, but conventionally injection-type vaccines have been mainly used. Systemic immunity can be raised by the immunization route with an injectable vaccine, and induces the production of immunoglobulins corresponding only to pathogens causing so-called specific diseases.
  • weaned piglet in which the transfer antibody from the mother pig remains the absorption of the vaccine is inhibited, the establishment of the autoimmune system is insufficient, and it is not always an effective prevention method.
  • weanling pigs have a wide variety of diseases, and there is no limit to taking individual measures, and comprehensive measures are desirable.
  • Patent Document 1 using a linker (PG12) having a specific amino acid sequence, Shiga (edema disease) toxin B subunit (Stx2eB) and Escherichia coli heat-labile toxin B subunit (LTB) or cholera toxin B subunit ( CTB) is produced and produced in plants.
  • PG12 linker
  • Shiga (edema disease) toxin B subunit (Stx2eB) and Escherichia coli heat-labile toxin B subunit (LTB) or cholera toxin B subunit ( CTB) is produced and produced in plants.
  • the purpose is only for use as a vaccine targeting only these toxins, and there is no example that evaluates the vaccine function of the fusion protein.
  • Patent Document 2 discloses that a fusion protein of LTB and Stx2eB is used as a vaccine for Escherichia coli such as edema disease and diarrhea, but these disease prevention effects are antigen-specific for L
  • Patent Document 3 discloses that a fusion protein containing Glycoprotein 5 (GP5) protein of PRRS virus and an adjuvant protein (LTB or Stx2eB) is used as a PRRS vaccine, but the PRRS preventive effect is against PRRS. It was intended for antigen-specific immunity, and it was never expected that a vaccine having PRRS preventive effect could be obtained without using PRRS protein as an antigen.
  • GP5 Glycoprotein 5
  • LTB or Stx2eB adjuvant protein
  • Non-patent Document 1 reported that the symptoms of Salmonella infection were alleviated by mixing lactic acid bacteria with feed and orally administered to pigs, and Kritas and Morrison (2007) ( Non-patent document 2) reports improvement in weight gain due to PRRS infection by administering lactic acid bacteria to pigs, but in any case, a high effect is not necessarily obtained because viable bacteria are used. There was a problem.
  • the innate immune system can be activated in animals such as pigs, it stimulates innate immune cells such as macrophages and dendritic cells in the infected area of the pathogen, and induces nonspecific pathogen phagocytosis. Can be expected to control the disease.
  • innate immune cells such as macrophages and dendritic cells
  • nonspecific pathogen phagocytosis Can be expected to control the disease.
  • optimization of effective antigen design has been an important issue.
  • an object of the present invention is to provide a substance that can efficiently induce innate immunity in an administered individual.
  • the present inventors have selected from the B subunit of Shiga toxin 2e, the B subunit (LTB) of Escherichia coli heat-labile toxin, and the B subunit (CTB) of cholera toxin.
  • B subunit of Shiga toxin 2e
  • LTB B subunit of Escherichia coli heat-labile toxin
  • CTB B subunit of cholera toxin
  • the present invention is as follows.
  • a fusion protein of two or more toxin B subunits selected from Shiga toxin 2e B subunit (Stx2eB), Escherichia coli heat-labile toxin B subunit (LTB), and cholera toxin B subunit (CTB) Innate immunity enhancer containing.
  • the peptide linker is PG12 (SEQ ID NO: 2), PG12v2 (SEQ ID NO: 4), PG17 (SEQ ID NO: 30), or PG22 (SEQ ID NO: 31), or an amino acid sequence having 80% or more identity with these sequences
  • the innate immunity enhancer according to (5) which is a peptide having (7)
  • the innate immunity enhancing agent according to any one of (1) to (6), wherein the fusion protein has any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 15 to 17.
  • the innate immunity enhancing agent according to any one of (1) to (7) which comprises a transformant transformed with DNA encoding the fusion protein and expressing the fusion protein.
  • PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
  • PRRS causative virus a virus classified as Arteriviridae or Arterivirus genus
  • Salmonella or Mycoplasma Salmonella or Mycoplasma
  • a macrophage activator comprising: (15) a fusion protein of two or more toxin B subunits selected from Shiga toxin 2e B subunit (Stx2eB), Escherichia coli heat-labile toxin B subunit (LTB) and cholera toxin B subunit (CTB) or
  • a method for enhancing innate immunity of a non-human mammal which comprises administering to the non-human mammal a transformed plant transformed with a DNA encoding the fusion protein and expressing the fusion protein.
  • fusion protein of the present invention By administering the fusion protein of the present invention or a transformant containing the same to animals such as pigs and chickens, immunity against unspecified diseases caused by all pathogens such as bacteria, viruses and mycoplasmas (not specific toxins) ( Natural immunity) can be improved. That is, by feeding the fusion protein or a transgenic plant that expresses the fusion protein, an effective component (antigen) is usually expected to have a vaccine effect only against a disease having a one-to-one relationship. In the present invention, immunity can be induced against unspecified diseases. This makes it possible to reduce the cost and labor of producers such as pigs and chickens, and to reduce the stress of livestock and poultry farming, and can be expected to improve productivity.
  • the innate immunity enhancing agent refers to a drug that activates innate immunity in an animal body.
  • innate immunity refers to a mechanism that is innately provided in the living body and functions when the antigen is removed from the living body without being exposed to the antigen in advance.
  • the innate immunity enhancing agent of the present invention means a drug that activates a non-specific immune response via macrophages, neutrophils, dendritic cells and / or natural killer (NK) cells.
  • NK natural killer
  • the innate immunity enhancer of the present invention comprises two or more toxins B selected from Shiga toxin 2e B subunit (Stx2eB), Escherichia coli heat-labile toxin B subunit (LTB) and cholera toxin B subunit (CTB).
  • toxins B selected from Shiga toxin 2e B subunit (Stx2eB), Escherichia coli heat-labile toxin B subunit (LTB) and cholera toxin B subunit (CTB).
  • toxins B selected from Shiga toxin 2e B subunit (Stx2eB), Escherichia coli heat-labile toxin B subunit (LTB) and cholera toxin B subunit (CTB).
  • Shiga toxin, Escherichia coli heat-labile toxin and cholera toxin are all holotoxins composed of one molecule of A subunit which is a toxic
  • the number of 2 or more is preferably 2 to 5, more preferably 2 to 3, and still more preferably 2.
  • the two or more proteins may include two or more toxin B subunits selected from Stx2eB, LTB and CTB, or two types selected from Stx2eB, LTB and CTB. There may be a mode in which two or more toxins are included in total, or a mode in which three or more Stx2eB, LTB, and CTB are included in total.
  • the fusion protein means a multivalent protein containing two or more protein units in one polypeptide chain.
  • Shiga toxin is a proteinous toxin produced by enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC, STEC) that causes edema disease, and is classified into type 1 (Stx1) and type 2 (Stx2).
  • Stx1 is classified into subclasses a to d
  • Stx2 is classified into subclasses a to g.
  • a holotoxin consisting of 1 molecule of A subunit, which is the main body of toxicity, and 5 molecules of B subunit that works to bind to the intestinal mucosa. It acts on ribosomes of eukaryotic cells and inhibits protein synthesis.
  • the B subunit (Stx2eB) of Stx2e used in the present invention is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, for example.
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of the mature region of the Stx2e B subunit protein (GenBank Accession No. AAQ63639) (Ala19 to Asn87, excluding the signal peptide secreted into the periplasm).
  • Stx2eB may be, for example, a mutant type in which Asn73 (that is, the Asn residue at position 55 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8) is substituted with a Ser residue.
  • amino acid sequence (Asn73Ser) in which the Asn residue at position 55 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is substituted with Ser is represented by SEQ ID NO: 10. Wild-type Stx2eB undergoes N-linked glycosylation at this Asn residue, but this mutant does not undergo N-linked glycosylation.
  • Stx2eB can be administered to animals such as pigs and chickens as a fusion protein to induce innate immunity
  • one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10 are substituted. May be deleted, inserted or added.
  • the “several” is, for example, 2 to 10, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 3.
  • Stx2eB has an identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, and pig or It may be one that can be administered to animals such as chickens to cause innate immunity enhancement.
  • E. coli diarrhea is caused by the proteinaceous toxin LT produced by Toxigenic E. coli (ETEC), which is also called E. coli heat-labile toxin.
  • ETEC Toxigenic E. coli
  • LT is a holotoxin consisting of 1 molecule of A subunit and 5 molecules of B subunit which are toxic bodies.
  • the LT A subunit (LTA) enters the cytoplasm, increases intracellular cAMP concentration, and activates cell membrane chloride channels, causing water leakage into the intestinal tract, ie, diarrheal pathology.
  • the LT B subunit (LTB) is non-toxic and is involved in the adhesion between LT toxins and intestinal cells.
  • the LTB used in the present invention is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, for example.
  • SEQ ID NO: 12 As long as LTB can be administered to animals such as pigs and chickens as a fusion protein to induce innate immunity, one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 are substituted, deleted, It may be inserted or added.
  • the “several” is, for example, 2 to 10, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 3.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is registered as GenBank Accession No. AAL55672.
  • LTB has 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and is used as a fusion protein in animals such as pigs and chickens. It may be one that can be administered to cause innate immunity enhancement.
  • a sugar chain may be added to LTB.
  • an N-linked sugar chain is added to the Asn residue at position 90 of LTB (ie, position 90 of SEQ ID NO: 12).
  • a mutant LTB in which the 90th position of SEQ ID NO: 12 is replaced with a Ser residue does not undergo N-linked sugar chain modification.
  • CTB Cholera toxin (CT) protein consists of one A subunit (CTA), which is the main body of toxicity, and five B subunits (CTB) involved in invasion into the intestinal mucosa.
  • CTB used in the present invention is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, for example.
  • SEQ ID NO: 6 As long as CTB can be administered to animals such as pigs and chickens as a fusion protein to induce innate immunity, one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 are substituted, deleted, It may be inserted or added.
  • the “several” is, for example, 2 to 10, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 3.
  • CTB has 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and as fusion protein to animals such as pigs and chickens. It may be one that can be administered to cause innate immunity enhancement.
  • the fusion protein that is an active ingredient of the innate immunity enhancing agent of the present invention may be a fusion protein of two or more toxin B subunits arbitrarily selected from Stx2eB, LTB, and CTB, but preferably, fusion of Stx2eB and LTB It is a protein.
  • the order in which Stx2eB and LTB are fused may be any first.
  • a fusion protein containing two or more Stx2eB is also preferable because of its excellent ability to activate macrophages.
  • the peptide linker means a linker composed of peptides in which amino acids are linked in a straight chain.
  • the number of amino acids in the peptide linker used in the present invention is, for example, 5 to 30, preferably 10 to 25, more preferably 10 to 22, and more preferably 12 to 22.
  • the proline content is preferably 20 to 27%, more preferably 20 to 25%.
  • prolines are preferably arranged every two or every third (with 2 or 3 other amino acids in between).
  • the amino acid placed between the prolines is preferably selected from glycine, serine, arginine. However, at one or both ends of the peptide, amino acids other than proline may be added within the range of 5 or less, preferably 4 or less. Such preferred peptide linkers are described in, for example, International Publication WO2009 / 133882.
  • the peptide linker is preferably a peptide (PG12) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a peptide (PG12v2) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the peptide (PG17) which consists of an amino acid sequence represented by sequence number 30, and the peptide (PG22) which consists of an amino acid sequence represented by sequence number 31 can also be used conveniently.
  • the peptide linker may preferably be a peptide having 80% or more, preferably 90% or more identity with the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 30 or 31. .
  • the fusion protein used in the present invention may further have the peptide linker added to its C-terminus.
  • the fusion protein used in the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 15 to 17, for example.
  • LTB and Stx2eB are connected in tandem via a PG12 peptide linker in this order, and PG12 is further added to the C-terminus.
  • Stx2eB and LTB are linked in tandem through a PG12 peptide linker in this order, and PG12 is further added to the C-terminus.
  • two Stx2eBs are linked in tandem via a PG12 peptide linker, and PG12 is further added to the C-terminus.
  • a plant-derived secretory signal peptide or chloroplast transit signal peptide may be added to the amino terminus thereof.
  • additional includes the case where the secretory signal peptide is directly bound to the amino terminus of the fusion protein linked via the peptide or the case where it is bound via another peptide. It is a concept.
  • the secretory signal peptide is preferably a plant belonging to the family Solanaceae, Brassicaceae, Asteraceae, more preferably Nicotiana, Arabidopsis, Lactuca, etc.
  • the secretory signal peptide is preferably derived from tobacco ⁇ -D-glucan exohydrolase and tobacco 38 kDa peroxidase (GenBank Accession D42064).
  • Examples of the secretory signal peptide include a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 derived from tobacco ⁇ -D glucan exohydrolase.
  • the base sequence of DNA encoding tobacco ⁇ -D glucan exohydrolase is represented by SEQ ID NO: 24, for example.
  • Preferred chloroplast translocation signal peptides are described, for example, in International Publication WO2009 / 004842 and International Publication WO2009 / 133882.
  • a signal peptide such as an endoplasmic reticulum residual signal peptide or a vacuolar translocation signal peptide may be added to the carboxyl terminus thereof.
  • the “addition” is a concept including a case where the signal peptide is directly bound to the carboxyl terminus of the fusion protein or a case where it is bound via another peptide.
  • a hybrid protein in which a secretory signal peptide is added to the amino terminus and an endoplasmic reticulum residual signal peptide is added to the carboxyl terminus is also referred to as an endoplasmic reticulum type (ER) hybrid protein.
  • ER endoplasmic reticulum type
  • a DNA construct encoding a protein is also referred to as an endoplasmic reticulum type DNA construct.
  • the fusion protein used in the present invention preferably has an endoplasmic reticulum residual signal peptide added to its carboxyl terminus.
  • Preferred endoplasmic reticulum residual signal peptides are described in, for example, International Publication WO2009 / 004842 Pamphlet and International Publication WO2009 / 133882 Pamphlet, but an HDEL sequence (SEQ ID NO: 26) can be used.
  • Other preferred vacuolar transit signal peptides are described, for example, in International Publication WO2009 / 004842 and International Publication WO2009 / 133882.
  • the fusion protein used in the present invention can be synthesized chemically or can be produced by genetic engineering.
  • DNA construct containing DNA encoding a fusion protein is used.
  • two or more DNAs selected from DNA encoding Stx2eB, DNA encoding LTB, and DNA encoding CTB are linked in tandem via DNA encoding the peptide linker.
  • DNA encoding a peptide linker may be included on the 3 ′ side.
  • the DNA encoding the peptide linker is represented by, for example, SEQ ID NO: 1 (PG12) or SEQ ID NO: 3 (PG12v2).
  • DNA encoding Stx2eB examples include DNA (SEQ ID NO: 7) encoding Stx2eB (Asn73) and DNA (SEQ ID NO: 9) encoding Stx2eB (Asn73Ser).
  • DNA encoding LTB examples include DNA (SEQ ID NO: 11) encoding LTB (Asn90) and DNA (SEQ ID NO: 13) encoding LTB (Asn90Ser).
  • An example of DNA encoding CTB is SEQ ID NO: 5.
  • the DNA encoding the peptide linker and two or more toxin B subunit DNAs are ligated together in the same reading frame except for the stop codon.
  • DNAs encoding Stx2eB, LTB, and CTB can be obtained by a general genetic engineering technique based on the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, and 5, for example.
  • a cDNA library is prepared from bacteria producing each toxin according to a conventional method, and a desired clone is selected using a probe prepared based on the above base sequence from the library. It can also be synthesized by chemical synthesis based on the above base sequence, PCR using the 5 'and 3' end base sequences of the above base sequence as primers, and genomic DNA as a template.
  • DNA encoding a fusion protein can be obtained.
  • the DNA encoding the fusion protein used in the present invention is represented by SEQ ID NOs: 18 to 20, for example. These DNAs encode fusion proteins with amino acid sequences 15, 16, and 17, respectively.
  • the DNA encoding the fusion protein may be DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 18 to 20.
  • Stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • two DNAs having high identity preferably two DNAs having an identity of 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more hybridize, but the identity is lower than that.
  • a condition in which two DNAs do not hybridize is mentioned.
  • 2 ⁇ SSC 330 mM NaCl, 30 mM citrate
  • 42 ° C. may be mentioned
  • preferably 0.1 ⁇ SSC 330 mM NaCl, 30 mM citrate
  • 60 ° C. may be mentioned.
  • the codons indicating the amino acids constituting the fusion protein are appropriately modified so that the amount of translation of the hybrid protein increases depending on the host cell that produces the protein.
  • a codon modification method for example, the method of Kang et al. (Protein Expr Purif. 2004 Nov; 38 (1): 129-35.) Can be referred to.
  • a method of selecting a codon frequently used in the host cell, selecting a codon having a high GC content, or selecting a codon frequently used in the housekeeping gene of the host cell can be mentioned.
  • the DNA encoding the fusion protein is operably linked to an enhancer.
  • “expressible” means that the fusion protein is produced in a host cell when the DNA construct used in the present invention is inserted into a vector containing an appropriate promoter and the vector is introduced into an appropriate host cell.
  • “linkage” is a concept that includes a case where two DNAs are directly bonded and a case where they are bonded via another base sequence. Enhancers include the Kozak sequence and the 5′-untranslated region of plant-derived alcohol dehydrogenase genes. For example, when expressed in plants, the DNA encoding the hybrid protein is preferably operably linked to the 5′-untranslated region of a plant-derived alcohol dehydrogenase gene.
  • the 5′-untranslated region of the alcohol dehydrogenase gene refers to a region including the base sequence from the transcription start point of the gene encoding alcohol dehydrogenase to the translation start point (ATG, methionine).
  • the region may be derived from a plant, preferably a plant belonging to the family Solanaceae, Brassicaceae, Asteraceae, more preferably Nicotiana, Arabidopsis, It is derived from a plant belonging to the genus Lactuca, more preferably from tobacco (Nicotiana tabacum), Arabidopsis thaliana, lettuce (Lactuca sativa) and the like.
  • the 5′-untranslated region of the alcohol dehydrogenase gene for example, the 5′-untranslated region (NtADH5′UTR) (SEQ ID NO: 27) of the alcohol dehydrogenase gene derived from tobacco (Nicotiana tabacum) can be used. Higher translation can be expected by using an NtADH5′UTR region (NtADHmod 5′UTR) (SEQ ID NO: 28) obtained by modifying the point upstream 3 bases.
  • NtADH5′UTR NtADHmod 5′UTR region obtained by modifying the point upstream 3 bases.
  • the DNA construct used in the present invention has a base sequence represented by SEQ ID NOs: 21 to 23, for example.
  • a DNA construct having the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 is composed of NtADHmod5'UTR (SEQ ID NO: 28), LTB protein (wild type Asn90), PG12, Stx2eB protein (mutant Asn73Ser), PG12. It is a DNA construct in which a DNA encoding a fusion protein linked in this order and having a secretory signal peptide added to the amino terminus and an endoplasmic reticulum residual signal peptide added to the carboxyl terminus is linked.
  • a DNA construct having the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 (B-LTB) is prepared by adding Stx2eB protein (mutant Asn73Ser), PG12, LTB protein (wild type Asn90), PG12 to NtADHmod5'UTR (SEQ ID NO: 28). It is a DNA construct in which a DNA encoding a fusion protein linked in this order and having a secretory signal peptide added to the amino terminus and an endoplasmic reticulum residual signal peptide added to the carboxyl terminus is linked.
  • a DNA construct having a base sequence represented by SEQ ID NO: 23 is composed of NtADHmod5'UTR (SEQ ID NO: 28), Stx2eB protein (mutant Asn73Ser), PG12, Stx2eB protein (mutant Asn73Ser), and PG12. It is a DNA construct in which a DNA encoding a fusion protein linked in this order and having a secretory signal peptide added to the amino terminus and an endoplasmic reticulum residual signal peptide added to the carboxyl terminus is linked.
  • the DNA construct used in the present invention can be prepared by a general genetic engineering technique, and includes a 5′-untranslated region of a plant-derived alcohol dehydrogenase gene, a DNA encoding a plant-derived secretory signal peptide, and a fusion protein
  • Each DNA such as a DNA encoding a DNA and a DNA encoding an endoplasmic reticulum residual signal peptide, can be constructed by cleaving with an appropriate restriction enzyme and ligating with an appropriate ligase.
  • the recombinant vector used in the present invention is characterized by including the DNA construct.
  • the recombinant vector used in the present invention may be inserted into the vector so that the DNA encoding the fusion protein can be expressed in the host cell into which the vector is introduced.
  • the vector is not particularly limited as long as it can replicate in the host cell, and examples thereof include plasmid DNA and viral DNA.
  • the vector preferably contains a selection marker such as a drug resistance gene.
  • Plasmid DNA can be prepared from Escherichia coli and Agrobacterium by an alkali extraction method (Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513) or a modified method thereof.
  • pBI221, pBI121, pBI101, pIG121Hm etc. can also be used, for example.
  • viral DNA for example, pTB2 (Donson et al., 1991) can be used (Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ gene by a tobacco mosaic virus-based (See vector. Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88: 7204-7208)
  • the promoter used in the vector can be appropriately selected according to the host cell into which the vector is introduced.
  • cauliflower mosaic virus 35S promoter (Odell et al. 1985 Nature810313: 810), rice actin promoter (Zhang et al.1991 Plant Cell 3: 1155), maize ubiquitin promoter (Cornejo et al.1993 Plant Mol. Biol . 23: 567) is preferably used.
  • the terminator used in the vector can be appropriately selected according to the host cell into which the vector is introduced.
  • nopaline synthase gene transcription terminator cauliflower mosaic virus 35S terminator, Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene terminator (HSP-T) and the like are preferably used.
  • a preferred terminator used in the present invention is, for example, AtHSP-T represented by SEQ ID NO: 29.
  • the recombinant vector used in the present invention can be obtained, for example, by cleaving the DNA construct with an appropriate restriction enzyme or adding a restriction enzyme site by PCR and inserting it into a restriction enzyme site or a multicloning site of the vector.
  • the transformant used in the present invention is characterized by being transformed with the recombinant vector.
  • the host cell used for transformation may be either a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.
  • Eukaryotic cells, mammalian cells, yeast cells, or in insect cells, plant cells are preferably used, among others Lactuca (Lactuca) Asteraceae such as (Asteraceae), Solanaceae, Brassicaceae, the Chenopodiaceae
  • the plant cell to which it belongs is preferably used.
  • plant cells belonging to the genus Lactuca particularly lettuce ( Lactuca sativa ) cells, are preferably used.
  • cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter or the like can be used as the vector.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli , Agrobacterium tumefaciens, and the like.
  • the transformant used in the present invention can be prepared by introducing the vector used in the present invention into a host cell using a general genetic engineering technique.
  • introduction methods using Acrobacterium Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2: 218, Hiei, et al., 1994 Plan J. 6: 271
  • electroporation method Tada, et al., 1990, Theor.Appl.Genet, 80: 475
  • polyethylene glycol method Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 437
  • particle gun method Sanford, et al., 1987
  • J. Part. Sci.tech. 5:27 polycation method
  • Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29; 428 (3): 235-40 can be used. is there.
  • the transformant After introducing the vector used in the present invention into a host cell, the transformant can be selected according to the phenotype of the selection marker.
  • the fusion protein can be produced by culturing the selected transformant.
  • the medium and conditions used for the culture can be appropriately selected according to the species of the transformant.
  • the host cell is a plant cell
  • the plant body can be regenerated by culturing the selected plant cell according to a conventional method, and the fusion protein is accumulated in the plant cell or outside the cell membrane of the plant cell. be able to.
  • the method of Visser et al. (Theor. Appl. Genet 78: 594 (1989)) can be cited for potato, and Nagata and Takebe (Planta 99:12 (1971) for tobacco. ) Method.
  • shoot regeneration is possible with MS medium containing 0.1 mg / l NAA (naphthalene acetic acid), 0.05 mg / l BA (benzyladenine) and 0.5 g / l polyvinylpyrrolidone.
  • MS medium containing 0.1 mg / l NAA (naphthalene acetic acid), 0.05 mg / l BA (benzyladenine) and 0.5 g / l polyvinylpyrrolidone.
  • a plant body producing the fusion protein can be obtained. , Included in the transformant.
  • Agrobacterium tumefaciens infects plant wounds and carries a large extrachromosomal factor called a tumor-inducing Ti (tumor-inducing) plasmid.
  • tumor-inducing Ti tumor-inducing
  • Representative plants converted by this technique include tobacco, tomato, sunflower, cotton, rapeseed, potato, poplar, and soybean, strawberry, rice.
  • a variety of plant species have been demonstrated to regenerate plants from tissues transformed with Agrobacterium tumefaciens . Examples of this plant include sunflower, tomato, white clover, rape, cotton, tobacco, potato, corn, strawberry, rice and many other vegetable crops.
  • edible plants including the lettuce can be transformed with the Agrobacterium Ti vector.
  • the expression level of the fusion protein in the transformant is preferably 0.1 mg to 150 mg per gram of the dry weight of the transformant, more preferably 0.5 mg to 100 mg, and further preferably 0.5 mg to 50 mg.
  • the innate immunity enhancing agent of the present invention is not limited as long as it contains the fusion protein, but may contain a transformant transformed with DNA encoding the fusion protein as described above and expressing the fusion protein. Good.
  • the immunopotentiator of the present invention may contain all or part of the transformant containing the fusion protein.
  • the transformant can be used as it is, or can be used after drying, pulverizing, or the like. In particular, when the transformant is a plant, it is preferably used after being powdered.
  • the method for pulverizing the transformed plant is not particularly limited.
  • a compression crusher such as a jaw crusher, a gyratory crusher, or a corn crusher, a shear crusher such as a cutter mill or a shredder, an impact crusher such as a hammer crusher, or a roll crusher.
  • Roll mills such as roll mills, disintegrators, cage mills, screw mills such as coffee mills, roll rolling mills such as edge runners, striking mills such as stamp mills, centrifugal roller mills, ball bearing mills, bawl mills, High speed rotating mills such as roller mills such as ong mills, swing hammer mills, pin mills, cage mills, turbo type mills, centrifugal classification mills, container vibration mills such as rolling ball mills, vibration ball mills, planetary ball mills, CF mills, and distribution pipe types Pulverization using an agitator, stirring tank mill, annular mill, airflow suction, airflow collision, collision plate collision, fluidized bed type jet mill, ultrasonic crusher, etc. Etc.
  • the drying method include methods such as reduced pressure heat drying, normal pressure heat drying, spray dryer, drum dryer, and freeze drying.
  • the shape and size of the powder of the transformed plant is not particularly limited as long as it is a shape and size that can be administered to the target animal and absorbed into the body, and may be particulate powder.
  • the fusion protein or a transformant containing the fusion protein may be used as it is, or may be used as a composition after being mixed with a carrier or additive used for animal drugs or animal feed.
  • a carrier or additive used for animal drugs or animal feed examples include solvents, diluents, excipients, binders, solvents, and the like that do not cause a harmful physiological reaction to the administration target and do not cause a harmful interaction with other components contained in the vaccine.
  • the carrier include solvents, diluents, excipients, binders, solvents, and the like that do not cause a harmful physiological reaction to the administration target and do not cause a harmful interaction with other components contained in the vaccine.
  • water, physiological saline, and various buffers are used for the preparation of a liquid vaccine composition.
  • Additives include adjuvants, stabilizers, pH adjusters, thickeners, antioxidants, isotonic agents, buffers, solubilizers, suspending agents, preservatives, frost damage inhibitors, cryoprotectants, Examples are freeze-drying protective agents, antibacterial agents and the like.
  • the adjuvant a substance that enhances the immunogenicity of the fusion protein can be used, and examples thereof include aluminum hydroxide, an adhesion factor of E. coli, such as cilia of E. coli.
  • Examples of the dosage form of the innate immunity enhancing agent of the present invention include liquids, tablets, ointments, granules and the like, but liquids are preferable.
  • the fusion protein or transformant is water, physiological saline, buffer, A liquid vaccine composition obtained by suspending or dissolving in a vegetable oil or the like and adding an additive such as a stabilizer as necessary is preferable.
  • a suspension with a concentration of 0.5 mg / ml to 500 mg / ml is preferable, and a suspension with a concentration of 1 mg / ml to 100 mg / ml is more preferable.
  • a suspension with a concentration of 5 mg / ml to 50 mg / ml is more preferable.
  • the suspension means a composition in which a powder of the transformant as an active ingredient is dispersed in a liquid, and a part of the powder may be dissolved in the liquid.
  • the concentration of the active ingredient antigen protein is 10 ppm to 15000 ppm, more preferably 10 ppm to 5000 ppm, and more preferably 50 ppm to 2000 ppm. It is more preferable to suspend so that.
  • the transformant powder may be supplied as a powder and used by the user suspended in water, physiological saline, buffer solution, vegetable oil or the like immediately before administration to the target animal.
  • the innate immunity enhancing method of the present invention is characterized in that a transformant such as a plant transformed with the fusion protein or the DNA construct, or a dried or pulverized product thereof is administered to an animal.
  • administration subjects include non-human mammals such as pigs, cows, chickens, sheep, goats, dogs, cats, and fish.
  • the innate immunity enhancing agent of the present invention activates macrophages, neutrophils, dendritic cells and / or NK cells to enhance non-specific immune responses and is not particularly limited as a target disease, and is prevented by innate immunity. Or, all diseases that can be treated are included.
  • pigs edema disease, brucellosis, anthrax, tetanus, swine erysipelas, swine dysentery, salmonellosis, colibacillosis, atrophic rhinitis, actinobasiosis, mycoplasma infection Disease, swine infectious gastroenteritis, swine epidemic diarrhea onset, swine influenza, Japanese encephalitis, Aujeszky's disease, foot-and-mouth disease, swine buffalo disease, swine cholera, swine leukemia, swine genital / respiratory disease group, rotavirus, roundworm, Examples include pneumonia, toxoplasmosis, and coccidiosis.
  • the target diseases of cattle include bovine lung disease, anthrax, hemorrhagic sepsis, brucellosis, tuberculosis, salmonellosis, tetanus, rinderpest, foot-and-mouth disease, epidemic encephalitis, rabies, blistering stomatitis, Rift Valley disease, Yone disease, Bluetongue, Akabane disease, Chuzan disease, Lampeskin disease, bovine viral diarrhea, bovine leukemia, piroplasmosis, anaplasmosis and the like.
  • chicken diseases include salmonella infection, mycoplasma disease, chicken colibacillosis, hemophilus, Newcastle disease, highly pathogenic avian influenza, poultry infectious bronchitis, fowlpox, chicken encephalomyelitis, and coccidiosis.
  • the target diseases of goats include anthrax, brucellosis, tuberculosis, Chuzan disease, foot-and-mouth disease, and Akabane disease.
  • the target diseases of dogs include leptospira, bacterial enteritis, rabies, parvovirus infection, distemper virus infection, canine infectious bronchitis (kennel cough), coronavirus infection, herpes virus infection, babesiosis and the like.
  • Feline target diseases include feline hemoplasma infection, rickettsia infection, rabies, feline leukemia virus infection, feline herpes virus infection, feline immunodeficiency virus (FIV) infection, feline calicivirus infection, feline viral nasal trachea Fire (FVR), cat filaria, etc. are mentioned.
  • the target diseases of fish include streptococci, vibrio disease, iridovirus infection and the like.
  • the innate immunity enhancing agent of the present invention is particularly effective in controlling various diseases such as edema disease, Escherichia coli diarrhea, PRRS (pig reproduction / respiratory disorder syndrome), mycoplasma infection (mycoplasma pneumonia), trisalmonellosis and the like. is there.
  • the timing of administration is not particularly limited. For example, it can be administered to pigs in the lactation period to 120 days of age, and for pigs in the lactation period to 90 days of age. It is preferable to administer, and it is preferable to administer to mother pigs before and after the breeding season.
  • a plant transformed with the DNA construct is administered to a mother pig, and the antibody produced by the mother pig is given to the piglet with milk, and the plant transformed with the DNA construct Can be administered to a piglet of the suckling stage to 90 days of age, and the piglet can be directly immunized.
  • the innate immunity enhancing agent of the present invention When the innate immunity enhancing agent of the present invention is administered to a chicken, it can be administered regardless of the age of the chicken.
  • a method for administering the innate immunity enhancing agent of the present invention to animals such as pigs and chickens a method wherein the plant transformed with the DNA construct or a dried or crushed product thereof is mixed and given to the feed, nasal nose Examples thereof include a nasal administration method.
  • nasal administration an immune reaction can be gently induced in a living body using a small amount of antigen.
  • the innate immunity enhancing agent of the present invention is preferably administered multiple times at regular intervals. For example, a method of administering a total of 2 to 3 times every 4 to 7 days can be mentioned.
  • the dose of the innate immunity enhancing agent of the present invention is appropriately determined depending on the type of the target animal, body weight, sex, age, type of the target disease, etc.
  • a single dose Is 0.01 mg to 100 g per kg body weight of the subject animal.
  • the mass (absolute amount) of the fusion protein is preferably 0.005 mg to 100 mg per day.
  • the dry mass (absolute amount) of the transformant is preferably 0.01 mg to 200 mg per day.
  • the mass (absolute amount) of the fusion protein is preferably 0.005 mg to 0.5 g per day.
  • the dry mass (absolute amount) of the transformant is preferably 0.01 mg to 1 g per day.
  • the dose of fusion protein per kg body weight of the animal to be administered is preferably 0.005 mg to 50 g per day.
  • the dosage of the transformant per kg body weight of the animal to be administered is preferably 0.01 mg to 100 g (dry mass) per day.
  • LTB-Stx2eB LTB-Stx2eB
  • B-LTB Stx2eB-LTB
  • Stx2eB a glycosylation site mutant (Asn73Se) was used (SEQ ID NO: 10).
  • SEQ ID NO: 28 sequence-modified NtADH 5′-UTR
  • AtHSP terminator SEQ ID NO: 29
  • the combined vaccine antigen candidate protein was highly accumulated.
  • the constructed gene cassette was introduced into a binary vector pRI909 (TAKARA) and used for transformation of lettuce (FIG. 1).
  • Stx2eB-Stx2eB (Stx2eB-B) (SEQ ID NO: 17) in which Stx2eB was linked in two via a PG12 peptide linker was also prepared in the same manner.
  • the selection medium [1 ⁇ MS salt, 1 ⁇ MS vitamin, 0.05 mg / l BA, 0.1 mg / l NAA, 0.5 g / l polyvinylpyrrolidone (PVP), 50 mg / l kanamycin (Km ), 250 mg cefotaxime (Cef), 3% sucrose, 0.8% agar, pH 5.8] and cultured at 25 ° C. under fluorescent light (2000-3000 lux). Thereafter, transplantation to a new selection medium was performed once every 3-4 days (twice / week) until adventitious buds were obtained.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • Km 50 mg / l kanamycin
  • Cef cefotaxime
  • 3% sucrose 0.8% agar, pH 5.8
  • Redifferentiated individuals formed from adventitious buds were placed on rooting medium [1/2 x MS salt, 1 x MS vitamin, 0.5 g / l PVP, 250 mg Cef, 3% sucrose, 0.8% agar, pH 5.8]
  • the cells were transplanted and cultured under the same conditions. Thereafter, transplantation to a new rooting medium was performed once every 3-4 days (twice / week).
  • the rooted redifferentiated individuals were potted and cultivated under the same conditions.
  • Electrophoresis buffer (EZ Run, manufactured by ATTO) was added, 5 ⁇ l of the SDS-converted sample was applied to the well, and this was performed at 200 V constant voltage for 40 minutes.
  • the gel after electrophoresis was blotted with a transblot Turbo (BIO RAD) using a transblot transcription pack (BIO RAD).
  • the membrane after blotting is immersed in a blocking solution (TBS, pH 7.2, Nacalai Tesque), shaken at room temperature for 1 hour or left at 4 ° C for 16 hours, and then TBS-T (137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride). In 1% polyoxyethylene sorbitan monolaurate, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4), washing was performed 3 times at room temperature for 5 minutes.
  • a blocking solution TBS, pH 7.2, Nacalai Tesque
  • the membrane was immersed in this diluted solution, and the antigen-antibody reaction was performed by shaking at room temperature for 2 hours, followed by washing in TBS-T by shaking at room temperature for 5 minutes three times.
  • Anti-Rabbit IgG, AP-linked Antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY) diluted 10,000 times with TBS-T was used as the secondary antibody.
  • the membrane was immersed in this diluted solution, and the antigen-antibody reaction was performed by shaking at room temperature for 1 hour, followed by washing in TBS-T by shaking at room temperature for 5 minutes three times.
  • the color development reaction with alkaline phosphatase was carried out using a chromogenic solution (0.1 M sodium chloride, 5 mM magnesium chloride, 0.33 mg / ml nitroblue tetrazolium, 0.33 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate, 0.1 M Tris
  • a chromogenic solution 0.1 M sodium chloride, 5 mM magnesium chloride, 0.33 mg / ml nitroblue tetrazolium, 0.33 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate, 0.1 M Tris
  • the membrane was immersed in HCl, pH 9.5) and shaken at room temperature for 7 minutes. The membrane was washed with distilled water and then dried at room temperature.
  • the developed membrane was imaged at a resolution of 600 dpi using a scanner (PM-A900, Epson), and LTB protein was quantified using image analysis software (CS
  • Macrophage activation test 1 As an innate immunity activation index, the amount of TNF ⁇ produced by macrophage activation was measured, and the innate immunity induction ability of each test substance was compared. The procedure is as follows. As test samples, Stx2eB-Stx2eB and Stx2eB-His prepared and purified by recombinant E. coli were used. (6-1) Preculture RAW264.7 cells were subcultured in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 100 ⁇ g / mL penicillin, and streptomycin.
  • the culture solution was added to the remaining solution and diluted to prepare a cell number of 8 ⁇ 10 5 cells / mL. 100 ⁇ L of this cell suspension was added to each well of a 96 well flat bottom plate. The cells were transferred to an incubator and pre-cultured for 6 hours until the cells attached to the bottom of the well and spread. Test solutions each having a concentration 4 times the final concentration were prepared and mixed in an equal amount with the polymyxin B solution prepared to 40 ⁇ g / mL. The plate that had been pre-cultured for 6 hours was taken out, and 100 ⁇ L of the sample was added to each well.
  • the cells were cultured for 24 hours, and 100 ⁇ L of the culture supernatant was transferred to another 96-well flat bottom plate.
  • Medium culture supernatant was prepared with 300 ⁇ L of 5-fold diluted solution with 1% BSA-containing PBS (-) solution.
  • Other group culture supernatants were diluted 100-fold with 1% BSA-containing PBS (-) solution.
  • 1 mL of the solution was prepared.
  • the diluted solution was used for TNF ⁇ ELISA measurement. The measurement method was measured according to the method described in the kit.
  • Macrophage activation test 2 As in the macrophage activation test 1, the amount of TNF ⁇ produced by macrophage activation was measured as an innate immunity activation index, and the innate immunity induction ability of each test substance was compared.
  • test samples recombinant lettuce producing LTB-Stx2eB and Stx2eB-Stx2eB were prepared, frozen, pulverized using liquid nitrogen in a mortar, and juiced. Evaluation was carried out by the same test method as in macrophage activation test 1.
  • a juice of genetically modified lettuce was added to a predetermined concentration. The addition concentration was adjusted using the concentration of Stx2eB as an index.
  • PRRS virus infection protection test A PRRS virus prevention effect confirmation test by oral administration of B-LTB lettuce was conducted.
  • the piglets used in the test were fed artificial milk without colostrum until 24 hours after parturition, and then returned to mother pig feeding.
  • vaccine lettuce (LTB equivalent to 1.7 mg / dose) or lyophilized powder of empty vector lettuce was suspended in water and forcibly administered with a syringe connected to a tube (FIG. 2).
  • lettuce ER LTB-ectGP5, WO2016 / 021276, abbreviated as LG
  • LG expressing an antigen in which a neutralizing epitope of PRRS virus was fused to LTB was administered.
  • test animals The number of test animals was 2 for the negative control and 3 each for B-LTB and LG.
  • North American type III PRRS virus was administered and challenged on day 25 by nasal spray. Body weight and feed intake were measured, clinical symptoms were observed daily, and respiratory symptoms (0: none 1: mild 2: moderate 3: severe), typical symptoms of PRRS, were observed and scored.
  • autopsy After euthanasia on the 21st day of the PRRS virus attack, autopsy was performed, and abnormalities in each organ and tissue were observed macroscopically. Pathological specimens of major organs were prepared and histopathological findings were observed.
  • SE infection 15-day-old chicks are forcibly orally administered 1 mL of culture solution of Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Enteritidis (SE) field isolate.
  • the number of bacteria in the culture solution was about 1.0 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • SE infection 15-day-old chicks are forcibly orally administered 1 mL of culture solution of Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Enteritidis (SE) field isolate.
  • the number of bacteria in the culture solution was about 1.0 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • (10-5) Follow-up The breeding period is 7 days after SE infection. Body weight is measured on days 0, 3, and 7 after SE infection. At the time of body weight measurement, feed intake is also measured. General clinical symptoms were observed every day during the study period.
  • Necropsy Perform autopsy on 7 birds in each group 3 and 7 days after SE infection. Blood is collected at necropsy. Cecal contents were collected.
  • (10-7) Analysis The number of
  • test pig weights are as follows. Placebo 7.9, 8.4, 6.0, 6.9 Average 7.3 kg, Standard deviation 1.1 Nasal 4.7, 8.5, 7.2, 7.7 Average 7.0 kg, Standard deviation 1.6
  • Clinical score healthy (0: normal 1: decline 2: disappearance) Appetite (0: Normal 1: Slightly poor 2: Slow 3: Abolition) Periocular edema (0: none 1: mild 2: moderate 3: severe) Movement disorder (0: none 1: mild 2: moderate 3: severe) Fecal properties (0: normal 1: soft stool 2: mud stool 3: watery diarrhea) Posture (0: Normal 1: Prone 2: Lying) Neurological symptoms (0: none 1: mild 2: moderate 3: severe) In the case of death, the highest value of each score was continuously given until the end of observation.
  • PRRS infection protection test Respiratory symptoms were scored daily after PRRS virus infection. The total score for each of the 6 days from 0-6 days, 7-13 days, and 14-21 days after infection was calculated for each individual, and the mean and standard deviation were calculated within the group (FIG. 4). As a result, although there was no significant difference, alleviation of symptoms was observed in the B-LTB administration group compared to the negative control. The effect was not comparable to LG containing PRRS antigen.
  • Mycoplasma LTB-B and B-LTB-treated pigs were necropsied on day 56. As a result, natural infection of mycoplasma was observed in some individuals. The degree of Mycoplasma pneumonia was scored by individual (-, +, ++). In the negative control lettuce administration group, findings were observed in 3 out of 3 animals, whereas in the LTB-B and B-LTB administration groups, the number of individuals that had findings decreased (Table 4).
  • Salmonella Table 5 shows the results of weight analysis. In the placebo administration group, chicks gained an average of 16 g on the third day after 15 days of age, but in the vaccine lettuce administration group, the average was 28 g in the 5 administration group and 29 g in the 2 administration group, with Salmonella. It was shown to mitigate the effects of
  • the results of the bacterial count analysis are shown in Table 6.
  • the number of Salmonella in the cecal contents of the chick cecal content was 6.92 (log cells / g) on the third day after the Salmonella attack and 68% compared to 7.41 (log cells / g) in the placebo lettuce group On day 7, it decreased by 6.61 (log cells / g) and 61% compared to 7.03 (log cells / g) with placeboletus.
  • the number of Salmonella in the cecal contents of the chick cecal content was 6.69 (log cells / g) on the 7th day after Salmonella attack and 54% compared with the placebo lettuce 7.03 (log cells / g) Diminished. From these results, it was found that administration of Stx2eB-B lettuce to chicken chicks prior to Salmonella challenge reduces the number of Salmonella in the intestines and prevents a decrease in weight gain.
  • the innate immunity enhancer of the present invention is particularly useful in the field of livestock.

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Abstract

志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質を対象動物に投与することで対象動物における自然免疫を誘導する。

Description

自然免疫増強剤
　本発明は、毒素融合タンパク質を利用した自然免疫増強剤に関する。
　ブタは通常生後21日を目安に離乳する。離乳前は母ブタからの乳汁免疫による移行抗体で病原菌の感染から免れている。しかし、離乳と同時に、豚舎の移動、環境の変化、餌の切り替え、群編成など、子ブタには多くのストレスがかかり、先の移行抗体の消失もあって、離乳から70日齢のいわゆる離乳仔ブタの期間は、ブタの一生のうち最も病気に罹りやすい時期といわれている。この時期に高発する疾病としては、例えば、細菌病ではブタ浮腫病、連鎖球菌症、グレーサー病、サルモネラ症、コクシジウム病、大腸菌性下痢症、マイコプラズマ感染、ウイルス病ではブタ繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）、離乳後多臓器性発育不良症候群（PMWS）などが挙げられる。
　ワクチンは疾病予防の有効な手段であるが、従来は注射型のワクチンが主であった。注射型ワクチンによる免疫ルートで惹起できるのは全身免疫であり、いわゆる特定の疾病を引き起こす病原体にのみ対応する免疫グロブリンの産生を誘導する。この場合、母ブタからの移行抗体が残留する離乳仔ブタにおいては、ワクチンの吸収が阻害されたり、また自己免疫システムの確立が不十分であったり、必ずしも効果的な予防法になっていない。このように離乳仔ブタの疾病は多種多様であり、個々の対策を行うことは際限がなく、総合的な対策が望ましい。
　特許文献１では、特定のアミノ酸配列を持つリンカー(PG12)を利用して、志賀（浮腫病）毒素Bサブユニット(Stx2eB)と大腸菌易熱性毒素Bサブユニット（LTB）またはコレラ毒素Bサブユニット（CTB）の融合タンパク質を作製し、植物で生産させたことが開示されている。しかしながら、目的はあくまでもこれらの毒素のみを標的としたワクチンとしての使用であり、融合タンパク質のワクチン機能を評価した実施例もない。
　また、特許文献２では、LTBとStx2eBの融合タンパク質を浮腫病および下痢症などの大腸菌症のワクチンとして使用することが開示されているが、これらの疾病予防効果はLTBとStx2eBに対する抗原特異的な免疫作用を目的としたものであり、自然免疫系を亢進し、他の疾病も含めて予防効果を持つことは全く予想されていなかった。
　また、特許文献３では、PRRSウイルスのGlycoprotein 5 (GP5)タンパク質と、アジュバントタンパク質（LTBまたはStx2eB）を含む融合タンパク質をPRRSのワクチンとして使用することが開示されているが、PRRS予防効果はPRRSに対する抗原特異的な免疫作用を目的としたものであり、PRRSタンパク質を抗原に使用せずに、PRRS予防効果を有するワクチンが得られるとは全く予想されなかった。
　一方、様々な疾病に対する有望な総合的対策として、非特異的な免疫賦活という考え方がある。Casey ey al., (2007) （非特許文献１）は乳酸菌を飼料に混合しブタに経口投与することで、サルモネラ菌感染の症状を緩和したと報告しているし、Kritas and Morrison(2007) （非特許文献２）は、ブタに乳酸菌を投与することで、PRRS感染による増体重の改善を報告しているが、いずれの場合も生菌を使用するために必ずしも高い効果が得られるものではないという問題点があった。
特許5360727号明細書 WO2015/080100 WO2016/021276
Casey ey al., Applied and Environmental Microbiology (2007) 73:1858-63 Kritas and Morrison, Veterinary Microbiology (2007) 119:248-55
　ブタなどの動物において自然免疫系を活性化することができれば、病原体の感染局所におけるマクロファージや樹状細胞などの自然免疫担当細胞を刺激し、非特異的な病原体の貪食を誘導することで、総合的な疾患の防除効果が期待できる。しかしながら、非特異的な自然免疫を効果的に誘導するためには、有効な抗原デザインの最適化が重要な課題であった。
　したがって、本発明は、投与された個体に効率よく自然免疫を誘導することのできる物質を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、志賀毒素2eのBサブユニット、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選ばれる２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質またはそれを含む形質転換体を動物に投与することにより、動物体内においてマクロファージの活性化などを通じて自然免疫を誘導し、ウイルスや細菌およびマイコプラズマの感染などに対して全般的に防除効果を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質を含む、自然免疫増強剤。
（２）前記融合タンパク質がStx2eBとLTBを含む融合タンパク質である、（１）に記載の自然免疫増強剤。
（３）前記融合タンパク質がStx2eBを２つ以上含む融合タンパク質である、（１）に記載の自然免疫増強剤。
（４）前記Stx2eBの73位のAsn残基がSer残基に置換されている、（１）～（３）のいずれかに記載の自然免疫増強剤。
（５）前記２以上の毒素Bサブユニットがペプチドリンカーを介して融合されている、（１）～（４）のいずれかに記載の自然免疫増強剤。
（６）前記ペプチドリンカーがPG12（配列番号２）、PG12v2（配列番号４）、PG17（配列番号３０）、もしくはPG22（配列番号３１）、またはこれらの配列と８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドである、（５）に記載の自然免疫増強剤。
（７）前記融合タンパク質が配列番号１５～１７のいずれかのアミノ酸配列を有する、（１）～（６）のいずれかに記載の自然免疫増強剤。
（８）前記融合タンパク質をコードするDNAで形質転換され、前記融合タンパク質を発現した形質転換体を含む、（１）～（７）のいずれかに記載の自然免疫増強剤。
（９）前記形質転換体が植物である、（８）に記載の自然免疫増強剤。
（１０）前記植物が植物の乾燥粉末又はその懸濁液として含まれる、（９）に記載の自然免疫増強剤。
（１１）経鼻投与用である、（１）～（１０）のいずれかに記載の自然免疫増強剤。
（１２）ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）（PRRSの原因ウイルスであり、アルテリウイルス科、アルテリウイルス属に分類されるウイルス）、サルモネラ菌またはマイコプラズマに対する免疫応答を誘導する、（１）～（１１）のいずれかに記載の自然免疫増強剤。
（１３）マクロファージ活性化作用を有する、（１）～（１２）のいずれかに記載の自然免疫増強剤。
（１４）志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質を含む、マクロファージ活性化剤。
（１５）志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質または該融合タンパク質をコードするDNAで形質転換され、前記融合タンパク質を発現した形質転換植物を非ヒト哺乳動物に投与することを特徴とする、非ヒト哺乳動物の自然免疫を増強させる方法。
　本発明の融合タンパク質またはそれを含む形質転換体をブタや鶏などの動物に投与することにより、特定の毒素ではなく、細菌、ウイルス、マイコプラズマなどあらゆる病原体に起因する不特定の疾病に対する免疫力（自然免疫）を向上させることができる。すなわち、当該融合タンパク質やそれを発現するトランスジェニック植物を食餌することによって、通常、有効成分（抗原）に対して、１対１の関係にある疾病に対してのみワクチン効果が期待されるものを、本発明では、不特定な疾病に対しても免疫誘導ができるようになった。これによって、ブタや鶏などの生産者の省コスト化、省力化、および家畜や養鶏のストレス軽減を可能にし、生産性の向上が期待できる。
レタスに導入した融合タンパク質の発現カセットを示す図。 PRRSV感染防御試験スケジュールを示す図。 融合タンパク質ワクチンの経口投与スケジュールを示す図。 対照又は融合タンパク質ワクチンを投与した時のPRRSV感染後の呼吸スコアを示す図。 対照又は融合タンパク質ワクチンを投与した時のPRRSV感染後の飼料要求率を示す図。 対照又は融合タンパク質ワクチンを投与した時のPRRSV感染後の剖検時における肺の所見を示す図（写真）。
　以下、本発明の実施形態について説明する。
　本発明において、自然免疫増強剤とは、動物生体内における自然免疫作用を活性化する薬剤をいう。本発明において、自然免疫とは、生体が備える免疫のうち、生体に先天的に備わっており、事前に抗原に暴露していなくても前記抗原を生体から排除するに際に機能する機構を意味する。本発明の自然免疫増強剤としてより具体的には、マクロファージ、好中球、樹状細胞及び／またはナチュラルキラー（NK）細胞等を介した非特異的な免疫応答を活性化する薬剤を意味する。なお、マクロファージの活性化はマクロファージ細胞における腫瘍壊死因子（TNF）αの発現などで確認できる。
　本発明の自然免疫増強剤は、志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質を含む。なお、志賀毒素、大腸菌易熱性毒素及びコレラ毒素はいずれも毒性本体であるAサブユニット１分子と腸管粘膜への結合に関与するBサブユニット５分子からなるホロ毒素であり、これらのBサブユニットは、当該腸管粘膜への結合に関与するBサブユニットを意味する。
　前記２以上としては、好ましくは、２～５であり、より好ましくは２～３であり、さらに好ましくは２である。なお、２以上のタンパク質とは、Stx2eB、LTB及びCTBから選択されるいずれか１種類の毒素Bサブユニットが２つ以上含まれる態様でもよいし、Stx2eB、LTB及びCTBから選択される２種類の毒素が合計で２つ以上含まれる態様でもよいし、Stx2eB、LTB及びCTBが合計で３つ以上含まれる態様でもよい。
　なお、本発明において、融合タンパク質とは、１つのポリペプチド鎖の中に２つ以上のタンパク質ユニットを含む多価タンパク質を意味する。
＜Stx2eB＞
　志賀毒素（Stx）は、浮腫病の原因となる腸管出血性大腸菌(EHEC, STEC)が産生するタンパク質性毒素で、１型（Stx1）及び２型（Stx2）に分けられる。Stx1は、ａ～ｄのサブクラスに、Stx2はａ～ｇのサブクラスにそれぞれ分類される。毒性本体であるAサブユニット１分子と腸管粘膜への結合に働くBサブユニット５分子からなるホロ毒素で、真核細胞のリボソームに作用して、タンパク質合成を阻害する働きを持つ。
　本発明で使用されるStx2eのBサブユニット（Stx2eB）は、例えば、配列番号８のアミノ酸配列で表される。配列番号８は、Stx2e Bサブユニットタンパク質（GenBank Accession No. AAQ63639）の成熟領域（ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ala19～Asn87）のアミノ酸配列を示す。
　また、Stx2eBは、例えば、Asn73（すなわち、配列番号８のアミノ酸配列の55位のAsn残基）がSer残基に置換されている変異型でもよい。配列番号８のアミノ酸配列の55位のAsn残基がSerに置換されているアミノ酸配列（Asn73Ser）を配列番号１０で示す。野生型のStx2eBはこのAsn残基においてN－結合型の糖鎖修飾を受けるが、この変異体はN－結合型の糖鎖修飾を受けない。
　また、Stx2eBは、融合タンパク質としてブタや鶏等の動物に投与して自然免疫増強を引き起こすことができる限り、配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２～１０個、好ましくは２～５個、より好ましくは２～３個である。
　また、Stx2eBは、配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ融合タンパク質としてブタや鶏等の動物に投与して自然免疫増強を引き起こすことができるものであってもよい。
＜LTB＞
　大腸菌性下痢症は、毒素原性大腸菌(ETEC)が生産するタンパク質性毒素LTが原因であり、LTは大腸菌易熱性毒素とも呼ばれる。LTは、毒性本体であるAサブユニット１分子とBサブユニット５分子からなるホロ毒素である。LTのAサブユニット（LTA）は細胞質内に侵入し、細胞内cAMP濃度を上昇させ、細胞膜クロライドチャネルを活性化することで腸管内への水の漏出すなわち下痢の病態を引き起こす。LTのBサブユニット（LTB）は無毒であり、LT毒素と腸管細胞との接着に関与する。
　本発明で使用されるLTBは、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列で表される。LTBは、融合タンパク質としてブタや鶏等の動物に投与して自然免疫増強を引き起こすことができる限り、配列番号１２で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２～１０個、好ましくは２～５個、より好ましくは２～３個である。配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、GenBank Accession No. AAL55672として登録されている。
　また、LTBは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ融合タンパク質としてブタや鶏等の動物に投与して自然免疫増強を引き起こすことができるものであってもよい。
　本発明の他の実施形態では、LTBに糖鎖が付加されていてもよい。例えば、LTBの９０位（すなわち、配列番号１２の９０位）のAsn残基にN－結合型の糖鎖が付加される。一方、配列番号１２の９０位がＳｅｒ残基に置換された変異型LTB（アミノ酸配列を配列番号１４で表す）はN－結合型の糖鎖修飾を受けない。
＜CTB＞
コレラ毒素（CT）タンパク質は、毒性本体である１つのAサブユニット（CTA）と、腸管粘膜への侵入へ関与する５つのBサブユニット（CTB）からなる。
本発明で使用されるCTBは、例えば、配列番号６のアミノ酸配列で表される。CTBは、融合タンパク質としてブタや鶏等の動物に投与して自然免疫増強を引き起こすことができる限り、配列番号６で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、２～１０個、好ましくは２～５個、より好ましくは２～３個である。
また、CTBは、配列番号６で表されるアミノ酸配列と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつ融合タンパク質としてブタや鶏等の動物に投与して自然免疫増強を引き起こすことができるものであってもよい。
　本発明の自然免疫増強剤の有効成分である融合タンパク質は、Stx2eB、LTB、CTBから任意に選ばれる２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質であればよいが、好ましくは、Stx2eBとLTB の融合タンパク質である。本発明において、Stx2eBとLTBとが融合される順序は、いずれが先であってもよい。また、マクロファージ活性化能に優れるため、Stx2eBを２つ以上含む融合タンパク質も好ましい。
　本発明の好ましい実施形態では、Stx2eB、LTB、CTBから任意に選ばれる２以上の毒素Bサブユニットはペプチドリンカーを介してタンデムに連結される。ここで、ペプチドリンカーとは、直鎖状にアミノ酸が連結したペプチドからなるリンカーを意味する。
　本発明で用いるペプチドリンカーのアミノ酸の個数は、例えば５～３０個、好ましくは１０～２５個、さらに好ましくは１０～２２個、より好ましくは１２～２２個である。また、本発明で用いるペプチドリンカーにおいて、好ましくは、プロリンの含有率が２０～２７％、より好ましくは、２０～２５％である。
　ペプチドリンカーにおいて、プロリンは、好ましくは２つ置き、又は３つ置きに（２または３個の他のアミノ酸を挟んで）配置される。プロリンの間に配置されるアミノ酸は、好ましくは、グリシン、セリン、アルギニンから選択される。但し、ペプチドの一方または両方の末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で付加されていてもよい。このような好ましいペプチドリンカーは、例えば、国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
　本発明において、ペプチドリンカーは、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG12）や配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（PG12v2）である。また、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG17)や配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(PG22)も好適に使用できる。
　本発明において、ペプチドリンカーは、好ましくは、配列番号２、４、３０または３１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するペプチドであってもよい。
　上記のようなペプチドリンカーを用いることにより、融合タンパク質の安定性を向上させ、宿主細胞において高蓄積させることができる。
　なお、本発明で用いる融合タンパク質は、さらにそのＣ末端に前記ペプチドリンカーが付加されていてもよい。
　本発明で用いる融合タンパク質は、例えば、配列番号１５～１７で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、LTBおよびStx2eBがこの順で、PG12ペプチドリンカーを介してタンデムに連結され、そのＣ末端にはPG12がさらに付加されている。配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、Stx2eBおよび LTBがこの順で、PG12ペプチドリンカーを介してタンデムに連結され、そのＣ末端にはPG12がさらに付加されている。配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、２つのStx2eBがPG12ペプチドリンカーを介してタンデムに連結され、そのＣ末端にはPG12がさらに付加されている。
　本発明で用いる融合タンパク質は、植物で発現させる場合などは、そのアミノ末端に、植物由来の分泌シグナルペプチド又は葉緑体移行シグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、前記分泌シグナルペプチドが、前記ペプチドを介して連結した融合タンパク質のアミノ末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。
　分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
　また、分泌シグナルペプチドは、好ましくはタバコのβ-Dグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ-Dグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。タバコのβ-DグルカンエキソヒドロラーゼをコードするDNAの塩基配列は、例えば配列番号２４で表される。
　好ましい葉緑体移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
　さらに、本発明で用いる融合タンパク質は、植物で発現させる場合などは、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、シグナルペプチドが、前記融合タンパク質のカルボキシル末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、小胞体型（ER）のハイブリッドタンパク質ともいい、該小胞体型の融合タンパク質をコードするDNA構築物を、小胞体型のDNA構築物ともいう。小胞体型の融合タンパク質は、真核生物で効率良く蓄積する報告例が多数ある。
　本発明で用いる融合タンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。好ましい小胞体残留シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されているが、HDEL配列（配列番号２６）を利用することができる。
　他の好ましい液胞移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開WO2009/004842号パンフレット及び国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
　本発明で用いる融合タンパク質は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。
　遺伝子工学的に生産する場合、融合タンパク質をコードするDNAを含むDNA構築物を用いる。本発明で用いるDNA構築物は、Stx2eBをコードするDNA、LTBをコードするDNAおよびCTBをコードするDNAから選ばれる２つ以上のDNAが、前記ペプチドリンカーをコードするDNAを介してタンデムに連結されているDNAを含む。さらに、３’側にペプチドリンカーをコードするDNAが含まれてよい。前記ペプチドリンカーをコードするDNAは、例えば配列番号１（PG12）や配列番号３（PG12v2）で表される。Stx2eBをコードするDNAとして、例えば、Stx2eB（Asn73）をコードするDNA（配列番号７）、Stx2eB（Asn73Ser）をコードするDNA（配列番号９）が挙げられる。LTBをコードするDNAとして、例えば、LTB（Asn90）をコードするDNA（配列番号１１）、LTB（Asn90Ser）をコードするDNA（配列番号１３）が挙げられる。CTBをコードするDNAとして、例えば、配列番号５が挙げられる。
　前記ペプチドリンカーをコードするDNAと２つ以上の毒素BサブユニットDNAは、それぞれ終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
　Stx2eB、LTB、CTBをコードするDNAは、例えば、配列番号７、９、１１、１３、５の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。具体的には、各毒素を生産する細菌より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記塩基配列に基づいて作製したプローブを用いて所望のクローンを選択する。また、上記塩基配列を基にした化学合成、上記塩基配列の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムDNAを鋳型としたPCRなどにより合成することもできる。これらを公知の手法でペプチドリンカーをコードするDNAと連結させることにより融合タンパク質をコードするDNAが得られる。
　本発明で用いる融合タンパク質をコードするDNAは、例えば、配列番号１８～２０で表される。これらのDNAはそれぞれアミノ酸配列１５、１６、１７の融合タンパク質をコードする。
　また、融合タンパク質をコードするDNAは、配列番号１８～２０の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのDNAどうし、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのDNAがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのDNAがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば２×SSC（３３０ｍＭ NaCl、３０ｍＭ クエン酸）、４２℃が挙げられ、好ましくは０．１×SSC（３３０ｍＭ NaCl、３０ｍＭ クエン酸）、６０℃が挙げられる。
　融合タンパク質をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、融合タンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。
　コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (Protein Expr Purif. 2004 Nov;38(1):129-35.)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
　本発明で用いるDNA構築物において、好ましくは、前記融合タンパク質をコードするDNAが、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明で用いるDNA構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記融合タンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのDNAが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。
　エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－非翻訳領域が挙げられる。植物で発現させる場合などは、好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするDNAが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－非翻訳領域に発現可能に連結されている。
　アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点（ATG、メチオニン）の前までの塩基配列を含む領域をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
　前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－非翻訳領域（NtADH5'UTR）（配列番号２７）を用いることができ、翻訳開始点上流３塩基を改変したNtADH5'UTR領域（NtADHmod 5'UTR）（配列番号２８）を用いることでさらに高翻訳が期待できる。
　植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－非翻訳領域を得る方法は、例えば、特開2012-19719号公報および国際公開WO2009/133882号パンフレットに記載されている。
　本発明で用いるDNA構築物は、例えば、配列番号２１～２３で表される塩基配列を有する。
　配列番号２１(LTB-B)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号２８）に、LTBタンパク質（野生型Asn90）、PG12、Stx2eBタンパク質（変異型Asn73Ser）、PG12をこの順で連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質、をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
　配列番号２２(B-LTB)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号２８）に、Stx2eBタンパク質（変異型Asn73Ser）、PG12、LTBタンパク質（野生型Asn90）、PG12をこの順で連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質、をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
　配列番号２３(Stx2eB-B)で表される塩基配列を有するDNA構築物は、NtADHmod5'UTR（配列番号２８）に、Stx2eBタンパク質（変異型Asn73Ser）、PG12、Stx2eBタンパク質（変異型Asn73Ser）、PG12をこの順で連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加した融合タンパク質、をコードするDNAを連結したDNA構築物である。
　本発明で用いるDNA構築物は、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－非翻訳領域、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするDNA、及び融合タンパク質をコードするDNA、小胞体残留シグナルペプチドをコードするDNAなどの各DNAを、それぞれ、適当な制限酵素により切断し、適当なリガーゼで連結することで構築することができる。
　本発明で用いる組換えベクターは、前記DNA構築物を含むことを特徴とする。本発明で用いる組換えベクターは、前記融合タンパク質をコードするDNAが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。プラスミドDNAは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法（Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513）又はその変法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして、例えばpBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm等を用いることもできる。ウイルスDNAとしては、例えばpTB2(Donson et al.,1991)等を用いることができる（Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。）
　ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Odell et al．1985 Nature 313：810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al．1991 Plant Cell 3：1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al．1993 Plant Mol．Biol．23：567）等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター、シロイヌナズナheat shock protein 18.2 遺伝子のターミネーター(HSP-T)等が好ましく用いられる。本発明で使用される好ましいターミネーターは、例えば、配列番号２９で表されるAtHSP-Tである。
　本発明で用いる組換えベクターは、例えば、前記DNA構築物を適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することで得ることができる。
　本発明で用いる形質転換体は、前記組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよい。
　真核細胞としては、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞などでもよいが、植物細胞が好ましく用いられ、中でもアキノノゲシ属（Lactuca）などのキク科（Asteraceae）、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ属（Lactuca）に属する植物の細胞、中でもレタス（Lactuca sativa）細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。
　原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）等が用いられる。
　本発明で用いる形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.）などの方法を用いることが可能である。
　本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって前記形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記融合タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
　また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記融合タンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
　レタスの場合は、例えば0.1 mg /ｌのNAA(ナフタレン酢酸)、0.05 mg/ｌのBA(ベンジルアデニン)および0.5 g/ｌのpolyvinylpyrrolidoneを含むMS培地でシュートの再生が可能であり、再生したシュートを0.5 g/lのpolyvinylpyrrolidoneを含む1/2 MS培地で培養することで発根が可能である。
　また、上記のようにして再生した植物体から種子を採取し、それを適当な方法で播種し栽培することにより、前記融合タンパク質を生産する植物体とすることができ、このような植物体も、前記形質転換体に含まれる。
　アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)は植物の傷口で感染させるもので、腫瘍誘発性のTi(tumor-inducing)プラスミドと呼ばれる大きな染色体外因子を運搬する。多くの研究所において、数年に亘る鋭意研究の後、アグロバクテリウム系の開発により、様々な植物組織を型通りに形質転換することが可能となった。この技術により転換された代表的な植物として、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、ナタネ、ジャガイモ、ポプラ、及びダイズ、イチゴ、イネなどがある。
　様々な種の植物について、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)で形質転換された組織から植物を再生することが実証されている。この植物として、ヒマワリ、トマト、シロツメクサ、アブラナ、コットン、タバコ、ジャガイモ、トウモロコシ、イチゴ、イネ、その他多数の野菜作物を挙げることができる。
　本発明においては、アグロバクテリウムＴｉベクターにより上記レタスをはじめとした可食植物を形質転換することができる。
　形質転換体における融合タンパク質の発現量は、好ましくは形質転換体の乾燥重量１ｇあたり0.1mg～150mgであり、より好ましくは0.5mg～100mgであり、さらに好ましくは0.5mg～50mgである。
　本発明の自然免疫増強剤は、前記融合タンパク質を含むものであればよいが、上記のような融合タンパク質をコードするDNAで形質転換され、該融合タンパク質を発現する形質転換体を含んでいてもよい。本発明の免疫増強剤は、前記融合タンパク質を含む形質転換体の全部を含んでいても、一部を含んでいてもよい。また、形質転換体をそのまま用いることもでき、乾燥、粉砕するなどして用いることもできる。特に、形質転換体が植物である場合、粉末化して使用することが好ましい。
　形質転換植物の粉末化の方法は特に制限されないが、例えばジョークラッシャ、ジャイレトリクラッシャ、コーンクラッシャなどの圧縮破砕機、カッターミル、シュレッダーなどの剪断粗砕機、ハンマークラッシャーなどの衝撃破砕機、ロールクラッシャなどのロールミル、ディスインテグレーター、ケージミルなどの回転解砕機、コーヒーミルなどのスクリューミル、エッジランナーなどのロール転動ミル、スタンプミルなどの打槌ミル、遠心ローラーミル、ボールベアリングミル、バウルミル、ゼゴミル、オングミルなどのローラーミル、スイングハンマーミル、ピンミル、ケージミル、ターボタイプミル、遠心分級ミルなどの高速回転ミル、転動ボールミル、振動ボールミル、遊星ボールミル、ＣＦミルなどの容器振動ミル、流通管式ミル、攪拌槽式ミル、アニュラー式ミル、気流吸い込み、気流衝突、衝突板衝突、流動層タイプなどのジェットミル、超音波破砕機などの粉砕機や石うす、乳鉢等の装置を使って粉砕する方法等が挙げられる。
　なお、粉末化は植物を水分量が採取時の１／１０以下になるまで乾燥させてから行うことが好ましい。乾燥方法としては、例えば減圧加熱乾燥、常圧加熱乾燥、スプレードライヤー、ドラムドライヤー、凍結乾燥等の方法が挙げられる。
　形質転換植物の粉末の形状や大きさは、対象動物に投与され、体内に吸収されうる形状や大きさであれば特に制限されず、粒子状の粉末でもよい。
　融合タンパク質またはそれを含む形質転換体は、そのまま使用してもよいし、動物薬や動物用飼料に用いられる担体や添加剤と混合されて組成物として使用してもよい。ここで、担体としては、投与対象に有害な生理学的反応を引き起こさず、ワクチンに含まれる他の成分と有害な相互作用を生じない溶媒、希釈剤、賦形剤、結合剤、溶媒などが挙げられ、液体状のワクチン組成物の調製には例えば、水、生理食塩水、各種緩衝液が用いられる。添加剤としては、アジュバント、安定剤、pH調整剤、増粘剤、抗酸化剤、等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、凍害防止剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、制菌剤などが例示される。
　なお、前記アジュバントとしては、融合タンパク質の免疫原性を高める物質が使用できるが、例えば、水酸化アルミニウム、大腸菌の付着因子、例えば大腸菌の繊毛などが挙げられる。
  本発明の自然免疫増強剤の剤型は、液剤、錠剤、軟膏、顆粒剤などが例示されるが、液剤が好ましく、例えば、上記融合タンパク質または形質転換体を水、生理食塩水、緩衝液、植物油などに懸濁又は溶解し、必要に応じて安定化剤等の添加剤を添加することにより得られる液状ワクチン組成物が好ましい。
　例えば、形質転換体の粉末を使用する場合、0.5mg/ml～500mg/mlの濃度の懸濁液とすることが好ましく、1mg/ml～100mg/mlの濃度の懸濁液とすることがより好ましく、5mg/ml～50mg/mlの濃度の懸濁液とすることがさらに好ましい。なお、懸濁液とは、有効成分である前記形質転換体の粉末が液体中に分散されている組成物を意味し、粉末の一部が液体に溶解していてもよい。また、有効成分である抗原タンパク質の濃度が10ppm～15000ppmの濃度になるように懸濁することが好ましく、10ppm～5000ppmの濃度になるように懸濁することがより好ましく、50ppm～2000ppmの濃度になるように懸濁することがさらに好ましい。なお、形質転換体の粉末は粉末のまま供給され、使用者が、対象動物に投与する直前に水、生理食塩水、緩衝液、植物油などに懸濁して使用されるものでもよい。
　本発明の自然免疫増強方法は、前記融合タンパク質または前記DNA構築物で形質転換された植物体などの形質転換体またはその乾燥物もしくは粉砕物を動物に投与することを特徴とする。投与対象としては、ブタ、ウシ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどの非ヒト哺乳動物や魚類が挙げられる。
　本発明の自然免疫増強剤はマクロファージ、好中球、樹状細胞及び／またはNK細胞等を活性化して非特異的な免疫応答を増強するため対象疾病としては特に限定されず、自然免疫によって予防または治療し得る疾患全般が含まれるが、例えば、ブタであれば、浮腫病、ブルセラ病、炭疽、破傷風、ブタ丹毒、ブタ赤痢、サルモネラ症、大腸菌症、萎縮性鼻炎、アクチノバシラス症、マイコプラズマ感染症、ブタ伝染性胃腸炎、ブタ流行性下痢発症、ブタインフルエンザ、日本脳炎、オーエスキー病、口蹄疫、ブタ水泡病、ブタコレラ、ブタ白血病、ブタ生殖器・呼吸器症侯群、ロタウイルス、回虫症、肺虫症、トキソプラズマ症、コクシジウム病などが挙げられる。ウシの対象疾病としては、牛肺疫、炭疽病、出血性敗血症、ブルセラ病、結核病、サルモネラ症、破傷風、牛疫、口蹄疫、流行性脳炎、狂犬病、水泡性口炎、リフトバレー病、ヨーネ病、ブルータング、アカバネ病、チュウザン病、ランピースキン病、牛ウイルス性下痢、牛白血病、ピロプラズマ病、アナプラズマ病などが挙げられる。ニワトリの対象疾病としてはサルモネラ感染症、マイコプラズマ病、鶏大腸菌症、ヘモフィルス、ニューカッスル病、高病原性鳥インフルエンザ、毒鶏伝染性気管支炎、鶏痘、鶏脳脊髄炎、コクシジウム病などが挙げられる。ヤギの対象疾病として、炭疽病、ブルセラ病、結核病、チュウザン病、口蹄疫、アカバネ病などが挙げられる。イヌの対象疾病として、レプトスピラ、細菌性腸炎、狂犬病、パルボウイルス感染症、ジステンバーウイルス感染症、犬伝染性気管支炎（ケンネルコフ）、コロナウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、バベシア症などが挙げられる。ネコの対象疾病として、猫ヘモプラズマ感染症、リケッチア感染症、狂犬病、猫白血病ウイルス感染症、猫ヘルペスウイルス感染症、猫免疫不全ウイルス (FIV) 感染症、猫カリシウイルス感染症、猫ウイルス性鼻気管炎(FVR)、猫フィラリアなどが挙げられる。サカナの対象疾病として、連鎖球菌、ビブリオ病、イリドウイルス感染症などが挙げられる。
　本発明の自然免疫増強剤は、特に、浮腫病、大腸菌性下痢症、PRRS（ブタ繁殖・呼吸障害症候群）、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎）、トリサルモネラ症等の様々な疾患の防除に有効である。
　本発明の自然免疫増強剤をブタに投与する場合、投与時期は特に制限されないが、例えば、哺乳期～１２０日齢のブタに投与することができ、哺乳期～９０日齢のブタに対して投与することが好ましく、また繁殖期前後の母ブタに対して投与することが好ましい。免疫の方法としては、前記DNA構築物で形質転換された植物体を母ブタに投与して、母ブタが産生した抗体を、乳汁により子ブタに与える方法、前記DNA構築物で形質転換された植物体を哺乳期～９０日齢の子ブタに投与し、子ブタを直接免疫する方法等が挙げられる。
　本発明の自然免疫増強剤を鶏に投与する場合、鶏の日齢に関係なく投与できる。
　本発明の自然免疫増強剤をブタや鶏等の動物に投与する方法としては、飼料に、前記DNA構築物で形質転換された植物体またはその乾燥物もしくは粉砕物を混合して与える方法、点鼻投与など経鼻投与する方法などが挙げられる。経鼻投与により、少量の抗原を用いて生体に穏やかに免疫反応を惹起させることができる。本発明の自然免疫増強剤は、一定の間隔をおいて、複数回投与することが好ましい。例えば、４～７日おきに、合計２～３回投与する方法が挙げられる。
　本発明の自然免疫増強剤の投与量は、対象動物の種類、体重、性別、週齢、対象疾患の種類などによって適宜定められるが、形質転換体を投与する場合、例えば、１回の投与量が、対象動物の体重１kgあたり0.01mg～100gである。
　より具体的には、経鼻投与の場合、融合タンパク質の質量（絶対量）として、１日当たり好ましくは0.005mg～100mgである。また、形質転換体の乾燥質量（絶対量）として、１日当たり好ましくは0.01mg～200mgである。
　注射投与の場合、融合タンパク質の質量（絶対量）として、１日当たり好ましくは0.005mg～0.5gである。また、形質転換体の乾燥質量（絶対量）として、１日当たり好ましくは0.01mg～1gである。
　経口投与の場合、投与対象動物の体重１ｋｇあたりの融合タンパク質の投与量として、１日当たり好ましくは0.005mg～50gである。また、投与対象動物の体重１ｋｇあたりの形質転換体の投与量として、１日当たり好ましくは0.01mg～100g（乾燥質量）である。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
＜実験手順＞
（１）融合タンパク質の構造
　供試材料として、腸管出血性大腸菌が生産する志賀毒素2eの無毒Bサブユニット(Stx2eB)と毒素原生大腸菌が生産する易熱性毒素の無毒Bサブユニット(LTB) （配列番号１２）がPG12ペプチドリンカー（Matsui et al, Transgenic Res, 2011, 20:735-48：配列番号２）を介して連結された融合タンパク質を発現するレタスを用いた。融合タンパク質は、LTBがN末側に配置されたLTB-Stx2eB （LTB-B：配列番号１５）およびStx2eBがN末側に配置されたStx2eB-LTB（B-LTB：配列番号１６）の2種類を作製した。Stx2eBは糖鎖付加部位変異体（Asn73Se）を用いた（配列番号１０）。この融合タンパク質をコードするDNAの発現のために、近傍配列改変型NtADH 5’-UTR（配列番号２８）とAtHSPターミネーター（配列番号２９）を使用した。さらにタバコ由来β-D-glucan exohydrolase分泌シグナルペプチドコード配列（配列番号２４）および小胞体残留シグナル（HDEL）（配列番号２６）を用いることでコンビネーション化ワクチン抗原候補タンパク質の高蓄積化をはかった。構築した遺伝子カセットはバイナリーベクターpRI909(TAKARA)に導入し、レタスの形質転換に用いた(図1)。
　なお、Stx2eBがPG12ペプチドリンカーを介して2連結されたStx2eB-Stx2eB（Stx2eB-B）（配列番号１７）も同様にして作製した。
（２）アグロバクテリウムによるレタスへの遺伝子導入
　レタス(Lactuca sativa L.)品種グリーンウェーブ(タキイ種苗)をMS培地 [1/2×ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（MS塩、和光純薬工業）、1×Murashige and Skoog vitamin solution（MSビタミン、Sigma-Aldrich）、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に無菌播種後、10-16日目の本葉を5 mm角程度に切断し、ベクターコンストラクトを有するバイナリープラスミド（pRI909）を保持するアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefacience EHA105）懸濁液に本切片を10分間浸漬後、共存培地 [1× MS塩、1× MSビタミン、0.05 mg/l 6-ベンジルアミノプリン（BA）、0.1 mg/l 1-ナフチル酢酸（NAA）、0.1 M アセトシリンゴン、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に置床し、25℃、暗所で2日間培養した。切片を滅菌水で洗浄後、選抜培地 [1× MS塩、1× MSビタミン、0.05 mg/l BA、0.1 mg/l NAA、0.5 g/l ポリビニルピロリドン（PVP）、50 mg/lカナマイシン（Km）、250 mg セフォタキシム（Cef）、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に置床し、25℃、蛍光灯下（2000-3000 lux）で培養を行った。以降、不定芽が得られるまで3-4日間に1回（2回/週）の間隔で新しい選抜培地への移植を行った。不定芽から形成された再分化個体は発根培地[1/2× MS塩、1× MSビタミン、0.5 g/l PVP、250 mg Cef、3% ショ糖、0.8% 寒天、pH5.8] に移植し、同条件で培養を行った。以降、3-4日間に1回（2回/週）の間隔で新しい発根培地への移植を行った。発根した再分化個体は鉢植えにし、同条件で栽培を行った。
（３）レタス乾燥粉末の調製
　上記（２）で得られた毒素融合タンパク質産生レタスを真空凍結乾燥機（FD-6BM-SQ、日本テクノサービス社）で凍結乾燥した。棚温度はなりゆき、乾燥期間は7日間とした。得られた乾燥粉末はブレンダー（Wonder crush/mill D3V-10、大阪ケミカル株式会社）を用い、10秒間の粉砕を三回行って粉末化し、B-LTBまたはStx2eB-B を含むレタス乾燥粉末を得た。
（４）レタスからのタンパク質抽出
　タンパク質抽出はTCA-acetone法（Shultz et al. Plant Mol Biol Rep, 2005, 23:405）に従い、液体窒素凍結後、-80℃で保存した遺伝子導入レタス本葉を用いて行った。100-200 mgのサンプルをTissueLyzer II（QIAGEN）を用い破砕後、サンプルの5倍量の TCA-acetone（10% トリクロロ酢酸、90% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール）を添加、混合し、-20℃で1時間静置後、16,000×g、4℃、30分間遠心操作を行い、上清を除去し、タンパク質を含む沈殿を得た。さらに夾雑物を除去するために、サンプルの5倍量の acetone/BME（100% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール）を添加、混合し、16,000×g、4℃、10分間遠心操作を行い、上清を除去した。本夾雑物除去操作はさらに2回行った。沈殿は減圧乾燥後、サンプルの2倍量の 抽出Iバッファー [0.5 M 塩化ナトリウム、5 mM イミダゾール、6 M 尿素、20 mM トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）-HCl、pH7.9] に懸濁し、16,000×g、4℃、10分間遠心を行い、上清を回収、タンパク質溶液を得た。タンパク質濃度の測定は、Protein Assay Kit II（Bio-Rad）を用い行った。
（５）ウエスタン解析
　得られたタンパク質溶液をマイクロチューブに適量入れ、同量のサンプルバッファー（EZ Apply、ATTO製）を加え混合し、沸騰水中で5分間加温し、サンプルのSDS化を行った。タンパク質定量時の標準物質には大腸菌で生産し精製したLTBを用いた。具体的には特許文献２のL+を本特許文献に示す方法でタンパク質生産用大腸菌(BL21 DE3)にて発現し、ガラクトースカラムで精製した。これを抽出Iバッファーで2倍希釈を繰り返すことにより希釈系列を作製し、これら希釈系列をスタンダードとして用いた。
　タンパク質の電気泳動（SDS-PAGE）は、電気泳動槽（ミニプロティアンTetraセル）およびミニプロティアンTGX-ゲル（BIO RAD）を用いた。電気泳動バッファー（EZ Run、ATTO製）を入れ、ウェルにSDS化したサンプルを5 μlアプライし、200 V定電圧で40分間行った。
　電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック（BIO RAD）を用い、トランスブロットTurbo（BIO RAD）でブロッティングを行った。
　ブロッティング後のメンブレンはブロッキング溶液（TBS系, pH7.2、ナカライテスク）に浸し、室温で1時間振とうまたは4℃で16時間静置後、TBS-T（137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、25 mM Tris-HCl、pH 7.4）中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。LTBタンパク質の検出には、抗血清Rabbit-Antiserum Anti-LTp 991109(inactive)(0.1% NaN3)AO をTBS-Tで10,000倍希釈して使用した。本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で2時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。二次抗体にはTBS-Tで10,000倍希釈したAnti-Rabbit IgG, AP-linked Antibody（Cell Signaling TECHNOLOGY）を使用した。本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。アルカリホスファターゼによる発色反応は、発色液（0.1 M 塩化ナトリウム、5 mM 塩化マグネシウム、0.33 mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.33 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、0.1 M Tris-HCl、pH9.5）中にメンブレンを浸し、室温で7分間振とうすることにより行い、メンブレンを蒸留水で洗浄した後、常温で乾燥した。
　発色したメンブレンはスキャナー（PM-A900、エプソン）により解像度600 dpiで画像化し、画像解析ソフト（CS Analyzer ver. 3.0、アトー）を用い、LTBタンパク質の定量を行った。
（６）マクロファージ活性化試験１
　自然免疫の活性化指標としてマクロファージの活性化に伴うTNFαの産生量を測定し、各被験物質の自然免疫誘導能の比較検討を行った。
　手順は以下の通りである。なお、供試サンプルとしては、遺伝子組換え大腸菌で作製、精製したStx2eB-Stx2eB及びStx2eB-Hisを用いた。
（６－１）前培養
　RAW264.7細胞は、10%の牛胎児血清、100μg/mLペニシリン、ストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地にて継代培養したものを用いた。
（６－２）試験操作
　T25培養フラスコ 4本にて前培養した細胞をピペッティングにより壁から剥がし、得られた細胞の懸濁液を50mLコニカルチューブに移した。チューブを室温で遠心分離し（1000rpm、5分間）、上清をデカンテーションで捨て、細胞を回収した。タッピングにより細胞をほぐした後、培養液5mLを加え、ピペッティングによって細胞を均一に懸濁した。11μLを別のチューブに移し0.5%トリパンブルー11μLを添加した後、血液計算板に液を移して細胞数と生存率を測定した。生存率が90%以上であったので、残液を試験に用いた。
　測定した細胞数に基づいて、残液に培養液を加えて希釈し8×105cells/mLになるよう細胞数を調製した。この細胞懸濁液を100μLずつ96well平底プレートの各ウェルに加えた。インキュベータに移して、細胞がウェルの底に接着して伸展するまで6時間前培養を行った。
　被験液はそれぞれ終濃度の4倍濃度のものを調製し、40μg/mLに調製したポリミキシンB溶液と等量混合した。6時間前培養が終了したプレートを取り出し、ウェルに100μLずつ検体を加えた。各検体を添加後、24時間培養し、培養上清100μLずつ別の96穴平底プレートに移した。Medium群の培養上清は、1%BSA含有PBS(-)溶液により、5倍希釈液を300μL調製した、他の群の培養上清は、1%BSA含有PBS(-)溶液により100倍希釈液を1mL調製した。希釈液をTNFα ELISA測定に用いた。測定方法は、キット記載の方法に従い測定した。
（７）マクロファージ活性化試験２
　マクロファージ活性化試験１と同様に、自然免疫の活性化指標としてマクロファージの活性化に伴うTNFαの産生量を測定し、各被験物質の自然免疫誘導能の比較検討を行った。
　供試サンプルとしては、LTB-Stx2eB、Stx2eB-Stx2eBを生産する遺伝子組換えレタスを作製し乳鉢で液体窒素を用いて凍結、粉砕し、ジュース化したものを用いた。
　マクロファージ活性化試験１と同様の試験方法で評価を実施した。被験物質は遺伝子組換えレタスのジュースを所定の濃度になるように添加した。添加濃度はStx2eBの濃度を指標として調整した。
（８）PRRSウイルス感染防御試験
　B-LTBレタスの経口投与によるPRRSウイルス予防効果確認試験を行った。試験に供試した子ブタは分娩後24時間目までは初乳を与えず人工乳を与え、以降は母ブタ哺乳に戻した。分娩後10、16、22日目にワクチンレタス（LTB 1.7 mg相当量/回）もしくは空ベクターレタスの凍結乾燥粉末を水に懸濁し、チューブを接続したシリンジで強制投与した(図2)。陽性対照として、PRRSウイルスの中和エピトープをLTBに融合した抗原を発現するレタス(ER LTB-ectGP5、WO2016/021276、LGと略記する)を投与した。供試頭数は、陰性対照が2頭、B-LTBおよびLGは各3頭とした。北米III型PRRSウイルスを経鼻噴霧により25日目に投与し攻撃した。体重、飼料摂取量を測定するとともに、臨床症状を毎日観察し、PRRSに典型的な症状である呼吸器症状（0:なし 1:軽度 2:中度 3:重度）について観察しスコア化した。PRRSウイルスによる攻撃21日目に安楽死後、剖検を行い、各臓器及び組織の異常を肉眼的に観察した。主要臓器の病理標本を作製し、病理組織学的所見を観察した。
（９）マイコプラズマ感染予防効果
　LTB-BレタスおよびB-LTBレタスの経口投与により抗体誘導が行われるかどうかを解析する目的で、以下のスケジュールで投与を行った(図3)。すなわち、7、14、21、22、23、28、29、30、35、36、37、42、49日齢でレタスを子ブタに経口投与した。一回あたりの抗原投与量は、LTB相当量で1.7 mg、Stx2eB相当量では1.0 mgとした。供試頭数は、陰性対照とB-LTBが3頭、LTB-Bが4頭とした56日齢で解剖を行った。
（１０）サルモネラ感染防除試験
Salmonella Enteritidis実験感染鶏に対するレタスワクチン給与の効果を以下の手順で調べた。なお、供試物質としては、Stx2eB-Stx2eBを生産する遺伝子組換えレタスを凍結乾燥し、ブレンダーで粉砕した粉末を用いた。
（１０－１）試験群
　無投与対照群，レタスワクチン強制経口投与A群，レタスワクチン強制経口投与B群：各14羽。
（１０－２）飼育条件
　1日齢ヒナ（名古屋コーチン初生オス）を導入後，株式会社栄養・病理学研究所内の閉鎖系の動物飼育室で，一般的な飼育管理を行う。SE感染後は，株式会社栄養・病理学研究所内の閉鎖系の動物飼育室にアイソレーター内で飼育する。部屋を空調で，またケージを保温灯などで温度管理をした。飼料及び飲水は試験期間を通して自由摂取とした。
（１０－３）群分け
　市販鶏を導入後，体重測定を実施し，体重が均一になるように3群に群分けし，群ごとに14羽ずつケージに入れて試験を開始した。感染後はアイソレーター内に収容した。各群に基礎飼料及び飲水を1日齢から試験終了時まで不断給餌した。なお，全供試鶏はマーキング等で個体識別した。また，各群所定の被験物質を飲料水で懸濁した溶液を作製し，所定の日齢で強制経口投与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 （１０－４）SE感染
　15日齢雛に，Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (SE) 野外分離株の培養菌液1 mLを強制経口投与する。培養液中の菌数は約1.0×106cells/mLとした。
（１０－５）経過観察
　飼育期間はSE感染後7日間とする。SE感染後0，3及び7日に体重測定を行う。体重測定時に飼料摂取量も併せて測定する。試験期間中は毎日，一般臨床症状を観察した。
（１０－６）剖検
　SE感染後3及び7日に，各群7羽ずつ剖検を行う。剖検時に採血を行う。盲腸内容物を採取した。
（１０－７）分析
　盲腸内容物1 g中のSE菌数をreal-time PCRを用いて測定した。
（１１）経鼻投与試験～レタスワクチンのブタ浮腫病評価
　Stx2eB-B産生レタス乾燥粉末60mg（Stx2eB-B濃度は5mg/gレタス乾燥粉末）を、投与直前に2ｍｌのリン酸緩衝液（PBS）に懸濁し、経鼻投与用ワクチン懸濁液（粉末濃度30mg/ml, 抗原濃度0.15mg/ml（150ppm）, pH6.5）を得た。
　被験用のブタについて、娩出時は産仔全頭の初乳を24時間制限した後、18日齢までは通常飼育し、試験を開始した。18日齢で離乳させ、群分けした。21日齢で上記経鼻投与用ワクチン懸濁液を経鼻投与（1ｍｌずつ片鼻孔に投与）した後、25日齢から連続して3日間浮腫病用攻撃菌（Stx2e毒素保有大腸菌）を強制経口投与した。攻撃後、11日間を観察期間とし、毎日臨床的な観察（元気、食欲、目の周りの浮腫、神経失調、運動障害、横臥、下痢、死亡）を行い、下記に示すスコアを基準にして記録した。
試験豚の体重（強制投与時）は以下の通り。
プラセボ　7.9, 8.4, 6.0, 6.9 平均7.3kg、標準偏差1.1
経鼻　　　4.7, 8.5, 7.2, 7.7 平均7.0kg、標準偏差1.6
　臨床スコアは観察期間中の積算値として計算した。
　・臨床スコア値：元気（0：正常1：減退2：消失）
　　　　　　　　食欲（0：正常1：やや不振2：不振3：廃絶）
　　　　　　　　目周囲浮腫（0：なし1：軽度2：中度3：重度）
　　　　　　　　運動障害（0：なし1：軽度2：中度3：重度）
　　　　　　　　糞便性状（0：正常1：軟便2：泥状便3：水様性下痢）
　　　　　　　　姿勢（0：正常1：腹臥2：横臥）
　　　　　　　　神経症状（0：なし1：軽度2：中度3：重度）
　　　　　　　　なお、死亡例は各スコアの最高値を観察終了まで継続して付与した。
＜結果＞
（１）マクロファージ活性化試験１
　結果を表２に示す。Stx2eB-Stx2eB、Stx2eB-Hisともに濃度依存的にTNFα産生量が増加することからマクロファージの活性化能があることが示唆された。Stx2eB-Stx2eB、Stx2eB-Hisの比較では1000ng/ml、5000ng/mlの濃度で有意にStx2eB-Stx2eBがStx2eB-Hisより高いTNFα産生量を示し、マクロファージ活性化能が高いことから、Stx2eBをペプチドリンカーでつなぎタンデム化することでStx2eB単独の場合より更にマクロファージの活性化能が高くなることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）マクロファージ活性化試験２
　結果を表３に示す。全てのレタスサンプルで濃度依存的にTNFα産生量の増加が見られ、マクロファージの活性化能が示された。また、プラセボレタスに比べ1000ng/ ml及び5000ng/ mlの添加区でLTB-Stx2eBレタス、Stx2eB-Stx2eBレタスのTNFα産生量が有意に高く、マクロファージ活性能が高いことが示された。特に、Stx2eB-Stx2eBレタスは5000ng/mlの添加区でTNFα産生量が顕著に高い結果であった。一方、プラセボレタスにも一定のマクロファージ活性化能があることもわかったが、レタス成分中に含まれる多糖類やサポニン成分などの影響が考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（３）PRRS感染防御試験
　PRRSウイルス感染後毎日、呼吸症状をスコア化した。感染後0-6日、7-13日、14-21日の各6日間でのスコア合計を各個体につき算出し、群内で平均値と標準偏差を算出した(図4)。その結果、有意差はないものの、B-LTB投与群で陰性対照に比べ症状の緩和が見られた。またその効果はPRRS抗原を含むLGとそん色なかった。
　次に感染後期間(25日から46日齢まで)の飼料要求率を比較した。有意差はないものの、B-LTB投与群で陰性対照に比べ、飼料要求率の改善が見られた(図5)。
　剖検時の肺の所見では、陰性対照レタス投与群では肺の特に下葉に灰色の変色が見られたが、B-LTB投与群では改善傾向が確認できた(図6)。
（４）マイコプラズマ
　LTB-BおよびB-LTB投与ブタを56日目に剖検した。その結果、一部の個体にマイコプラズマの自然感染が認められた。個体別にマイコプラズマ肺炎の程度をスコア化した(-, +, ++)。陰性対照レタス投与群では3頭中3頭で所見が見られたのに対し、LTB-BおよびB-LTB投与群では所見のあった個体数が減少した(表４)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（５）サルモネラ
　体重解析の結果を表５に示す。プラセボレタス投与区では15日齢でのサルモネラ菌攻撃後3日目では雛の増体重は平均16gにとどまったが、ワクチンレタス投与区では5回投与区で平均28g、2回投与区で29gとサルモネラ菌の影響を緩和することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　菌数解析の結果を表６に示す。ワクチンレタス5回投与区では雛の盲腸内容物中のサルモネラ菌数はサルモネラ菌攻撃後3日目で6.92 (log cells/g) とプラセボレタス投与区7.41 (log cells/g)に比べサルモネラ菌数が68％減少し、7日目でも6.62 (log cells/g)とプラセボレタス投与区7.03 (log cells/g)に比べで61％減少していた。
　ワクチンレタス2回投与区では雛の盲腸内容物中のサルモネラ菌数はサルモネラ菌攻撃後7日目で6.69 (log cells/g) とプラセボレタス投与区7.03 (log cells/g)に比べ菌数が54％減少した。
　これらの結果から、Stx2eB-Bレタスをニワトリ雛にサルモネラ菌の攻撃の前に投与することで腸内のサルモネラ菌数を低減し、増体重の減少を防ぐことが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（６）経鼻投与試験
　表７に示すように、ワクチンを経鼻投与されたブタはプラセボ群と比較して顕著に臨床スコアが小さく、Stx2eB-B産生レタスの乾燥粉末を含む経鼻ワクチンはブタ浮腫病の予防効果に優れることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明の自然免疫増強剤は、特に畜産の分野で有用である。

Claims (15)

  1. 志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質を含む、自然免疫増強剤。
  2. 前記融合タンパク質がStx2eBとLTBを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の自然免疫増強剤。
  3. 前記融合タンパク質がStx2eBを2つ以上含む融合タンパク質である、請求項１に記載の自然免疫増強剤。
  4. 前記Stx2eBの７３位のAsn残基がSer残基に置換されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の自然免疫増強剤。
  5. 前記２以上の毒素Bサブユニットがペプチドリンカーを介して融合されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の自然免疫増強剤。
  6. 前記ペプチドリンカーがPG12（配列番号２）、PG12v2（配列番号４）、PG17（配列番号３０）、もしくはPG22（配列番号３１）、またはこれらの配列と８０％以上同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項５に記載の自然免疫増強剤。
  7. 前記融合タンパク質が配列番号１５～１７のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の自然免疫増強剤。
  8. 前記融合タンパク質をコードするDNAで形質転換され、前記融合タンパク質を発現した形質転換体を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の自然免疫増強剤。
  9. 前記形質転換体が植物である、請求項８に記載の自然免疫増強剤。
  10. 前記植物が植物の乾燥粉末又はその懸濁液として含まれる、請求項９に記載の自然免疫増強剤。
  11. 経鼻投与用である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の自然免疫増強剤。
  12. ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、サルモネラ菌またはマイコプラズマに対する免疫応答を誘導する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の自然免疫増強剤。
  13. マクロファージ活性化作用を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の自然免疫増強剤。
  14. 志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質を含む、マクロファージ活性化剤。
  15. 志賀毒素2eのBサブユニット（Stx2eB）、大腸菌易熱性毒素のBサブユニット（LTB）およびコレラ毒素のBサブユニット(CTB)から選択される２以上の毒素Bサブユニットの融合タンパク質または該融合タンパク質をコードするDNAで形質転換され、前記融合タンパク質を発現した形質転換植物を非ヒト哺乳動物に投与することを特徴とする、非ヒト哺乳動物の自然免疫を増強させる方法。
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